İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK

I- GENEL BAKIŞ;

• KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİN

a) Çok iyi bir ÖYKÜ alınması

b) FİZİKİ İNCELEME yapılması

c) Uygun TANI TESTİNİN yapılması

ZORUNLUDUR

a)ÖYKÜ:

KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU NEDENLERİ(sıklık sırasıyla);

• ENFEKSİYONLAR (en sık) Yineleyen enfeksiyon

Çocuklarda bulaşıcı ÜSYE çok sıktır

Bu çocuklarda sekonder olarak

♣ Otit, sinüzit, bronşit gelişebilir

Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre daha sıksa

♣ Antibiyotik almayı gerektiriyorsa

Ig G alt sınıf yetersizliği vardır

Deri ve ÜSYE’nin;

♣ 6-12 aydan sonra başlaması

♣ Sık ve birincil olması

Ig yetersizliğini gösterir

Çok ağır enfeksiyonlar

Ağır viral enfeksiyonlar

T hücre yetersizliği

Ağır bakteri enfeksiyonlar

B hücre yetersizliğini gösterir

Fırsatçı mikroorganizmalarla enfeksiyon

Hastane enfeksiyon etkenleri

KİT’ de CMV enfeksiyonu

Doğal ve özgül immunitede

♣ Özellikle T hücre bozukluğu

Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyon

Aspleniklerde

Pnömokok enfeksiyonu

Enflamasyonsuz enfeksiyon

Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerde

Pyojenik bakterilere dirençsizlik

Kronik enfeksiyon

Kronik ishal yada büyüme bozukluğu olanlarda

sIgA yada T hücre yetersizliği

♣ Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu

• İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI;

HASTALIK BELİRTİLERİ

Allerjik

Artrit

Deri değişiklikleri

MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ BELİRTİLER

b)FİZİKİ İNCELEME:

• Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı; VARSA;

Hastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesi

• Hastalarda; Solgunluk

Kanama odakları

Deride kolay morarma

Döküntü

• Hastanın; Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı

Büyüklüğü saptanmalıdır Ağır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmez

Bademcikler görünmez

• Normal bebeklerde dalağın alt ucu ele gelir Ancak dalak yokluğu (aspleni ile) Bakteriyel (kapsüllü) enfeksiyonlar sıktır

• Ağızda pamukçukların olması

T hücre yetersizliği

Candida sp

• Bazı özel sendromlara spesifik; Hastalık ve/veya bulguların olması Di George sendromunda

Neonatal tetanoz ve KKH

Wiskott-Aldrich sendromu

Egzama

Kolay kanama eğilimi

Peteşi

c)TANI TESTLERİ:

• UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK?

Hastanın kliniğine paralel doğru seçilmiş

Laboratuvar da özenle yapılmış

Sonucu titizlikle açıklanmış testtir

• UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN NEDENLERİ

İmmun sistem çevre ile dinamik bir dengede olduğu için;

Çoğu testin spektrumu geniştir

İmmunolojik testlerin BAZILARI;

BİOASSAY (yaşam sürecinde inceleme) olduğundan

Test sırasında kontrol edilemeyen değişken faktörlerden etkilenirler

Bundan dolayı testler

♣ Aynı yaş ve zamanda

Hasta ve kontrol gruplarında yapılmalıdır

Bazı testler ilgili laboratuvarda az yapılır Bundan dolayı

Bu birim sürekli nitelik kontrolü yapması gerekir

Test sonuçları Klinik durumla paralel açıklanması gerekir

ÇÜNKÜ;

Başka ikincil hastalıklar

Veya metabolik bozukluklar sonuçları etkiler

İmmunolojik testler Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı laboratuvarlar

gerektirdiğinden pahalıdır

IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK ÖRNEKLER

• Venöz damardan kan alınabilir • Mikrobiyal antijen tayini ile ilgili Serum, dışkı, balgam, idrar, Boğaz salgısı, BOS, PMNL Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar

• Humoral immuniteyle (antikor tayini) ilgili Serum (antikoagulansız kan)

• Hücresel immuniteyle ilgili Heparinlenmiş taze kan ve eriyik maddeler İnvivo uygulamalar (cilt testleri)

• İmmuno genetik çalışmalarla ilgili Kan örnekleri Taze veya fikse edilmiş dokular

ENFEKSİYON HASTALIKLARININ TANISINDA

• İmmunolojik (Serolojik) Testler ♦ Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla indirekt,

(bazende direkt) yardımcı olurlar

♦ Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara özgül antijen (Ag) veya antikorları (Ab) arama testleridir

♦ Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve tedavi edilmeyen durumlarda yüksektir

♦ Ab araştıran testlerde primer immun yanıt 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken evrede yalancı negatif olabilir

♦ Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği olan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedir

♦ Bu testler Ag-Ab birleşme temelli testlerdir ♦ Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı YÖNTEMLERLE invitro olarak yapılmaktadır ♦ Bu yöntemlerin ANALİTİK duyarlılığı farklıdır

– Hücresel İmmun Yanıt (Fakültatif yada zorunlu H.İ.B) gelişir

• İnvivo deri testleri • İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da Quanteferon

sentezleyen hücre miktarı ölçülür.

İmmunolojik yöntemlerin analitik duyarlılıkları (µg/ml- ng/ml)

Yöntemler Analitik duyarlılıklar

Protein elektroforezi 100 mg/dl

Immun elektroforez 5-10 mg/dl

Tek Yönlü Immundiffüzyon <1-2 mg/dl

Çift Yönlü Immundiffüzyon <1 mg/dl

Elektroimmundiffüzyon <0,5 mg/dl

Nefakometre? 0.1 mg/dl

Aglütinasyon/KBD 1 mikrog/dl

RIA-EIA-FIA- Kemilüminesans-IA <5pg/ml

Presipitasyon

MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I)

1- TANIDA;

• ÖRNEĞĠN; VĠRUSLARIN TANIMLANMASINDA;

♦ Kültürle izolasyonu;

• Olanaksız, güç veya uzun zaman aldığından

• örneğin HIV enf uygun hayvan yok

• Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar gerektirdiğinden

• Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport etmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayı

• RUTĠN TANIDA PRATĠK DEĞĠLDĠR

VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I)

*Viruslerin mikroskobisinde;

-EM ve inklüzyon cisimciği aranmasının

pratikte kullanımı sınırlı, zahmetli ve pahalı olması

-Subjektif değerlendirmelere (deneyimli eleman) açık olması, yalancı pozitiflik ve negatiflikler olabilir

VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I)

♦Viral nükleik asidin saptanmasında;

-Moleküler Yöntemlerin

*Her sağlık merkezinde uygulanamaması

* Uygulandığı laboratuvarlara teknik donanım yetersizliği ve deneyimli ekipman azlığı

* Her virus için deneysel olarak optimize edilememesi

-Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu

* Her virus için uygulamasının olmaması

- Özgül primer sorunu

• Mikrobiyal Enfeksiyonlarda İmmunolojik (serolojik) Test Yöntemlerinin amacı; ÖRNEĞİN; BAKTERİYAL ETKENİN TANIMLANMASINDA

İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği durumlar;

Lepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi

Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya üretmede zorluk;

Coxiella endokarditinde endokard örneği almak veya kanda üretme zorluğu

Legionella, Chlamydophila, atipik pnömosinde BAL yada NFS almak veya üretme zorluğu

Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede:

ARA veya AGN’ de ASO düzeyi

Tifo’da Anti-Vi varlığı

MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ (I)

Antikor tayin temelli dört kriter vardır

a) Tek bir serum örneğinde; Yüksek titrede spesifik IgM yanıtı -Rubella IgM, M.pneumoniae IgM Veya IgM negatif IgG pozitif ise; Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra) serumda

4 kat titre artışı -EBV IgG, C. pneumophila IgG ≥512

b) Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda 4 kat titre artışı Total antikor yanıtında

Paul Bunnel testi (EBV)

Bruselloz tanısında Wright Testi

1/20den > 1/160 c) Nadir görülen enfeksiyonlarda; Tek serum örneğinde Özgül IgM antikor yanıtı

Kuduz, Botulismus

d) IgG AVİDİTE TESTLERİ

AFİNİTE: Multivalan bir antikorun monovalan bir antijenle bağlanma kuvveti

AVİDİTE: Multivalan bir antikorun multivalan bir antijenle bağlanma kuvveti

Olası Serolojik Profiller

IgG (-) IgG (+) IgG (+) IgM (+) IgM (-) IgM (+) Yeni Önceden Kazanılmış Geçirilmiş ve enfeksiyon Kazanılmış Bağışıklık

Primer ve sekonder enfeksiyon

ayırımında kullanılır

BU DURUM;

Re-enfeksiyonlarda

Toplumda yaygın dolaşan viruslar;

CMV, HSV gibi

Re-aktivasyonlarda

CMV, HSV, EBV, VZV gibi latent viruslar

Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası Uzamış

Serokonversiyonda GÖRÜLEBİLİR

Toksoplazmoz

IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (I)

• Primer enfeksiyonlarda viruse özgül IgG aviditesi düşük; Sekonder enfeksiyonlarda Yüksek

Re-enfeksiyon/aktivasyon

Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere bağlanma gücü artar Bunun nedeni;

Yüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendir

• İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA SÜRELERİ

CMV 4 ay

RUBELLA 2 ay

TOXOPLASMA 6 ay

EBV 2.5 ay

HIV 6 – 12 ay

IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (II)

• Hamile kadınların;

CMV, Rubella konjenital enfeksiyonlarında;

Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında önemlidir

Enfeksiyon primerse konjenital geçiş yüksektir

Sekonder ise virusun geçişi düşüktür

• Immunsuprese Olgularda

CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonların primer yada sekonder ayrımında kullanılır

• ETKENİ TANIMLAMADA ANTİJEN TAYİNİ: Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı yöntemleriyle

• Doğru yerden ve uygun şekilde alınan örneklerde Ag tayini PMNH / pp65’in IF ile CMV tanısı

Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile HBV tanısı

C.trachomatis Ag tayini ancak epitel hücre içeren üretral yada endoservikal sürüntü yada akıntı

H.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada katı olmayan dışkı

Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar;

• İzolasyonda(Kültür) sorunlar

– Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında;

» Örn: - C. trachomatis

- L. pneumophila

– Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların tanısında;

» Bakteriler

- H.pylori

» Viruslar

- CMV/pp65

» Parazitler

- E. granulosus

» Mantarlar

-C. neoformans

• Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-CİDDİ durumlarda;

– Özellikle mikrobiyal menenjit tablosunda

» Örn: S.agalactia yenidoğan menenjiti

– Tonsillofarenjit

» S.pyogenes

• Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik Tanısında – C. difficile

• Karışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısında – Campylobacter

• İndirekt bakteriyal tür tanısında – Shigella spp

Immunolojik(Serolojik) tanı neleri amaçlar?(II)

2. Enfeksiyon hastalığını doğrulama Direkt Aglutinasyon Testi

-Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı hasta serumundaki antikor yanıtının saptanması

M.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon testi HIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanması

3. Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama

Anti-HAV IgG, Anti-HBs

4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immuno tiplendirilmesi E. coli’de ETEC, EPEC gibi

5. Hastalığın prognozu HAV IgM yanıtı,

HBV’de hepatit belirteçleri

Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Klinik Örnek Uygunluğu

• Serum, plazma, plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku kesitleri • Ab Arama amaçlı serumun eldesi aseptik koşullarda olmalı ve

Hemolizli, lipemik, fibrinli olmamalı

• Ag Arama temelli klinik örnekler; CMV/ pp 65 PMNH bakılabilir RSV/Ag Nazofarengiyal yıkama suyu veya aspirat

• Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Örneğin: Soğuk aglütinasyon • Taze serumla çalışılmalı,

Çalışılamıyorsa; Testlerin özelliğine göre 40C, -22, -40, -700C’

de saklanmalı

• Serumlarda dondurma ve çözme işlemi bir kez yapılmalı • Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Örneğin: HIV’de ortalama 1.5 ay sonra

Serolojik Tanıda İnvitro Test Prensipleri

IgG’nin moleküler yapısı

Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birleşmesinin özellikleri

• Antijen-antikor birleşmesi kimyasal bir reaksiyondur – Çünkü ısı açığa çıkar

• Özgül bir reaksiyondur – S. flexneri‘ye karşı hazırlanan Ab

– S. dysenteria ile birleşmez

• Geriye dönüşür bir reaksiyondur

– Ag+AbAgAb

– Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile gösterilen denge sabiti ile açıklanır

• K=(AgAb) / (Ag) (Ab)

• K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür.

• Antijen ve antikor uygun oranlarda bir araya

getirildiğinde maksimum reaksiyon oluşur

• İki safhalı reaksiyondur: 1. safha;

-Çok kısadır, Gözle görülmez

-Elektrolitlere gereksinim yoktur

2. safha;

- Uzundur, gözle görülür.

- Elektrolitlere gereksinim vardır.

- Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır

Antijen-antikor birleşmesinde rol oynayan kuvvetler

1- Elektrostatik kuvvetler - Ag ve Ab moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü

yapıların birbirini çekmesidir - Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki uzaklığın

karesi ile ters orantılıdır. F=(1/d2) -Bu kuvvetler Ag ve Ab birbirine yaklaştıkça artar - Örneğin NH+ grubu ise iyonize COO- grupları birbirine çeker.

2- Hidrojen bağları -Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır

-Zayıf ve geriye dönüşümlü bağlardır -Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine yaklaşması

gerekmektedir.

3- Hidrofobik bağlar

- Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması

sırasında su moleküllerini iterek birleşmesinde etkendir

4- Van der Walls kuvvetleri

- Bu kuvvetler Ag ve Ab molekülünü saran elektron

bulutları ile ilgili kuvvetlerdir.

- Bu kuvvetlerin etkinliği için Ag ve Ab moleküllerinin birbirine çok yaklaşmaları gerekir.

- Bu kuvvetlerin etkinliği Ag ve Ab arasındaki uzaklığı 7 ile ters orantılıdır

F=1/d7

SEROLOJİK TEST YÖNTEMLERİ 1)PRESİPİTASYON;

• Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorların Optimum konsantrasyonda karıştırılması ve Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona denir Reaksiyon sonucu

Kompleks (presipitat)gözle görülür Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar

uzayabilir • Reaksiyonda Optimum Ag ve Ab miktarı önemlidir AYRICA;

PH, elektrolit ve ısı da önemlidir

Presipitasyon reaksiyonları;

• Pasif difüzyon şeklinde Sıvı ortamda difüzyon

Halka ve kapiller tüp

N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae Ag

Jel (agar)ortamda difüzyon

Tek yönlü difüzyon

Quidin tüp dif.

Çeşitli virus ve bakteri Ag belirlenmesinde kullanılır

Radyal, Mancini plak dif.

CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri

♣ Türbidimetrik ve nefolometrik cihazlar geliştirilmiştir

♣ Çok sayıda kan değerlendirilmesi için

Çift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyon

Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesinde

Immuno-double diffusion

■ ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda;

Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez)

Elektroforez için değişik matriksler;

Kağıt

Sellüloz asetat

Agar

Poliakrilamid kullanılır

İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine

İMMUNELEKTROFOREZ denir

Serum proteinlerinin tanımlanmasında

Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasında

Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi)

♣ Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler

Karşıt( zıt yönlü) IEF

♣ HBV Ag ve Ab saptanmasında

♣ Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen saptanmasında

2) AGLUTİNASYON: • Doğal olarak antijen taşıyan

Bakteriler, Eritrositler, Lökositler

• Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan Eritrosit, Latex, Bentonit

Polistren gibi sentetik parçacıkların

Elektrolitli bir ortamda

Taşıdıkları antijenlerle,

Spesifik antikorların

♣ Kümeleşme yaparak çökmesine denir

• Lamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlar

• İkiye ayrılır Aktif aglutinasyon

Pasif aglutinasyon

• AKTİF AGLUTİNASYON;

DİREKT

Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün kendisidir Bakterilerin antijenleri

Gruber- Widal, Wright, WF

Kan grubu antijenleri

Aktif hemaglutinasyon

♣ ABO, Rh, Vd

Forward

Reverse

♣ Cross-Matching

Major

Minor

♣ Soğuk aglutinasyon

M.pneumoniae ♣ Paul- Bunnel

EBV

• AKTİF AGLUTİNASYON; İNDİREKT Antijen ve antikorun bağlanmasında

ikincil bir antikorun kullanılması

Antiglobulin Ab (tavşan kaynaklı - ticari)

Direk Coombs ♣ Eritroblostasis fetalisli

çocukların eritrosit yüzeyindeki Ab saptanır

İndirekt Coombs ♣ Rh (-) annenin serumdaki

Anti-Rh Ab’ler saptanır

PASİF AGLUTİNASYON

• ANTİKOR (Ab) ARANIYORSA

Aglutinasyonda rol alan antijenler

Polisakkarit veya

Proteinler (tannik asitle)

Eritrosite bağlanırsa

♣ HEMAGLUTİNASYON

VZV, Rubella, CMV, T.gondii

Latex partikülleri, bentonit, kömür vb

PASİF AGLUTİNASYON • ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA;

Eritrosit, latex, bentonit, kömür

S.aureus covan 1

Antikorun Fc’sine bağlanır

Latex Agg (LA)

Ko Agg (CoA)

♣ Serum, BOS, idrarda

Bakteriyal polisakkarit Ag’leri

N.menengitidis

Hib

S.pneumoniae

C.neoformans

Streptokok gruplandırılması,

S.aureus koagulaz deneyi

Çeşitli bakteri ve virusta ag tayinleri

• Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi Hemaglutinasyonu engelleyici antikorların

saptandığı testtir

Hastanın serumu seri dilusyon edilir

Üzerine standardize sabit virus antijeni konulur

Eritrositler eklenir

Serumda Ab’ler varsa

Hemaglutinasyonun görülmediği son titre pozitif sonuçtur

İnfluenzae, Kabakulak, Rubella enfeksiyonlarında

3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ

• Antijen ve antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir

• Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir

• Test birbirinden farklı üç komponent içerir Test sistemi Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)

Antijen (bilinen)

KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum)

İndikatör sistemi (hemolitik sistem) Koyun eritrositleri

Koyun eritrositlerine karşı Ab

DEĞERLENDİRME; • Hasta serumunda Ab varsa

Ag ve Ab birleşecek (klasik yol)

C, Ag ve Ab’ye bağlanacak

Ortamda C kalmayacağı için

Hemolitik sisteme bağlanamayacak

Hemoliz olmayacak

Bazı viral, riketsiyal ve fungal hastalıkların tanısında

1990’lı yıllarda Sifiliz için KOLMER

4)FLOKÜLASYON

– Kardiolipin antijenin sifilitik hasta serumlarındaki reaginlerle birleşerek oluşturdukları,

– VE; Toksin ile anti toksinin uygun miktarda karşılaştıklarında meydana getirdikleri

KÜMECİKLERE denir

– Bu kümecikler gözle yada küçük büyütmelerle görülebilir.

Toksoid aşıların miktar tayininde kullanılır

AYRICA;

Sifilizin tarama testlerinde;

Rapid plazma reagin (RPR) direkt, VDRL kadar ise serum inaktif edilerek çalışılır.

Bunlar tüplerde veya özel lambalarla kalitatif (RPR) ve kantitatif (VDRL) olarak yapılabilirler.

RPR, 4+’dan (-) kadar, VDRL de ise ½ den başlayan ve yukarı titrelere kadar varan titrede sonuç verilir.

5)NÖTRALİZASYON

• Bir virusun enfektivitesini Özgül antikoru ile etkileştikten sonra Kaybetmesine denir. Enfektiviteyi nötrleyen antikorların ortaya çıkarılması testidir.

BİRÇOK VİRAL ENFEKSİYON TANISI Nötrolizan Ab’lerin saptanması Çift serumda Ab titresinin artışıyla sağlanır Poliovirus/Serum Doku Kültürüne

Kabakulak virusu/Serum Embriyonlu Yumurta

Kuduz Aşısı/Serum Fareye

• Nötralizasyon İnvitro ve invivo yapılabilir İN VİVO 3 ŞEKİLDE YAPILABİLİR: Deney Hayvanlarında En sık Fare kullanılır

Doku Kültüründe

En sık bu yöntem kullanılır

Prensip CPE’nin yok edilmesidir.

CP’nin görülmediği titre nötr. titresidir.

Embriyonlu Yumurta İnfluenzae- Kabakulak Allantoik keseye Çiçek-Herpesviruslar Karioallantoik zara

İN VİTRO OLARAK ASO deneyi

AGBHS’ de Streptolysin O’ya karşı Anti- Streptolysin O oluşur

Nötrolizasyon sonucu İndikatör olarak eritrositlerde erime olmaz

METABOLİK İNHİBİSYON TESTİ • Nötralizasyon Testi gibidir

• Virus/Serum karışımı

• Üzerine hücre süspansiyonu konur

• Fenol kırmızısı(İndikatör)

Nötralizasyon varsa renk SARI

Nötralizasyon yoksa renk KIRMIZI

Örneğin; Enteroviruslarda renk kırmızı kalır, Adenoviruslarda renk değişikliği olur.

G)İMMUNOASSAY TESTLER • İşaretli antikorların kullanılmasıyla 1942’de; FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) 1954’de; IFA (İndirekt Fluoresan Antikor) 1960’da; RIA (Radyoizotopla- iyotla) 1970’de; EIA (enzimle) kullanıma girmiştir Antikor yada antijen saptamak

için kullanılırlar

I- İmmun Fluoresan (IF) testler

• FLUORESANS

Fluorokrom veya florofor boyaların

Ultraviyole ışık altında

Işık enerjisini emerek

Bu enerjiyi farklı dalga boyuna çevirmesine denir

• Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat (FITC) ile işaretlenir. BUNA GÖRE; Direk fluoresan antikor (DFA)

Katı fazda klinik örnek (Ag) Üzerine FITC’li Ab Pozitif sonuç (fluoresan-yeşil görüntü)

Bakteri ve viruslerin hızlı tanıda

♣ Kuduzda negri cisimciği

♣ Kolera tanısında

İndirek fluoresan antikor (İFA) Katı fazda hazır Ag Hasta serumu(aranan Ab) FITC’li Anti-Ig Pozitif sonuç (fluoresan görüntü)

Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast.

♣ FTA- Abs (T.pallidum)

♣ ANA, AMA vb

• IF yöntemiyle klinik örneklerden hem Ag hem Ab aranır • Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi gereklidir

II-Radioimmuno Assay (RIA)

• Yöntem aynı IF ve EIA gibidir

• Antikorda işaretliyici madde olarak

Radyoaktif madde I. 125 ve I. 132 kullanılır

Gamma sayaçlarında değerlendirilir

Radyoaktif madde kullanımından dolayı sınırlıdır

Özellikle hormon testlerinde (TSH, T3, T4) kullanılır

Radyo allergo sorbent (RAST) deneyi

Allerjene spesifik IgE tayininde kullanılır

Radioimmunosorbent (RIST)

Serumda total IgE tayininde

VI. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbend Assay)

– Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidir Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz gibi enzimler Spesifik substratları renkli ürünlere çevirirler

Peroksidaz/Orthofenilendiamin Alkali fosfataz/Nitrofenil fosfat

Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga boylarında olurlar

– Yöntemin; Kullanılan reaktifler uzun ömürlü olması Artık maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmaması Uygulamasının basit ve otomatize edilebilmesi yönleriyle

Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve IF’ye göre avantajlıdır

• Dezavantajları ise;

Antijen saptamada klinik örneğin uygunluğunun değerlendirememesi

Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag yoğunluğu saptanmaması

IgM saptanmasında RF-IgM ile çatışmanın olması

Bunun için Absorblama işlemi olması

– Antijen veya antikorun çeşitli vücut sıvılarında <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek ANALİTİK DUYARLILIKTA olması

– UYGULAMA PRENSİPLERİ

Ag ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilir

Katı faz olarak; Plastik tabanlı mikrotitrasyon plakları

Boncuk veya filtre kullanılır

Bazı ELIZA uygulama şekilleri:

1)İNDİREK ELIZA ile Ab Tayini

• Ag kaplı kuyucuk

• Hasta serumu (Aranan Ab)

• Yıkama

• Enzim işaretli ikincil Ab

• Yıkama

• Substrat

• H2SO4 (Reaksiyonu durdurur)

• Spektrofotometre

Yarışmasız İndirekt ELISA ile Ab saptama

2)Sandwich ELIZA ile Ag Tayini

• Katı yüzeyde capture monoklonal yada poliklonal

• Ag içeren hasta serum örneği

• Yıkama

• Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada poliklonal

• Yıkama

• Substrat

• H2SO4 (Reaksiyonu durdurma)

• Spektrofotometrede okuma

3) İNDİREK SANDWİCH ELIZA ile Ag Tayini

• Katı yüzeyde capture Ab

• Ag içeren hasta serum örneği

• Yıkama

• Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene bağlanır

• Ag iki antikor arasında kalır

• Enzimle işaretli ikincil Ab saptayıcı antikora Fc bölgesinden bağlanır • HRP ile işaretli

• Yıkama

• Substrat

• H2SO4 (Reaksiyonu durdurma)

• Spektrofotometrede okuma

4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA:

–Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır) Katı yüzeyde Ab

Şüpheli serum (Ag aranan klinik örnek) ve enzimli işaretli antijenin beraber konulduğu antijen rekabet (Competetive) yöntemidir.

İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, substratla da birleşir RENK OLUŞUR.

Bu sonuç klinik örnekteki Ag’nin olmadığı bir sonuçtur.

Fakat klinik örnekteki antijen katı faza bağlanırsa enzim olmadığından substratla reaksiyon olmaz. RENK OLUŞMAZ.

5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA:

Sıklıkla;

Enfeksiyoz etkene yönelik,

Spesifik IgM ve IgG saptama testidir

1)Spesifik Ag saptama Katı faza poliklonal veya M.ab’lar konulur Poli Ab’ler,

M Ab’lere göre

Farklı Ag epitoplarını

bağladığı için güvenilirdir

2)Spesifik Ab (IgM) saptama

• Katı faz formu IgM’in Fc bölgesine karşıt anti-IgM Ab katı faza

bağlanır

Üzerine hasta serumu (IgM?) konulur

Üzerine viral antijen

Enzimle işaretli antikor

Substrat…

• Konjugat faz formu Katı fazda viral Ag

Hasta serumu (IgM?)

ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab (KONJUGAT)

Substrat…

• UYGULAMA CİHAZ SİSTEMLERİ – MİKROELİSA TEMELLİ AÇIK SİSTEMLER

Klasik Cihazlar

İlk yıllarda kullanılan bağımsız yıkayıcı ve okuma cihazlarından ibaret sistem

Yarı Otomatik veya Tam Otomatik Cihazlar Örnek yükleme, Yıkama ve okuma cihazları entegre

sistemler

• MAKROELİSA TEMELLİ KAPALI SİSTEMLER

– Kan bankası rutin çalışmalarına son yıllarda giren sistemlerdir.

– Çalışma sistemleri ve Prensipleri; Kapalı bir cihaz ve bu cihazda çalışmaya uygun kitler ile

cihaza bağlı bilgisayar ve yazıcı.

– Piyasada en sık bulunan sistemlerde kullanılan kitler; Enzyme-linked flureskent assay (ELFA) Mikro partikül enzim immuno assay (MPEIA) Fluoresan polorizasyon immuno assay (FPIA) Chemiluminescent Assay (CA) yöntemleri ile

çalışmaktadır.

MİNİ VİDAS-ELFA

• Bu sistemlerin; – BAŞLICA AVANTAJLARI

Duyarlılık ve özgüllükleri yüksektir.

Tam otomatik (inkübasyon, yıkama, reaktif pipetleme işlemleri) 24 saat kesintisiz çalışmaktadırlar. Açık sistemlere göre kontaminasyon, teknisyen hataları son derece azalmaktadır.

Random acces(Rastgele erişimli) Çok sayıda farklı testi aynı anda ve aralıklı yapan sistem

İstenilen bir test istenilen bir örnekten istenilen bir durumda(acil)yapabilmeye uygun

STAT girişli (tek örnek ve bir örneklik reaktif kullanımı) olmalarıdır.

Reaktif kompartmanlarının 2-8 0C sahip olmalarıdır ve cihazlarda atık torbalarının olması.

Bunların yanında gerek cihaz donanımı gerek kitlerin hazırlanma tekniklerine ilişkin olarak avantajları vardır.

–DEZAVANTAJLARI Kurumu tek cihaza ve buna bağlı olarak tek kite zorunlu

kılmaları

Açık sistemlere göre pahalı olmaları

IV-WESTERN- BLOT • Viral lizat veya rekombinant antijenler Sodyum dodesilsulfat yardımıyla

(SDS) POLİACRYLAMİD JEL zemininde, molekül ağırlıklarına göre elektroforetik

olarak ayrılır. • Polipeptit antijenler, ikinci bir elektroforez ile NİTROSELÜLOZ MEMRAN

ŞERİTLER ÜZERİNE transfer edilir. • Hasta serumu ile şerit üzerindeki antijenler özel bir testte temas ettirilir

(elektroforetik yöntem) • Hasta serumunda aranılan antikorlar varsa, şerit üzerindeki antijen

bulunan BANDLARDA RENK KOYULUĞU (KOYU-ZAYIF-RENKSİZ) oluşur. • Kitin internal Pozitif ve Negatif kontrollerindeki band renkleri

değerlendirmede önemlidir. • Ve band için, HANGİ ANTİJEN VARSA REAKTİF kabul edilir. • Şeritlerin üzerindeki bandların pozitifliğine göre o hasta için, etkenin

sonuç virulansı patternlerine göre POZİTİF-NEGATİF VEYA SAPTANMAYAN sonuç verilir.

Etkene özgü IgM, IgG, IgA antikorlarına göre test yapılabilir. HIV, H.pylori ve T.pallidum enfeksiyonlarının tanısında

özgüllüğü yüksek olarak kullanılmaktadır.

Western blot (WB)

III-HÜCRESEL İMMUNİTE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

• HÜCRESEL İMMUNİTEYE YÖNELİK TEST YÖNTEMLERİ

İKİ BAŞLIK ALTINDA İNCELENİR

A) İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİ

B) İNVİVO TEST YÖNTEMLERİ

A)İNVİTRO TEST YÖNTEMLERİ 1)LÖKOSİT SAYIM VE FENOTİPLEMESİ

• LÖKOSİT SAYIMI

Mikroskopik yöntemlerle

Hemositometrik hücre sayımı

Işık mikroskobu (40’lık)

Thoma ve Neabaur lamları

%0.4’lük tripan mavisi

♣ Rutinde Pek kullanılmıyor

Gelişmiş immuno hemotolojik cihazlar

En uygun yöntemdir

Piyasada farklı firma cihazları var

• LÖKOSİT FENOTİPLEMESİ Vücudun değişik bölgelerinde

Kemik iliği, kan, dalak ve lenf nodüllerinde

Lökositlerin sayı ve tipleri

♣ Lenfositlerin

B lenfositleri

T lenfositleri

T4 ve T8

♣ Monositlerin

♣ Granülositlerin

Nötrofiller

Bazofiller

Eozinofiller

İmmuno hematolojik cihazlar,

Flowsitometrik cihazlarla

Hücre yüzey moleküllerinin (Marker) fenotiplemesi

CD (cluster of differntiation – farklılaşma kümeleri) antijenleri

Hematopoetik hücrelerin yüzeyinde yer alırlar

250’ye yakın CD tanımlanmıştır

♣ Örneğin CD4 T, CD8 T, CD45 B lenfosit gibi

Lökositlerin yüzeyindeki CD antijenik epitopları

♣ Monoklonal antikorların (MAbs)

Fluoresan boyalar

Enzimlerle konjuge edilerek

Fluoresan mikroskobuyla

Flow sitometri cihazlarıyla( EN SIK)

* Kantitatif analizi ve

* Hücre ayrımı ve tanımlaması yapılır

FLOWSİTOMETRİ

ÇALIŞMA PRENSİBİ;

• Fluoresanlanmış (FITC ile) M Ab ile işaretlenmiş hücreler

• Sıvı bir ortamda sıra halinde uyarıcı ışıktan (Argon lazer) 488nm’de geçirilirler

Uyarıcı ışığı

Hücreler kırarlar veya

Florokromla işaretlenmiş m Ab’lerin bağlandığı hücre tarafından emilir ve yayılır

Bu yayılan ışığın şiddetini ve niteliğini algılayan dedektörler bilgisayara aktarırlar

Buna göre;

♣ Hücrenin tipi ve sayısı belirlenir

1’den 10’a kadar renk eklenebilir – ve bu sayı artmaktadır

• KLİNİK KULLANIMI

Lökosit fenotiplemesi (EN SIK)

Konjenital veya kazanılmış immun yetersizlik tanısı (en sık AIDS)

HIV pozitifliğinde prognoz değerlendirilmesi

İmmun yetersiz hastalarda immuniteyi yada kemoterapi monitörizasyonu

KİT yapılan hastalarda yeni immun durumun takibi

Tümör hücre fenotiplemesi

Lösemi ve lenfoma tanı ve sınıflaması

B lenfositlerinde klonal tayini ve lenfoma ve lösemi ayırımında

Hücre içi antijenlerin (myeloperoksidaz miktarı) tayini

Hematopoetik hücrelerin (CD4)

Hematopoetik olmayan

Tümörler ve hücrelerden ayırt edilmesi

• DNA analizi

Anöploidi tayini

Hücre siklüsu kinetiğinin belirlenmesi

Apoptozis

• Nötrofil fonksiyon analizleri

O2’nin oluşumunun tayini ile;

Granulomatoz hastalık tayini

• Diğer kullanım alanları

Retikülosit sayımı

Transplant hastalarında Cross-Match

Sitogenetik

• ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA

Mikroorganizma- hedef hücre ilişkisi;

Apoptozisin incelenmesi

HIV ile enfekte kişilerde

♣ Monunükleer hücrelerinde apoptosis oranları

CD8 T ve

CD19 B hücrelerinde en sıktır

Konak hücreye ait proteinlerdeki değişimler

EBV ile enfekte B lenfositlerinde;

♣ BCR2 ekpresyonu

HIV ile enfekte T lenfositlerinde;

♣ CD4 ekpresyonu

CMV ile fibroblastlarda;

♣ MHC I ekpresyonu

Mikroorganizmanın hücreye bağlanmasının incelenebilmesi

EBV’nin ♣ B lenfositlerine

♣ Epitel hücrelerine

CR2 reseptörüne

Poliovirus ♣ MNH CD14 reseptörlerinde

Kızamık virusu ♣ Hedef hücrelerin CD46 reseptöründe

Hücre içi ve yüzeyi mikroorganizma antijenlerini inceleme VZV ile enfekte hücre yüzeyinde

♣ gp1

HIV ile enfekte CD4 T lenfositlerinde

♣ gp 160/120

İnfluenzae ile enfekte hücrelerde

♣ HA antijenileri

Klinik virolojide kullanılmaktadır Enfekte kişilerin hücrelerinden

Virusle enfekte olanları süratle belirler

♣ CMV ile enfekte MNH’ler kantitatif olarak

♣ HIV seropozitif kişilerde

MNH’ lerde kantitatif Ag tayini Böylelikle;

*Antiviral tedavinin izlemi

Spesifik antikor tayini

CMV, HSV, HIV gibi viruslara

H. pylori gibi bakterilere

T.gondii gibi parazitlere karşı

Gelişen spesifik Ab’ler ölçülebilir

2-LENFOSİT SAYIMI VE AKTİVASYON TESTLERİ a) Lenfosit izolasyonu

• Dansite- Gradient Santrifüj Yöntemi Kan hücre grupları birbirinden farklı dansite özelliğine

sahiptir 3 ml ficol-isopak (Dansite 1077 gr/lt) konur

3 ml heparinli periferik kan konur

1500 devirde, 45 dakika santrifüj edilir

Lenfositler orta tabakada yoğunlaşırlar

En altta eritrosit ve granülositler

♣ Dansiteleri 1077 ‘den fazla

En üstte buff-coat toplanır

♣ Dansiteleri 1077’den düşük

♣ Buff- Coat’dan

Trombositler (santrifüj)

Monositler petri kabında tutularak uzaklaştırılır

b) Lenfosit ayırımı

• T lenfosit ayırımı

Rozet testi

Koyun eritrositlerine karşı CD2 reseptörü vardır

Periferik kanda E-Rozet yapan

%65-70 T lenfosit vardır

B lenfositi E-Rozet yapmaz

• B lenfosit ayırımı Direkt immun fluoresan yöntemi

Fluoresanlanmış (FITC) anti- Ig Ab ile yapılır

Toplam lenfositlerin %20-25’i B lenfositleridir

• Periferik kandaki

T ve B lenfosit oranını saptamak İmmun yetmezlik hastalıklarının tanısında

Lenfosit lösemi ve lenfomadaki lenfosit tipinin tayininde

Otoimmun hastalıklar ve kanserli olgularda hücresel immun yanıtın değerlendirilmesinde kullanılır

• NK sitotoksisite ölçümü Antikora bağımlı hücresel sitotoksisite

ölçümü CR 51 ile işaretlenmiş ve yıkanmış hedef

hücrelere Anti- hedef hücre Ig G ile FcR bulunan effektör hücreler (NK, makrofajlar)

eklenir Hedef hücrelerden CR 51 salınır Gamma sayacında CR 51 ölçülür CR 51 miktarı, ♣ NK hücre sayı ve aktivite düzeyi ile

doğru orantılıdır

c) Lenfosit Aktivasyon testleri(LAT) • Lenfosit uyarımı

Otoimmunite

Kanser patogenezinde

İntraselüler enfeksiyonlarda

Hücresel immun yanıtın ölçümünde uygulanmaktadır

• Genelde T hücre bazen B hücre yanıtı değerlendirilir

• Aktive olan T hücreleri

Morfolojik ve fenotipik değişikliğe uğrarlar

Büyüklüğü değişir

Histolojik boyamada kromatik değişiklik

Dinlenme halinde olmayan

Ancak; aktive olduğunda ortaya çıkan yüzey proteinleri meydana gelir

• LAT;

Hasta lenfositlerinin

Özgül antijenle

Veya özgül olmayan antijenlerle

İnvitro uyarılmasına dayanır

İki tipi vardır

1)Yüzey fenotipi (aktivasyon belirteçleri) değişikliklerini belirlemek

Aktivasyon belirteçleri

Ya enflamasyon bölgesinden direkt hücrelerden

Ya da invitro uyarılan lenfositlerden aranır

♣ FLOWSİTOMETRİ ile belirlenir

2) Uyarı sonrası lenfositin proliferasyon yeteneğini ölçmek

Lenfoblast transformasyon testi (LTT)

96 kuyucuklu plaklarda yapılır

T hücre uyaranları olarak

Fitohemaglutin (PHA)

Konkovalin A (ConA)gibi lektinlerle

Süperantijenler gibi bakteriyel toksinlerle

B hücre uyaranları olarak,

Süperantijenler

LPS kullanılır

LTT TESTİNDE;

Antijen ve lenfositlerin 72 saat kültürü yapılır

H timidin eklenir

H timidin çoğalan DNA yapısına girer

Radyoaktif veya fluoresan boya ile

DNA sentez hızı ve miktarı ölçülür

♣ Hasta ve kontrol karşılaştırmaları ile yorumlanır

Karışık lenfosit kültürü Alıcı ve verici kanından ayrılan lenfositler

İnvitro besiyerinde karıştırılarak

Lenfosit kültürü yapılır

♣ Antijenik farklılık varsa

♣ Biri diğerini aktive eder

♣ Blastik dönüşümle DNA miktarı artar

DNA sentezinin kantitatif ölçümü yapılır

Bazen verici lenfositleri

♣ X ışınları ile işleme sokulur

♣ Blastik dönüşüm olmaz

♣ Alıcının lenfositleri uyarılır

♣ Alıcının verilecek Dokuya karşı reaksiyon ölçülür

Buna tek yönlü karışık lenfosit kültürü denir

Doku transplantasyonunda

* HLA- D (LD antijenleri) antijenleri saptanır

Sitolitik T hücre yanıtının değerlendirilmesinde

Lenfositotoksik test Test prosedürü

HLA antijeni saptanacak total lenfositler veya CD 19 B lenfosit

Hangi HLA’ya ait olduğu bilinen anti-serum

Kompleman

Tripan mavisi veya eozin boyası

♣ Antijen + antikor birleşir

♣ Kompleman bağlanır

♣ Lenfosit zarı zedelenir

♣ Boya lenfosit içine girer

♣ Mikroskopta %50’den fazla boyanan lenfosit miktarı

Denenen lenfositleri, bilinen anti- HLA tipine ait olduğunu gösterir

Doku transplantasyonunda

* HLA A,B,C antijenlerin göstermede kullanılır

• Sitokin sentezini belirleme testleri Aktive T hücreler değişik sitokinler üretirler

Enflamasyon bölgesinden elde edilen T lenfositler

İnvitro kültürü yapılır

Total sitokin sentezini verir

ELISPOT (Enzimle işaretli immunspot) Gama- IFN (Quantiferon) sentezleyen hücre sayısı yüzde

olarak belirlenir

ELISA ile TH1’lerce sentezlenen gama IFN (Quantiferon) miktarı kantitatif olarak saptanır

Flowsitometrik yöntemle

Tüm farklı sitokin sentezleri ölçülebilir

3- MONOSİT/MAKROFAJ TESTLERİ M/M Hücreleri • Doğal bağışıklıkta rol alırlar Ve özgül bağışıklığı sitokinlerle koordine ederler • Spesifik patojenleri yok eden efektör hücrelerdir • Apoptosizde apoptotik hücreleri temizlerler

Bu hücreler doku örnekleri yada hücre süspansiyonlarından MAbs ile saptanırlar

Monositin en iyi belirlenmesi; FLOWSİTOMETRİDE

Anti, CD14 mAbs ile olur

Ayrıca CD11b, CD11c, CD16, CD32, CD64 gibi taşıdıkları reseptörlerle tanımlanmaları yapılır

Histokimyasal boyama olarak

Non spesifik esteraz Boyaması Monositer lösemi tanısında kullanılır

MAKROFAJ GÖÇÜNÜ ÖNLENİM TESTİ

• Duyarlı lenfosit ile antijen teması sonucu

Salgılanan MIF (Makrofaj göçünü önleyen faktör)

Saptama testidir

Kapiller tüpte

Lenfosit

Özgün antijen varsa MIF pozitiftir

MIF TESTİNİN POZİTİFLİĞİ

♣ O antijene karşı hücresel immun yanıtı gösterir

4-NÖTROFİL FONKSİYON TESTLERİ

• Polimorf nüveli nötrofiller (PMN) Doğal immunitenin efektör (fagositik) hücreleridirler

Enflamasyon bölgesine ilk gelen hücrelerdir

PMN yetersizliği Ya PMN sayısal azlığı

Yada PMN fonksiyon bozukluğu şeklinde olabilir

Bakteriyel enfeksiyonlara yatkınlık sağlar

Yetersizlik ölçüm testleri; a) Nötrofil sayısal değerlendirmesi testleri

b) Nötrofil adhezyon değerlendirme testleri

c) Kemotaksi değerlendirme testleri

d) Opsonizasyon değerlendirme testleri

e) Fagositoz yapmayı saptama testleri

f) Oksidatif patlama ve degranülasyon değerlendirmesi

g) Bakteriyel öldürmeyi değerlendirme testleri

olarak sınıflandırılır

a)Nötrofil sayısı

• Nötropeni 500/ml kanda olması

Kemik iliği, malignite, otoimmunite ve kemoterapiye bağlı gelişir

Mikroskobik boyama yöntemleri

Gelişmiş hematoloji ve immuno hemotoloji cihazlarıyla saptanır

FLOWSİTOMETRİ

b) Kemotaksi(KT) testleri

• Nötrofillerin Enflamasyon bölgesine hareketine (migrasyonu) KT denir

Bakteri ürünleri (endotoksin, hücre duvar yapıları, bakteri enzimleri)

Konak faktörleri (C3a ve C5a, LTB4) rol oynar

Bu kemotaktik moleküllere yanıtsızlık;

Defektif migrasyon (göç) yanıtı ile sonuçlanır

Defektif göçü saptamada BOYDEN odacık testi kullanılır

Filtre üzerinde;

♣ Kemotaktik madde

♣ Nötrofillerle yapılır

Petride agaroz jelde;

♣ Kemotaktik maddeler

♣ Nötrofillerle yapılır

Kemotaksi testleri İdyopatik immun yetersizlik hastalıklarının tanısında kullanılır

c) Nötrofil adhezyonu

NÖTROFİLLERİN

• Endotele adhezyonu ve enflamasyon bölgesine göçü

L-selectin ve İntegrinle sağlanır

Bu iki adezindeki yetersizliğe

Lökosit adhezyonu yetersizliği (LAY) denir

Bu durumda;

♣ Nötrofil enflamasyon bölgesine ulaşamaz

♣ Bakteriyel enfeksiyon yayılır

♣ Abse oluşmaz

• LAY hastalarında

CD11a/CD 18a LFA-1 (lenfosit fonksiyon antijen-1) lökosit integrini yoktur

Mabs’lerle FLOWSİTOMETRİ ile belirlenir

d) Opsonizasyon testleri

OPSONİN

• Mikroorganizmaların fagositlere bağlanmasını sağlayarak fagositozu kolaylaştıran moleküllere denir

IgG1,3 ve IgM, C3b ve iC3b’dir

Opsoninler için

Nötrofillerde

FcγR III (IgG ve IgM)

CR1 ve CR3 (C3b ve iC3b)

Makrofajlarda

FcγR I,II,III (IgG ve IgM) reseptörleri bulunur

• OPSONOSİTOFAJİK TEST

Amacı;opsonizasyon-fagositoz sürecini göstermektir. I-tüpe

Norm serum + norm lök + kuşkulu bakteri

II-tüpe İmmun (hasta) serum + norm lök + kuşkulu bakteri

37ºC’de 20 dakika inkübasyon .Her iki tüpden ayrı preparat hazırlanır

May –Grunwald – Giemsa boyama

Lökositlerin içine girmiş bakteri sayılır

Normal serumda ve immun serumda

♣ Ayrı sayılan bakterilerin toplamı sayılan lökosit sayısına bölünür

♣ Bir lökosite düşen bakteri sayısı bulunur

Buna fagositoz endeksi (FE) denir

İS/NS oranı OPSONİK ENDEKSİ’ni verir Oranın büyüklüğü İS’deki Ab titresi ile orantılıdır

• ERİTROSİT –AMBOSEPTÖR-KOMPLEMAN(EAC) TESTİ

Kompleman C3b parçasına karşı

Nötrofillerde bulunan reseptörlerin belirlenme testine denir

Koyun eritrositleri

Özgül antikorları ile birleşir

Kompleman bağlarlar

♣ Hemoliz oluşur

Kompleman C5 parçası eksik olarak deneye sokulursa

♣ E+Ab/C kompleksi

C3b reseptörlü nötrofillerle rozet yaparlar

e) Fagositoz • Mikrobiyal öldürmenin ilk basamağıdır

• Antikor ve komplemanla opsonize mikroorganizmanın PNL ve makrofajlarla temasından sonra

İçeriye alınma işlemidir

• Fagositoz testleri Opsonize partiküller ile

Nötrofillerin inkübasyonu sonucu Mikroskopta partikülleri içine alan

Nötrofiller görülür

Opsonize olmuş Ancak hücre içine alınmamış partiküller

Asit muamelesi ile uzaklaştırılırlar

Fluoresan veya radyoaktif madde ile işaretlenirler

♣ Direkt sayımları yapılır

f) Oksidatif patlama ve degranülasyonun değerlendirilmesi

I- Oksidatif patlamaya yönelik

• Nötrofillerin fonksiyonun değerlendirilmesinde

En sık uygulanan test

Süperoksit sentez yeteneğinin değerlendirilmesidir

• Kronik granülomatöz hastalığın taramasında

Bu değerlendirme kullanılır

ÇÜNKÜ;

Bu hastalık fagositoz defekti sonucu gelişir

♣ Nötrofil içinde NADPH’ı (nikotin amid adenin di nükleotid fosfat de hidro genaz) etkileyen oksidaz enzimdeki bozukluktur

• Dört test yöntemi kullanılır 1)NBT (Nitroblue tetrazolium test)

• Testin prensibi

NBT’ in redüksiyonuna dayanan bir testtir

Redükte olduğunda sarı renkten koyu mora dönüşür

Nötrofiller;

NBT içinde 37 ºC’ de 15 dakika tutulur

NBT, nötrofil içine alınır

Pyridine ile ekstrakte edilir

515 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunur

Veya mikroskopta boyanarak görülebilir

• Testin değerlendirilmesi

Nötrofiller içinde süperoksit ve H2O2 oluşur

Bunların redüktan etkisiyle

NBT redükte olur (renk değişir)

Öldürme işlemi olduğunu gösterir

• Lökositlerin mikroorganizmaları öldürme işlemi bozuk olan hastalıklarda Kronik granülamatöz hastalık Chediak- Higashi sendromu Myeloperoksidaz yetmezliği olanlar Glukoz- 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği

olanlarda Akut lösemi Down sendromu Akut enfeksiyonu olanlarda

NBT negatiftir

2)Sitokrom b ölçülmesi

■ Fagositlerde bulunan;

Oksidaz enziminin parçası olan sitokrom –b’ nin

İmmunolojik cihazlar

Ve biokimyasal yöntemlerle ölçülmesidir

3) Flowsitometrik , DCF (dichlorofluoresan) yöntemi

■ Bu test H2O2 oluşumunu ölçer

■ Kronik granülomatoz hastalığın tanısında kesin sonuç verir

4)Kemülimunisans’a Dayalı immuno hematolojik cihazlar

■ H2O2, O-, O2 radikallerini ölçmeye dayanır

II- Degranülasyona dayalı testler

• Degranülasyon

Fagozom ve lizozomların füzyonu sonucunda

Fagolizozomun içine lizozom içeriğinin boşalmasıdır

• ELISA yöntemiyle

Lizozom içeriğinin

Asid hidroloz

Lizozim

Laktoferrin

Katyonik proteinlerin ölçümü yapılır

III- Mikrobik öldürme

• Mikrobisidal test

Hasta ve kontrol grubundan nötrofiller alınır

Hastalardan izole edilen bakteri ve mantar ile kültürü yapılır

Bir gece beklenir

Ertesi gün yaşayan bakteri veya mantar yoksa mikrobik öldürme tamdır

B)İNVİVO TEST YÖNTEMLERİ DERİ TESTLERİ;

• Geç aşırı duyarlılık reaksiyonunu ölçerek Hücresel bağışık yanıtın değerlendirmesini

Belirli bir patojeni veya temas antijenini tanıyan bellekli T lenf varlığını saptar

Test pozitifliği ancak klinik öyküyle anlamlıdır

• En sık uygulanan model İntraselüler bakteri enfeksiyonlarında

Tüberkülin deri testi olarak Old tüberkülin(OT)

1890 yılında R.Koch buldu

PPD( purified protein derivide) uygulanır

Saybert ve Glen 1941 yılında tanımladılar

PPD-s olarak standardize edildi

1-TÜ : 0.00002 mgr PPD-s içerir

M.tuberculosis enfeksiyonlarının tanısında kullanılır

• AYRICA;

Blastomisin (blastomikoz)

Histoplazmin (histoplazmoz)

Brucellin (bruselloz)

Frei testi (LGV)

Toksoplazmin (toksoplazmoz)

Ekinokokkin(ekinokokkoz)

Deri testleride kullanılır

• Bunların dışında;

Kontak duyarlılığında ilaç, metal, bitkisel maddelere karşı

Dermatit tanısında panel antijenler kullanılır

Prausnitz-Küstner (PK) reaksiyonu Atopik allerjili bir serum ve spesifik antijenin

Diğer bir kişinin deri içine verilmesiyle

♣ Anafilaksinin pasif transferi gösterilir

TÜBERKÜLİN DERİ TESTİ PPD;

• Montoux deri içi uygulaması ile yapılır 5 T U (0.1ml) ön kol iç yüzeyinin deri içine

48 -72 saat sonra endurasyon değerlendirilir Endurasyonu (Sertliği);

≥10 mm olan,

♣ BCG olmamış çocuk ve yetişkinlerde

♣ Pozitifliği gösterir

≥ 15 mm olan

♣ BCG’li çocuklarda pozitifliği gösterir

5-10 mm arası

♣ BCG aşılanmasına

♣ Atipiklerle çapraz reaksiyona

♣ Anerjiye bağlı olarak görülür

• Pozitif deri testinin anlamlı olması için; Klinik belirtilerden önce negatif daha sonra pozitif olması

gerekir

Tuberculin PPD

2 - 3 gün sonra

Cilt üzerinde şişlik ölçülür.

Deri testinde teknik hatalar ■ Uygunsuz antijen konsantrasyonu ■ Enjeksiyonun cildin derinine yapılması ■ Subjektif değerlendirme ■ Test yerine dışsal müdahaleler ■ Booster olayı gelişebilir

Yaşla BCG aşılaması

M.tuberculosis ve atipiklere karşı oluşan aşırı duyarlılık

Booster’ı artırır

IMMUNOGENETİK TESTLER;

• İMMUN SİSTEMİN Bileşeni ve hücrelerin doğal ya da özgül fazlarındaki

Naif yapılarını Mutasyonel değişikliklerin

Molekülleri genetik yöntemlerle ortaya koyan testlerdir.

• ÖRNEĞİN; Antijen sunan hücrelerde(ASH) MHC I ve II moleküllerinin tayini Ig’lerin Fab kısmında variable(v)bölgesini,Fc kısmındaki CH2 gibi

aktif bölgelerin genetik yapıtaşlarının belirlenmesi Fagositlerin sentezinde enzim ve sitokinlerin genetik

mutasyonlarını ortaya koyan testler Primer veya sekonder immün yetersizliklerin genetik

mutasyonlarının ortaya konulmasında

İMMUNO GENETİK YÖNTEMLER

• Nükleik asit teknolojisine (NAT) dayalı test yöntemleri

Klinik immunoloji laboratuvarında tanısal amaçlı daha yenidirler

Rutin tanı amaçlı konvansiyonel yöntemlerin yerini ne kadar alacakları zamanla görülecektir

ANCAK; Primer ya da seconder immun yetersizliğe bağlı birçok

sendrom ve hastalığın, Örneğin X’e bağlı A-gammaglobulin hastalığı

Artrit ve oto-immun hastalıklarla seyreder B hücre ve Ig izotiplerinde azalmaya nedeni olan B

hücre tirozin kinaz genindeki mutasyonun belirlenmesi gibi

Malign bazı hastalıkların; Örneğin;Hodgkin ve Non-Hodgkin lenfoma etiyolojisinde T

lenfositlerinde moleküler bozulmaların tayini MOLEKÜLER TANISINDA SIKLIKLA KULLANILMAKTADIRLAR

NAT’a dayalı test yöntemleri

1)Hibridizasyon (birleşme)

2)Amplifikasyon (çoğaltma)

başlıkları altında incelenir

1)HİBRİDİZASYON

• Bir DNA molekülü

Kompementerlik (birbirinin tamamlayıcısı) özelliğindedir

Isı ya çeşitli kimyasal maddelerle ayrılabilen

Uygun ısı, tuz konsantrasyonu, PH’da yeniden birleşebilen

İki sarmal zincire sahiptir

• İşte tanı amacıyla nükleik asitlerin araştırılması

Molekülün bu özelliklerine dayanmaktadır

YÖNTEMİN PRENSİBİ

• Klinik örnekte varsayılan etkenin nükleik asidi ısı ve kimyasal maddelerle iki zincire ayrılır

• Bu zincirlerin varlığı PROB adı verilen işaretli DNA ve RNA parçasıyla gösterilmektedir

• PROB adı verilen reaktiflerin işaretlenmesinde Flurokrom

Enzim

Kemülüminesan madde

Radyoizotop kullanılmaktadır

• PROBLAR Hedef nükleik asitlerin belirli bölgelerine komplementerdir

50 bp’den küçüktürler

HİBRİDİZASYON TEKNİKLERİ

a)Sıvı faz hibridizasyonu

• Sıvı ortamda prob ve hedef nükleik asit serbesttir

DNA/DNA

DNA/RNA

b)Katı faz hibridizasyonu

I-MAKROARRAY( makroskobik dizinleme) yöntemi – Nitro selüloz ve Naylon gibi porlu yüzeylerde yapılır

• Southern blot DNA’lar;

Agaroz jel elektroforezle, nitroselluloz ve naylon membran kağıda aktarılır Restriksiyon enzimleri ile klinik örnek temas ettirilir

DNA/DNA (32p-Biotin/Avidin peroksidaz)

Nokta mutasyonları, delesyonlar ve translokasyon sonucu farklılıkların saptanmasıyla hematolojik malignitelerin özelliklerinin belirlenmesinde kullanılır Burkitt lenfoma, Foliküler lenfoma

Kronik myeloid lösemi

Philadelphia kromozomu

AYRICA; B hücre lenfomalarında

♣ B hücre klonizitesinin incelenmesinde

T hücre lenfomasında

♣ T hücre klonizitesinin incelenmesinde

Nükleik asit boyutları konusunda yardımcı olur

• Northern blot RNA’lar, Nitroseluloz kağıtlara aktarılır mRNA /cDNA-cRNA hibridlemesinde 32p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır

• Dot blot DNA’lar,

Nitroselüloz kağıtlarda

DNA/DNA

32 p-Biotin/AP işaretlemesi kullanılır

II-MİKROARRAY • Porsuz yüzeyleriyle plastik, cam ve silikon kullanılır • Klinik örnekten

Nükleik asidin pürifikasyonu Amplifikasyonu Hibridizasyonu Tespiti

25- 75 mm’lik slaytlarda yapılmaktadır

• Uygulama alanları Antimikrobiyal ilaç keşfi ve geliştirilmesi ile aşı çalışmaları

Konak bağışıklık sistemindeki polimorfizmler Gen up ve downregülasyonları Apoptozis mekanizmalarında

Kanserlerin sınıflandırması ve derecelendirmesinde

Microarray

c) İn Situ Hibridizasyon

• Doku yada hücrelerdeki;

Nükleik asitleri saptar

• DNA/DNA hibridlemesinde;

Biotin/AP işaretlemesi kullanılır

• 16S/23S r-RNA’ları hedefleyen

Fluorokrom’la işaretleme olur

FISH (flouresan inn situ hibridizasyon yöntemi)

• FISH yöntemiyle; – Belirli genlerin;

Kromosomal lokalizasyonunu haritalamak

Veya kromozomal bozukluklarının saptanmasında kullanılır

T hücre fonksiyonlarının belirlenmesinde

2)NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYONU (ÇOĞALTMA)(NAA)

NAA yöntemleri

a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri

b) Prob Amplifikasyon Sistemleri

c) Sinyal Amplifikasyon Sistemleri

adı altında incelenmektedir

a) Hedef Amplifikasyon Sistemleri

• İncelenecek örnekteki az sayıda hedef molekülün (DNA, RNA)

İnvitro enzimatik replikasyon yöntemleriyle

Saptanabilecek düzeylere çıkarılmasıdır

Yöntemler • PCR

Klinik örnekte DNA aranıyorsa 4 adet deoksinükleik trifosfat (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

Özgül oligonükleotik primerleri (15-30 bazlık)

Isıya dayanıklı Tag polimeraz enzimi

94 ºC’de (denatürasyon)

54 ºC’de (bağlama)

72 ºC’de (Genişleme)

♣ Bu işlem 25-30 kez yapılır

Southern hibridizasyonla tanımlama yapılır

Klinik örnekte RNA aranıyorsa RNA’nın elde edilmesinden sonra

Revers-Transkriptaz uygulanarak

cDNA’ya çevrilir

Daha sonra cDNA amplifiye edilir

Değişik PCR tipleri Arbitrarily primer PCR(APP)

Multiplex PCR(MP)

Nested PCR(NP)

RT-PCR(RTP)

Kantitatif PCR(KP)

Real time PCR(RTİP)

Real-time PCR

Eş zamanlı

Nükleik asit amplifikasyonu

Amplifikasyon sırasında saptama yapılır

Floresan sinyalin ölçülmesi (Cyber green I)

Kantitatif ve kalitatif sonuç

Kısa sürede (2-3 saat) alınır

REAL TIME PCR

www.biorad.com

özel deteksiyon sistemli PCR cihazı

Real Time PCR

• DNA Bağlayıcı Flouroforlar

– Etidyum Bromid

– Syber Green

– Syber Gold

• Problar

– Lineer Oligo problar

“HybProbes”

– 5’ Nükleaz Oligo problar “Taq

Man” **

– Molecular becon

Transkripsiyon temelli Amplifikasyon teknikleri

Hedef molekülleri RNA’dır

TAS( Transcription based Amp)

TMA(Transcription mediated Amp)

NASBA (Nükleik Asid Sequence based Amp)

Northern blot ile tanımlama yapılır

Klinik immunoloji ve moleküler biyoloji lab.

İnsan immun sistem bileşenleri genomu ve kanser genotipi incelemelerinde

DNA yapısındaki mutasyonlar

Gen tayini ve dizilimi saptaması

Gen ve genetik polimorfizmi saptama

Transkriptlerin özellikleri ve miktarı saptanması

Genetik manipülasyonun saptanması

PCR’ IN İMMUNOGENETİK ÇALIŞMA ALANLARI

B) Prob Hibridizasyon Bazlı (NAA) Yöntemi

–Ligasyon yardımı ile prob çoğaltılmasına dayanır

–Hedef DNA + Prob Hibridizasyon / Ligaz LCR

• C) Sinyal Amplifikasyon Bazlı NAA Yöntemi – Aslında prob hibridizasyon çoğaltma yöntemidir

– İki prob kullanılır

– Birinci prob hedef NA dizisini tanır • Üzerinde ikinci probu bağlama bölgesi vardır

– Çok sayıda sinyal taşıyan 2. prob 1. proba bağlanır • SONUÇTA HEDEF DİZİ +1 Prob/2. Prob hibridi oluşur

• Bağlama bölgesindeki bol miktardaki sinyalle HİBRİD oluşur

– Örnek :

b-DNA (dallanmış DNA)

RCA (Rolling Circle Amp) Tek nükleotid polymorfizm

Allellik ayrımında kullanılır

MAJOR HİSTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) GEN BÖLGESİNE YÖNELİK TESTLER

• MHC ve ÜRÜNLERİ

İnsan 6. kromozom kısa kolunda yer alırlar

Üç gen bölgesine sahiptirler

MHC Sınıf I gen bölgesi

HLA-A,B,C,E,F,G antijenleri

MHC Sınıf II gen bölgesi

HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP antijenleri

MHC Sınıf III gen bölgesi

Hsp, TNFα, C4A,C4B, C2

HLA molekülleri Glikoprotein yapısındadırlar

Transmembranöz yapıda bulunurlar

Yüksek polimorfizm (bireyden bireye) gösterirler

HLA-I;

En fazla lenfosit, lökosit olmak üzere

Tüm çekirdekli somatik hücrelerin çoğunda,

Eritrositler hariç

HLA-II ise;

Sınır olup APC (dendritik hücre, makrofaj)

B lenfositleri, Aktive T4 lenfositleri,

Endotel, böbrek glomerül hücrelerde bulunur

HLA Doku tipi tayinindeki amaçlar

• Organ ve doku tipi nakillerinde, HLA uyumu

• Adli tıpta

Babalık tayininde

Kimlik tanımlamasında

• Bazı otoimmun hastalıkların tanısında

HLA-DR4 ile RA

HLA-B 5 ile Behçet hastalığı

HLA Doku Tipi Tayin Yöntemleri

• Üç grup altında yapılmaktadır

1) MOLEKÜLER/DNA TEMELLİ YÖNTEMLER

2) Antikor Temelli Yöntemler

3) Hücre Temelli Yöntemler

Moleküler Yöntemler

Özgün, esnek, yeni alleller yeni reaktiflerin geliştirilmesi,

Canlı hücre gerektirmemesi,

Otomasyona uygun olması(serolojik ve hücresel yöntemlere göre),

Eşzamanlı çok sayıda örnek ile çalışma

HLA genlerindeki tüm çeşitliliklerin gösterilmesi, serolojik olarak tanımlanamayan alllellerin gösterilmesi

DNA temelli yöntemler • MHC gen bölgesinde;

PCR yöntemi ile; Sekansa spesifik Primerleri (SSP) kullanılır

Daha sonra Restriction fragments lenght polymorfizm (RFLP)uygulanarak DNA parçalara ayrılarak spesifik problarla tanımlanır

HLA-I ve II tiplemesi yapılır

AVANTAJ VE DEZAVANTAJLARI; Sadece bir allel veya allel grubuna özgün DNA segmentlerini

çoğaltacak primer seti kullanılır

Serolojik yöntemlerin doğrulanmasında

Dezavantajı çok sayıda PCR yapılması

SSP cihazı

HLA-B27 için PCR-SSP ürünü (agaroz

jelde)

HİBRİDİZASYON YÖNTEMİ İLE; Sekansa spesifik oligonükleotid (SSO) prob

hibridizasyonu ile

HLA-I ve II tayini

AVANTAJLARI;

Sekansa özgü oligonukleotitler kullanılarak yapılır

Tüm lokusu içine alacak şekilde primer seçilir

Strip, tüp, çip (mikroarray), boncuk (luminex teknoloji)

Solid organ transp. da yeterli (böbrek, krc transp)

Çok sayıda örnekle çalışılabilir

Histo spot SSO (full otomatik)

SSO hibridizasyon deneyi

Sekans (dizi analizi) HLA Tiplemesi

PCR ile çoğaltılan HLA gen segmentinin

SEKANS CİHAZINDA, nükleotid dizi analizi yapılmaktadır

KULLANIM ALANLARI; Böbrek alıcısı gibi hızlı sonuç gerektiren

örneklerde

Denk olan vericilerin tespit edilebilmesi, diğer yöntemlerle elde edilen karmaşık sonuçların çözülmesi amacıyla sık kullanılmaktadır.

DNA Dizi Analizi

Aynı hastada Sekans Bazlı Tipleme(SBT)

ile

(HLA-B genotipi)

A lokusu SBT

Diğer Yöntemler

• SSCP (Single stranded conformational polymorphism)(PAGE))

• Pyrosequencing

• Ekzonükleazla released fluorescence gibi

IMMUNOGENETİK YÖNTEMLERİN SON YILLARDA KULLANIM ALANLARI

• Immunolojide son yıllarda önem kazanan Mikro RNA’lar(Mi RNA)

Post transkripsiyon döneminin regülatör proteinleri olarak ortaya çıkan çeşitli kanserlerin ve hastalıkların tanısında kullanılan küçük RNA parçacıklarıdır.

A)Mikro-RNA bazlı çalışmalar Mikro-RNA’nın direkt kantitatif tayinidir Mikro-RNA’nın klonlama tayinidir Mikro-RNA ekspresyon ölçümüdür

B)Immunolojide bioinformatik gelişmeler Immun genomik sistemlerin moleküler genetik bazlı sayısal

veri sunan analiz teknikleriyle bilgisayar ortamında ortaya konmasıdır

MiRNA Bazlı Çalışmalarda Kullanılan yöntemler

• Mikro array ve genom dizilimi

• Deep sequencing

• Quantatif Real Time -PCR

• Mikrodizi veri analizi