ministÉrio da educaÇÃo universidade federal de … · após a descongelação o sêmen foi...
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO EXTRATO AQUOSO DO FRUTO DO
NONI EM DILUENTE PARA CONGELAÇÃO DE SÊMEN OVINO
ANNA LAUREN COSTA NASCIMENTO
SÃO CRISTÓVÃO – SE
2015
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ANNA LAUREN COSTA NASCIMENTO
POTENCIAL ANTIOXIDANTE DO EXTRATO AQUOSO DO FRUTO DO
NONI EM DILUENTE PARA CONGELAÇÃO DE SÊMEN OVINO
Exame de Defesa apresentada a
Universidade Federal de
Sergipe como parte das
exigências para obtenção do
título de Mestre em Zootecnia.
Orientador : Prof. Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos
Co-orientador : Prof. Dr. Hymerson Costa Azevedo
SÃO CRISTÓVÃO – SE
2015
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
N244p
Nascimento, Anna Lauren Costa Potencial antioxidante do extrato do fruto do noni em diluente para congelação de sêmen ovino / Anna Lauren Costa Nascimento ; orientador Anselmo Domingos Ferreira Santos. – São Cristóvão, 2015.
51 f. : il.
Dissertação (mestrado em Zootecnia) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Zootecnia. 2. Ovino – Reprodução. 3. Sêmen. 4. Noni (Planta). I. Santos, Anselmo Domingos Ferreira, orient. II. Título.
CDU 636.32/.38.082
DEDICATÓRIA
A minha família por não medir esforços, pelo incentivo e amor.
“...heróis são pessoas que fizeram o que era necessário fazer, enfrentando as
consequências.”
William Shakespeare
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por estar sempre presente em minha vida.
A minha família por terem cuidado de mim, por ter me proporcionado educação e pela
torcida incessante pelo meu sucesso.
Ao meu orientador professor Anselmo pela orientação acadêmica e pelos conselhos
como amigo.
Ao meu co-orientador professor Hymerson pela disponibilidade e preocupação.
Aos amigos de caminhada Rebeca Silva e Ana Carla Andrade que estiveram sempre ao
meu lado, me apoiando e incentivando.
Ao meu namorado Vinícius Dias que esteve presente ao meu lado desde o processo de
seleção até a defesa me incentivando.
A Gabryelle Pinheiro, Juliana, Washington e Yanca que me ajudaram no momento em
que me encontrava sozinha para realizações de análises e acabaram se tornando grandes
colegas e amigos.
A Clésio pela disponibilidade em ajudar nas análises.
A Cleydson e equipe do Laboratório de Biotecnologia da Reprodução Animal da
EMBRAPA.
Ao pessoal do biotério Sr. Aloízio e Sr. Milton pela disponibilidade em colaborar com o
experimento.
A Universidade Federal de Sergipe e ao Programa de Pós Graduação em Zootecnia pela
oferta e oportunidade do curso.
A EMBRAPA Tabuleiros costeiros pela concessão de laboratórios.
A Capes / Fapitec pela concessão da bolsa e o incentivo aos estudos
A todos que de alguma forma contribuíram para obtenção deste Título.
Muito obrigada a todos!!!
SUMÁRIO
RESUMO .............................................................................................................................................. i
ABSTRACT ......................................................................................................................................... ii
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 9
2. REFERENCIAL TEÓRICO ...................................................................................................... 11
2.1. Meio diluidor ............................................................................................................................... 11
2.2. Congelação de sêmen .................................................................................................................. 13
2.3. Espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS) ............................................................... 14
2.4. Noni (Morinda citrifolia) ............................................................................................................. 15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 18
ARTIGO 1 .......................................................................................................................................... 23
RESUMO ........................................................................................................................................... 23
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 24
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 25
MATERIAL E METÓDOS ............................................................................................................... 26
RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................................... 28
CONCLUSÃO ................................................................................................................................... 32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 33
ARTIGO 2 .......................................................................................................................................... 35
RESUMO ........................................................................................................................................... 35
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 36
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 37
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................... 38
RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................................... 41
CONCLUSÃO ................................................................................................................................... 48
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................... 49
i
RESUMO
NASCIMENTO, A. L. C. Potencial antioxidante do extrato aquoso do fruto do noni em
diluente para congelação de sêmen ovino Sergipe: UFS, 2014 32p. (Dissertação – Mestrado
em Zootecnia).
Sabe-se que as substâncias antioxidantes quando adicionadas aos meios diluidores
podem contribuir para a preservação da integridade de células espermáticas. Como o noni é
considerado um fruto com potencial antioxidante, objetivou-se avaliar a viabilidade de sêmen
ovino submetido a diluição em meio contendo diferentes quantidades de extrato aquoso de
noni (Morinda citrifolia L). Inicialmente o noni foi colhido e em seguida elaborou-se o
extrato aquoso a ser adicionado ao meio diluidor. O fruto foi avaliado quanto as suas
características físico-químicas apresentando como resultados ph=4,12; Acidez titulável =
8,78%; Sólidos solúveis = 8,18°Brix e teor de Vitamina C = 309,43 mg.100-1
. O extrato
aquoso produzido foi avaliado quanto a quantificação de compostos fenólicos totais, atividade
antioxidante e capacidade de inibição da peroxidação lipídica, apresentando quantidades de
fenóis totais de 47,96 ± 1,95 mg Eq. Ácido Gálico.100g-1
do extrato. Na concentração de 3,0
μg.mL-1
no tempo de 30 minutos apresentou uma atividade antioxidante de 89,35 ± 2,32 %,
sendo observado que apenas 1,2± 0,15 µg/mL da amostra é suficiente para reduzir o radical
2,2-difenil-1- picril-hidrazila (DPPH) em 50%. Também apresentou uma excelente
capacidade redox em inibir a lipoperoxidação na concentração de 10 µg.mL-1
, sendo
semelhante ao controle positivo sintético Trolox (p<0,05) O extrato nas concentrações de 72
e 120µg.mL-1
foi capaz de inibir a lipoperoxidação no meio diluídor em 21,75% e 51,32%. Os
tratamentos para congelação de sêmen ovino diferiram quanto a utilização de meio diluidor
contendo diferentes concentrações do extrato: T1- controle, sem adição; T2- 24 µg/mL; T3-72
µg/mL; T4 - 120 µg/mL. Um total de 16 ejaculados foram coletados, diluídos de acordo com
os tratamentos e congelados. Após a descongelação o sêmen foi submetido ao teste de
termorresistência (TTR) e avaliado quanto a motilidade subjetiva, vigor espermático, teste de
integridade de membrana plasmática pelo teste hiposmótico, teste supravital, e pela
combinação de fluorocromos SYBR Green e iodeto de propídio (IP), e o status de capacitação
espermática e reação acrossomal pela clortetracliclina (CTC). O resultado encontrado para o
TTR mostrou o T2 com melhor motilidade 22,6 ± 9,7; que os demais tratamentos com adição
de extrato, enquanto que os tratamentos T1e T2 apresentaram melhor vigor que o T4; no teste
hiposmótico o T3 mostrou-se superior ao T2 após duas horas de incubação; o T4 mostrou
melhor preservação da membrana plasmática e quanto a capacitação espermática os
tratamentos diferiram P<0,05 apenas para espermatozoides capacitados com acrossomo
reagido. Também foi realizada a análise de cinética através de sistema computadorizado no
momento da descongelação e os percentuais para motilidade progressiva nos tratamentos T1,
T2, T3 e T4 foram 26,9±9,7; 20,1±12,6; 20,7±10,8 e 15,5±9,2 respectivamente, para os
parâmetros velocidade curvilinear (VCL) e velocidade do percurso médio (VAP) os
tratamentos T1 e T2 mostraram-se superior ao T3 e T4, e para amplitude de deslocamento
lateral da cabeça (ALH) o T4 apresentou inferioridade aos outros tratamentos testados. Não se
observou diferença para velocidade em linha reta (VSL), retilinearidade (STR) e linearidade
(LIN). Os tratamentos com adição de extrato aquoso de noni apresentaram maior viabilidade
que o tratamento controle.
Palavras-chave: espermatozoides, meio diluidor, lipoperoxidação, antioxidante
ii
ABSTRACT
NASCIMENTO, A. L. C. Antioxidant activity of aqueous extract of noni fruit in thinner
to ram semen freezing Sergipe: UFS, 2014 32p. (Master - Master in Animal Science).
It is known that antioxidants when added to extenders can contribute to preserving the
integrity of sperm cells. How noni is considered a fruit with antioxidant potential, aimed to
evaluate the feasibility of ram semen subjected to dilution in medium containing different
amounts of aqueous extract of noni (Morinda citrifolia L). Initially noni cropped and then
elaborated the aqueous extract to be added to the medium thinner. The fruit was evaluated for
its physical and chemical characteristics as presenting results ph = 4.12; Titratable acidity =
8.78%; Soluble solids = 8.18 ° Brix and Vitamin C = 309.43 mg.100-1 content. The aqueous
extract produced was evaluated for quantification of total phenolic compounds, antioxidant
activity and ability to inhibit lipid peroxidation, with amounts of total phenols of 47.96 ± 1.95
mg Eq. Gálico.100g acid-1 extract. Concentration of 3.0 μg.mL-1 time 30 minutes had
antioxidant activity 89.35 ± 2.32% It was observed that only 1.2 ± 0.15 ug / ml of sample is
sufficient to reduce the DPPH by 50%. It also exhibited excellent redox ability to inhibit lipid
peroxidation in a concentration of 10 μg.mL-1, similar to the synthetic Trolox positive control
(p <0.05) at 72 The Extract concentrations and 120μg.mL-1 was able to inhibit lipid
peroxidation in the thinner half in 21.75% and 51.32%. Treatments for ram semen freezing
differ in the use of thinner medium containing different concentrations of the extract: T1-
control without addition; T2 24 mg / mL; T3-72 / mL; T4 - 120 mg / mL. A total of 16
ejaculates were collected, diluted according to the treatments and frozen. After thawing the
semen was subjected to heat resistance test (TTR) and evaluated for the subjective motility,
sperm vigor, health test hypoosmotic swelling test plasma membrane, supravital test, and the
combination of SYBR Green and fluorochrome propidium iodide (PI ), and the status of
sperm capacitation and acrosome reaction by clortetracliclina (CTC). The results found for
TTR showed T2 with better motility 22.6 ± 9.7; than the other treatments with the addition of
extract, while the T1 and T2 treatments showed better effect than T4; in hiposmotic test T3
was superior to T2 after two hours of incubation; T4 showed better preservation of the plasma
membrane and the sperm capacitation treatments differ P <0.05 only for trained with sperm
acrosome reacted. Also the kinetic analysis was performed using a computerized system at the
time of thawing and the percentages for progressive motility in T1, T2, T3 and T4 were 26.9
± 9.7; 20.1 ± 12.6; 20.7 ± 10.8 and 15.5 ± 9.2 respectively, for the curvilinear velocity
parameters (VCL) and the average speed path (VAP) T1 and T2 shown to be superior to T3
and T4, and amplitude lateral displacement of the head (ALH) T4 showed inferiority to the
other tested treatments. No difference was observed for straight-line speed (VSL),
straightness (STR) and linearity (LIN). The treatments with the addition of aqueous extract of
noni showed higher viability than control.
Keywords: antioxidant, sperm, lipid peroxidation, means thinner
9
1. INTRODUÇÃO
Em busca de um aumento na produtividade do rebanho, os ovinos têm sido submetidos a
criteriosos manejos nutricionais, sanitários, reprodutivos e de melhoramento genético. Neste
ultimo caso, uma ferramenta disponível para os produtores são as biotécnicas voltadas a
reprodução como a inseminação artificial com sêmen congelado, porém, com resultados de
fertilidade variados em função de vários fatores como a técnica utilizada, a condição
reprodutiva da fêmea, os métodos de manipulação do ciclo estral e a qualidade do sêmen após
a descongelação.
A criopreservação de sêmen é uma biotécnica de grande importância, pois promove a
conservação do germoplasma masculino por tempo indeterminado, mantendo o material
genético de bons reprodutores e, aliada a biotécnica de inseminação artificial (IA), oferece
vantagens a produção animal, principalmente quando se refere a programas de melhoramento
animal.
No entanto, o processo de congelação/descongelação promove danos químicos e físicos à
membrana plasmática do espermatozoide. Em especial, o espermatozoide do ovino é bastante
prejudicado, pois é sensível a mudanças extremas de temperatura (SALAMON e
MAXWELL, 1995).
Estudos realizados nos últimos anos (BALL, 2009; CÂMARA e GUERRA, 2011)
mostram que durante o processo de congelação/descongelação há a produção de espécies
reativas ao oxigênio (ROS) que são responsáveis pelos danos oxidativos afetando
negativamente o metabolismo energético celular, a motilidade, a viabilidade e a integridade
do DNA da célula espermática (MAIA et al., 2009).
Naturalmente, os espermatozoides e o plasma seminal apresentam um sistema de defesa
antioxidante que desempenha papel importante na viabilidade espermática. Porém, quando o
sêmen é diluído para a congelação, este sistema de defesa antioxidante reduz sua eficiência
(CÂMARA; GUERRA, 2011). Assim, faz-se necessária a identificação de componentes com
ação antioxidante que possam ser incluídos no meio diluidor de sêmen para equilibrar a ação
dos agentes oxidantes produzidos durante os procedimentos de congelação e, dessa forma,
controlar a peroxidação lipídica para que as células permaneçam viáveis por mais tempo.
Neste contexto, o noni (Morinda citrifolia L.), considerado um fruto com alto poder
antioxidante, tem sido objeto de alguns estudos que avaliam suas propriedades biológicas e
terapêuticas (WANG et al, 2002; CHAN-BLANCO et al., 2007; AHMAD et al., 2012;
COSTA et al., 2013). O efeito benéfico do noni pode ser resultado de diferentes compostos
10
encontrados em diversas partes da planta, destacando-se o fruto que contém vitamina C em
uma média de 243,16 mg/100 g de polpa do fruto maduro (SILVA et al., 2009), e polifenóis
com uma média de 51,1 mgEq (ácido gálico)/g de polpa (CHAN-BLANCO et al., 2007).
Devido ao potencial de ação antioxidante do noni aliado a necessidade da redução de
danos causados as células espermáticas durante os processos de congelação/descongelação
pelas espécies reativas ao oxigênio, objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da adição de
diferentes concentrações de extrato aquoso de noni em meio diluente para congelação de
sêmen de carneiro.
11
2. REFERENCIAL TEÓRICO
O sêmen é produto da ejaculação e é constituído basicamente por espermatozoides e
plasma seminal. Este último é uma secreção composta de diversas substâncias produzidas
pelas glândulas acessórias, testículos e epidídimos. Sendo considerado meio de suspensão e
veículo líquido de transporte dos espermatozoides, o plasma seminal fornece os elementos
necessários à manutenção dos espermatozoides (DUKES, 2012; GONÇALVES, 2008).
O processo de congelação de sêmen a baixas temperaturas e armazenamento a -196°C
causa uma suspensão completa de sua atividade metabólica, podendo-se preservá-lo por
longos períodos de tempo, transportando-o por diversos lugares e utilizando em grande
número de fêmeas. Porém a utilização de sêmen congelado comercialmente ainda apresenta-
se restrita considerando que os resultados obtidos com aplicação das técnicas de inseminação
artificial disponíveis são inconsistentes e variam de 25 a 45% de prenhez (GONÇALVES,
2008).
Estes baixos resultados da IA estão relacionados a diversos fatores, incluindo a baixa
qualidade de sêmen após descongelação. Os danos causados ao sêmen durante o processo de
refrigeração, congelação e descongelação são variados e sua ocorrência vai depender do tipo
de curva de refrigeração, congelação e descongelação, ação de meios diluentes e
crioprotetores, entre outros, e podem se localizar nas membranas plasmáticas e acrossomal, na
peça intermediária ou no axonema, sendo a membrana plasmática mais sensível do que o
núcleo e a cauda do espermatozoide (SALAMON E MAXWELL, 1995). Mudanças de
temperatura que ocorre durante os processos de refrigeração, congelação e descongelação
alteram a organização dos componentes estruturais da membrana plasmática, afetando as suas
propriedades. Tais alterações estão associadas a mudanças na permeabilidade e na habilidade
de sofrer fusão. Os espermatozoides podem ainda apresentar inchaços e consequentemente
rupturas na membrana plasmática e acrossomal externas (JANUSKAUSKAS et al., 1999).
2.1. Meio diluidor
Os meios diluidores são constituídos de substâncias que permitem a preservação da
membrana plasmática, mediante a estabilização do ph no meio, neutralização de produtos
tóxicos produzidos pelos espermatozóides e proteção contra choque térmico. Além disso,
possibilitam o equilíbrio osmótico e eletrolítico, fornecimento de energia e inibição do
crescimento bacteriano (FURT, 2006).
12
De modo geral, nos meios diluidores devem estar presentes carboidratos, como fonte
de energia; tampões para manutenção do pH e da pressão osmótica em faixas apropriadas, se
tratando da espécie ovina, recomenda-se o pH=6,8 e a osmolaridade de 300 mOsm;
antibióticos para inibir o crescimento microbiano no sêmen; crioprotetores não penetrantes
que, além de terem função nutritiva, protegem as células contra o choque frio, à medida que
os espermatozoides são refrigerados até 5ºC; e crioprotetores penetrantes para protegerem os
espermatozoides dos efeitos deletérios da congelação (HAFEZ e HAFEZ, 2004; PURDY,
2006; OLIVEIRA et al., 2011).
Os crioprotetores não penetrantes são os açúcares e as lipoproteínas encontradas na gema do
ovo e no leite (BITTENCOURT et al. 2013). Estes são bastante utilizados por protegerem as células
durante os processos de congelação e descongelação, atuando sobre a membrana plasmática dos
espermatozoides (SALAMON e MAXWELL, 2000). Os fosfolipídeos e as lipoproteínas de baixa
densidade, presentes na gema de ovo e no leite, são responsáveis pelo efeito protetor contra o choque
frio (STORNELLI et al., 2005), além de possibilitarem a restauração dos fosfolipídeos da membrana
perdidos durante a refrigeração do sêmen (HAMMERSTEDT et al., 1990).
Com relação ao crioprotetor penetrante o mais utilizado é o glicerol para o sêmen congelado
através do método convencional lento e com o uso, principalmente, de diluidores hipertônicos, a
maioria dos estudos demonstra que as melhores concentrações de glicerol encontram-se entre 6% a 8%
(SALAMON e MAXWELL, 2000). Apresenta ação tanto intracelular como extracelular na proteção
das estruturas celulares, prevenindo a formação de cristais de gelo. No entanto, apesar de o glicerol ser
o crioprotetor habitualmente utilizado nos diluidores de congelação do sêmen ovino, alguns autores
afirmam que a sua atividade crioprotetora sobre o espermatozoide é prejudicada pela sua atividade
negativa sobre a viabilidade e fertilidade pós-descongelação como, por exemplo, estresse osmótico,
mudanças na organização, fluidez, permeabilidade e desorganização da composição lipídica da
membrana plasmática. Porém, nos dias atuais, a diluição com uso de glicerol tem apresentado bons
resultados (BITTENCOURT et al.2013).
Para congelação de sêmen ovino vários diluidores tem sido utilizados e testados, sendo
os mais comuns os que têm como base glicina-gema-leite, glicina-gema (GONZALEZ et al.,
1999), água de coco (NUNES, 1998), citrato-açúcar-gema, leite ou leite desnatado, lactose,
sacarose, rafinose e os formulados com TRIS-gema de ovo (SALAMON & MAXWELL,
2000).
Alguns autores indicam a suplementação dos meios com fatores antioxidantes, como
algumas enzimas, proteínas, minerais ou vitaminas (BICUDO et al.,2007; MAIA et. al.,2009;
TONIOLLI,2012). Corandin (2013) adicionando cisteína ao meio diluidor não observou diferenças
significativas (P>0,05) para motilidade e vigor, porém observou maiores valores de espermatozóides
13
com membrana íntegra (23,2%) e os menores valores para células com membranas lesada (66,5%) e
semi-lesada (10,6%). Atunes 2014 avaliou o efeito da adição de diferentes concentrações de aloe vera
na diluição de sêmen ovino não observou diferença entre os tratamentos testados para motilidade.
Porém os resultados de linearidade apresentaram-se maiores nos tratamentos com adição de Aloe vera;
todavia, Silva et al. (2011) relataram que a adição de Superóxido dismutase (100 U⁄mL) preservou o
acrossoma de espermatozoides congelados de ovinos, bem como efeito no número de estruturas
recuperadas.
2.2. Congelação de sêmen
De maneira geral, o sêmen é congelado lentamente e envasado em palhetas, sendo
utilizados diluentes que apresentam as mesmas propriedades que os utilizados para a diluição
ou refrigeração mais associado a substâncias crioprotetoras. Um dos diluentes mais utilizados
para esta finalidade é o tris-citrato-gema com glicerol, desenvolvido e preconizado por Steven
Salamon (GONÇALVES, 2008).
A integridade das membranas do espermatozoide tem sido afetada devido alterações
ultra-estruturais oriundas de alterações causadas pela criopreservação. Com isso, os resultados
de fertilidade obtidos com a IA utilizando sêmen congelado apresentam-se variados e na
maioria baixos.
Os danos ultra-estruturais dos espermatozoides ocorridos durante a congelação são
acompanhados por mudanças bioquímicas e perdas de substâncias vitais, como transaminase
glutâmico oxalacética (TGO), proteínas e aminoácidos, decréscimo na atividade da fosfatase,
aumento na concentração de sódio e diminuição de potássio, inativação de hialuronidase e
outras enzimas, perda de prostaglandinas, redução da síntese de ATP e ADP, bem como da
atividade proteolítica acrossomal (SALAMON e MAXWELL, 1995), sendo essas
modificações prejudiciais e associadas a baixa capacidade de fertilizar logo após a
descongelação. Porém, como mecanismo de defesa, a membrana plasmática sofre
modificações para se adequar às mudanças de temperatura, como por exemplo, o movimento
de translocação de fosfolipídeos, semelhantes as alterações fisiológicas da capacitação
(SILVA et al., 2009).
14
2.3. Espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS)
As espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS) são utilizadas como meio
identificador dos intermediários químicos reativos provenientes do metabolismo do oxigênio,
entre eles: o radical superóxido (O2
-
), o radical hidroxila (OH•) e o peróxido de hidrogênio
(H2O2) (BICUDO e MAIA 2009).
As ROS no sêmen podem ser produzidas por meio dos leucócitos presentes no
ejaculado e pelos espermatozoides. Os leucócitos são altamente capazes de produzir radicais
livres, sendo considerados mais reativos que os espermatozoides. Por sua vez, as células
espermáticas íntegras são consideradas menos reativas que as células anormais ou não
funcionais (ARGAWAL et al., 2005).
Os espermatozoides naturalmente apresentam sistema intracelular de defesa
antioxidante, sendo composto por antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase-SOD,
catalase, glutationa peroxidase e redutase), antioxidantes não enzimáticos (vitamina C e α-
tocoferol) (AITKEN, 1995), e redutores de ROS extracelulares como a vitamina C, ácido
úrico, catalase, SOD, glutationa, vitamina E entre outros (ZINI et al.,2000), os quais são
capazes de gerar e degradar ROS que, em pequenas quantidades, são necessárias para o
funcionamento normal da célula (MAIA e BICUDO 2009).
Em situações de desequilíbrio na concentração de ROS, quando se tem aumento nas
substâncias reativas ou diminuição da ação das substâncias antioxidantes, a célula entra em
estresse oxidativo, ocasionando problemas na sua funcionalidade (CÂMARA; GUERRA,
2011).
Silva et al. (2012) demonstraram que o processo de congelação/descongelação
ocasiona estresse oxidativo à célula espermática e que a inclusão de antioxidantes aos meios
utilizados para refrigeração e congelação de sêmen ajuda a proteger o espermatozoide contra
o dano causado pelos radicais livres sobre a sua motilidade, viabilidade, produção de energia
e integridade do DNA.
A lipoperoxidação consiste na deterioração oxidativa de lipídios poli-insaturados
(HALLIWELL E GUTTERIDGE, 1999; NORDBERG e ARNÉR, 2001), sendo considerada
uma reação em cadeia de eventos bioquímicos. Esta é iniciada por reações das ROS com os
lipídios poli-insaturados e propagada por radicais peroxila resultando na formação de
hidroperóxidos lipídicos e aldeídos citotóxicos como, por exemplo, o malondialdeído (MDA),
o 4-hidroxynonenal e os isoprostanos (LIMA e ABDALLA, 2001).
15
Como os lipídios da membrana espermática são ricos em ácidos graxos poli-
insaturados, estes se tornam susceptíveis a ação das ROS desencadeando uma
lipoperoxidação. Nos espermatozoides oxidados observa-se diminuição da fluidez da
membrana, aumento da permeabilidade e diminuição da capacidade de fertilização (AITKEN,
1995). Existe também uma relação entre a lipoperoxidação no sêmen com a morfologia e a
motilidade espermática. Assim, a peroxidação lipídica é considerada uma causa importante de
disfunção espermática, podendo ser revertida ou controlada através da utilização de
substâncias antioxidantes no meio diluidor (MAIA e BICUDO, 2009).
Maia et al.(2009), adicionando catalase ao meio diluidor para congelação de sêmen
ovino, observaram aumento no percentual de células espermáticas com membranas viáveis;
Silva et al. (2011) verificaram que a adição de 100 U⁄mL de superóxido dismutase (SOD)
preservou o acrossoma de espermatozoides congelados de ovinos; Câmara et al. (2009)
observaram que a inclusão de glutationa reduzida (GSG) em diferentes concentrações (0,5;
1,0 e 2,0 mM) no meio para criopreservação do sêmen de carneiros promoveu um aumento na
capacidade antioxidante total, proporcional ao aumento da concentração.
Castro (2010), utilizando quantidades de 2,5; 4,5; 6,5 e 8,5 mM de vitamina C em
meio à base de TES-TRIS para criopreservação de sêmen de bubalinos, observou incremento
na motilidade progressiva e no vigor pós-descongelação e após TTR, mas não notou diferença
nos testes que avaliaram a integridade física e funcional da membrana. Corroborando, Memon
et al. (2012) utilizaram as mesmas concentrações de vitamina C para criopreservação de
sêmen caprino e encontraram em todos os grupos testados incremento nas características
seminais observadas, recomendando a concentração mais alta para a suplementação de meios
diluentes. Porém, Silva (2013) não encontrou diferença na motilidade pós-descongelação nos
grupos com e sem antioxidantes (vitamina C).
2.4. Noni (Morinda citrifolia)
O noni é um vegetal pertencente à família Rubiaceae originária do Sudoeste da Ásia
(Indonésia) e Austrália e está presente em regiões tropicais de todos os continentes. No Brasil
o cultivo do Morinda citrifolia L. é relatado nos Estados do Acre, São Paulo, Minas Gerais,
Pará, Sergipe e Ceará (CORREIA et al.,2011).
A planta é um arbusto perene que cresce entre 3-10 metros em regiões costeiras ao
nível do mar e em áreas de florestas até aproximadamente 1300 metros acima do nível do mar
(WANG et al., 2002). Ele é bastante conhecido por sua facilidade de tolerância ambiental,
16
podendo crescer em solos inférteis, ácidos ou alcalinos, ou até mesmo em solos variando de
muito secos a encharcados (NELSON, 2006). Apesar de tolerar a saturação dos solos, cresce e
produz mais adequadamente em solos bem drenados (SILVA, 2010).
O fruto do noni possui uma grande quantidade de água (90%) e os principais
componentes da matéria são os sólidos solúveis, fibras dietéticas e proteínas. O teor de
proteínas do fruto chega a 11,3%; os aminoácidos principais são o ácido aspártico, ácido
glutâmico e isoleucina. Os minerais correspondem a 8,4% do peso seco, e são principalmente
potássio, cálcio, enxofre e fósforo (CHAN-BLANCO et al., 2006).
A composição química de noni cultivado no Ceará foi avaliada por Correia et al.,
(2011) que obtiveram médias de 91,91% de umidade, 0,63% de cinzas, 0,08% de lipídeos
totais, 1,06% de proteínas, 6,32% de carboidratos e um valor energético de 30,25 kcal/100g.
Já Costa (2010), avaliando frutos do Estado do Piauí, encontrou diferentes resultados para as
mesmos características estudadas por Correia et al., 2011 (88,36% de umidade, 0,93% de
cinzas, 0,37% de lipídeos totais, 2,24% de proteínas, 8,37% de carboidratos e um valor
energético de 45,77 kcal/100g), evidenciando que a composição química do noni varia de
acordo com fatores ambientais e distribuição geográfica onde o mesmo é cultivado.
O noni tem sido bastante estudado por apresentar benefícios a saúde. Segundo WANG
et al. (2002), experimentos realizados em laboratório utilizando sucos, extrato ou compostos
biológicos isolados promovem a eliminação de radicais livres devido a sua propriedade
antioxidante. Além de apresentar atividades anticarcinogênicas, atividades anti-inflamatórias,
estimulam o sistema imunológico, atuam na regulação das funções celulares e do colesterol.
A fruta é considerada fonte de vitamina C e compostos fenólicos, responsáveis pela
atividade antioxidante (CORREIA, 2010). Nas folhas os principais constituintes químicos
encontrados são aminoácidos, antraquinonas, glicosídios, compostos fenólicos, resinas, ácido
ursólico (ELKINS, 2002 apud SILVA, 2010).
Nas sementes são encontradas grandes quantidades de ácidos graxos como: ácido
oléico (11,7%), ácido linoléico (68,6%), ácido cáprico (0,4%), ácido palmítico (12,2%), ácido
esteárico (4,36%) e ácido araquidônico (0,43%). Estes são responsáveis por garantir a rigidez
das células, coagulação do sangue e respostas anti-inflamatórias às agressões exteriores
(RIOS, 2009).
Ainda podem ser encontrados no noni ácidos orgânicos (ácido capróico e ácido
caprílico), alcalóide (xeronina), escopoletina, óxido nítrico, alcalóides e esteróis. A cumarina
presente no noni possui odor característico. Dentre os compostos cumarínicos, a escopoletina
é responsável pela atividade antimicrobiana, antiinflamatória e antioxidante (DENG et al.,
17
2007). Derivados cumarínicos, tais como: escopoletina, 7-hidroxicumarina (7-HC) e 4-
hidroxicumarina (4-HC), em noni foram avaliados em cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC) e confirmados por Ikeda et al. (2009).
No fruto já se identificou mais de 100 metabólitos secundários, sendo as estruturas
destes metabólitos classificados como flavonóides, ligninas, iridóides, cumarinas,
antraquinonas, polissacarídeos, terpenos, esteróis e ácidos graxos (DENG et al., 2010).
No processo de elaboração de extratos ou durante a desidratação do fruto para a
produção de produtos o noni pode perder parte de seus nutrientes. Segundo Yang et al.,
(2007), os compostos fenólicos são bem estáveis antes de sofrerem tratamento pelo calor e
desidratação. Já a refrigeração e a congelação podem impedir a degradação de alguns
antioxidantes em produtos originados do noni. Ainda assim, os compostos fenólicos são mais
resistentes ao tratamento com calor do que outros antioxidantes (BICUDO et. al., 2007).
Dessa forma, como o noni é considerado um antioxidante natural e um dos seus
principais componentes encontrados é a proxeronina, precursora do alcaloide xeronina que
ativa as enzimas catalisadoras do metabolismo celular (TOMBOLATO et al., 2005), além de
ser considerada fonte de vitamina C e compostos fenólicos, responsáveis pela atividade
antioxidante, espera-se que com a inclusão do noni no meio diluidor promova uma
diminuição nos danos celulares (CORREIA 2010).
Santos et al., (2014) utilizando polpa de noni liofilizada em meio diluidor para sêmen
ovino observou que a adição de 0,4692g do liofilizado ao diluente de sêmen, apresentou efeito
protetor significativo reduzindo a oxidação lipídica. Porém, não houve diferença significativa
entre os tratamentos para a motilidade e vigor.
18
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23
ARTIGO 1
Atividade antioxidante do extrato aquoso de noni em diluente para congelação de sêmen ovino
Antioxidade activity of aqueous extract of noni in diluent for freezing sheep sêmen
Anna Lauren Costa NascimentoI, Anselmo Domingos Ferreira Santos
II
RESUMO
O noni (Morinda Citrifolia L) é um fruto que vem sendo consumido no mundo por apresentar
propriedades nutricionais e terapêuticas possuindo grande quantidade de compostos fenólicos o que
vem despertando interesse da comunidade científica. Com o intuito de buscar novas fontes naturais de
antioxidantes objetivou-se avaliar o desempenho do noni em diluente para congelação de sêmen ovino.
Os tratamentos diferiram quanto a concentração do extrato aquoso do noni ao meio diluidor em: T1 -
controle, sem adição do extrato; T2 - 24 µg/mL; T3 - 72 µg/mL; T4 - 120 µg/mL. Inicialmente foram
avaliadas as variáveis físicas e químicas do fruto maduro para acidez total, pH e sólidos solúveis sendo
obtido os seguintes esultados noni apresentou como resultado 8,78; 4,12 e 8,18% respectivamente.
Para Vitamina C obteve-se 309,42 mg em 100g de matéria fresca. O extrato aquoso do noni também
foi avaliado quanto a quantificação de compostos fenólicos totais, atividade antioxidante e capacidade
de inibição da peroxidação lipídica apresentando os seguintes resultados: 47,96 ± 1,95 mg Eq. ácido
gálico.100g-1
. Avaliando-se a capacidade do extrato aquoso do noni em inibir a lipoperoxidação no
meio diluidor observou-se que a concentração de 120 µg/mL do extrato mostrou-se significativamente
superior as outras concentrações estudadas, prevenindo o meio da lipoperoxidação em mais de 50%.
Palavras chave: ácido ascórbico, compostos fenólicos, fruto, meio diluidor,
*Artigo escrito segundo as normas da revista Semina Ciências Agrárias
Para melhor compreensão do artigo, as tabelas e quadros foram inclusas ao texto, saindo das normas
da revista.
24
ABSTRACT
NASCIMENTO, A. L. C. Antioxidant activity of aqueous extract of noni in thinner to ram semen
freezing Sergipe: UFS, 2014 32p. (Dissertation – Master in Zootecnia).
Noni (Morinda citrifolia L) is a fruit that has been widely consumed in the world to present nutritional
and therapeutic properties having lot of fenólicos compounds. So has aroused interest of the scientific
community. So in order to seek new sources of natural antioxidant aimed to evaluate the antioxidant
performance of noni in thinner to ram sêmen freezing. The treatments differed as the concentration of
the aqueous extract of noni in half thinner in: T1 control treatments without addition of the extract; T2
diluent containing 24 ug / ml; T3 with 72 ug / ml and T4 120 ug / ml extract. Initially we evaluate the
physical and chemical variables of the ripe fruit. For total acidity, pH and soluble solids noni presented
as a result 8.78; 4.12 and 8.18%. To Vitamin C yielded 309.42 mg vitamin C per 100g of fresh weight.
The extract of noni was also evaluated for quantification of total fenólicos compounds, antioxidant
activity and ability to inhibit lipid peroxidation. The extract of noni showed 47.96 Eq. Gálico.100g
acid-1 extract in amounts of total phenols. Evaluating the ability of the aqueous noni extract to inhibit
lipid peroxidation in the middle thinner observed that the concentration of 120 mg / ml of the extract
was considered the best. Means of preventing lipid peroxidation in more than 50%.
Keywords: ascorbic acid, phenolic, compounds, fruit, means thinner
25
INTRODUÇÃO
A composição do meio diluidor utilizado para congelação de sêmen é de fundamental
importância, uma vez que a diluição diminui a concentração de antioxidantes, o que promove uma
instabilidade entre antioxidantes e oxidantes gerando um estresse celular (BILODEAU et al., 2000).
Um meio diluidor com concentrações adequadas de substâncias que atuem como antioxidantes pode
promover uma menor ação de espécies reativas ao oxigênio (ROS), pois estas substâncias seriam
responsáveis por interceptar estes radicais gerados pelo metabolismo das células.
A utilização de antioxidantes exógenos no diluente de sêmen tem determinado resultados
favoráveis, como a redução da concentração de malonaldeido (MDA) nas amostras seminais em
decorrência da redução da peroxidação lipídica, com isso há uma menor incidência de danos
espermáticos e melhor conservação dos espermatozoides durante o processo de criopreservação
(SARLÓS et al., 2002).
Nesse contexto, o noni um fruto nativo da Ásia cujo consumo se dá há mais de 2000 anos, tem
sido associado a benefícios na saúde por sua conhecida capacidade antioxidante. Este potencial
antioxidante se dá pela grande quantidade de vitamina C e pela presença de compostos fenólicos, e
possivelmente devido à presença da proxeronina, um dos principais componentes deste fruto, que é
capaz de ativar as enzimas catalisadoras do metabolismo celular (SILVA et al., 2012). Quando
inclusos em meios para congelação de sêmen, podem minimizar ou reverter os efeitos danosos
causados pela ação das espécies reativas ao oxigênio no espermatozoide.
Assim, devido à presença de substâncias antioxidantes presentes no fruto do noni, tem-se
como objetivo caracterizar os aspectos físicos e químicos do noni cultivado no estado de Sergipe e
avaliar a ação antioxidante do mesmo através da inclusão de diferentes concentrações do extrato
aquoso do fruto em diluente para congelação de sêmen ovino.
26
MATERIAL E METÓDOS
O experimento foi realizado na Universidade Federal de Sergipe - UFS, São Cristóvão,
Sergipe, localizada a 11º01'de latitude sul e 37º12'de longitude oeste, com início em setembro e
término em Dezembro de 2014.
Frutos maduros do noni (Morinda citrifolia) na cor amarelo esbranquiçado foram colhidos de
plantas com aproximadamente 12 anos de idade cultivadas em solo classificado como argissolo
vermelho-amarelo ditrófico e sob regime de precipitação mensal de 126,1mm e temperatura média de
28°C.
Para a obteção do extrato a ser adicionado ao meio diluidor de sêmen ovino, foi seguida
metologia adaptada a partir daquela proposta por Kutvoelgyi (2008). O fruto maduro do noni foi
descascado, despolpado e retirado as sementes. Em seguida passado por uma peneira de 400 micras e
centrifugado a 600G durante 6 minutos. Após a centrifugação, retirou-se o sobrenadante desprovido de
sedimento filamentoso filtrando-o em copo coletor com filtro de 75 micra.
Após obtenção do extrato aquoso do noni foi elaborado o meio diluidor a base de tris-gema-
glicerol e seus respectivos tratamentos. Estes diferiram quanto a concentração do extrato aquoso do
noni adicionada ao meio diluidor: T1 - controle, sem adição; T2 - 24 µg/mL; T3 - 72 µg/mL e T4 -
120 µg/mL.
A quantificação espectrofotométrica de compostos fenólicos do produto da filtragem (extrato
aquoso) do noni foi realizada através do método de Folin-Ciocalteau (SOUSA at al., 2007).
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da média de absorbância de três
leituras de cada amostra contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido gálico (5 a
100 g.mL-1
) e expresso em mg de equivalentes de ácido gálico (EAG) por grama de extrato. A equação
da curva de calibração do ácido gálico foi C = (A – 0,0278)/0,0018, onde C é a concentração do ácido
gálico, A é a absorbância a 750 nm e o coeficiente de correlação R = 0,9773.
Para avaliar a atividade antioxidante do extrato aquoso do noni, foi realizado o teste de
sequestro do radical livre 2,2-difenil-1- picril-hidrazila (DPPH) segundo metodologia descrita por
Soler-Rivas et al. (2000), Argolo et al. (2004). Para tanto, Uma alíquota de 50 mL de solução estoque
de DPPH em metanol na concentração de 40 g.mL-1
foi preparada e mantida sob refrigeração e
protegida da luz. Em seguida, diluições para dar as concentrações finais de 30, 25, 20, 15, 10, 5 g.mL-1
da solução estoque de DPPH foram preparadas. A curva de calibração foi construída a partir dos
valores da absorbância a 515 nm de todas as soluções medidas em cubetas de vidro com percurso
óptico de 1 cm, tendo como controle o metanol. As medidas de absorbância foram efetuadas em
triplicata e nos tempo de 1, 5, 10 20, 30, 40, 50 e 60 min. Igualmente, soluções do extrato de noni (1
mg.mL-1
), bem como do controle positivo (ácido gálico) em metanol foram diluídas para dar
concentrações finais de 30, 25, 20, 15, 10 e 5 g.mL-1
. As medidas das absorbâncias das misturas
reacionais (0,3 mL da amostra ou do controle positivo e 2,7 mL de DPPH) foram realizadas a 515 nm
27
nos mesmos tempos da curva de calibração do DPPH. Misturas de metanol (2,7 mL) e solução
metanólica do extrato (0,3 mL) foram utilizadas como controle. A partir da equação da curva de
calibração e dos valores de absorbância para cada concentração testada, foram determinados os
percentuais de DPPH remanescentes (%DPPHREM), conforme a equação: %DPPH•REM =
[DPPH•]T = t ÷ [DPPH•]T= 0 x 100. Onde, [DPPH•]T = t corresponde à concentração de DPPH• no
meio, após a reação com o extrato e [DPPH•]T = 0 é a concentração inicial de DPPH•.
Os valores de absorbância em todas as concentrações testadas foram convertidos em
porcentagem de inibição (PI). A concentração eficiente, quantidade de antioxidante necessária para
decrescer a concentração inicial de DPPH• em 50% (CE50), foi determinada usando o programa
computacional Microcal Origin 7.5, a partir de uma curva exponencial de primeira ordem, obtida
plotando nos eixos das abscissas as concentrações da amostra (g.mL-1
) ou do controle positivo e no
eixo das ordenadas, a porcentagem de DPPH• remanescente (% DPPH• REM).
A atividade antioxidante foi determinada através do índice de atividade antioxidante (IAA)
conforme Scherer e Godoy (2009) e calculada através da seguinte equação: IAA = DPPH• (μg.mL-1
) ÷
CE50 (μg.mL-1
)
A atividade antioxidante foi considerada insatisfatória quando o valor do IAA for inferior a
0,5, moderada quando o IAA foi entre 0,5 e 1,0, forte quando o IAA foi entre 1,0 e 2,0, e muito forte
quando o valor do IAA foi superior a 2,0.
A capacidade do extrato para inibir a lipoperoxidação foi determinada através do
monitoramento da produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARs) em meio rico em
lipídio conforme protocolo descrito por Silva et al. (2007). Para a quantificação de TBARs foi
realizada protocolo de Lapenna et al. (2001).
Em síntese, 1,0 mL de homogenato de gema de ovo (1% m.v-1
) em tampão fosfato 20 mM (pH
7,4), foi sonicado (10 s na potência 4) e, em seguida, homogeneizado com 0,1 mL do extrato em
concentrações 10, 50, 100, 150 e 200 g.mL-1
preparadas imediatamente antes do experimento. A
peroxidação lipídica foi induzida pela adição de 0,1 mL de solução de FeSO4 (0,17 M). O trolox (100
g.mL-1
) foi usado como moléculas antioxidantes de referência (controle positivo) e o controle negativo
foi com amostras contendo apenas extrato e veículo (água ou metanol). As reações foram realizadas
por 30 min a 37ºC. Após o resfriamento, as amostras (0,5 mL) foram centrifugadas com 0,5 mL de
ácido tricloroacético (15%) a 1200 G por 10 min. Uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante foi
misturada com 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) (0,67%) e aquecida a 95°C por 60 min. Após
atingir temperatura ambiente as absorbâncias foram medidas usando espectrofotômetro a 532 nm. O
coeficiente de extinção molar de 1,54 x 10-5
M-1
.cm-1foi usado no presente estudo e o resultado foi
expresso em equivalentes de malondialdeído (Eq MDA).mL-1
de substrato.
Utilizando cálculos de relação entre a concentração eficiente em reduzir o DPPH à 50% na
atividade antioxidante (CE50) e concentração inibitória para inibir a lipoperoxidação à 50% (CI50) foi
interpolado três concentrações (24, 72 e 120 μg.mL-1
do extrato de noni) para testar o potencial de
28
prevenção da lipoperoxidação do meio utilizado para diluir o sêmen e consequentemente manter os
espermatozóides. Em seguida determinaram-se as concentrações utilizadas para cada tratamento.
Estes diferiram quanto a concentração do extrato aquoso do noni adicionada ao meio diluidor: T1 -
controle, sem adição; T2 - 24 µg/mL; T3 - 72 µg/mL e T4 - 120 µg/mL. Para tanto, essa análise
ocorreu da mesma forma que a utilizada para inibir a lipoperoxidação, sendo que o meio lipídico
(gema de ovo) e o FeSO4 era incluso no meio reacional, sem espermatozoides.
O teor de sólidos solúveis (ºBrix) foi realizado conforme Jacomino et al. (2011) atravéz da
adição de algumas gotas de suco de noni obtidas por meio de expressão da polpa minimamente
processada em gaze sobre o prisma de um refratômetro e relatado em porcentagem.
O pH foi determinado por meio de um phmetro de bancada digital Hanna previamente
calibrado com soluções padrões de pH 7,0 e 4,0.
A determinação de acidez titulável foi realizada atravéz do método de titulação com hidróxido
de sódio até o ponto de viragem com o indicador fenolftaleína. Cinco gramas do noni foram
dissolvidos em 100mL de água destilada e adicionadas de 3 gotas de fenolftaleína. Em seguida retirou-
se 20 mL desta solução para a titulação com solução de hidróxido de sódio a 0,1 M sob agitação
constante, até obter-se a coloração rósea persistente por pelo menos 30 segundos.
A determinação da vitamina C foi de acordo com técnica adaptada da American Official
Analysis of Chemistry (AOAC) (CARNELOSSI, 2000), utilizando uma solução de extração 2,6,
diclororofenolindofenol (DCPIP) e solução de ácido ascórbico PA. O teor de vitamina C foi expresso
em mg de ácido ascórbico por 100mL-1
de suco. Para estes resultados as análises foram realizadas em
quadriplicatas em seguida expressas em média.
Foi utilizado o Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC) com quatro grupos três
tratamentos e um controle e três repetições por tratamento sendo os resultados encontrados expressos
em média ± EPM. Para observar a normalidade dos dados foi utilizado o teste Shapiro-Wilk através do
pacote estatístico XLSTAT-Pro 2011. O teste t de student foi utilizado para amostras não pareadas
comparando os valores em % da atividade antioxidante e CE50. A ANOVA foi utilizada para verificar
se houve influência sobre os tratamentos. Para avaliar a significância das diferenças entre as médias
foi utilizado o teste de Tukey. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando
p<0,05. Para estes procedimentos foi utilizado o programa estatístico Graphpad Prism versão 5.0
(Graphpad Software, San Diego, CA, EUA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A polpa do noni apresentou pH ácido 3,75 a uma temperatura de 25ºC. O pH dos meios
diluidores correspondentes aos tratamentos T1, T2, T3 e T4 foram 6,06; 6,02; 5,97 e 5,89
respectivamente.
29
Os resultados das características físicas e químicas do Noni colhidos no Campus Rural estão
apresentados na tabela 1.
. O fruto maduro do noni apresentou pH semelhante ao encontrado por Silva (2012) que foi de
4,66. Silva et al. (2009) mostraram que o pH do noni diminui de acordo com a sua maturação. Os
frutos quando maduros apresentaram pH em torno de 4,6, e quando verdes o pH encontrado foi 5. O
noni, quando comparado a outros frutos, é menos ácido que o cajá (2,5), apresenta valores de pH
próximos ao do caju (4,0) e mais ácido que o açaí (4,5–5,5) (RUFINO, 2008).
Tabela1- Características físicas e químicas do Noni (Morinda Citrifolia L.) colhidos maduros.
VARIÁVEIS RESULTADOS
Acidez Titulável 8,78*
Ph 4,12
Sólidos Solúveis (ºBrix) 8,18*
Vitamina C 309,42**
*Resultado expresso em percentagem
** Resultado expresso em mg vitamina C em 100g matéria Fresca
Os sólidos solúveis associados a outros compostos existentes representam um indicativo da
quantidade de açúcares presentes no alimento. Assim, os teores de sólidos solúveis tendem a aumentar
devido à biossíntese ou degradação dos polissacarídeos com a maturação do fruto (FICHINELLO et
al., 2011). A média de 8,18 °Brix é indicativo de que o noni apresenta baixo teor de sólidos solúveis
quando comparado a outros frutos comercializados como, por exemplo, a manga, caju, uva (SILVA et
al., 2009). O resultado obtido esta de acordo com Barros et al. (2008) estudando o noni que foi 8
°Brix.
As fontes de vitamina C são classificadas em diferentes níveis: elevada contém de 100-
300mg/100g de AA, médias contêm de 50-100mg/100g de AA e baixas, contém de 25-50mg/100g de
AA (ANDRADE et al., 2002). Diante desta classificação, pôde-se concluir que o noni apresentou
elevado teor de vitamina C e consequentemente possui atividade antioxidante.
O teor de vitamina C da polpa do noni (309,42 mg 100g-1
) quando comparado a outros
estudos realizados com o noni os frutos colhidos neste trabalho apresentaram três vezes mais teor de
vitamina C que aquele relatado por Silva (2012) que encontrou 101,41 mg.100g-1
e semelhantes ao
teor encontrado por Chan-Blanco (2007) que foi de 316mg.100g-1
de ácido ascórbico.
Barros et al. (2008) comparando o teor de vitamina C dos frutos do noni em diferentes
estádios de maturação, relataram que, dependendo da fase, o fruto chega a atingir média de 385,16
mg.100g-1
de polpa.
30
O extrato aquoso do noni apresentou uma moderada quantidade de compostos fitoquímicos do
tipo fenólicos. Sendo observado um total de 47,96 ± 1,95 mg Eq. ácido gálico.100g-1
do extrato, o que,
em termos proporcionais, ajustando a unidade por grama, representa 47,96 % dos compostos
fitoquímicos presente no extrato em uma grama.
A atividade antioxidante observada no extrato aquoso do noni mostrou-se maior que aquela
encontrado por Costa et al. (2013) que foi 1.401,00 μg.mL-1
.
Devido à quantidade expressiva de compostos com potencial antioxidante, como os compostos
fenólicos, o extrato aquoso do noni na concentração de 3,0 μg.mL-1
no tempo de 30 minutos reduziu o
radical livre DPPH em 85,72 ± 0,87%, o que representa uma atividade antioxidante de 89,35 ± 2,32%.
Paralelamente, foi observado que apenas 1,2 ± 0,15 μg.mL-1
do extrato foi capaz de inibir o radical
livre DPPH em 50%. O índice de atividade antioxidante do noni foi de 33,33, o que representa uma
atividade antioxidante muito forte (tabela 2).
Tabela 2. Atividade antioxidante (médias ± desvio padrão) do extrato aquoso de noni determinado
através da redução do radical livre DPPH•.
AMOSTRA AA* CE50** IAA***
NONI 89,35 ± 2,32a 1,2 ± 0,15ª 33,33
Ácido Gálico 96,91 ± 1,69b 1,05 ± 0,15ª 38,09
* Atividade antioxidante, **Concentração eficiente em reduzir o DPPH a 50% na atividade
antioxidante. ***Índice de atividade antioxidante. Letras diferentes indicam diferença estatística
entre as colunas, teste t não pareado, p> 0,05).
Em relação ao sequestro de radicais livres, os extratos são classificados como sendo forte
(acima de 70%), moderada (70 – 50%) e fraca (abaixo de 50%) capacidade de sequestro (MELO et al.,
2008). O extrato aquoso do noni do presente estudo apresentou maior capacidade (89,35%) em
sequestrar o radical livre sintético DPPH que o mesmo extrato (8,08 ± 0,81%) relatado por
Nascimento, 2012, sendo então considerado um extrato forte. Essa diferença de sequestro de radicais
pode ser atribuída ao estado de maturação em que o fruto se encontrava na obtenção do extrato.
Observou-se que o extrato aquoso do noni apresentou uma excelente capacidade em inibir a
lipoperoxidação na concentração de 10 µg.mL-1
, sendo semelhante ao controle positivo sintético
Trolox. No entanto, o noni apresentou um comportamento de redução de eficiência em prevenir a
lipoperoxidação em concentrações mais elevadas, demonstrando uma reversão pro-oxidativa com o
aumento da concentração como pode-se observar na Figura 1. Sua capacidade em inibir
lipoperoxidação induzida por sulfato ferroso em 50% (CI50) foi 34,76 ± 6,45 μg.mL-1
. Concentrações
mais elevadas não sugerem boa proteção lipoperoxidativa.
31
0
1
2
3
4CONTROLE
10
50
100
150
200
TROLOX*
*
*
*
*
g.mL-1
nm
ol.E
q-M
DA
Figura 1. Capacidade de prevenção da lipoperoxidação in vitro de diferentes concentrações extrato aquoso do
noni quanto à produção de malonaldeído em nmol comparada ao controle positivo Trolox na concentração de
100 µg.mL-1
.
Quando foi avaliada a capacidade do noni em prevenir a lipoperoxidação no meio diluidor
para congelação de sêmen, após avaliação do CE50 na capacidade antioxidante e CI50 no potencial
inibitório lipoperoxidativo, observou-se que a concentração baixa não apresentou efeito positivo, no
entanto, a concentração de 72 e 120 mg.mL-1
inibiu a lipoperoxidação na ordem de 21,75 e 51,32%,
respectivamente. O controle positivo Trolox na concentração 100µ.mL foi capaz de inibir a
lipoperoxidação em 93,20% como é possível observar através da produção de malonaldeído na Tabela
3.
Tabela 3. Capacidade do noni em prevenir a lipoperoxidação no meio diluidor
para sêmen.
Meio Diluidor Concentração de
Noni (µg.mL-1
)
Média e desvio padrão (DP) de
Produção de malonaldeído
(nmol Eq MDA.mL)
0 Sem antioxidante 5,10 ± 0,30
24µg.mL-1
de Noni 5,28 ± 0,14
72 µg.mL-1
de Noni 3,99 ± 0,37
120 µg.mL-1
de Noni 2,48 ± 0,50
Trolox 100* µg.mL-1
de Noni 0,35±0,11
32
CONCLUSÃO
A polpa do noni apresentou quantidades elevadas de vitamina C e o seu extrato aquoso uma
moderada quantidade de compostos fenólicos, representando uma atividade antioxidante muito forte.
Nas condições deste estudo o extrato aquoso de noni quando incluso ao meio diluidor para
criopreservação de sêmen é capaz de inibir a lipoperoxidação a partir da concentração de72 mg.mL-1
.
.
33
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35
ARTIGO 2
Utilização do extrato aquoso de noni em diluente para congelação de sêmen ovino
Use of aqueous extract of noni in diluent for freezing sheep semen
Anna Lauren Costa NascimentoI, Anselmo Domingos Ferreira Santos
II
RESUMO
A utilização de extrato aquoso de noni (Morinda citrifolia L) na composição dos meios diluidores por
apresentar caráter antioxidante pode diminuir o processo de lipoperoxidação nas células espermáticas
e diminuir as injúrias provocadas pelo processo de congelação. Este estudo teve como objetivo avaliar
a ação do extrato aquoso de noni em diluente para congelação de sêmen de carneiro atentando para
funcionalidade, viabilidade e cinética espermática. Os tratamentos diferiram quanto a inclusão de
extrato aquoso de noni ao meio diluidor em: T1- sem adição de extrato; T2- 24µg/mL ; T3- 24µg/mL e
120µg/mL. Por meio de vagina artificial 16 ejaculados foram coletados, analisados e todos foram
diluídos entre os quatro tratamentos e congelados. Após o descongelamento o sêmen foi submetido ao
teste de termorresistência e avaliado quanto a motilidade subjetiva, vigor espermático, teste de
integridade de membrana pelo teste hiposmótico, teste supravital, pela combinação de fluorocromos
SYBR Green e iodeto de propídio (IP), e o status de capacitação espermática e reação acrossomal pela
clortetracliclina (CTC) imediatamente após a descongelação e cinética espermática computadorizada.
No teste de termorresistência (TTR) após duas horas de incubação a motilidade do T4 apresentou-se
inferior ao demais tratamentos, não houve diferença significativa P>0,05 no teste HOS tanto no sêmen
diluído quanto para o sêmen avaliado imediatamente pós-descongelação, para as demais horas (H1 e
H2) os tratamentos apresentaram comportamento semelhante. Para os parâmetros de cinética foi
observada diferença estatística P<0,05 para Motilidade Progressiva (MP),velocidade curvilinear
(VCL), velocidade do percurso médio (VAP) e amplitude de deslocamento lateral da cabeça (ALH).
Quanto ao estado de capacitação espermática observou-se diferença P<0,05 entre os tratamentos para
espermatozoide capacitado com acrossomo intacto.
*Artigo escrito segundo as normas da revista Semina Ciências Agrárias
Para melhor compreensão do artigo, as tabelas e quadros foram inclusas ao texto, saindo das
normas da revista.
Palavras-chave: concentrações, espermatozoide, lipoperoxidação, membrana plasmática
36
ABSTRACT
The use of aqueous extract of noni (Morinda citrifolia L) in the composition of extenders for
presenting antioxidant character can decrease the process of lipid peroxidation in sperm cells and
reduce the injuries caused by the freezing process. This study aimed to evaluate the effects of aqueous
extract of noni in thinner to ram semen freezing paying attention to functionality, viability and sperm
kinetics. The treatments differed inclusion of aqueous extract of noni in half thinner in: T1 no added
extract; T2 24μg / ml; T3 24μg / ML and 120μg / ML. Through artificial vagina 16 ejaculates were
collected, analyzed and all were diluted among the four treatments and frozen. After thawing the
semen was subjected to heat resistance test and evaluated for the subjective motility, sperm vigor,
membrane integrity test hypoosmotic swelling test supravital test, the combination of SYBR Green
and fluorochrome propidium iodide (PI), and the status of sperm capacitation and acrosome reaction
by clortetracliclina (CTC) immediately after thawing and computerized sperm kinetics. In the heat
resistance test (TTR) after two hours of incubation the motility of the treatment 4 showed up less than
the other treatments, there was no significant difference P> 0.05 in the HOS test both the diluted
semen and for the semen evaluated immediately after thawing for the other hours (H1 and H2)
treatments showed similar behavior. For the kinetic parameters was observed statistical difference P
<0.05 for MP, VCL, VAP and ALH. As to the state of sperm capacitation was observed difference P
<0.05 between treatments for sperm with intact acrosome enabled.
Keywords: lipid peroxidation, sperm cell concentrations, plasma membrane
37
INTRODUÇÃO
O processo de congelação do sêmen promove diversos danos às membranas dos espermatozóides,
podendo estes ser causados pelo aumento da lipoperoxidação, levando a célula espermática a danos
oxidativos decorrentes do desequilíbrio entre substâncias antioxidantes e concentrações fisiológicas de
oxidantes resultantes da redução da capacidade antioxidante total do sêmen e do aumento da produção
de espécies reativas ao oxigênio (ROS) (Guerra et al., 2004).
Estudos realizados nos últimos anos mostram que estes desequilíbrios entre substâncias
oxidantes e antioxidantes afetam negativamente o metabolismo energético celular, a
motilidade, a viabilidade e a integridade do DNA da célula espermática (BALL, 2009; MAIA
et al., 2009; CÂMARA e GUERRA, 2011). Naturalmente, os espermatozoides e o plasma
seminal apresentam um sistema de defesa antioxidante que desempenha papel importante na
viabilidade espermática. Porém, quando o sêmen é diluído para a congelação, este sistema de
defesa antioxidante reduz sua eficiência (CÂMARA; GUERRA, 2011).
Assim, para uma melhor viabilidade espermática após a descongelação, faz-se necessária a
inclusão de substâncias com ação antioxidante nos meios de diluição a fim de promover equilíbrio na
ação dos oxidantes produzidos durante os procedimentos de conservação.
O noni tem sido muito estudado quanto a sua ação antioxidante, anti-inflamatória e
anticarcinogênicas (CHAN-BLANCO 2007; BARROS et al. 2008; SILVA 2012) por ser considerado
um fruto com potencial antioxidante e com provável efeito eliminador de radicais livres, podendo este
resultar de compostos contidos em diversas partes da planta, destacando a polpa do fruto que apresenta
grande quantidade de vitamina C. Chan-Blanco (2007); Barros et al. (2008) e Silva (2012), estudando
o noni, encontraram na polpa do fruto diferentes porem elevadas quantidades de vitamina C com
concentração de 316mg.100g-1
, 385,16 mg.100g-1
e 101,41 mg.100g-1
respectivamente.
Objetivou-se com este trabalho avaliar a inclusão de diferentes concentrações de extrato
aquoso de noni em diluente para congelação de sêmen de carneiro, atentando sobre a cinética
espermática e integridade da membrana dos espermatozóides.
38
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no período de setembro de 2014 a janeiro de 2015 no Setor de
Ovinocultura do Biotério Central da Universidade Federal de Sergipe, no município de São Cristóvão,
Região Metropolitana de Aracaju / Se, localizada a 11° 00' 54" S 37° 12' 21" O, estando a uma altitude
de 30,0 metros.
As análises do sêmen congelado e descongelado foram desenvolvidas no Laboratório de
Reprodução Animal, na Universidade Federal de Sergipe e no Laboratório de Biotecnologia da
Reprodução Animal (LABRA) da EMBRAPA no município de Aracaju.
Foram utilizados dois reprodutores ovinos da raça Santa Inês, idade entre 12 e 24 meses,
comprovadamente férteis e submetidos a exame andrológico prévio. Durante o período experimental
os animais permaneceram em cercados coletivos, separados das fêmeas e alimentados com capim
elefante (Pennisetum Purpureum) e concentrado comercial. O sal mineral e água foram fornecidos à
vontade.
Os tratamentos foram diferidos com base nos resultados de Nascimento et al. (2015; dados não
publicados) quanto à inclusão de extrato do fruto do noni em: T1 - Sêmen diluído em diluente a base
de tris-gema-glicerol sem extrato aquoso da polpa de noni; Tratamento (T2) – 24µg/mL de extrato
aquoso do fruto de noni adicionado ao diluente; Tratamento (T3) - 72µg/mL de extrato do fruto de
noni adicionado ao diluente; e Tratamento (T4) - 120µg/mL de extrato aquoso do fruto de noni
adicionado ao diluente. Para a elaboração do extrato foi seguida a metodologia de Kutvoelgyi (2008)
adaptada. O fruto maduro do noni foi descascado, despolpado e retirado às sementes. Em seguida, a
polpa foi passada por uma peneira de 400 micras e centrifugado a 600 G durante 6 minutos. Após a
centrifugação, retirou-se o sobrenadante desprovido de sedimento filamentoso filtrando-o em copo
coletor com filtro de 75 micra.
O meio diluidor utilizado foi a base de TRIS composto pela solução padrão contendo 2,42g
Tris, 1,50g de ácido cítrico monohidratado, 1,25g de glicose, 0,0134g de sulfato de estreptomicina;
20mL de gema de ovo; 4mL de glicerol e 100mL de água tridestilada.
Foram realizadas duas coletas diariamente, sendo uma por animal durante oito dias,
totalizando 16 ejaculados. Os animais foram submetidos à coleta de sêmen por meio de vagina
artificial, previamente aquecida a 42ºC, tendo como manequim uma fêmea em estro, induzida pela
aplicação de 1,0 mg de benzoato de estradiol (Estrogin® - Farmavet) no primeiro dia e 0,5 mg sempre
que a fêmea ficava menos receptiva ao macho.
Seguindo a metodologia proposta por Maia (2006), após a coleta o sêmen foi encaminhado ao
laboratório e avaliado quanto ao volume por meio de leitura direta no próprio tubo de coleta e mantido
em banho-maria a 32°C até o momento da diluição. Utilizou-se 20 µL de sêmen para avaliação da
concentração, retirando-se ainda uma alíquota de sêmen e colocando-a sobre lâmina aquecida a 37°C
para avaliação do turbilhonamento (de 0 a 5), e sobre lâmina e lamínula aquecidas a 37°C para a
39
avaliação da motilidade (0 a 100%) e do vigor (0 a 5), todos por meio de microscopia óptica com
aumento de 20x. Também foram retiradas amostras para posterior avaliação da morfologia
espermática.
Para a avaliação da concentração seminal, adicionou-se 20μL de sêmen a um microtubo tipo
Eppendorf® contendo 2mL de solução formol-salina tamponada, de onde foram retiradas alíquotas
para avaliação imediata da concentração espermática e posterior análise morfológica em câmara úmida
e lâmina corada. A concentração espermática (x106sptz/mL) foi determinada pela contagem de células
em câmara de Neubauer por microscopia ótica com aumento de 40x, determinando-se o número de
doses inseminantes com concentração de 50x106sptz/mL.
O sêmen foi dividido em quatro alíquotas de mesmo volume, diluído conforme os diferentes
tratamentos, armazenado em palhetas de 0,25mL, lacradas com álcool polivinílico, seguido da
refrigeração em refrigerador Minitüb® 518C (Minitüb do Brasil Ltda), onde as palhetas foram
dispostas em mamadeiras plásticas contendo álcool, a fim de controlar o resfriamento de 32 a 5o C por
um período de duas horas. Em seguida as palhetas foram transferidas para uma caixa de isopor com
capacidade para 37 litros contendo 5,5 litros de nitrogênio líquido (N2L), onde ficaram expostas ao
vapor de N2L (5°C) por 20 minutos, na posição horizontal, distante três centímetros da lâmina de
nitrogênio, sendo, logo após, submersas no N2L, acondicionadas em raques e armazenadas em botijão
criogênico, com nitrogênio líquido a -196°C.
A viabilidade espermática foi avaliada por meio do teste supravital. Para tanto, foi realizado o
esfregaço de sêmen corado pela eosina/nigrosina. Uma alíquota de 10μL de sêmen foi adicionada a
500μL de x-cell®
e, em seguida, 50μL do x-cell® + sêmen foram adicionados em 50μL de
eosina/nigrosina, de onde foi retirada uma alíquota para a realização do esfregaço e posterior
contagem de 200 células em microscópio binocular em aumento de 100x. O resultado foi expresso em
porcentagem total dos espermatozoides não corados (vivos).
Do tubo tipo eppendorf® contendo sêmen + solução formol salina tamponada, foram retiradas
alíquotas para análises de patologias de cabeça em esfregaço corado com Kit Instant-Prov®, enquanto
para avaliação morfológica de patologias de cauda e acrossoma, foi utilizada a técnica de câmara
úmida (HANCOCH,1957). Para ambas as análises, foram contadas 200 células espermáticas em
microscopia de contraste de fases no aumento de 100x.
A capacidade do extrato para inibir a lipoperoxidação após a descongelação do sêmen
durante 30s a 37°C foi determinada através do monitoramento da produção de substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARs) em meio rico em lipídio conforme protocolo descrito por Silva et al.
(2007). Para a quantificação de TBARs foi realizada protocolo de Lapenna et al. (2001).
Para a realização do teste de termorresistência lento (TTR), seguiram-se as recomendações do
CBRA (2013). As doses de sêmen foram descongeladas a 37C por 30 segundos, acondicionadas em
microtubos Eppendorf® (1,5ml), cobertas com uma gota de óleo mineral previamente aquecido, e
incubadas a 37C durante um período de 2 horas simulando a presença dos espermatozóides no trato
40
genital feminino. Foram avaliados a motilidade e o vigor espermático por meio de microscopia óptica,
em aumento de 20x em três momentos: hora zero (H0) imediatamente após a descongelação, e a cada
hora após a descongelação, H1 e H2. Durante o TTR foi realizado também o teste supravital, por meio
do esfregaço de sêmen corado pela eosina/nigrosina e posterior contagem de 200 células em
microscópio binocular em aumento de 100x. O resultado foi expresso em porcentagem total dos
espermatozóides não corados (vivos). Este teste foi realizado imediatamente após a descongelação do
sêmen (H0) e após duas horas de incubação a 37° (H2).
Foi realizado o teste hiposmótico do sêmen após a diluição nos respectivos tratamentos, antes
do resfriamento, e durante o teste de termorresistência (TTR). Para tanto, utilizou-se uma solução
hiposmótica com osmolaridade de 125mOsm/L (FONSECA et al., 2005), a qual foi mantida em um
microtubos contendo 1,5 ml desta solução, em banho-maria a 37ºC, sendo adicionado 10μL de sêmen
diluído fresco e descongelado nos tempos 0, 1 e 2 horas, os quais foram incubados por uma hora.
Decorrido o tempo determinado, uma amostra foi colocada entre lâmina e lamínula e, em microscópio
de contraste de fases com aumento de 100x, foram contadas 200 células sendo o resultado expresso
em porcentagem de espermatozóides com cauda dobrada, subtraindo-se os defeitos de cauda dobrada
relacionada a patologia.
A cinética espermática foi avaliada utilizando-se o sistema CASA (Computer Assisted Sperm
Analysis), configurado com set-up para ovinos como descrito por Azevedo (2006). Amostras de 3 μL
do sêmen diluído em solução de avaliação (pH 6,8 e 320 mOsm) foram transferidas para uma câmara
de Makler® previamente aquecidas (37°C). Foram capturadas imagens em quatro campos
selecionados aleatoriamente a partir de um mesmo ponto central. Os parâmetros de cinética avaliados
foram: Motilidade Total (%), Motilidade Progressiva (%), Velocidade de Trajeto (μm/s), Velocidade
Curvilinear (μm/s), Amplitude Lateral da Cabeça (μm), Retilinearidade (%) e Linearidade (%).
A análise de integridade da membrana plasmática (IMP) foi realizada pela combinação de
fluorocromos SYBR Green e iodeto de propídio (1-7011LIVE/DEAD, Molecular Probes Inc., Eugene,
OR, USA) adaptando-se a metodologia utilizada por Garner e Johnson (1995). Uma alíquota de 50µL
da amostra seminal diluída em solução de avaliação foi colocada em microtubos previamente
aquecidos a 37°C ao qual foi adicionado 2,5µL de SYBR Green mantendo a amostra sob incubação
durante 5 minutos. Após esse período foi ainda adicionado 2,5µL de iodeto de propídio e 1µL de
glutaraldeído a 1% mantendo a amostra sob incubação por mais cinco minutos e em seguida fez-se a
leitura da amostra. Um total de 200 células foi avaliado em microscópio com epifluorescência e
objetiva com aumento de 1000x, sendo os espermatozoides classificados como portadores de
membrana plasmática íntegra, quando apresentavam a região da cabeça corada somente de verde ou
em qualquer porção de vermelho.
O status de capacitação e reação acrossomal dos espermatozoides foi analisado pela
clortetraciclina (CTC) descrito pela metodologia de Gilian et al. (1997) e adaptada por Azevedo
(2006). Amostras de sêmen foram diluídas em 1000µL de solução tampão fosfato-salina (Phophate
41
Buffered Salina- PBS) sem cálcio (BARTH e OKO,1989), pré aquecida a 37°C e submetidas a uma
leve centrifugação de 400G durante 4 minutos. Em seguida, retirou-se cuidadosamente o
sobrenadante, o pellet de sêmen foi ressuspendido com 150µL de PBS. Da solução produto da
ressuspensão retirou-se uma alíquota de 5µL adicionando a um microtubo contendo 20 µL da solução
de 1mM de CTC. A mistura foi homogeneizada e permaneceu sob incubação durante 15 minutos. Em
seguida retirou-se uma alíquota de 12 µL para leitura sob lâmina e lamínula em microscópio de
epifluorescência com aumento de 1000x. Foram analisadas um total de 200 células, sendo
classificadas como: F- não capacitadas com acrossomo intacto, uniforme distribuição da fluorescência
amarela por toda cabeça com presença ou não de faixa pontilhada mais brilhosa na região equatorial;
B- capacitados com acrossomo intacto, fluorescência na região anterior da cabeça, ausência de
fluorescência na região pós acrossomal; ou AR- com acrossomo reagido ausência de fluorescência na
região da cabeça correspondente ao acrossomo.
O experimento foi conduzido em um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com quatro
tratamentos e 16 repetições por tratamento. Para a análise estatística das características avaliadas, foi
empregado o pacote estatístico Statistical Analysis System (SAS Institute Inc. 2006), utilizando-se
para análise descritiva o Procedimento MEANS e o Procedimento GLM, com o teste de Student
Newman Keuls (SNK) a 5% para a comparação dos parâmetros espermáticos entre os diferentes
grupos experimentais. Todas as variáveis estudadas foram submetidas ao teste de normalidade de
Saphiro-Wilk. No entanto, as variáveis Teste hiposmótico, motilidade total e progressiva, integridade
da membrana e vigor foram consideradas não normais. Estas foram transformadas em normais usando
a metodologia de Box-Cox (BOX e COX, 1964) e avaliadas mediante o procedimento PROC
UNIVARIATE. Os dados foram submetidos a análise de variância (ANOVA), e em seguida
submetidos ao teste de Tukey em nível de significância de 5%. As variáveis que apresentaram
significância foram submetidas aos efeitos de regressão. Todos os procedimentos usados pertencem
aos pacotes MIXED, NPAR1WAY do software estatístico SAS (SAS Institute Inc. 2006).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores descritos na Tabela 1, referentes às características seminais obtidas neste
experimento, estão de acordo com os valores preconizados pelo CBRA (2013). Após o processo de
congelação, 40 a 50% dos espermatozoides se tornam incapazes de fertilizar (WATSON, 2000). Por
isso a necessidade de se utilizar ejaculados de boa qualidade para que se obtenham níveis satisfatórios
de fertilização.
42
Tabela 1. Características físicas e morfológicas do sêmen ovino fresco
Parâmetro Valores Médios e Desvio Padrão
Volume (mL) 0,73 ± 0,18
Turbilhonamento 4,21 ± 0,44
Motilidade (%) 0,80 ± 0,02
Vigor (0-5) 3,09 ± 0,20
Integridade da membrana (vivos e mortos)% 85,16 ± 7,72
Integridade de membrana plasmática (HOST) 58,19 ± 14,80
Patologias Totais (%) 6,93 ± 3,86
0
1
2
3T1
T2
T3
T4b
a
c
a
Tratamentos
nm
ol.E
q-M
DA
Figura 1. Capacidade de prevenção da lipoperoxidação in vivo de diferentes concentrações extrato aquoso do
noni em sêmen descongelado quanto à produção de malonaldeído em nmol.
Os tratamentos T1 e T3 foram os que melhor preveniram a lipoperoxidação nos
espermatozoides pós-descongelação com uma menor produção de malonaldeído (Figura 1). Dos
tratamentos com extrato aquoso de noni o T3 foi o que melhor preveniu a lipoperoxidação. Assim é
possível inferir que a concentração ideal de extrato aquoso de noni a ser adicionada ao meio diluidor
para se observar uma redução da lipoperoxidação está entre 24 e 124µg/mL.
Os valores para motilidade, vigor e resultados para o teste supravital estão dispostos na Tabela
2.
43
Tabela 2. Motilidade e vigor de sêmen descongelado durante o teste de termorresistência lento (TTR) e
percentual de espermatozóides não corados no teste supravital descongelado e ao final do TTR em diluente
contendo diferentes concentrações de extrato aquoso da polpa de noni em três momentos H0, H1 e H2.
Concentrações µg/Ml
Parâmetro Tempo T1 T2 T3 T4
Motilidade
H0 36,8±5,8a 37,8±5,9
a
31,3±6,2b
24,9±7,7c
H1 29,7±10a
31,8±10,7a
24,5±8,7a
14,4±9,1b
H2 20,8±11,6ab
22,6±9,7a
13,8±7,3bc
8,3±6,8c
Vigor
0 3,0±0,1
2,9±0,3
2,8±0,4
2,7±0,5
1 2,7±0,5a
2,8±0,4a
2,5±0,8ab
2,1± 1,0b
2 2,4±0,5a
2,5±0,5a
1,9±0,8ab
1,6±0,8b
Supravital
H0 37,6±10,1a 24,3±10,5
b 17,3± 8,2
bc 13,7±6,3
c
H2 30,7±12,1a 11,8±6,2
ab 11,7±5,0
bc 10,9±5,7
c
Letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente, Teste de Tukey P <0,05.
Imediatamente após a descongelação, a motilidade dos tratamentos T1 com médias (36,8 ±
5,8) e o T2 (37,8 ± 5,9), mostrou-se significativamente superiores aos tratamentos 3 e 4, os quais
obtiveram médias de 31,3 ± 6,2 e 24,9 ± 7,7, respectivamente.
Analisando a motilidade após uma hora de incubação o tratamento T4 mostrou-se inferior aos
demais, e após duas horas de incubação o T2 (24 µg/mL de extrato aquoso de noni) mostrou-se
semelhante ao tratamento controle, apresentando maior motilidade que os outros tratamentos com
adição de extrato aquoso de noni.
Os resultados de motilidade encontrados após uma hora de incubação mostram-se superiores
aos encontrados por Peixoto et al. (2008), que congelaram sêmen ovino com adição de ácido ascórbico
e Trolox em meio diluente tris-gema e encontraram motilidades de 20 ± 5% e 15 ± 5% para grupo
controle e o grupo adicionado com 600µM/L de ácido ascórbico (0,11mg/mL), e semelhantes ao
encontrados por Santos (2014) que comparou um diluente controle para congelação de sêmen ovino a
diluentes com diferentes quantidades de polpa liofilizada de noni (0,2346g; 0,4692g; 0,7038g) e
encontrou motilidades (%) de 40,7±13,5; 31,4±14,5; 33,3±12,9; 22,1±16,1, respectivamente, para o
tratamento controle e para os demais tratamentos testados.
Quanto ao vigor não houve diferença entre os tratamentos logo após a descongelação (P>
0,05). Após uma hora de incubação (H1) o T4, com média de 2,7 ± 5, mostrou-se significativamente
inferior aos tratamentos T1, T2 e T3, os quais apresentaram médias de 2,8 ± 0,4; 2,5 ± 0,8; 2,1 ±1,
respectivamente. O vigor expressa a velocidade do movimento de espermatozoides com motilidade
progressiva (GONÇALVES, 2008), sendo assim, o baixo vigor apresentado no T4 pode ser refletido
na motilidade progressiva deste mesmo tratamento comprometendo a fecundação por estes
espermatozoides. Em relação ao vigor, na hora dois os maiores resultados foram encontrados em T1,
44
T2 e T3, que não apresentaram diferença entre si (P>0,05). No entanto, apenas os tratamentos T1 e T2
foram superiores ao T4 (P<0,05).
Houve diferença para o percentual de espermatozóides corados no teste supravital
imediatamente após descongelação, no qual o T1 apresentou superioridade e o T3 e T4 foram
inferiores aos demais tratamentos. Após duas horas de incubação os tratamentos T1, T3 e T4 diferiram
entre si (P<0,05). Enquanto que o T2 não diferiu do T1. De forma geral, o T4 apresentou resultados
inferiores de motilidade e vigor após a descongelação e o TTR quando comparado aos demais
tratamentos. Contudo, quando avaliado pelo teste supravital, pode-se perceber que o extrato aquoso de
noni na concentração de 120µg/mL possibilitou a manutenção da integridade estrutural da membrana e
viabilidade espermática após a descongelação, com redução média de 2,8% de espermatozoides
íntegros duas horas após a descongelação.
Não houve diferença (P>0,05) entre os tratamentos para o sêmen diluído e imediatamente após
descongelação (H0) no teste hiposmótico (Tabela 3). Também não foram observadas diferenças
(P>0,05) entre os tratamentos T1, T3 e T4 após uma (H1) e duas (H2) horas de incubação, sendo que
apenas o T4 foi superior ao T2 após uma hora de incubação e apenas o T3 foi superior ao T2 após
duas horas de incubação.
Pelo teste hiposmótico foi possível inferir que a membrana plasmática do espermatozoide foi
mais preservada com o aumento da concentração de extrato aquoso de noni ao meio diluidor. Estes
resultados foram superiores aos encontrados por Penitente Filho (2010) que incluiu diferentes
concentrações de vitamina E (25µM, 50 µM e 100 µM de vitamina E) em sêmen caprino. Porém,
foram inferiores aos encontrados por Santos (2014) após adição do diluidor de diferentes quantidades
de polpa liofilizada de noni em sêmen ovino descongelado.
Tabela 3. Médias e desvio-padrão de espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico (HOST) em sêmen
diluído e no TTR em meio diluidor com diferentes concentrações de extrato aquoso de noni.
Tratamentos
HOST
pré -
congelamento %
TTR (horas)
H0 H1 H2
T1 60,0 ± 16,7
33,8 ± 8,0 30,9 ± 11,2ab
29,6 ± 6,6ab
T2 51,6 ± 13,9
31,7 ± 12,4 26,6 ±9,0b 26,9 ±9,5
b
T3 58,3 ± 13,0
35,2 ± 13,9 35,3 ± 10,6ab
35,8 ± 10ª
T4 63,5 ± 15,0 38,2 ± 8,6 38,4 ± 13,6ª 31,2 ± 8,8ab
T1- grupo controle sem adição de extrato aquoso de noni; T2- 24, T3- 72 e T4- 120 µg/mL de extrato aquoso de
noni. Letras diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente, Teste de Tukey P <0,05.
Na Tabela 4 estão dispostos os resultados referentes à cinética espermática do sêmen após a
descongelação. As células espermáticas diferiram para MP, velocidade curvilinear (VCL), VAP, ALH
nas diferentes concentrações de extrato aquoso de noni (P<0,05). Para MP o tratamento controle foi
superior aos demais tratamentos, não havendo diferença entre os tratamentos T2; T3 e T4; para as
45
variáveis VCL e VAP o T2 apresentou resultado semelhante ao tratamento controle; para ALH o T4
foi inferior aos demais tratamentos.
Tabela 4. Cinética espermática pós descongelação de sêmen ovino congelado em meio contendo diferentes
concentrações de extrato aquoso de noni.
Tratamentos
Parâmetros T1 T2 T3 T4
MT(%) 48,2±14,9 35,6±17,4 39,0±15,0 32,9±16,0
MP (%)
26,9±9,7ª
20,1±12,6b
20,7±10,8b
15,5±9,2b
VCL(µ/s) 194,5±20,7ª 186,6±34,1ª 176,6±19,4b 170,3±24,7
b
VSL(µ/s) 97,2±13,3 97,2±13,3 89,2±14,6 84,6±16,2
VAP(µ/s)
121,5±12,8ª
121,5±12,8ª
111,8±13,8b
107,0±16,8b
ALH(%)
2,7±0,4ª
2,7±0,4ª
2,5±0,3ª
2,3±0,4b
STR(%)
79,8±7,5
79,8±4,5
79,5±4,9
78,7±4,2
LIN(%) 49,9±3,3 49,9±3,3 50,4±5 49,6±5,7 0-Grupo controle sem adição de extrato aquoso de noni; 24, 72, 120 concentrações de extrato aquoso de noni
µg/mL; MT- motilidade total; VCL- velocidade curvilinear; VSL- velocidade em linha reta; VAP- velocidade do
percurso médio; ALH- amplitude de deslocamento lateral da cabeça; STR- retilinearidade; LIN- linearidade.
Letras diferentes na mesma linha diferem estatisticamente, Teste Scott-Knott P <0,05.
No tocante a motilidade total nos tratamentos não diferiram entre si (P>0,05). Os resultados
de MT e MP foram semelhantes aos encontrados por Maia (2006) não observou diferenças
significativas quando adicinou 6,25 mg/mL (0,0935 U/mL) de catalase ao meio diluidor, e Silva
(2013) com adição de 0,5mg/mL de ácido ascórbico ao meio diluidor.
Para os parâmetros VCL e STR os resultados encontrados neste estudo foram superiores ao de
Sicherle et al. (2007), que foi 173,4±4,33 e 77,1±1,56, respectivamente, quando adicionaram ao meio
diluidor catalase, e semelhantes quando se adicionou trolox (179,2 ± 5,98 e 80,5±1,29). Referindo-se a
VAP, ALH, e velocidade em linha reta (VSL), os resultados deste estudo também foram superiores
aos encontrados por Corandim et al. (2013) ao adicionarem 2,5mM de cisteína ao meio diluidor. No
entanto, LIN dos espermatozoides diluídos em meio com extrato aquoso de noni apresentou-se inferior
a dos estudos mencionados. Assim, o extrato aquoso do noni em meio diluidor apresentou-se
semelhante a outras substâncias definidas como antioxidantes.
De forma geral foi observado que o aumento na concentração do extrato aquoso de noni
diminuiu as velocidades de deslocamento dos espermatozoides, esse resultado pode ser prejudicial
quando se fala em deslocamento do espermatozoide em direção ao óvulo para que ocorra a
fecundação.
46
Tabela 5. Integridade de membrana plasmática e capacitação espermática (CTC) pós-descongelação de sêmen
ovino diluído em diferentes concentrações de extrato aquoso de noni.
Tratamentos
Parâmetros T1 T2 T3 T4
IMP 14,9 ± 7,3 11,8 ± 6,2 11,7 ± 5,0 10,9 ± 5,7
F 17,3 ± 10,3 12,2 ± 10,3 15,7 ± 11,1
13,3 ± 7,5
B 4,9 ± 3,0ab
5,4 ± 3,0a
4,5 ± 3,9ab
2,5 ± 1,3b
AR 77,8 ± 10,8
82,1 ± 10,8
80,0 ± 13,3
84,3 ± 8,1
IMP- Integridade de membrana plasmática; F - espermatozoides não capacitados com acrossomo intacto; B -
capacitados com acrossomo intacto e AR - com acrossomo reagido. Letras diferentes na mesma linha diferem
estatisticamente, Teste de Tukey P <0,05.
Os tratamentos não diferiram quanto à integridade de membrana plasmática, espermatozoides
não capacitados com acrossomo intacto (F) e espermatozoides com acrossomo reagido (AR) (P>0,05)
(Tabela 5). Houve diferença (P<0,05) para espermatozoides capacitados com acrossomo intacto (B),
mostrando que os tratamentos adicionados de extrato aquoso de noni apresentaram comportamento
semelhante ao tratamento controle e que o T2 mostrou-se superior ao tratamento com maior
concentração de extrato. Porém, o número de espermatozoides com acrossomo reagido (AR) foi
elevado em todos os tratamentos testados sendo superior aos encontrados por Gillan et al.(1997),
Azevedo (2006) e Sicherle et al.(2007) que trabalhando com espermatozoides de ovinos encontraram
27%, 51% e 54,1% respectivamente.
Após a congelação e descongelação do sêmen, o espermatozoide ovino exibe os padrões de
coloração produzidos pela clortetraciclina (CTC) típicos do espermatozoide capacitado. De acordo
com os padrões da CTC, ocorre uma diminuição na porcentagem de espermatozóides não capacitados
(F) e aumento na porcentagem de espermatozóides capacitados (B e AR) com o acrossomo reagido ou
não (PÉREZ et al., 1996; GILLAN et al., 1997).
A integridade da membrana plasmática é considerada importante para a qualidade seminal
devido a inabilidade dos espermatozóides em restaurá-la. Esta membrana atua no metabolismo celular,
na capacitação espermática, na reação acrossômica e na união dos espermatozóides à superfície do
óvulo (GONÇALVES, 2008). O processo de criopreservação pode haver alterações nas membranas
dos espermatozoides ovino tornando-o semelhante ao espermatozoide capacitado (GREEN E
WATSON 2001 e THOMAS et al. 2006).
A reação acrossomal tem sido utilizada como indicador de completa capacitação. Alguns
pesquisadores informam que os espermatozóides que sofreram reação acrossomal são mais
susceptíveis a desnaturação do DNA nuclear, observando-se uma relação direta entre a condensação
da cromatina e a capacidade fecundante do espermatozoide (WATSON, 1995; e PERIS et al. 2004).
Este elevado número de espermatozoides com acrossomo reagido (AR) pode ter sido causado pelo
processo de congelação e a não ação das substâncias com caráter antioxidante.
47
Tabela 6. Equação de regressão linear e coeficiente de correlação R
2 obtidos para extrato aquoso de noni
(µg/mL) em função das variáveis estudadas para sêmen descongelado.
VARIÁVEL FUNÇÃO Y= ax + b R2
Hiposmótico H1 Y = 34.64285x + 11.26596 0.1093
Hiposmótico H2 Y = 29.32030x + 9. 08471 0,0238
Motilidade H0 Y = 20.03704x + 6.58092 0.3698
Motilidade H1 Y = 37.58980x + 9. 50317 0.3495
Motilidade H2 Y= 54. 43730x + 9. 05871 0.2817
Vivos Final Y = 47.87818x + 9.97662 0.2480
VCL Y = 13. 67421x+ 24.98285 0.1460
VAP Y = 13.69435x + 15.74134 0.1327
CTC B Y = 35.90849x + 0.40257 0.1255 VCL- Velocidade curvilinear, VAP- velocidade do percurso médio, CTC B - capacitados com acrossomo intacto
Variáveis que apresentaram significância após ANOVA e submetidas aos efeitos de
regressão.
48
CONCLUSÃO
O extrato aquoso de noni quando adicionado ao meio diluidor a base de TRIS-Gema-Glicerol
para congelação de sêmen ovino é capaz de manter a função e a integridade da membrana plasmática
do espermatozoide.
49
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