MikroskopijaSteklena krogla napolnjena z vodo - prva povečevalna naprava -Plinij prvo stoletjeAntonij van Leeuwenhoek (1632 – 1723)izdelal leče v velikosti bucikine glave (eritrocite, bakterije)

Zaharias Jansen - izumitelj mikroskopaizdelal mikroskop z bikonveksno in bikonkavno lečoRobert Hook prvič opisal mikroskop v svoji knjigi Micrographia (1665 leta) – uporabil plan-konveksni leči za objektiv in okular

Svetlobni mikroskopPrincip delovanjaPomembna kakovost leč

Ločljivost mikroskopa (D)(ločevanje dveh točk)je odvisna od valovna dolžina svetlobe (λ ) in numerične aperture (NA)

D=0,61 λ / NA

NA=produkt lomnega količnika medija med objektom in objektivom ter sinusa polovice kotne odprtine (α)

NA= n x sin α- lomni količnik vzorca in zraka (n) apertura objektiva (α)

Zaradi tehničnih omejitev je ločljivost 0,2 µm

Izboljšava ločljivostiKotna odprtina, konkavno zrcalo, imerzijsko olje

Sestavni deli svetlobnega mikroskopaMehanski deli: stativ, nosilec zrcala, nosilec kondenzorja, mizica, revolver, nosilec tubusa, vijakiVir svetlobe:

- močna žarnica, - kompaktna žarilna nitka

Objektivi:- ahromatični, apohromatični- različne povečave (10x,20x,40x,100x)

Povečave okularjev (10x,15x)Kondenzorji:

- enakomerna in intenzivna osvetlitev- aperturna zaslonka

Priprava vzorca

Barvanja mikrobioloških preparatov

Barvanje po Gramu – ločevanje osnovnih dveh skupin bakterijNegativno barvanje (različna barvila: indijsko črno, kristal violetno, metilensko modro)Barvanje različnih struktur celice: endospor, kapsule, bičkov, vključkov, nukleotida – specifična barvila

Barvanje različnih skupin bakterij: npr. spirohet, rikecij, legionel, mikoplazm

Acidorezistentno barvanje

Temno vidno poljePoseben postopek osvetljevanja. Svetlobi, ki gre skozi objektiv,preprečimo direkten dostop do okularja s kondenzorjem. Predmete opazujemo v odklonjeni svetlobi na temnem polju. Ker direkten žarek iz kondenzorja ne pride v objektiv je vidno polje temno, na objektu pa se žarki razpršijo, odbijejo in je svetleč.Posebni kondenzorji za osvetljevanje objektov s strani (velik kot vpada svetlobe) in močen vir svetlobe.Primerno za opazovanje prozornih predmetov, svetleči delci so mnogo bolj vidni in zato lahko opazujemo zelo majhne objekte.

Fazno kontrastno mikroskopijaFazna ploščica za objektivom zavre ali pospeši žarke - ustvari fazno razliko direktnih in uklonskih žarkov.Po interference direktnih in uklonskih žarkov se amplitudi seštejeta v ravnini realne slike. Direktni žarek, se na objektu pospeši, po interferenci je amplituda manjša in objekt je na sliki temnejši. Zaradi različne optične gostote preparataje lahko objekt temen, ozadje svetlejše indobimo jasno kontrastno sliko.

objektiv

Primerjava slike

presevna svetloba fazni kontrast temno polje

Fluorescenčna mikroskopijaFluorescencaAvtofluorescenca

(pigmenti avtotrofov,npr.klorofil,…) Fluorokromi

(različni, odvisno kaj sledimo)Objekt osvetljujemo

s kratkovalovno UV svetlobo ali modro svetlobo,..Zelo uporabna metoda

(ekologija, medicina…)

Priprava preparata

filtracija

barvanje

štetje

Koncentracija vzorca na filtru

Vrste filtrov:

različnih materialov (stekleni, celulozni, polikarbonatni,…)

Različne velikosti por odvisno od vrste materiala

(od 10 µm do 0,02 µm)

Različne dimenzije odvisno od uporabe(volumna tekočine)

Filtracija

Barvila:DAPIAOSYBRPrimulin

Fluorescentna in situ hibridizacijaFiksacija celic

Povečanje permeabilnosticelične stene

Spiranje & barvanje

Pregled pod mikroskopom

Dodatek specifičnih sond

Transmisijska elektronska mikroskopija TEM

Osnovni principi so enaki kot pri svetlobni mikroskopiji, le da s snopom elektronov raziskujemo objekt.Uporabljamo snop elektronov in elektromagnetne leče (kondenzor, objektiv in projektiv namesto okularja).Elektronska puška (katoda z napetostjopospeši elektrone proti anodi). S projektivom projiciramo sliko objekta na zaslon, ki zažari na mestih, ki jih bombardirajo elektroni.Ločljivost je 0,1 nm, pov. do 106x Delamo v vakuumu Potrebna je posebna priprava vzorca.

Priprava vzorca za TEM

Ultramikroton: Fiksacija vzorca (glutaraldehid, Osmijev tetraoksid)Sušenje (etanol, aceton)Utrjevanje vzorca (polimerizacija plastike)Rezanje (ultratanke rezine)Nalaganje na mrežice

Freez-fracture:Hitro zamrzovanje vzorca (tekoči dušik)Rezanje, lomljenje z nožemNaparevanje s težkimi kovinami

Primeren za opazovanje celičnih struktur, virusov…

Vrstična elektronska mikroskopija SEM

Priprava preparata podobna kot pri TEM.S pomočjo ozkega snopa elektronov osvetljujemo površine objektov, ki je prevlečena s kovino. Primarni elektroni povzroče emisijo sekundarnih elektronov, ki jih zbere kolektor. Na kolektorju je fotopomnoževalka, ta ojača dobljeni tok, ki napaja katodno cev (televizijska katodna cev).Dobimo sliko površine preparata. Slika je 2D, vendar zaradi senckot 3D (elektroni se odbijajo pod različnim kotom).Velika globinska ostrina –globinska predstava o površini objekta.Povečave od 15 x do 106x Delamo v vakuumu

Konfokalna laserska mikroskopija SCLM

Opazujemo žive materiale v kombinaciji laserske svetlobe in fluorescentne ali svetlobne mikroskopije preko računalnika.Žarek usmerimo na različno globino, preparat režemo v plasteh z laserjem; posnetke z različnih globin spravimo in naknadno obdelujemo kot tridimenzionalno sliko.Večja resolucijaUporabna metoda v mikrobni ekologijiOpazujemo filogenetsko različne populacije v habitatu(površine biofilmov,mucusnih agregatov,globino določenega proteina,…

Druge oblike mikroskopiranjaAMF - Mikroskopija na atomsko silo

Z laserskim tipalom pregledujemo površino v treh dimenzijah

opazujemo žive preparate, ni potrebna priprava preparatazelo velika ločljivost ( 0,1 do 0,01 Å)

3D opazovanje celičnih struktur, opazovanje na nivoju molekul (npr. LPS struktura c. membrane)

Merjenje dimenzij z mikroskopom

Milimetersko merilce

Velikost vidnega polja

Določanje števila mikroorganizmov z mikroskopom

Število objektov preštejemo v vidnem polju (najmanj 30 polj – izračunamo pov. število/vzorec, st.dev.) (n)

določimo velikost površine na katero nanesemo vzorec (P)določimo velikost vidnega polja (P1), volumen vzorca (V)

Število/ml = P x n/ P1 x V