mitochondriÁlnÍ proteÁzy
DESCRIPTION
MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY. Lukáš Stibůrek. INTRACELULÁRNÍ PROTEOLÝZA. Koncept „proteinového obratu“ – 40. léta minulého století Rudolf Schoenheimer na Columbia Univ – společně s Davidem Rittenbergem pokusy s 15 N-značenými AK - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/1.jpg)
MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY
Lukáš Stibůrek
![Page 2: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/2.jpg)
INTRACELULÁRNÍ PROTEOLÝZA
Koncept „proteinového obratu“ – 40. léta minulého století Rudolf Schoenheimer na Columbia Univ – společně s Davidem Rittenbergem pokusy s 15N-značenými AK
Lysozom – objeven v polovině 50. let Christian de Duve
ATP-dependentní proteolýza za nepřítomnosti lysozomů (retikulocyty) – 1977 Alfred Goldberg
Ubikvitin-dependentní proteolýza – 1980 Aaron Ciechanover et al. Institute of Technology, Haifa
2004 Nobelova cena – Aaron Ciechanover, Avram Hershko, Irwin Rose
![Page 3: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/3.jpg)
A. NESELEKTIVNÍ – MAKROAUTOFAGIE (Lysozom)
B. SELEKTIVNÍ –
– VNĚJŠÍ MEMBRÁNA – 26S Proteazom
– MEZIMEMBRÁNOVÝ PROSTOR, VNITŘNÍ MEMBRÁNA A MATRIX – Mitochondriální proteázy
• selektivní intramitochondriální proteolýza - různé poločasy života mitochondriálních proteinů
• ~5% mitochondriálních proteinů degradováno za hodinu – vysoká stabilita
• 5-10% nově importovaných preproteinů degradováno – efektivita mitochondriální biogeneze >90%
MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEOLÝZA
![Page 4: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/4.jpg)
MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY (funkční třídy)
1. Procesující peptidázy – odštěpení peptidů signalizujících mitochondriální lokalizaci
2. ATP-dependentní proteázy – kontrola proteinové kvality, proteolytická maturace mito proteinů
3. Oligopeptidázy – štěpení intramitochondriálních peptidů na aminokyseliny
![Page 5: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/5.jpg)
PROCESUJÍCÍ PEPTIDÁZY
Mitochondriální procesující peptidáza (MPP) – konzervovaná heterodimerní metalopeptidáza (, podjednotky)
Mitochondriální intermediátní peptidáza (MIP) – monomerní metalopeptidáza štěpící oktapeptid z preproteinů po jejich štěpení MPP
Peptidáza vnitřní membrány (IMP) – heterotrimerní komplex ukotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou exponovanou do IMS
Atp23 (KUB3) – konzervovaná metalopeptidáza se specifickou funkcí – štěpí presekvenci mtDNA kódované podjednotky Atp6 (yeast). Bifunkční charakter – dále funguje jako šaperon Atp6 při její asemblaci do komplexu ATP syntázy.
Rhomboidní proteáza (Pcp1/PARL) – serinová proteáza s katalytickou doménou uvnitř svých hydrofóbních membránových segmentů, štěpí transmembránové proteiny přímo v membráně
![Page 6: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/6.jpg)
ATP-DEPENDENTNÍ PROTEÁZY
– odstranění nadbytečných, poškozených a špatně sbalených polypeptidů, proteolytická maturace importovaných polypeptidů
ClpXP proteáza
– heterooligomerní komplex lokalizovaný v matrix skládající se z ClpP podjednotek se serin-peptidázovou aktivitou a ClpX šaperonových podjednotek zajišťujících rozpoznání a rekrutování substrátů– zevrubně charakterizovaná u prokaryot– proteolytická ClpP podjednotka chybí u kvasinek
LON proteáza
– homooligomerní serin-proteázový komplex lokalizovaný v mitochondriální matrix– afinita k mtDNA– její podjednotky podstupují proteolytickou maturaci
![Page 7: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/7.jpg)
ATP-DEPENDENTNÍ PROTEÁZY
AAA PROTEÁZY
Obsahují Walker A a B motivy v tzv. AAA doméně zajišťující vazbu a hydrolýzu ATP, dále pak proteolytickou doménu s konzervovanou HEXGH sekvencí
i-AAA proteáza – homooligomerní komplex podjednotek YME1 zakotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou v IMS
m-AAA proteáza – heterooligomerní komplex podjednotek Spg7 a Afg3L2 zakotvený ve vnitřní membráně s aktivní doménou v matrixSPG7 – hereditární spastická paraplegieAFG3L2 – hereditární ataxie SCA28
![Page 8: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/8.jpg)
OLIGOPEPTIDÁZY
• velmi málo charakterizované • delece genů pro mitochondriální oligopeptidázy nezpůsobuje kvasinkám žádnou popř. větší újmu:
– funkční redundance jednotlivých enzymů– existence ABC transporteru Mdl1 který zajišťuje export nadbytečných peptidů z matrix– spekuluje se o signalizační funkci těchto peptidů (retrográdní signál)
Thimet oligopeptidáza (Prd1/saccharolysin) – degradace peptidů produkovaných i-AAA proteázou
Mop112/PreP olygopeptidáza – degradace peptidů produkovaných i-AAA proteázou
Bleomycin hydroláza Lap3 – duální lokalizace (cytosol/matrix)
![Page 9: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/9.jpg)
YME1L je mitochondriální integrální membránový protein s C-koncem exponovaným do IMS, nativní molekulovou hmotností 600-1100 kDa a markantními rozdíly v tkáňové expresi
![Page 10: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/10.jpg)
Stabilní RNAi YME1L v HEK293 buňkách vede k efektivnímu snížení hladin YME1L mRNA
![Page 11: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/11.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede k efektivnímu snížení hladin YME1L proteinu, akumulaci Ndufb6 a Cox4 podjednotek a změně paternu fragmentů OPA1
![Page 12: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/12.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede k zpomalení proliferace takových buněk a k fragmentaci a zeslabení mitochondriální sítě
![Page 13: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/13.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede k abnormální morfogenezi mitochondriálních krist, po reexpresi YME1L-FLAG dochází k reverzi tohoto fenotypu
![Page 14: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/14.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede k akumulaci subkomplexů komplexu I a IV OXPHOS a snížené respirační aktivitě komplexu I
![Page 15: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/15.jpg)
Ndufb6, Cox4 a Cox2 jsou membránově lokalizovány a koimunoprecipitují s YME1L E543Q z YME1L RNAi buněk
![Page 16: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/16.jpg)
Reexprese YME1L-FLAG v YME1L RNAi buňkách vede k supresi akumulace Ndufb6 a Cox4, exprese Ndufb6-FLAG v HEK293 buňkách vede k indukci tvorby subkomplexů komplexu I
![Page 17: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/17.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede ke zvýšení citlivosti k oxidativnímu poškození (H2O2, 200 μM ) mitochondriálních membránových proteinů (DNP, 2,4-dinitrofenyl)
![Page 18: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/18.jpg)
Stabilní RNAi YME1L vede ke snížené rezistenci k staurosporinem (STS, 2μM ) a H2O2 (200 μM) indukovanéprogramované buněčné smrti (apoptóze)
![Page 19: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/19.jpg)
Koimunoprecipitace radioaktivně (35S) značených mitochondriálních translačních produktů s YME1L E543Q a jejich zvýšená stabilita v YME1L buňkách
![Page 20: MITOCHONDRIÁLNÍ PROTEÁZY](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062322/56814df7550346895dbb64a2/html5/thumbnails/20.jpg)
Mgr. Jana Česneková
Mgr. Daniela Fornůsková, PhD
MUDr. Laszló Wenchich, PhD
Mgr. Olga Brantová, PhD
MUDr. Josef Houštěk, DrSc.
Prof. MUDr. Jiří Zeman, DrSc.
PODĚKOVÁNÍ