modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione...
DESCRIPTION
Massimo Pisu (CRS4) L’ingegneria tissutale ha dato impulso allo sviluppo della tecnica di coltivazione in vitro delle cellule che possono essere fatte crescere, espandere e differenziare su adatti terreni di coltura e con l’impiego di specifici fattori di crescita. La coltivazione delle cellule/tessuto può avvenire con l’ausilio di bioreattori di una certa semplicità costruttiva (stirrer flask) o di maggiore complessità (perfusion bioreactor, horizontal rotating wall bioreactor). In linea teorica la coltura cellulare può essere effettuata con cellule già specializzate (cardiomiociti, condrociti, cellule epiteliali, endoteliali, etc.) o con cellule staminali indifferenziate. Queste ultime sono attualmente oggetto di intenso studio nei laboratori di tutto il mondo, sia per l’individuazione dei meccanismi di base dello sviluppo cellulare, sia per la messa a punto di terapie innovative. I trattamenti medici per la riparazione di tessuti/organi necessitano di numerose cellule che però sono disponibili solo in quantità esigue richiedendo, pertanto, lo sviluppo di efficienti tecniche di coltivazione in vitro. Nel corso del seminario sarà presentata l’attività di ricerca svolta dai ricercatori del Programma di Bioingegneria del CRS4 nel recente passato, con particolare riferimento ai modelli di simulazione e codici di calcolo sviluppati per descrivere la crescita, espansione e differenziazione di cellule con tecniche di coltivazione in vitro.TRANSCRIPT
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Modellazione matematica e codici
di simulazione per la
proliferazione, crescita e
differenziazione in vitro di cellule
Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina
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• Breve introduzione all’Ingegneria tissutale
• Coltivazioni cellulari e bioreattori
• Modellazione matematica e simulazione
• Risultati ottenuti: alcuni esempi
• Potenziali applicazioni
Indice degli argomenti
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«L’Ingegneria Tissutale è un campo interdisciplinare della bioingegneria che applica
diversi principi dell’ingegneria e delle scienze biologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o
migliorare funzioni di tessuti o organi»
Ingegneria Tissutale: Definizione
R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)
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• L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici
• Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico
Causa patologie e terapie correnti
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Paradigma dell’Ingegneria Tissutale
cellule
scaffold
coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzato
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Esempio di ingegneria tissutale
P. Bianco, Nature, 2001
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Stato dell’arte
J. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010
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Stato dell’arte-2
Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010
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Cellule: classificazione
Cellule per
impianto
Autologhe
Allogeniche
Xenogeniche
Singeniche
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Tipi di cellule
Cellule
Specializzate
Condrociti
Osteoblasti
Endoteliali
Epatociti
……..
Non specializzate (Staminali)
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• TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule.
• PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali.
• MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule.
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.
Cellule staminali
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Nei tessuti connettivi
• Glicoproteine
• Proteoglicani
• Acido ialuronico
• Minerali Proteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG),
Minerali (idrossiapatite)
L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge la funzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di divisione tra i diversi tessuti
Matrice extracellulare (ECM)
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È un supporto (impalcatura) di tipo organico o inorganico, naturale o artificiale, polimerico o non.
Funzioni principali dello scaffold
• Conferire la forma 3D desiderata del tessuto
• Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM
• Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.
Scaffold
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Scaffold: caratteristiche ideali
Proprietà
Bio-compatibilità
Bio-degradabilità
in vivo controllata
Garantire adesione cellulare
Porosità
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Scaffold: morfologia
Fibroso Spugnoso Gelatinoso
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Fasi
• Prelievo (biopsia)
• Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga)
• Seeding su scaffold
• Espansione/crescita/differenziazione
Analisi e caratterizzazione
• Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA)
• Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker)
• Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter
• Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso
Coltivazione in vitro
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• Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask)
• Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi)
I bioreattori consentono il raggiungimento di alte densità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemi statici (106/cm3)
Sistemi di coltivazione in vitro
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Un bioreattore consente di:
• Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura
• Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari
• Monitorare e regolare i parametri fisico-chimici in tempo reale
• Produzione su larga scala di cellule e tessuti
Vantaggi di un bioreattore
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Stirred Flask Bioreactor
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Rotating wall Bioreactor
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Direct Perfusion Bioreactor
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Modellazione matematica
La modellazione matematica e la simulazione computazionale hanno lo scopo di:
• Riduzione dei costi della sperimentazione
• Progettazione di apparecchiature
• Ottimizzazione delle condizioni operative
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Modellazione matematica-2
I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dal Programma di Bioingegneria del CRS4 sono basati principalmente su:
• Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs)
• Bilancio di popolazione (sulle cellule)
- I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte
in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro).
- I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)
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Modellazione matematica-3
• Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN
• La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL)
• Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore.
• Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.
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Sistemi investigati
• Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate;
• Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo);
• Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo);
• Espansione di MSC (cellule ovine);
• Espansione di condrociti ovini;
• Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
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Esempi di applicazione: I
Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate
Coltivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASA commissionato per il MIT) , utilizzo di condrociti articolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti a base di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
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Cartilagini ingegnerizzate
a
c
b
x
0
r
y
z
r
q
d/2
d/2
h/2
h/2
Culture
medium bulk
Culture
medium
Sterile gas
incubator
Culture
medium
d
d
Scaffolds
z
0
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Cartilagini ingegnerizzate-2
Modello matematico
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Cartilagini ingegnerizzate-3
Modello matematico-2
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Cartilagini ingegnerizzate-4
PO2=80 mm hg
t=10 days
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Cartilagini ingegnerizzate-5
PO2=40 mm hg
t=5 weeks
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Cartilagini ingegnerizzate-6
Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg
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Cartilagini ingegnerizzate-7
Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA
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Cartilagini ingegnerizzate-8
Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA
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Esempi di applicazione: II
Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule mesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM, uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1
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Espansione e differenziazione di MSC
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Espansione e differenziazione di MSC-2
Modello matematico
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Espansione e differenziazione di MSC-3
Modello matematico-2
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Espansione e differenziazione di MSC-4
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily
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Espansione e differenziazione di MSC-5
Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1
t=21 days
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Espansione e differenziazione di MSC-6
Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura
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Esempi di applicazione: III
Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo)
Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine, aggiunta di LIF, Activin-A
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Espansione e differenziazione di CNSSC
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Espansione e differenziazione di CNSSC-2
Modello matematico
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Espansione e differenziazione di CNSSC-4
Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF
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Espansione e differenziazione di CNSSC-5
Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A
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Espansione e differenziazione di CNSSC-6
Coltivazione con aggiunta di Activin A
t=3 days
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Esempi di applicazione: IV
Espansione di MSC (cellule ovine)
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine, soluzione di nutrienti a base di MEM (Minimum Essential Medium Eagle)
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Espansione di MSC (cellule ovine)
Modello matematico
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Espansione di MSC (cellule ovine)-2
Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
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Esempi di applicazione: V
Espansione di condrociti ovini
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di DMEM
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Espansione di condrociti ovini
Modello matematico
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Espansione di condrociti ovini-2
Sistema statico, petri dishes, medium DMEM
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Espansione di condrociti ovini-3
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Esempi di applicazione: VI
Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) + EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)
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Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC
Modello matematico
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Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2
Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell
Growth Medium (EGM-2)
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Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3
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Possibili campi di applicazione
L’approccio modellistico presentato può essere utilizzato in diversi campi della biomedicina:
• Ingegneria Tissutale;
• Medicina rigenerativa;
• Coltivazione cellulare per Terapia Genica;
• Studio dell’evoluzione di masse tumorali.
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