Mikolojik Tanı

Dr Dilek Yeşim Metin

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir

Yüzeyel (mukoza ve deri) infeksiyon

Fırsatçı, sistemik infeksiyon

Candida infeksiyonları

200 fazla tür,

İnfeksiyonların en sık etkenleri

C albicans

C parapsilosis

C tropicalis

C glabrata

C krusei

Candida infeksiyonları

Candida infeksiyonları mikrobiyolojik tanı

•Örnekte Candida varlığını göstermek

•Tür düzeyinde belirleyebilmek

•Olanak varsa duyarlılık testlerini yapmak

•En kısa sürede!

Yüzeyel Candida infeksiyonları

Tanı kolay, yorum zor!

İnfeksiyon bölgesi sıklıkla gözle görülebilir, örnek alınabilir

Mukoza ve deri, flora yönünden zengin

Normal flora Kolonizasyon İnfeksiyon

Sistemik Candida İnfeksiyonları

Tanı zor!

Mikrobiyolojik tanı tek başına yeterli değil!

Klinik Radyolojik Histopatolojik

Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler

Yüzeyel örnekler

Deri, kıl, tırnak kazıntı, deri ve mukoza

sürüntüleri

Sistemik infeksiyon örnekleri

Kan

Solunum yolu örnekleri

İdrar

BOS

Steril boşluk sıvıları

Doku biyopsileri

Steril bölgelerden

alınan örnekler

tanıda

ÖNEMLİDİR !

Antifungal tedavi öncesi alınmalıdır!

Anaerobik transport besiyerleri

kullanılmamalı!

Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler

Örnek miktarı;

Mantar kültürü > bakteri kültürü

Üreme şansını artırır !!!

Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler

Mikrobiyolojik tanı

a. Direkt mikroskobik inceleme

b. Kültür

c. Tanımlama

c. Kültür dışı yöntemler

d. Duyarlılık testleri

Direkt Mikroskobik İnceleme

• Direkt örnek bakısı

• KOH preperatı ile örnek değerlendirme

• Kalkoflor beyazı ile floresan mikroskobik

değerlendirme

• Gram boyası

Cins ve tür düzeyinde tanımlama

Türe özgü olası direnci belirleme

Antifungal duyarlılık testi

Altın standart

Kültür

İdentifikasyon

Germ tüp: Candida albicans – albicans dışı Candida’lar

İdentifikasyon

Dalmou yöntemi: Mısır unu tween 80 agar besiyerinde

mikromorfolojik tanı

İdentifikasyon

Kromojenik besiyerinde (CHROMagar Candida, France) farklı koloni

renkleri

İdentifikasyon

Ticari kitler ile: KH asimilasyonları

•RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic Systems, Norcross, Ga)

•Fongiscreen test (Sanofi Diagnostics Pasteur, France)

•Automated Rapid Yeast Identification Panel (Dade Microscan, USA)

•API 20C AUX (bioMerieux-Vitek, Hazelwood, Mo.)

•API Candida (bioMerieux, France)

•Auxacolor (Sanofi Diagnostics Pasteur, France)

•Uni-Yeast-Tek kit (Remel Laboratories, Lenexa, Kan.)

•Kitch et al.,1996; Heelan et al., 1998; Wadlin et al., 1999•Quindos et al., 1993; Hoppe and Frey, 1999•Land et al., 1991; St-Germain and Beauchesne, 1991

İdentifikasyon

Ticari kitler ile: Otomatize biyokimyasal sistemler

ID32C stripleri (bioMerieux)

Vitek Yeast Biochemical Card system (bioMerieux Vitek, Inc.,

Hazelwood, Mo.), Vitek 2 ID-YST card system (bioMerieux Vitek, Inc.)

Quantum II (Abbott Laboratories, USA)

Biolog YT MicroPlate system (Biolog, USA)

İdentifikasyon

Moleküler tanımlama: Daha hızlı ve daha spesifik

tanımlama

Genellikle PCR temelli

İdentifikasyon

Kültürde ya da histopatolojik kesitlerde hibridizasyon temelli testler

Peptide Nucleic Acid Fluorescent in-situ hybridization (PNA FISH): Kan

kültüründe üreme sinyali olan örneklerde, Candida albicans’ı saptamaya yönelik

Duyarlılık ve özgüllük %100

Rigby et al., 2002)

İdentifikasyon MALDI-TOF MS

Duyarlılık istenilen düzeyde değil

Uygun örnek alınmasındaki zorluklar

Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür

Örnekteki mantar miktarı azlığı

Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür

Duyarlılık istenilen düzeyde değil

Üreme olan örneklerde değerlendirme

Kontaminasyon

Kolonizasyon

İnfeksiyon

KARAR ?

Duyarlılık istenilen düzeyde değil

•Etkenin üretilmesi ve tanımlanması zaman alıcı

•Deneyim gerektiriyor

Kültürde üreme : 2-4 gün

Kültürden tanımlama: 2-3 gün

Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür

4-7 gün

Sistemik mikoz şüpheli hastada

ilk incelenecek örnek

“KAN KÜLTÜRÜ”

•Enfeksiyon odağına ait belirtiler yoksa

•Enfeksiyon odaklarına kolay ulaşılamıyorsa

Kültür

“KAN KÜLTÜRÜ”

Lizis santrifügasyon yöntemi “altın standart”

Otomatize kan kültür sistemleri

Bactec (BD Diagnostic system, Sparks, Md.)

BacT/Alert (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France)

Otomatize sistemlerin performansı, lizis santrifügasyon ile uyumlu

Kandidemili olgularda duyarlılığı %50

Current Drug Targets, 2006; 7: 513-22

Kontaminasyon? / Kolonizasyon? > İnfeksiyon

Solunum yolu örnekleri

Orofaringeyal kolonizasyon nedeniyle balgam uygun örnek değil!

Üst solunum yolu sürüntü örnekleri ile birlikte değerlendirilmeli

Tür düzeyinde tanımlanmalı

Solunum yolu örnekleri

Kontaminasyon?

Kolonizasyon?

Ürinersistem

infeksiyonu?

Dissemineinfeksiyon

?

KANDİDÜRİ

Kültür

•YB, organ nakilli, bağışık sistemi baskılı hastalarda tür düzeyinde tanımlanmalı

•Kandideminin belirtisi (!)

•Renal kandidoz: İdrar kültürü (-)

Kültür

İdrar

Edwards JE. International conference for the development of a concensus on the

management and prevention of severe candidal infections. Clin Infect Dis 1997;25:43-49

• Piyüri, koloni sayısı anlamlı değil!

• >10.000 cfu/ml ÜS infeksiyonunda anlamlı olduğu ileri

sürülmüş kesinlik kazanmamış !

– Uzun süreli sondası olan hastalarda (=kolonizasyon)

– Risk faktörlerinin ortadan kaldırılması ile kandidüri düzelebilir

Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978

Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol. 1978

Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection-diagnosis and management. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science, 1997:78-93; 131-48

Edwards JE. International conference for the devolepment of concensus on themanagement and prevention of severe candidal infections. ClinInfect Dis 1997; 25: 43-59

Kolonizasyon-İnfeksiyon

• Kantitatif sonuçlar; tür identifikasyonu ile anlamlı!

– C. albicans, gebeler İYE ile ilişkili bulunmamış!

– C. glabrata, idrarda saptanması İYE lehine

– C. tropicalis, 103-105 cfu/ml İYE ile ilişkili olabilir

Ahearn DG, Janach JR, Roth EJ. Speciation and densities of yeasts in human urine specimens.Sabouraudia 1966: 5; 110-119.Hazen KC, Stei J, Darracott C, Breathnach A, May J, Howell SA. Isolation of cholesterol-dependentCandida glabrata from clinical specimens. Diagn Microbiol Infect. 2005: 52; 35-37.

Kolonizasyon-İnfeksiyon

Katater yoksa

Kültür

İdrar

Katater varsa

Üreme varsa, kültür tekrar alınır

Orta idrar Katater değiştirilir

Perianal-vaginal kültür

Kontaminasyon

olasılığı

Kültür

İdrar Kültürde sürekli üreme var

İnvazif kandidoz ?

•nötropeni?

•nedeni bilinmeyen ateş?

•geniş etki alanlı antibiyotik?

•santral venöz kateter?

•hiperalimentasyon?

•ameliyat (özel. karın)?

•Candida kolonizasyonu (yara, periton

KAN KÜLTÜRÜ

•Steril örnek alımındaki kısıtlamalar

(özellikle pansitopenik hastalarda)

•Var olan kültür yöntemlerinin zaman alışı

•Etken mantar izolasyonundaki başarı oranının çok yüksek olmayışı

•Üreyen etkeni değerlendirmede sorunlar

Kültür dışı yöntemler

“Moleküler Tanı”

• Çok sayıda çalışma var!

– Nükleik asid hibridizasyon

– DNA dizi analizi

– PNA FISH

– PCR …..

Moleküler yöntemler

• Kullanılan örnek

– Doku, kan, serum, plazma, BAL

• Örnek miktarı (200 µl-10 ml)

• Farklı metodoloji

– Nükleik asid ekstraksiyonu

– Farklı primer ve probların kullanılması

Moleküler yöntemler

Onay almış standart test yöntemi yok!

Arendrup MC, Fisher BT, Zaoutis TE. Invasive fungai infections in the paediatric and neonatal population: diagnostics and

management issues. CMI. 2009: 15; 613-624.

Xavier MO, Oliveria FM, Severo LC. Laboratory diagnosis of pulmonary mycose. J Bras Pneumol. 2009: 35; 907-919

39/26

• Test duyarlılığı:

Kandidemi %100

İnvazif kandidoz şüphesi %95

• İspatlanmış/yüksek olasılıklı invazif kandidozda

PCR pozitifliği: %85 (78-91)

Kan kültür pozitifliği %38 (29-46)

PCR temelli yöntemlerde

“Kan” uygun örnek değil

•Etken kanda az miktarda

-örnek miktarı artırılabilir

•inhibitör etki fazla

-internal kontroller çalışmaya dahil edilebilir

•Farklı örnekler kullanılabilir (BAL, doku biyopsisi)

-örnek alma sorunlu

Moleküler yöntemler

PCR temelli yöntemlerde

Tek örnek yerine, ardışık 2 veya daha fazla örnek

Diğer tanı yöntemleri ile birlikte

Cuenca-Estrella M, Bassetti M, Lass-Flörl C et al. Detection and investigation invasive mold disease J Antimicrob Chemother 2011; 66: 15-24.

Moleküler yöntemler

“İn vitro Duyarlılık Testleri”

• İn vitro-in vivo uyum göstermeli

• Sağaltım sonuçlarını öngörebilmeli

• Yeni ilaçların terapötik potansiyellerini saptayabilmeli

• Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği

• yüksek olmalı

• Hızlı sonuç verebilen, kolay uygulanabilir ve ucuz olmalı

İdeal bir duyarlılık testi

CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) Kılavuzları

2009

2008

2004

2003

2002

1997

1995

1992

1982

CLSI-AFDT

Alt komitesi

M44A2, M44S3

M27A3, M27S3

M44A

M44P

M27A2

M27A

M27T

M27P

The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing”

Antifungal Susceptibility Testing

(EUCAST-AFST)

“The European Society of Clinical Microbiology and Infectious

Diseases” (ESCMID)

•EUCAST definitive document EDef 7.1: method for the determination of broth

dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts.2008.

Mayalar için sıvı mikrodilüsyon testi

CLSI M27 A3 EUCAST-E-DEF 7.1

Uygulama alanı Candida ve Cryptococcus Candida

İnokülum 0.5x103-2.5x103 CFU/ml 0.5x105-2.5x105 CFU/ml

İnokülumstandardizasyonu

Spektrofotometrik Hemositometrik

Besiyeri RPMI 1640 RPMI % 2 glukoz

Buffer MOPS, pH 7.0±0.1 MOPS, pH 7.0±0.1

Mikrodilüsyon plağı U tabanlı Düz tabanlı

Değerlendirme Görsel Spektrofotometrik

Isı 350C 350C

İnkübasyon süresi 24-48 saat(C. neoformans72 saat)

24 saat

Sınır değer AmB için üreme olmayan kuyucuk, azoller, ekinokandinler için ~% 50 inhibisyon

AmB için ~% 90 inhibisyon, azoller, ekinokandinler için ~% 50

•Etest (bioMérieux)

•ATB Fungus 3 (bioMérieux)

•Vitek 2 yeast susceptibility test

(bioMérieux)

•Sensititre YeastOne colorimetric plate

(Trek Diagnostic Systems)

Antifungal ilaç S S-DD I R

M27A2

Flukonazol 8 16-32 - 64

İtrakonazol 0,125 0,25-0,5 - 1

M27A3-M27S3

Vorikonazol 1 2 - 4

Kaspofungin 2 - - > 2

Anidulafungin 2 - - > 2

Mikafungin 2 - - > 2

M44A

Flukonazol ≥ 19 15-18 ≤ 14

Vorikonazol ≥ 17 14-16 ≤ 13

Candida direnç sınır değerleri (CLSI)

Flukonazol

(24 h)

İtrakonazol

(48 h)

Vorikonazol

(48 h)

Posakonazol

(48 h)

C. albicans >4 >0.5 >2 >2

C. tropicalis >4 >0.5 >2 >2

C. krusei R >0.5 >2 >2

C. glabrata >32 >0.5 >2 >2

C. parapsilosis >4 >0.5 >2 >2

Kaspofungin

(24 h)

Anidulafungin

(24 h)

Mikafungin

(24 h)

C. albicans >0.5 >0.5 >0.5

C. tropicalis >0.5 >0.5 >0.5

C. krusei >0.5 >0.5 >0.5

C. glabrata >0.5 >0.5 >0.12

C. parapsilosis >4 >4 >4

Türe özgü direnç profilleri

İdentifikasyon çok daha önemli!

Steril bölgelerden soyutlanan Candida spp.

( özellikle non-albicans türler) için

Direnç görülebilme olasılığı olan türler nedeniyle

(örn; C. glabrata - flukonazol)

Standart sağaltıma yanıt vermeyen tablolarda

(örn. Mukozal kandidoz)

Klinik yanıtsızlık durumlarında

Epidemiyolojik amaçlarla

Hangi durumlarda yapılmalı?

YöntemKöken

sayısıAMB FLU İTRA VORİ EKİNO

Kuzucu Ç,

2007 (İnönü Ü)

M27A2 23 0 4 31 - -

Sancak B, 2007

(HÜ)

M27A2 134 (CG) - 0

3 (SDD)

6

73.1 (SDD)

- -

Efe-İris N,

2008 (Ok

Meydanı)

ATB

Fungus 2

37 0 19 19 0 -

Saraçlı MA,2009 (GATA)

M27A2 95 0 2 0

7 (SDD)

0 15 (KF)

Aydın F, 2010

(KTÜ )

M44A

Etest

166 1.8 2.4 - 0 -

Kiraz N, 2011

(OGÜ)

Etest 2068 0.3 5 13.3 - -

Metin DY, 2011

(EÜ)

M27A2 400 3.8 0.5

1.3

13.5

10.5 (SDD)

0 / 0.5

Türkiye - Çalışmalar

Doğanay-Oflazoğlu B, Metin DY

EÜTF, 2008-2010

Kan kültürü kökenleri

C. albicans (96), C. parapsilosis (88), C. tropicalis (18), C.glabrata (18),C. krusei (4),

C. guilliermondii (3), C. keyfr(2), C. lusitaniae (2), C. sake (2), C. famata (1), C. globosa (1),

C. dubliniensis (1)

24 saat 48 saat

S SDD R S SDD R

Candida

türleri

(236)

AMB 236(100) - - 235 (99.6) - 1 (0.4)

FLU 233(98.7) 3 (1.3) - 231 (97.9) 5 (2.1) -

İTRA 197(83.5) 37 (15.7) 2 (0.8) 169 (71.6) 58 (24.6) 9 (3.8)

VORİ 236(100) - - 236 (100) - -

CF 236(100) - - 236 (100) - -

AF 236(100) - - 236 (100) - -

C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. parapsilosis C. krusei

Amfoterisin B

Flukonazol

İtrakonazol

Vorikonazol

Ekinokandinler

Antifungal Duyarlılık Profilleri

• Gelecekte yeni in vitro tanı yöntemleri umut verici değil

– Uygun örnek ?

• Yeni tanı yöntemleri in vivo planlanabilir

– Spesifik mantar belirleyicileri ile etiketlenmiş ürünler (etiketli

antifungal molekül, hücre duvarına karşı antikor veya yalnızca mantara

bağlanan etiketli şeker molekülü) infüzyon yolu ile verildikten sonra

görüntüleme yöntemleri ile infeksiyon bölgesinin saptanması

Sonuç olarak;

Klutts JS, Robinson-Dunn B. A Critical Appraisal of the Role of the Clinical Microbiology

Laboratory in Diagnosis of Invasive Fungal Infections J Clin Microbiol 2011; 49 (Suppl): 39-42.

Moleküler

Tanı

DM

Kültür

Kültür dışı

yöntemler

Laboratuvar-klinik işbirliği

Çok önemli !!!