microscopia metodi, limiti, possibilità · il sem • il microscopio elettronico a scansione...
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Università Politecnica delle Marche, Facoltà di Agraria
C.d.L. Scienze Forestali e Ambientali, A.A. 2013/2014, Fisica
Microscopia – metodi, limiti, possibilità
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Incrementando di un fattore 10 la potenza dell’occhio umano tramite il suo telescopio, Galileo Galilei è riuscito a studiare la superficie della Luna e scoprire i satelliti di Jupiter.
15.02.1564 – 08.01.1642
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Primi microscopi:
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Microscopio moderno:
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Microscopio a fluorescenza Questo tipo di microscopio utilizza radiazioni ultraviolette, per ottenere, nei preparati in cui ciò è possibile, la fluorescenza.
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Però c’è un limite!
La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può essere ottenuta solamente aumentando il potere di ingrandimento. La diffrazione pone un limite inferiore alla distanza di separazione tra due punti in posizioni distinte. Questa distanza minima è data da: dmin = 1,2λ / 2n sinα (limite di Abbe)
dove λ è la lunghezza d'onda della luce che illumina l'oggetto, n l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo, α il semi-angolo del cono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo.
Luce nello spettro visibile: 380nm ≤ l ≤ 750nm; limite di Abbe ≈ 250nm
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Il Microscopio Elettronico a
Scansione (SEM)
Il potere risolutivo cresce proporzionalmente al decrescere della lunghezza d’onda della radiazione impiegata, infatti la scoperta che gli elettroni hanno una radiazione di bassissima lunghezza d’onda ha suggerito la possibilità di usare fasci di elettroni per ottenere poteri risolutivi assai elevati.
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Cosa è la Microscopia Elettronica
Tecnica che permette l’osservazione di campioni con ingrandimenti e risoluzione fino a 1000 volte superiore alla microscopia ottica ordinaria.
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Alcuni cenni storici
• 1897: J. Thomson scopre l’elettrone
• 1924: L. de Broglie propone la teoria ondulatoria della materia
• 1926: H. Busch dimostra che i campi elettrici e magnetici a
simmetria assiale si comportano come lenti per gli elettroni
Nascita dell’ottica elettronica
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• 1934: E. Ruska primo prototipo di TEM
• 1938: von Ardenne primo prototipo STEM
• 1942 Zworykin realizza il primo prottipo di SEM capace di
analizzare campioni massivi.
• 1960 Everhart e Thornley introducono il loro rivelatore per
elettroni secondari, basato su scintillatore e tubo
fotomoltiplicatore
• 1965: Cambridge Instruments produce e commercializza il
primo SEM
• 1986: Ruska vince il Nobel
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IL SEM
• In linea di principio un microscopio elettronico opera come
un normale microscopio ottico qualora si usasse luce con
lunghezza d’onda bassissima.
• Poiché però i normali dispositivi ottici non deviano gli
elettroni, si ricorre a lenti elettrostatiche o a lenti
magnetiche che, agendo sulla carica elettrica degli
elettroni, ne provocano la deviazione.
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IL SEM
• Il Microscopio Elettronico a Scansione sfrutta la generazione di
un fascio elettronico ad alta energia nel vuoto.
• Il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per
scandire una area del campione.
• L’interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono
acquisiti da opportuni detectors e successivamente elaborati
fino a formare una immagine a livelli di grigio.
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SEM moderno:
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I pregi del SEM
Da indicazioni su:
• morfologia della superficie del campione
• composizione chimico fisica
• difettosità elettriche
• contaminazione delle superfici
• misura dei potenziali superficiali
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• Alta risoluzione (limite 2nm)
• Alti ingrandimenti (fino a 100.000x)
• Alta profondità di campo
• Abbastanza facile preparazione del campione
La combinazione di alti ingrandimenti, alta risoluzione, larga ampiezza del fuoco e facile preparazione e osservazione del campione rende il SEM uno degli strumenti più affidabili e più semplici da utilizzare per lo studio della morfologia di vari campioni.
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Confronto tra microscopie MO SEM TEM
Range di ingrandimento 1-1000 10-10000 1000-1000000
Risoluzione
Ordinaria 5mm 0,1mm 5nm
Per osservazioni accurate 0,2mm 20nm 1nm
Limite 0,1mm 1nm 0,2nm
Profondità di campo 0,1mm a 10x 10mm a 10x limitata allo spessore del film
1mm a 100x 1mm a 100x limitata allo spessore del film
Ambiente versatile richiede il vuoto (0,03Pa) richiede il vuoto (0,03Pa)
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Pollini di Compositae al microscopio elettronico a scansione
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Creste delle cellule vegetali
Coccolithophore (alga) Emiliania huxleyi
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Peli sul fusto di una pianta di tabacco
Tricomi sulla pianta Juglandales Juglandaceae
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Tricoma sulla foglia di Arabidopsis thaliana
Fusto di bamboo
Caratteristiche del TEM
• Potere risolutivo altissimo (0,2 nm), dell’ordine delle molecole.
• Fino a 1.000.000 X.
• Richiede sezioni sottilissime, colorate solitamente con metalli e mantenute sotto vuoto: artefatti inevitabili.
• Non si possono osservare strutture viventi, né in 3D.
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TEM
vs
SEM
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Microscopio ottico Microscopio a raggi X Microscopi elettronici e ionici - Microscopio elettronico a scansione (SEM) - Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) - Microscopio elettronico a diffrazione - Microscopio elettronico ad emissione di campo - Microscopio ionico Microscopi a scansione di sonda (SPM) - Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM) - Microscopio ottico a scansione in campo prossimo (SNOM) - Microscopio a forza atomica (AFM) Altre tipologie di microscopio - Microscopio acustico - Microscopio confocale + forza atomica + riflessione interna totale in fluorescenza
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SEM – UNIVPM (Dipartimento SIMAU):
SEM PHILIPS
XL20 con EDS
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Microscopio a forza atomica – Dipartimento Di.S.C.O.
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Erythrocytes, contact mode scan field 40 µm * 40 µm
z-range 0 – 2.1 µm
Superficie della castagna, tapping mode scan field 30 µm * 30 µm
z-range 0 – 6 µm
Microtomografia computerizzata a raggi X o radiazione di
sincrotrone:
Strumento desktop Skyscan: risoluzione tipica nell’ordine dei micron.
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www.esrf.
fr
European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France
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Schematic set up of microCT system installed at ID19 in
ESRF
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ricostruzione 3D del legno
Visualizzare la struttura interna del legno utilizzando
microtomografia computerizzata
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Radiografia neutronica:
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Differenza tra una radiografia
neutronica e una a raggi X: i
liquidi vengono visualizzati
molto bene utilizzando
neutroni.
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Tomografia neutronica:
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L’assorbimento dell’acqua nelle piante
l’assorbimento di D2O in 5 min
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“L'acqua scorre sempre in discesa” (anché nel terreno)
Due sono le principali cause del movimento dell’acqua:
Gravità
• Quando il terreno è saturo
• Nei macropori
• Movimento veloce.
• Quando il terreno non è saturo
• Nei micropori
• Dovuto alle forze attrative tra le
superfici del terreno e l’acqua
• Movimento meno veloce.
Potenziale matriciale
Terreno secco
Falda d’acqua
Terreno umido P
rofilo
de
l te
rre
no
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Per l’acqua, le forze di adesione tra
l'acqua ed il recipiente che la
contiene sono maggiori delle forze di
coesione tra le molecole d'acqua.
Per il mercurio, le forze di coesione
prevalgono rispetto alle forze di
adesione.
Capillarità:
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dove:
- ϒ è la tensione superficiale (N/m);
- θ è l'angolo di raccordo tra la superficie del liquido e la parete del contenitore;
- ρ è la densità del liquido (kg/m3);
- g è l'accelerazione di gravità (m/s²);
- r è il raggio del capillare (m).
L'innalzamento del livello del liquido nel capillare rispetto a quello del liquido nel
recipiente esterno (legge di Jurin):
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Capillarità dei terreni porosi
T.H. Cooper, Univ. Minn.
Free water
Capillary rise
Exceeds
height of
capillary
rise
Pore diameter (mm) 1.0 0.5 0.1 0.01
He
igh
t o
f rise
(m
m)
0.1
5
0.3
1
.5
15
.0
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