UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO

Mikroskopija s Försterjevim resonančnim prenosom energije

Seminar v 3. letniku

Avtorica: Anja Horvat Mentor: dr. Zoran Arsov

Ljubljana, 23. 3. 2014

Povzetek V seminarju bomo predstavili mikroskopijo s Försterjevim resonančnim prenosom energije (FRET). Gre za različico fluorescenčne mikroskopije, ki se uporablja za določanje razdalj med dvema molekulama barvil na tipično nanometrski skali. Na začetku bom predstavila pojav fluorescence in njeno uporabo v mikroskopiji. V drugem delu seminarja bo opisan proces Försterjevega resonančnega prenosa energije in štiri različne mikroskopske metode za zaznavanje učinka FRET. Podrobneje bom opisala metodo za določanje FRET na osnovi spektralne analize s fluorescenčno mikrospektroskopijo. Prednosti te metode bom predstavila tudi z opisom eksperimenta, pri katerem smo spremljali interakcijo nanodelcev z lipidno membrano.

1

Kazalo 1UVOD...........................................................................................................................................12FLUORESCENCA........................................................................................................................2

2.1 OSNOVE FLUORESCENCE.....................................................................................................................22.3 FLUORESCENČNI MIKROSKOP............................................................................................................42.4 KONFOKALNA MIKROSKOPIJA...........................................................................................................5

3MIKROSKOPIJASFÖSTERJEVIMRESONANČNIMPRENOSOMENERGIJE(FRET).53.1 FÖSTERJEV RESONANČNI PRENOS ENERGIJE (FRET)................................................................63.2 PRISTOPI K FRET MIKROSKOPIJI...................................................................................................103.2.1Intenzitetaemisijeakceptorja................................................................................................103.2.2Fluorescenčnamikroskopijaživljenjskedobe(FLIM)..................................................103.2.3Bledenjefluorescence..................................................................................................................12

3.3 FLUORESCENČNA MIKROSPEKTROSKOPIJA (FMS).................................................................124RAZISKAVAINTERAKCIJENANODELCEVZDVOSLOJNIMILIPIDNIMI

MEMBRANAMI..............................................................................................................................135ZAKLJUČEK.............................................................................................................................146VIRI...........................................................................................................................................15

1 Uvod Opazovanje stvari, ki so prostemu očesu nevidne, že od nekdaj spodbuja razvoj znanosti in tehnologije. V 17. stoletju izumljen prvi optični mikroskop nam je omogočil videti prej nedoumljive gradnike našega telesa in narave okoli nas. Ena izmed omejitev optičnega mikroskopa je ločljivost d, ki jo definiramo kot razdaljo, pri kateri dva točkasta svetlobna izvora še lahko razločimo, in je odvisna od valovne dolžine svetlobe λ in numerične aperture objektiva NA kot:

2

dNA

, (2.1)

Pri npr. valovni dolžini 550 nm in numerični aperturi 1.5 za oljni imerzijski objektiv, dobimo ločljivost okoli 200 nm. To je na primer dovolj za opazovanje celic, vendar še zdaleč ne zadošča za lokalizacijo procesov na molekulskem nivoju, ki v njih potekajo.

V začetkih 20. stoletja se je začela revolucija v svetu svetobnih mikroskopov. Med letoma 1911 in 1913 sta Otto Heimstaedt in Heinrich Lehmann ustvarila prvi fluorescenčni mikroskop, v zadnjih nekaj desetletjih pa je začela fluorescenčna mikroskopija dobivati svoj pravi pomen. Njen razvoj je v teh letih odprl pot do številnih novih dognanj, predvsem v svetu bioloških znanosti, saj nam omogoča pogled v svet živih celic in opazovanje krajevnih spremenljivk v mikrometrski ločljivosti.

Fluorescenčna mikroskopija se je v teh letih močno razvila in postala osnova za mnoge metode opazovanja fluorescence. Ena izmed njih je tudi mikroskopija FRET, katere osnovo je v 40. letih 20. stoletja postavil Teodor Förster. Pomembnost tega

2

odkritja se je dodobra pokazala šele v zadnjih dvajsetih letih z razvojem različnih tehnik in aplikacijo v bioloških sistemih. Z uporabo primernih fluorescenčnih barvil, naprednih optičnih sistemov, detektorjev in analitičnih orodij omogoča FRET študije interakcij in kolokolizacije molekul z majhno medsebojno razdaljo in je kot taka ena izmed osnovnih tehnik za opazovanje celičnih procesov.

2 Fluorescenca

Snov v vzbujenem stanju lahko v osnovno stanje preide bodisi s katerim izmed nesevalnih procesov bodisi s pojavom luminiscence, torej oddajanjem fotonov. Luminiscenco lahko delimo na dve kategoriji: fluorescenco in fosforescenco, ki ju ločimo po naravi vzbujenega stanja. Pri fluorescenci je vzbujen elektron v stanju s spinom, ki je nasproten smeri spina njegovega para v osnovnem stanju, zato je prehod dovoljen in se zato zgodi nemudoma. Fosforescenca se od fluorescence razlikuje le po tem, da ima elektron v vzbujenem stanju enako smer spina kot njegov par v osnovnem stanju. Prehod je tako zaradi simetrije prepovedan in zato počasnejši (slika 1).

2.1 Osnove fluorescence Prehode med različnimi energijskimi stanji najbolje prikažemo z diagramom Jablonskega (slika 1). Vpadni foton povzroči prehod elektrona iz osnovnega v višje vzbujeno stanje, za kar potrebuje energijo:

f vzb osnE E E h , (2.1) kjer sta je ν frekvenca vpadnega fotona in h Planckova konstanta. Elektron se ob prehodu lahko znajde tudi v vzbujenem nihajnem stanju. To stanje zanj ni energetsko ugodno, zato se vibracijsko relaksira v najnižje nihajno stanje znotraj elektronskega vzbujenega stanja (slika 1), pri čemer razliko energij odda okolici v obliki toplote. Ker elektron pred prehodom nazaj v osnovno stanje vedno preide v vzbujeno stanje z najnižjo energijo, je spekter izsevane svetlobe praviloma neodvisen od valovne dolžine vpadnega eksitacijskega valovanja.

3

Slika 1 Diagram Jablonskega predstavlja pri fluorescenci udeležene energijske prehode med elektronskimi in vibracijskimi stanji. Modri puščici predstavljata ekcitacijo pri absorpciji fotona, oranžne vijugaste neradiacijsko neemisijsko izgubo energije (IC – notranja konverzija; quenching – dušenje), rdeče fluorescenčno emisijo. Slika prikazuje tudi proces fosforescence, in sicer vijolična vijuga prehod elektrona v vzbujeno tripletno stanje in nato zelena črta fosforescenco. Iz časov, označenih na diagramu, je razvidno, da je fosforescenca mnogo daljši proces od fluorescence.

Elektron se iz vzbujenega stanja vrne nazaj v eno izmed vibracijskih osnovnih

stanje z oddajanjem kvanta energije v obliki izsevanega fotona. Praviloma je vrsta prehoda v obeh smereh enaka, zato sta absorpcijski (eksitacijski) in emisijski spekter elektromagnetnega valovanja skoraj zrcalna (slika 2).

Slika 2 Shematski prikaz absorpcijskega in emisijskega spektra ter Stokesovega premika.

Zaradi prej omenjene izgube energije pri vibracijski relaksaciji ob prehodu elektrona

iz višjega v nižje vzbujeno stanje, je valovna dolžina emitiranega fotona daljša od valovne dolžine vzbujalnega fotona. Razliko v spektralnih maksimumih vzbujevalne in emitirane imenujemo Stokesov premik (slika 2), katerega vrednost variira glede na fluorescenčno barvilo.

Elektron lahko iz vzbujenega stanja preide v osnovno stanje tudi brez oddajanja svetlobe, če odvečno energijo molekula izgubi pri trkih z okoliškimi molekulami, kar

imekvan

Kvafluo

2.3 Temsvetspod

Zasvetbarvfluopompotrnjimfluošironačizauspričisti fluomikupoobču

Sli

eksczrcalemiseksc

A

enujemo dušntni izkoris

antni izkorisorescenčnih

Fluoresce

melj večine tlobni mikrdnje strani pa osvetlitevtlobni izvorvil. Širok orescenčnemmagamo z vrebujemo vimi dobimo orescenčnih ok kot pri žiinu ne potstavijo svetčakujemo flu

optični poorescenčni skroskopih poorabo odločutljivostjo.

ika 3 (A) citacijskim filtlom pošljemosijski filter pcitacijskega (m

šenje fluoretek, ki je de

stek je občubarvil in pr

enčni mikr

fluorescenčroskop, saj precej olajš

v uporabljamri, s kateri

spekter sm mikroskovzbujevalniisoko intenzdovolj visobarvil potr

ivosrebrnihtrebujemo, tlobo vzbujuorescenco oti, ločimosignal barvioteka s pomamo med m

Prikaz zgradtrom izberemo proti vzorcu.pa zadrži ne

modra črta) in

escence (anefiniran kot

števištevilo

utljiv na sprrisotnost mo

roskop

čnih mikrosje opazov

ano. mo različnemi lahko osvetlobe teopu omejitim filtrom zivno svetlooko intenzitrebujem ve

h in ksenonsše vedno

jevalnih va(slika 3). V

o z dikroičila (slika 3)močjo digitamodeli z v

dbe fluoresceo del spektra, Dikroično zreželene prispemisijskega f

4

g. quenchin:

lo izsevanihabsorbiran

remembe v olekul, ki na

skopov za cvanje vzorc

e vire. Stareosvetljujemeh virov ti na manj(slika 3). K

obo, so se zateto svetlob

eč različnihskih virih spa ostajajo

alovnih dolžVzbujevalnočnim zrcalo). Detekcijaalnih (CCD)visoko kraje

enčnega mik, ki je primerrcalo prepuščapevke drugihfiltra (zelena č

B

ng) (slika 1)

h fotonovnih fotonov

pH, polariza vzbujeno

celično-biolev v suspe

ejši način smo večino o

svetlobejše spektraKer za uspa dober nadbe, vendar

h laserjev, ssvetlobe. Vzo del mikrožin in prepo in emitiranom, ki pro

a svetlobe n) kamer, kjeevno ločljiv

kroskopa s ren za obsevana emitirano svh valovnih dčrta) ter dvoba

). Pri tem s

.

zacijo topilastanje vpliv

loške raziskenziji oziro

so živosrebnopazovanih moramo z

alno okno, ešno vzbuj

domestek izpa za vzbu

saj njihov zbujevalnihoskopa emiustijo le deno svetlobooti detektorna sodobniher se glede vostjo, hitro

širokospektrano barvilo, inetlobo iz vzordolžin. (B) arvnega zrcala

se zmanjša

(

a, koncentravajo.

kave je obroma raztopi

ni in ksenofluorescen

za uporabopri čeme

anje pravilzkazali laserujanje razlispekter ni

h filtrov pri isijski filtriel spektra,

o, ki potujetrju prepust

h fluorescenna nameravostjo branja

lnim izvoromn ga z dvobarrca proti detekGraf prepust

a (siva črta).

njen

(2.2)

acijo

rnjen ini s

onski nčnih o v

er si loma rji. Z ičnih tako tem

i, ki kjer

ta po ti le

nčnih vano a ali

m: z rvnim ktorju, tnosti

5

2.4 Konfokalna mikroskopija Pri opazovanju fluorescenčnega vzorca nas pogosto ovira prepuščena fluorescenca opazovanega barvila, ki izvira iz ravnin vzorca izven goriščne ravnine. Temu problemu se lahko izognemo z uporabo konfokalne mikroskopije. Konfokalen mikroskop temelji na prehodu svetlobe skozi dve drobni luknjici, ki se nahajata v ustreznih goriščnih ravninah glede na vzorec. Prva luknjica zbere žarke vzbujevalne svetlobe v opazovani goriščni ravnini vzorca, zato je tam jakost vzbujanja mnogo večja kot v okoliških ravninah. Kljub fokusiranemu vzbujanju lahko fluorescenca iz okoliških ravnin močno zamegli sliko, zato je na strani, kamor potuje emitirana svetloba, še en zaslon z luknjico, kamor se zbirajo zgolj žarki iz ravnine, ki nas zanimajo (slika 4). Velikosti luknjic določata globinsko ostrino sistema, pri čemer manjša luknjica pomeni večjo ločljivost, seveda do meje, ki jo določa uklon svetlobe. Hkrati manjša luknjica pomeni manj prepuščene svetlobe, zato je učinkovito zaznavanje preostale fluorescenčne svetlobe še posebej pomembno.

Z opisanim postopkom zajamemo sliko zgolj iz ene same točke vzorca, ki jo določata legi luknjic, zato moramo za zajem celotne slike žarek po vzorcu ustrezno premikati. Sistemi z laserskim osvetljevanjem praviloma uporabljajo način vrstičnega vzorčenja signala (angl. laser scanning confocal microscopy), medtem ko se v kombinaciji s širokospektralnimi izvori navadno uporablja hitro vrteči disk z velikim številom luknjic, razporejenih v spiralo (angl. spinning/Nipkow disk). Pri tem načinu naenkrat zajamemo celotno sliko, saj veliko število luknjic efektivno deluje tako, kot bi signal hkrati vzorčili z velikim številom žarkov.

Slika 4 Z uporabo dveh zaslonov z luknjicami konfokalni mikroskopi uspešno zavirajo svetlobo iz izvengoriščnih ravnin.

3 Mikroskopija s Fösterjevim resonančnim prenosom energije (FRET) Pojav resonančnega prenosa energije, ki ga je prvi opisal Teodor Förster, nam predstavlja veliko priložnost za pridobivanje pomembnih podatkov o razdaljah med molekulami, njihovih orientacijah in njihovi dinamiki s pomočjo konvencionalnih

fluo(oziizmproc

FRbarvakcemaninfoločljomo

3.1 Försenerspekemidonvzbureso

Zaenersvetvibrostabiti ener

Sli

koraprocimen

orescenčnih iroma fluor

med osnovnicesov. RET temeljvila, ki ga ieptor, pri čnjši od priormacijo, dljivost samogoča zelo n

Fösterjev

sterjev resorgije je poktrom akceisijskega spenor prenese ujeno stanj

onančni proa enostavnrgije privzetlobo vzbujracijskih staane v vzbuj

razlika energij osnovn

ika 5 Diagramaki pred samicesa fluorescennujemo življen

mikroskoprescenčnim)ih načinov

ji na neradimenujemo čemer slednibližno 10 a sta mole

mega mikronatančno do

v resonančn

onančni prenotrebno, daeptorja terektra donorjpri prehodu

je. Iz pogoces.

nejšo razlagemimo, da amo. Donoanj, čemur jenem stanjergij osnovnega in eneg

m Jablonskegim prenosom nčne emisije njski čas fluor

pov. V zadn) resonančn

za opazov

diacijskem pdonor, na b

nja ni nujnnm. Sama

ekuli na razoskopa, mooločitev vel

ni prenos

nos energijea se emisijr da sta drja in absorpu iz vzbujenoja, da se

go samega je akcepto

orjev elektrnemudoma

u z najnižjnega in naj

ga izmed vzb

ga prikazuje renergije (ab

ali FRET. Čarescence.

6

njih 10 letinim prenosovanje celic,

prenosu enbližnjo molo fluorescea prisotnoszdalji, man

očna krajevikosti razda

energije (F

e poteka prjski spekterdonor in apcijskega spnega stanjamorata ti

procesa For na začeton preide ia sledi vibo energijo. nižjega vzbbujenih stan

resonančni prsorpcija, vibr

as, ki ga fluor

ih se je miom energije njihovih s

nergije z vzekulo v osn

enčna. Interst FRET snjši od 10vna odvisnalje.

FRET)

reko dipol-dr donorja acceptor zpektra pomea v osnovnoenergiji uje

Försterjevegtku v osnoiz osnovnegracijska relZa resonan

bujenega stnj akceptorj

renos energijeracijska relakescentno barv

ikroskopija e FRET usstruktur in

zbujenega fnovnem stanrakcija potesignala namnm, ne gleost intenzi

dipol interakprekriva zadosti bliz

eni, da lahkoo stanje, vzbemati, vidi

ga resonanovnem stanjga v eno izlaksacija (snčni prenosanja donorja (slika 5).

e. Iz diagramksacija) trajajovilo preživi v

s Försterjestalila kot e

znotrajceli

fluorescenčnnju, imenoveka na razdm torej poede na optitete FRET

kcije. Za prez absorpcijszu. Prekrivo energija, kbudi akceptmo, da gre

nčnega prenju, donor p

zmed vzbujslika 5). Dos energije mja enaka raz

ma je razvidnoo mnogo manvzbujenem st

evim eden ičnih

nega vano dalji, odaja tično T pa

enos skim vanje ki jo tor v e za

nosa pa s enih onor mora zliki

o, da nj od tanju,

7

Če so vsi pogoji izpolnjeni, lahko z dipol-dipol interakcijo dolgega dosega poteče Försterjev prenos energije z donorja (D) na akceptor (A). Molekuli donorja in akceptorja sta šibko sklopljeni, zato lahko napišemo Hamiltonian za FRET v obliki, ki jo lahko rešimo s perturbacijsko teorijo:

00 * * * *D A

H H VH D A H D A A D H A D

(2.3)

Pri tem je HD Hamiltonian sistema z vzbujenim donorjem in HA Hamiltonian sistema z vzbujenim akceptorjem. V enačbi (3.1) označujemo elektronsko in jedrsko konfiguracijo donorske molekule v osnovnem stanju z D, akceptorske molekule v osnovnem stanju z A, donorsko oziroma akceptorsko molekulo v vzbujenem stanju pa z D* oziroma A* v tem zaporedju. Dipol-dipol interakcijo med obema molekulama lahko zapišemo v obliki potenciala:

30

ˆ ˆ1 3( )( )4

A D A Dr rVr

(2.4)

kjer je r razdalja med donorjem in akceptorjem ter r̂ enotski vektor, ki kaže smer med njima. Pri tem predpostavimo, da so dipolni operatorji v enačbi neodvisni od jedrske konfiguracije in delujejo le na elektronska stanja. To predpostavko imenujemo Condonova aproksimacija. Elementa prehodne matrike operatorjev dipolov A in D lahko zapišemo kot:

* *

* *

* *

* *A AA A A

D DD D D

A A A A

D D D D

(2.5)

kjer * * *, ,AA A A DD in *D D predstavljajo diagonalne matrične elemente. Za dipolni operator lahko velikost in smer zapišemo kot A A Au

. Iz tega dobimo prehodni matrični element dipolne interakcije:

30

* * * *4

A DV D A A D A D D Ar

(2.6)

pri čemer smo vse orientacijske faktorje združili v κ:

ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ ˆ3( )( )A D A Du r u r u u (2.7) Iz enačbe (3.5) je razvidno, da je FRET sklopitev neposredno odvisna od kota med dipoloma obeh sodelujočih molekul.

Z uporabo Fermijevega zlatega pravila, zapisanega v obliki korelacijske funkcije interakcije, dobimo stopnjo prenosa energije:

8

22

2

2 ( ( ) (0))

1 ( ) (0)

ETw V t

V t V dt

(2.8)

kjer je ( ( ) (0))t gostota stanj. V enačbo (3.6) vstavimo začetno *D A in

končno stanje sistema *A D :

2

2 2 60

1 1 * ( ) ( ) (0) (0) *(4 )ET D A D A

w dt A D t t D Ar

(2.9)

kjer je orientacijski faktor donorja / /( ) D DiH t iH tD Dt e e

(podobno za akceptor). Če v enačbo (3.7) vstavimo za µA in µD njuni vrednosti iz enačb (3.3), vidimo, da

delujeta zgolj na | ali na | ∗ , saj le v teh primerih dobimo neničelno rešitev. Izraza za stanji donorja in akceptorja lahko zato ločimo:

2

2 2 60

2

* *2 2 20

1 1 * ( ) (0) * ( ) (0)4

1 1 ( ) ( )4

ET D D A A

D D AA

w dt D t D A t Ar

dt C t C tr

(2.10)

kjer sta ∗ ∗ in korelacijski funkciji za donorjevo emisijo in akceptorjevo absorpcijo v tem zaporedju. Korelacijski funkciji lahko z izpeljavo iz Hamiltoniana za premaknjen harmonski oscilator zapišemo kot:

*

*

2 ( ) ( )* * *

2*

( )

( )

DD D D

AA A

i s t g tD D DD

i t g tAA AA

C t e

C t e

(2.11)

kjer *AA predstavlja akceptorjevo absorpcijsko frekvenco, * *D D DD Ds pa emisijsko frekvenco donorja, ki smo jo izrazili z njegovima absorpcijsko frekvenco

*DD in Stokesovim premikom sD. Oznaki ( )Dg t in ( )Ag t predstavljata razliki energij ustreznih vzbujenega in osnovnega stanja donorja oziroma akceptorja. Dani funkciji lahko inverzno Fourierjevo transformiramo:

* *1

21

2

i t DD D emis

i t AAA abs

C t e d

C t e d

(2.12)

Pri tem sta Demis emisijski spekter donorja in

Aabs absorpcijski spekter akceptorja.

Parsivalov teorem, ki pravi, da je integral para dveh funkcij po času enak integralu

9

njunih Fourierjevih transformirank po frekvenci, nam omogoča, da izrazimo stopnjo prenosa energije s prekrivnim integralom med spektroma emisije in absorpcije:

2

2 2* *2 2 62

0

1 1 ( )8

A DET DD AA abs emisw dr

(2.13)

kjer je 2 spektralna krivulja, normalizirana s kvadratom elementa prehodne matrike. Prekrivni integral je mera za resonanco pri prenosu energije med donorjem in akceptorjem. V primeru, da je prekrivni integral ničeln, do prenosa energije ne pride, kot je razvidno iz enačbe (3.11). Fluorescenčni barvili sta takrat nepovezani. Iz enačbe (3.11) je razvidno, da je stopnja prenosa energije obratno sorazmerna z r6.

Pri izpeljavi enačbe (3.11) smo zanemarili zelo pomemben vpliv časa, ki ga donor preživi v vzbujenem stanju, na hitrost prenosa energije. Za izračun te hitrosti vpeljemo konstanti τD, ki označuje življenjski čas donorjeve fluorescence, ter Försterjev radij R0, ki označuje kritično razdaljo, pri kateri izkoristek prenosa energije od donorja na akceptorja postane 50%. Försterjev radij opisuje enačba:

4 2

60 4 40

9 ( ) ( )8 ( )

Demis A

cR d

n

(2.14)

kjer so c hitrost svetlobe v vakuumu, n lomni količnik topila, Demis emisijski spekter donorja in molarni absorpcijski koeficient akceptorja, ki nam pove, kako dober absorber je akceptor pri določeni frekvenci. Z vpeljavo teh konstant dobimo enačbo za hitrost resonančnega prenosa energije:

6

01ET

D

Rvr

(2.15)

Izkoristek prenosa energije po Försterju, imenovan tudi FRET izkoristek EFRET,

običajno definiramo kot relativno spremembo donorjeve fluorescenčne emisije:

6

0

1

1FRETE

rR

(2.16)

Iz enačbe (3.14) lahko enostavno izrazimo razdaljo, ki je potrebna za željen EFRET:

1

6

01 1

FRET

r RE

(2.17)

Razdalje, pri katerih spremembe lahko detektiramo z zadostno občutljivostjo, so

nekje med 3-8 nm, kar ustreza FRET izkoristkom 5%-95%.

10

3.2 Pristopi k FRET mikroskopiji

3.2.1 Intenziteta emisije akceptorja Spremljanje spreminjanja intenzitete emisije akceptorja v odvisnosti od razdalje je verjetno najenostavnejša metoda za merjenje FRET. Problem, ki se pojavi pri tej metodi, je prekrivanje emisijskih spektrov obeh fluorescenčnih barvil (slika 6), zato je potrebno več kontrolnih meritev. Poleg meritve FRET izmerimo tako še emisijska spektra (i) donorja v odsotnosti akceptorja in (ii) akceptorja v odsotnosti donorja. Ti dve meritvi nam omogočata, da lahko določimo, kolikšen delež emisije v danem delu spektra FRET pripada donorju in kolikšen delež akceptorju.

Velik napredek v tej smeri predstavlja FRET s spektralnim slikanjem. Pri tej metodi

namesto merjenja intenzitet akceptorja in donorja zgolj v okolici max merimo celotna emisijska spektra donorja in akceptorja po ekcitaciji. Merjenje celotnega spektra nam omogoča lažje določanje spektralnih prekrivanj (slika 10) in s tem natančnejše opazovanje učinkovitosti FRET. Spektralna analiza je mogoča s sklapljanjem mikroskopije in spektroskopije, eden izmed možnih načinov te tehnike pa je opisan tudi v nadaljevanju seminarja.

3.2.2 Fluorescenčna mikroskopija življenjske dobe (FLIM)

Fluorescenčna mikroskopija življenjske dobe metoda, kjer življenjsko dobo fluorescence, torej karakteristični čas, ki ga elektron preživi v vzbujenem stanju preden se relaksira nazaj v osnovnega. Ta spremenljivka je neodvisna od intenzitete vzbujevalne svetlobe, transmisijskega izkoristka mikroskopa in zmernega bledenja fluorescence, kljub temu pa je občutljiva na spremembe v pH, polarnosti, temperaturi itd., kar nam pomaga pri določanju različnih okolij v vzorcu oziroma živi celici.

Slika 6 (levo) Graf prikazuje prekrivanje vzbujevalnih spektrov donorja in akceptorja. (desno)Graf prikazuje emisijska spektra donorja in akceptorja ter njuno prekrivanje (angl. crosstalk).

Slikapulznaravvzorfazn

Pr

enerpribnamfluofluosistebiomkonizra

kjerodso

Slikaakce

a 7 Meritve Fom svetlobe fvnost iz meri

rec pošiljamo ega zamika, b

ri FLIM-FRrgijskega pr

bliževanjemmreč donororescenčno orescence sema, prostmolekulami

nvencionalniačunamo kot

r sta τDA inotnosti akce

a 8 Graf prikaeptorjem, pri č

FLIM potekajofluorescenčnoitev emitiranesinusni signal

bodisi iz zmanj

RET pride renosa, saj

m akceptorjarska molek

emisijo tustatistično ztorsko porai in konfimi metodt:

n τA življeeptorja.

azuje odvisnosčemer polna čr

o na dva načio barvilo vzbu svetlobe (rdel svetlobe (zel

njšanja amplitu

do izrazase čas, ki ga (slika 8)

kula iz vzbudi z oddzmanjša (slazdelitev bformacijske

dami FRET

E

enjska časa

st življenjske rta velja za do

11

ina. Graf levoudi (zelena), neča). Graf na lena), življenjude emitirane

a odvisnostga elektron ). Kadar prbujenega sdajanjem elika 5). S biomolekulae sprememT. Energijs

1 DFRETE

donorjeve

dobe donorjeonor v odsotno

o prikazuje čanato življenjskdesni prikazusko dobo fluosvetlobe (rde

t življenjskpreživi v vride do enstanja v oenergije, zto metodo

arnih koncmbe z večski izkorist

DA

D

fluorescen

eve fluorescenosti akceptorja

sovno meritevko dobo fluoruje frekvenčnorescence pa dča).

ke dobe flvzbujenem snergijskega osnovnega ato se živ

lahko mecentracij, inčjo natančtek FRET

nce v priso

nce od razdaljea.

v, pri kateremrescence dolo

no meritev, kjdoločamo bod

luorescencestanju, manj

prenosa lapride polevljenjska drimo dinamnterakcije čnostjo ko

(EFRET) la

(2

otnosti ozir

e med donorje

m se s očimo er na

disi iz

e od jša s ahko eg s doba miko med

ot s ahko

2.18)

roma

em in

12

3.2.3 Bledenje fluorescence Bledenje signala fluorescence je pojav, pri katerem se zaradi obsevanja s svetlobo pri molekuli trajno zmanjša ali onemogoči proces vzbujanja in relaksacije z emisijo svetlobe. Fluorescenčna barvila so na ta pojav občutljiva v svojem vzbujenem stanju, zato kažejo tista z daljšo življenjsko dobo višje stopnje bledenja.

Resonančni prenos energije direktno zmanjšuje življenjsko dobo fluorescence, bledenje fluorescence pa je obratno sorazmerno s življenjskim časom fluorescence, zato lahko izračunamo FRET iz primerjave stopenj bledenja donorja v prisotnosti in odsotnosti akceptorja (akceptor popolnoma zbledimo).

V tipičnem eksperimentu z uporabo bledenja fluorescence v omejenem prostoru izmerimo intenziteto fluorescence donorskega fluorescenčnega barvila pred (IDA) in po bledenju (ID) akceptorja. Razlika med tema dvema meritvama nam omogoča direkten izračun izkoristka FRET:

1 DA D DAFRETD D

I I IEI I

(2.19)

Če FRET poteče, se donorjeva intenziteta na območju bledenja poveča.

3.3 Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) Metoda za merjenje učinkovitosti FRET, s katero sem se tekom pisanja seminarja spoznala tudi sama, je fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS). FMS združuje dve pomembni tehniki – fluorescenčno mikroskopijo in spektroskopijo. Klasična fluorescenčna mikroskopija praviloma meri zgolj intenziteto same svetlobe, kjer absolutne vrednosti niso točno določene, zdužena s spektroskopijo pa nam omogoča natančno določitev lege spektralnih vrhov ter posledično krajevno in časovno spremljanje molekularnih procesov v celicah in modelnih sistemih.

Mikroskop, uporabljen na v naslednjem poglavju opisanih meritvah, temelji na klasičnem konfokalnem fluorescenčnem mikroskopu s ksenonskim izvorom kot virom širokega spektra svetlobe. Glavna razlika med mikrospektroskopom in klasičnim mikroskopom je nastavljivi tekočekristalni filter (LCTF), ki nam omogoča zaporedno zajemanje slik pri različnih valovnih dolžinah. Z naključnim vzorčenjem valovnih dolžin zmanjšamo bledenje fluorescence. Uspešno obvladovanje bledenja nam omogoča tudi krajevno ločljivo spremljanje pojemanja signala, ki nam razkriva fizikalno-kemijske lastnosti okolice fluorescenčnih barvil, s čimer uporabnost FMS še razširimo. Standarden čas zajema optične rezine na takem fluorescenčnem mikrospektroskopu je reda velikosti nekaj deset sekund. Pridobljene slike iz meritve lahko še dodatno računalniško kontrastiramo tako, da bolje razločimo spektralne razlike med različnimi deli slike. Vsako točko slike npr. barvno kodiramo tako, da barvni odtenek odraža vrednost spremenljivke, npr. valovno dolžino maksimuma emisijskega spektra ali intenziteto spektra, v tisti točki.

4 Rme

V skdr. sodefluo

Nfarmnanlahkvesijih demiNanabsodon

MkapdelcGUVsvet

Slikafluorpom

Pospekposatemoznoznposnmemnepozn

Raziskavembrana

klopu priprMajo Garv

elovala prorescenčnemanotehnolog

maciji se naodelci priblko ta del ceiklov (GUVdodali memisijo pri 55nodelci TiOorbira svetl

nor. OmenjeMočno razred

ljico nanodcev liposomV. Vsakih tlobo na inte

a 9 Prikaz zrescence mem

močjo razstavlj

o zajemu sliktralnih kaameznih ko

m ena kompačevalca (sačevalca nanamemo smbranskih otrebni, saačevalce sli

Visoka intenziteta

Nizka intenziteta

va interaami

ave na semvas na Od

ri eni izmm mikrospekgija dandananodelci začližajo celicielice aprok

V). GUV za mbranski flu50 nm. Ti O2NT so olobo pri 448eni fluorescedčene GUV

delcev. Z mimov v notran

pet minut ervalu med

zajema emisimbranskih oznanja kompone

ik računalniarakteristik omponent vponenta ustlika 10C, ma nanodelcisliko GUVoznačevalc

aj nanodelciko popravim

a

a

akcije n

inar o mikrdseku za trmed njenihktroskopu.nes nastopačenjajo upo, je njihov p

ksimiramo zpotrebe op

uorescenčni membrans

označeni s 8 nm, emitienčni barvil

V kanemo nikroskopomnjosti, nato p

zajamemo 510 nm in

ijskega spektnačevalcev (Bent posamezni

iško obdelaopazovani

v odvisnostitreza emisijmodra črta),ih (slika 10

V brez prcev. Eksperci ne bledmo za nada

13

nanodelce

roskopiji s Frdno snov

h raziskav,

a na praktiorabljati kotprvi stik z nz lipidnimi

pisane raziskoznačevale

ski označevfluorescenč

ira pa pri pli tvorita FRna en rob opm poiščemo

previdno zlsliko vzor

580 nm z 2

tra fluorescenB). Ločena spih označevalc

amo spekterih fluoresci od časa zjskemu spe, druga pa C, rdeča čr

risotnosti nrimenti za

dijo. S pridaljnjo obdela

ev z dvo

FörsterjevimInstituta “

ki jo o

ično vseh pt nosilci zd

njo na celičnmembrana

kave so pripec Bodipy zvalci deluječnim barvi

približno 52RET par. pazovalnegaprimeren Gijemo nano

rca, pri čem-nm korako

nčnih označeektra fluorescev (slika 10).

r v vsaki točcenčnih baza vsako točektru membemisijskemrta). S kontnanodelcev,

določanje dobljeno reavo.

oslojnim

m prenosom“Jožef Stefopravlja na

področjih rdravilnih učni membran

ami velikanpravljeni iz z absorpcijoejo kot akcilom Alexa20 nm in je

a stekelca, nGUV z malo

delce v obmmer spremljom (slika 9)

evalcev na ncenčnih označ

čki opazovaarvil dobimčko zajemabranskega f

mu spektru ftrolnimi eks, izmerimo

bledenja eferenco z

mi lipidni

m energije sefan” na kra tamkajšn

raziskovanjačinkovin. Kni. V raziskaskih enoslolipidov, ki

o pri 528 nmceptorji FRa 448 SDP

v tem prim

na drugi robo slojev ter močje izbranjamo emitir.

nanodelcih (Ačevalcev dobi

anja. Na podmo spremea (slika 10)fluorescenčnfluorescenčnsperimenti, o še blednanodelceva membran

(A)

(B)

imi

em z ratko njem

a. V Ko se

avah ojnih smo m in

RET. P, ki meru

b pa brez nega rano

A) in imo s

dlagi embe . Pri nega nega kjer

denje v so nske

14

Meritev pokaže, da se pričakovano v okolici membrane ob povečanju koncentracije

nanodelcev v bližini GUV poveča intenziteta njihove emisije (slika 9A), hkrati pa se poveča emisija membranskih označevalcev (slika 9B). Ker so membranski označevalci dobro določeni in se iz drugih razlogov njihova emisija ne more povečati, smo s tem dobili dokaz, da so v njihovi bližini (manj kot 10 nm) nanodelci. S prenosom energije preko FRET iz barvila na nanodelcih na barvilo na membrani torej razložimo povečano emisijo membranskih označevalcev.

5 Zaključek Mikroskopija s Försterjevim prenosom energije omogoča določanje razdalj med molekulami daleč pod limito optičnega mikroskopa. Skupaj z ostalimi procesi (optična pinceta, spektroskopija …) nam nudi vpogled v procese, ki so se nedolgo nazaj zdeli še povsem nedostopni. V zadnjih desetletjih je mikroskopija FRET postala ena izmed osnovnih tehnik za raziskovanje bioloških procesov in nanodelcev, še vedno hiter razvoj tehnologije pa obljublja veliko novih odkritij s pomočjo FRET tudi v prihodnosti.

Slika 10 Grafa (A) prikazujeta ločena spektra donorja (levo) in akceptorja (desno). (B) Prikaz meritveFRET. (C) Prikaz ločevanja komponent meritve FRET. Modra črta prikazuje emisijski spekterdonorja, rdeča črta pa komponento emisijskega spektra akceptorja. Donor in akceptor v grafih služitaza razlago uporabljenega pristopa k meritvi FRET in nista fluorescenčni barvili, uporabljeni v meritvi.

15

6 Viri

[1] Ishikawa-Ankerhold, H., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C., Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules, 17: 4047-4132, 2012. [2] Urbančič, I. 2013. Odziv biomembranskih domen na zunanje dražljaje. Doktorska disertacija. Maribor, Fakulteta za naravoslovje in matematiko: 21-38. [3] Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET Imaging. Nature Biotechnology, 21(11): 1387-1395, November 2003. [4] Sun, Y. et al. Förster Resonance Energy Transfer Microscopy and Spectroscopy for localizing Protein-Protein interactions in Living Cells. Cytometry A, 83(9):780-93, September 2013. [5] Smyth, C. A., Rakovich, Y. P., McCabe, E. M. Surface Plasmon Enhanced Imaging. Research. Photonics Group. Trinity College Dublin. http://physics.tcd.ie (Citirano 8. 3. 2014) [6] Kremers, G.-J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Fundamental Principles of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy with Fluorescent Proteins. Mycroscopy U, www.microscopyu.com (Citirano 8. 3. 2014). [7] Herman, B. et al. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Mycroscopy. Olympus America Mycroscopy Research Center, http://www.olympusmicro.com (Citirano 8. 3. 2014) [8] Tokmakoff, A. Introductory Quantum Mechanics II. Spring 2009. (Massachusetts Institute of Technology: MIT OpenCourseWare), http://ocw.mit.edu (Citirano 9. 3. 2014). Licenca: Creative Commons BY-NC-SA [9] Pietraszewska-Bogiel, A., Gadella, T. W. J. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology. Journal of Mycroscopy, 241(2):111-118, 2010. [10] Padilla-Parra, S., Tramier, M. FRET microscopy in the living cell: Different approaches, strengths and weaknesses. Bioessays Journal, 34: 369-376, 2012 [11] Garsha, K. Spectral Methods for Biological Analysis. Photonics, http://www.photonics.com (Citirano 8. 3. 2014) [12] Garvas, M. Neobjavljeno.