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Modelo macro cinético de la producción de conidios en
fermentación sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Jeimy Geraldin Macias Camacho
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Bogotá D.C., Colombia
2017
Modelo macro cinético de la producción de conidios en
fermentación sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Jeimy Geraldin Macias Camacho
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Química
Directora:
M.Sc. Nubia Moreno Sarmiento
Codirectora:
Ph.D. Ivonne del Socorro Gutiérrez Rojas
Línea de Investigación:
Bioinsumos
Grupo de Investigación:
Bioprocesos y Bioprospección
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental,
Bogotá D.C., Colombia
2017
A mis padres por todo su apoyo y
paciencia durante este proceso.
A mi papi Vicente quien a pesar de ya no estar conmigo
me enseñó a creer siempre en mi
Agradecimientos
A mis padres Francisco Macias y Carmenza Camacho, sin quienes no sería la persona
que soy hoy en día, gracias por apoyarme en cada decisión que he tomado y por
comprender las múltiples ausencias en este tiempo.
A mis directoras, la ingeniería Nubia Moreno Sarmiento y la doctora Ivonne Gutiérrez
Rojas, por la confianza que depositaron en mí desde el inicio de este trabajo, por brindarme
las condiciones necesarias, el apoyo y los conocimientos para cumplir los objetivos de esta
tesis, además de hacerme crecer como profesional al enfrentarme a nuevos retos.
Al Instituto de Biotecnología, Biocultivos y a la Universidad Nacional por brindarme las
condiciones necesarias para la culminación de este trabajo de investigación.
A los docentes del Instituto de Biotecnología y del departamento de ingeniería Química y
ambiental por todos los conocimientos que me permitieron crecer de forma académica y
profesional.
A mis compañeros del Laboratorio de Fermentaciones, los que se encuentran actualmente
y los que ya no están, en especial a Diana Vergara, Diana Vinchira, Iván Cabeza y Daniel
Méndez, quienes durante este tiempo se convirtieron en grandes amigos y un apoyo
incondicional; a Geraldin Tibasosa, por haberme dado la mayor parte de los conocimientos
que tengo en este momento de microbiología y por haberme tenido mucha paciencia
cuando decidí iniciar en este campo de investigación.
A todas las personas que de una u otra manera aportaron a la finalización de este trabajo.
A todos ustedes mil y mil gracias.
Resumen y Abstract VII
Resumen
En el presente trabajo se desarrolló un modelo matemático, el cual reproduce el
comportamiento de la cepa Penicillium pinophilum HC1 en el proceso de producción de
conidios, generación de biomasa, consumo de fuente de carbono y nitrógeno
Para generar el modelo, se analizaron los efectos de limitación por fuente de carbono y
nitrógeno a escala laboratorio y piloto. Estos ensayos permitieron evidenciar, que la
limitación por carbono es el principal inductor de la producción de conidios de Penicillium
pinophilum HC1 en cultivo sumergido en operación por lote.
En el desarrollo del modelo inicialmente se evaluaron siete modelos no estructurados no
segregados para la tasa de crecimiento, utilizando como estrategia de cálculo la
evaluación simultanea de los perfiles de crecimiento experimentales; este método no
permitió simular el proceso, debido a la complejidad del sistema.
Teniendo en cuenta lo anterior, se desarrolló el modelo por análisis de fenómenos
biológicos presentes en el sistema, es decir, limitación de carbono y nitrógeno para
generación de biomasa y conidios, y consumo de sustratos.
Por último se adiciono al modelo la ruta metabólica asociada a la producción de biomasa,
ya que dentro de los ensayos experimentales se encontró que la biomasa tiene un efecto
limitante en la producción de conidios.
Se recomienda para mejorar la predicción del proceso evaluar la influencia de diversos
factores, como aireación, temperatura y pH, puesto que estos permanecieron constantes
durante esta evaluación
Palabras clave: Penicillium pinophilum, conidios, modelo, bioprocesos
Resumen y Abstract IX
Abstract
In the present work, a mathematical model was developed, which reproduces the behavior
of the Penicillium pinophilum HC1 strain in the process of conidial production, biomass
generation, consumption of carbon and nitrogen source
To generate the model, the effects of limitation by carbon and nitrogen source at laboratory
and pilot scale were analyzed. These tests showed that carbon limitation is the main
inducer of the production of conidia of Penicillium pinophilum HC1 in submerged culture in
operation by lot.
In the development of the model, initially, seven non-segregated unstructured models were
evaluated for the growth rate, using as a calculation strategy the simultaneous evaluation
of the experimental growth profiles; this method did not allow to simulate the process, due
to the complexity of the system.
Taking into account the above, the model was developed by analyzing biological
phenomena present in the system, that is, carbon and nitrogen limitation for generation of
biomass and conidia, and consumption of substrates.
Finally, the metabolic path associated with the production of biomass was added to the
model, since within the experimental tests it was found that the biomass has a limiting effect
on the production of conidia.
It is recommended to improve the prediction process evaluate the influence of various
factors such as aeration, temperature and pH, since these remained constant during this
evaluation
Keywords: Penicillium pinophilum, conidia, model, bioprocess.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ....................................................................................................................... VII
Lista de figuras ............................................................................................................ XIII
Lista de tablas .............................................................................................................. XV
Lista de Símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Objetivos ................................................................................................................... 3 Objetivo General ........................................................................................................ 3 Objetivos Específicos ................................................................................................. 3
2. Marco Teórico ........................................................................................................... 4 2.1.1 Penicillium spp. ..................................................................................... 5 2.1.2 Conidiogénesis ...................................................................................... 7 2.1.3 Producción de conidios ....................................................................... 10 2.1.4 Variables que afectan el proceso de conidiogénesis ........................... 13 2.1.5 Inductores ........................................................................................... 13 2.1.6 Variables físicas .................................................................................. 15 2.1.7 Limitación de nutrientes ...................................................................... 17 2.1.8 Régimen operacional .......................................................................... 20 2.1.9 Lote ..................................................................................................... 20 2.1.10 Continuo .............................................................................................. 21 2.1.11 Lote alimentado ................................................................................... 21 2.1.12 Modelos matemáticos ......................................................................... 22 2.1.13 Modelos de crecimiento para el género Penicillium spp. ..................... 24 2.1.14 Rutas metabólicas asociadas a la generación de biomasa ................. 26 2.1.15 Antecedentes de investigación ............................................................ 28
3. Materiales y métodos ............................................................................................. 30 3.1.1 Microorganismo ................................................................................... 30 3.1.2 Tren de inóculo ................................................................................... 30 3.1.3 Ensayos preliminares .......................................................................... 31 3.1.4 Limitación por sustrato ........................................................................ 31 3.1.5 Fermentaciones a escala piloto (100 L) ............................................... 33 3.1.6 Métodos analíticos .............................................................................. 33
Contenido XII
3.1.7 Cuantificación de biomasa .................................................................. 33 3.1.8 Cuantificación de sacarosa residual .................................................... 33 3.1.9 Cuantificación de amonio residual ...................................................... 34 3.1.10 Cuantificación de conidios .................................................................. 34 3.1.11 Tolerancia térmica .............................................................................. 34 3.1.12 Modelo ................................................................................................ 34 3.1.13 Generación de parámetros ................................................................. 35 3.1.14 Análisis de sensibilidad del modelo ..................................................... 40 3.1.15 Validación de modelo .......................................................................... 40 3.1.16 Análisis de estabilidad de modelo ....................................................... 40
4. Resultados y Análisis de Resultados ................................................................... 42 4.1.1 Ensayos preliminares .......................................................................... 42 4.1.2 Ensayos con limitación de sustratos a escala laboratorio (3 litros) ...... 47 4.1.3 Ensayos a escala piloto 100 litros ....................................................... 59 4.1.4 Modelo matemático............................................................................. 67
5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 87 Conclusiones ........................................................................................................... 87 Recomendaciones ................................................................................................... 88
Bibliografía .................................................................................................................... 89
A. Anexo: Medios de cultivo ...................................................................................... 101
B. Anexo: Protocolos experimentales .................................................................... 105
C. Anexo: Cinéticas ensayos limitación ................................................................ 114
D. Anexo: Derivadas a partir de Table curve 2d .................................................... 124
E. Anexo: Balance estequiométrico....................................................................... 129
F. Anexo: Balance estequiométrico intracelular ................................................... 131
G. Anexo: Análisis de sensibilidad del modelo ..................................................... 134
Lista de figuras XIII
Lista de figuras
Pág.
Figura 2 - 1 Producción, área mundial y generación de tamo de arroz paddy.. ............... 4
Figura 2 - 2 Conidioforos observados en Penicillium ........................................................ 8
Figura 2 - 3 Proceso de conidiogénesis ........................................................................... 9
Figura 2 - 4 Factor de fricción en la columna de burbujeo como descriptor del régimen de
flujo ............................................................................................................................... 15
Figura 2 - 5 ruta metabólica para la formación de biomasa ........................................... 27
Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis .......................................... 27
Figura 4 - 1 Producción de conidios en diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%) .....433
Figura 4 - 2 Producción de biomasa para diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%) ..444
Figura 4 - 3 Cinética de biomasa variando el porcentaje inicial de inóculo ....................455
Figura 4 - 4 Cinética de producción de conidios variando el porcentaje inicial de inóculo
......................................................................................................................................466
Figura 4 - 5 Comportamiento de la productividad de biomasa variando las
concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ...........................................477
Figura 4 - 6 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación por fuente de nitrógeno ......488
Figura 4 - 7 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación por fuente de carbono……...
489
Figura 4 - 8 Comportamiento del consumo máximo de sacarosa escala 3L ................... 51
Figura 4 - 9 Porcentaje de amonio consumido a las 144 horas escala 3 L ..................... 52
Figura 4 - 10 Comportamiento de los conidios generados respecto a las concentraciones
iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ...................................................................... 53
Lista de figuras XIV
Figura 4 – 11 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas
....................................................................................................................................... 54
Figura 4 - 12 A. Crecimiento vegetativo en medio sin limitación (40x). B. Diferenciación en
medio limitado sacarosa y amonio (100x). ...................................................................... 58
Figura 4 - 13 Biomasa producida en fermentación de 100 L ......................................... 599
Figura 4 - 14 Amonio residual en la fermentación de 100 litros ....................................... 62
Figura 4 - 15 Sacarosa residual para la fermentación de 100 litros ................................. 63
Figura 4 - 16 Producción de conidios en fermentación de 100 ........................................ 64
Figura 4 - 17Comportamiento de la tasa de crecimiento respecto a las concentraciones
iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ....................................................................... 70
Figura 4 - 18 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de
fuente de carbono sacarosa ............................................................................................ 74
Figura 4 - 19 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de
fuente de amonio ............................................................................................................ 76
Figura 4 - 20 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas
....................................................................................................................................... 81
Lista de tablas XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2 - 1 Producción de conidios y biomasa para diferentes especies de Penicillium. 12
Tabla 2 - 2 Concentraciones de calcio inductoras de conidiogénesis para diferentes
especies de Penicillium. ................................................................................................. 14
Tabla 2 - 3 Variables físicas reportadas para cultivo sumergido de diferentes especies de
Penicillium. ..................................................................................................................... 16
Tabla 2 - 4 fuentes de carbono utilizadas en el proceso de conidiogénesis .................... 19
Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de
Penicillium ...................................................................................................................... 25
Tabla 3 - 1 Concentraciones para los ensayos de limitación de sustrato ........................ 32
Tabla 3 - 2 Modelos utilizados para la tasa de crecimiento ............................................. 35
Tabla 4 - 1 Valores de tasa de crecimiento maxima y constante de afinidad por fuente de
carbono .......................................................................................................................... 49
Tabla 4 - 2 Valores de tasa de crecimiento máxima y constante de afinidad por fuente de
nitrógeno ........................................................................................................................ 49
Tabla 4 - 3 Valores de tasa de crecimiento de biomasa y otros metabolitos secundarios
para Penicillium sp. ........................................................................................................ 50
Tabla 4 - 4 Resultados análisis de varianza (ANOVA), para generación de biomasa,
producción de conidios, consumo de sacarosa y consumo de amonio. .......................... 55
Tabla 4 - 5 Concentraciones seleccionadas para los ensayos en reactor de 100 L ........ 56
Tabla 4 - 6 Resultados germinación y tolerancia térmica ensayos escala 3 litros ........... 57
Tabla 4 - 7 Comparación de biomasa máxima producida en el reactor de 3 y 100 L ..... 60
Lista de tablas XVI
Tabla 4 - 8 Comparación porcentaje de amonio consumido ensayos de 3 y 100 L) ........ 62
Tabla 4 - 9 Comparación producción de conidios en escala de 3 y de 100 L ................. 65
Tabla 4 - 10 Constantes obtenidas para los diferentes modelos aplicados ..................... 68
Tabla 4 - 11 Coeficientes de varianza de las constantes obtenidas según el análisis de
sensibilidad realizado. ..................................................................................................... 69
Tabla 4 - 12 Valores 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 análisis de sensibilidad limitación de carbono .............. 72
Tabla 4 - 13 Valores coeficientes de correlación R2 con los valores de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠
promedio ......................................................................................................................... 73
Tabla 4 - 14 Valores 𝑘𝑛 para ensayos de limitación de nitrógeno ................................... 73
Tabla 4 - 15 Valores coeficientes de correlación R2 con el valor de 𝑘𝑛 promedio ............ 73
Tabla 4 - 16 Valores 𝑚1 para ensayos con presencia de fase estacionaria. ................... 75
.Tabla 4 - 17 Valores 𝑚2 para ensayos con presencia de fase estacionaria. .................. 77
Tabla 4 - 18 Valores 𝜇𝑝𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 análisis de sensibilidad limitación de carbono ............ 78
Tabla 4 - 19 Valores de coeficiente de correlación para cada uno de los ensayos a escala
laboratorio 3 litros ........................................................................................................... 78
Tabla 4 - 20 Parámetros constantes usados en la iteración con la ruta metabólica (Yuan
et al., 2010) ..................................................................................................................... 80
Lista de símbolos y abreviaturas XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras latinas
Símbolo Término Unidad Definición
𝑘 Constante - Constantes de ajuste de modelo
𝑘𝑖 Constante de inhibición por sustrato c
g/L Concentración máxima de
la fuente de carbono inhibitoria
𝑘𝑛 Coeficiente afinidad de sustrato al nitrógeno
g/L Concentración de sustrato
en la que la bacteria empieza a crecer
𝑘𝑠 Constante de afinidad con fuente de carbono
g/L Concentración de sustrato
en la que la bacteria empieza a crecer
𝑚2 Mantenimiento por fuente nitrógeno
g/g.h Gramos nitrógeno por gramos de biomasa
𝑚1 Mantenimiento por fuente de carbono
g/g.h Gramos carbono por gramos de biomasa
𝑛 Sustrato fuente de nitrógeno g/L Gramos de fosfato de amonio por litro
𝑠 Sustrato fuente de carbono g/L g sustrato / L de medio
V Volumen L
x Biomasa g/L gramos de biomasa por litros de medio
𝑌𝑥𝑠 Rendimiento biomasa producto
por fuente de carbono g/g
gramos de biomasa y producto por gramos de
carbono
Lista de tablas XVIII
Símbolo Término Unidad Definición
𝑌𝑥𝑛
Rendimiento biomasa nitrógeno g/g gramos de biomasa por gramos de nitrógeno
𝑥(𝑡) Solución exacta - -
�̅�(𝑡) Solucion aproximada - -
Símbolos con letras griegas
Símbolo Término Unidad SI Definición
α, β, 𝛾 Constantes relacionadas al producto
µ Velocidad específica de crecimiento
𝜇max Velocidad específica máxima de crecimiento
𝛿, 휀 Constantes relacionadas a error
Subíndices Subíndice Término
s carbono
m máxima
n nitrógeno
0 Inicial
Superíndices Superíndice Término
𝑛 Exponente, potencia
Introducción
Penicillium sp. HC1, identificado como Penicillium pinophilum, es un hongo celulolítico y
xilanolítico aislado de suelo del Departamento del Tolima - Colombia, y seleccionado por
la alianza Biocultivos S.A - Universidad Nacional de Colombia – IBUN (Pedraza-Zapata et
al., 2016; Gutierrez et al. 2011 ), con el fin de desarrollar un bioinoculante para acelerar la
degradación in situ de residuos de cosecha. Actualmente, dicho producto se encuentra en
trámite de registro ante el ICA y se espera que con su uso se disminuya el impacto
ambiental negativo derivado de la disposición inadecuada de estos residuos y se aumente
la productividad del cultivo, al permitir que los nutrientes contenidos en estos retornen al
suelo mejorando su estructura y aportando materia orgánica.
En general los cultivos durante la etapa de cosecha producen una gran cantidad de
residuos, los cuales deben ser dispuestos para iniciar el siguiente cultivo. En el caso del
arroz, es frecuente la quema a cielo abierto de estos residuos con el fin de disminuir el
tiempo entre cosechas. Esta práctica ocasiona un daño ambiental por las emisiones que
se generan (70% CO2, 7% CO, 0.7% CH4 y 2.1% N2O) (Pathak et al., 2006); además,
deteriora la calidad del suelo, genera pérdida de microfauna benéfica y de nutrientes
contenidos en ese material vegetal.
Una alternativa para este problema es la biodegradación de los residuos mediante
microorganismos con actividad celulolítica y ligninolítica, ya que de esta manera se logra
reincorporar al suelo nutrientes tales como nitrógeno, fósforo, potasio y azufre (Naklang et
al., 1999) Con base en los beneficios que ofrece implementar el proceso de biodegradación
de residuos poscosecha en los campos de cultivos inicialmente de arroz, el grupo de
investigación de Bioprocesos y Bioprospección, en alianza con la empresa Biocultivos S.A.,
desarrolló un inoculante a partir de microorganismos con actividad ligninolítica y
celulolítica; con este fin se seleccionó la cepa Penicillium pinophilum HC1 (Gutiérrez et al.,
2011).
2 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Se tiene información previa del grupo de investigación, respecto al comportamiento de este
microorganismo en diferentes medios de cultivo; por ejemplo, usando diferentes fuentes
de carbono y nitrógeno (Gutiérrez et al, 2015) además de diferentes relaciones entre estas;
de esto se encontró que en fuentes complejas de carbono como la harina de arroz con una
fuente inorgánica de nitrógeno genera una mayor producción de conidios, sin embargo
debido a que las fuentes complejas de carbono no permiten realizar mediciones precisas
en las etapas de escalamiento, se realizaron ensayos teniendo como base los mejores
resultados de las fuentes simples de carbono.
Durante el proceso de escalamiento se ha observado que este microorganismo presenta
respuestas altamente sensibles a ciertas condiciones de estrés, lo cual ocasiona que se
generen productos no deseados; por esta razón, para entender el comportamiento del
microorganismo y el proceso de conidiogénesis, en este trabajo se desarrollaron ensayos
variando las concentraciones iniciales de carbono y nitrógeno, con el fin de observar el
comportamiento respecto al consumo de sustratos, formación de conidios y generación de
biomasa.
A partir de los datos obtenidos en el presente trabajo se generó un modelo macro cinético
asociado a la producción de conidios, para esto se decidió incluir parte de la ruta
metabólica asociada a la generación de biomasa. Este modelo se desarrolló con el fin de
generar herramientas para la implementación de estrategias de Ingeniería de Sistemas de
Procesos. Adicionalmente, el análisis del proceso a través de modelos matemáticos facilita
futuros procesos de escalamiento optimización y automatización del sistema.
1. Objetivos
Objetivo General
Establecer un modelo macro cinético de la producción de conidios a partir de Penicillium
pinophilum en fermentación sumergida por lotes
Objetivos Específicos
Evaluar la influencia de la limitación de fuentes de carbono y nitrógeno en la
generación de biomasa y generación de conidios.
Determinar el comportamiento en términos de crecimiento, producción de conidios
y consumo de sustratos en fermentación sumergida por lotes.
Ajustar y validar un modelo matemático para la formación de conidios.
4 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
2. Marco Teórico
Los residuos vegetales en el cultivo de arroz han venido incrementándose con el aumento
de la producción de arroz; según la FAO (2014) entre 2013 y 2014 se incrementó en 2.87
millones de toneladas la producción de arroz paddy y por cada hectárea de cultivo se
generan entre 4 y 8 toneladas de residuos verdes (Medina, 2010 ) (Figura 2-1).
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
400
600
800
1000
150
160
170
180
ProducciónÁrea Tamo
Pro
du
cció
n/T
am
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Áre
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a)
Figura 2 - 1 Producción, área mundial y generación de tamo de arroz paddy. (FAO, 2014).
Existen diversas opciones para el uso de los residuos vegetales, por ejemplo nano
partículas (Lu y Hsieh, 2012; Wu et al, 2011; Wu et al., 2009), biosílica (Pan et al., 2017),
biorrefinerías (Abraham et al., 2016), biogás (Narra et al., 2016), bioetanol (Goel y Wati,
2016; Kumar et al., 2016), alimento para animales (Sarnklong et al., 2010) y materia prima
para la industria del papel (Juwono y Subawi, 2014); sin embargo, todas ellas tienen altos
costos asociados a la remoción de los residuos hasta el sitio de uso.
Pequeños y medianos agricultores no están en capacidad de absorber los costos que ello
demanda; por esta razón, se recurre a la quema a cielo abierto, ya de esta manera se
libera el terreno para tener un mayor número de cosechas durante el año y se eliminan los
residuos poscosecha de una forma económica.
Capítulo 2. Marco Teórico 5
Sin embargo, esta práctica ocasiona un impacto ambiental negativo, ya que se estima que
la quema de biomasa, como madera, hojas, árboles y pastos —incluidos los residuos
agrícolas—, producen el 40% del dióxido de carbono (CO2), 32% del monóxido de carbono
(CO), 20% del material particulado o partículas de materia suspendidas y 50% de los
hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (HAP) emitidos al ambiente a escala mundial
(Kambis y Levine 1996). Adicional a esto, se causan otros daños ambientales como
pérdida de la materia orgánica, nutrientes, estructura del suelo, micro fauna benéfica, entre
otras.
Una alternativa a la quema de residuos, es la degradación biológica e incorporación al
suelo, a través de microorganismo con actividad celulolítica y ligninolítica, este proceso
ocurre de manera natural en tiempos largos, que los agricultores del trópico no están en
disposición de esperar para realizar su siguiente cultivo. Por esta razón, el uso de
inoculantes microbianos disminuye el tiempo de degradación y hace posible la
reincorporación de la materia orgánica producida, disminuyendo los costos asociados a los
nutrientes que se deben adicionar para cada cosecha.
Con este objetivo, en el Instituto de Biotecnología, el Grupo de Bioprocesos y
Bioprospección está desarrollando un proceso de producción de un inoculante elaborado
a partir de Penicillium pinophilum. Este ha sido evaluado en condiciones de laboratorio y
campo sobre residuos pos cosecha de arroz; utilizando este inoculante el proceso de
degradación en campo tarda 30 días, momento en el cual la materia orgánica y los
nutrientes pueden ser reincorporados en la preparación del suelo para el cultivo.
La comercialización del inoculante exige que el producto sea estable en el tiempo, por esta
razón, se decidió formular el producto a partir de estructuras de resistentes y tolerantes a
condiciones ambientales, para el caso de P. pinophillum los conidios cumplen con estas
características (Gutiérrez et al 2015, Duran, 2017)
2.1.1 Penicillium spp.
Penicillium es un género fúngico diverso presente a nivel mundial, sus especies tienen
diversas aplicaciones como descomposición de materia orgánica, producción de
micotoxinas, generación de enzimas y antibióticos. Algunas especies, generan un impacto
negativo al ser fitopatógenos en diversos cultivos (Frisvad et al., 2004; Pitt y Hocking, 2009;
6 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Samson et al., 2010), mientras otras tienen efectos positivos, por ejemplo en la industria
de alimentos son usadas para la producción de quesos como Camembert o Roquefort o
salchichas maduradas; también es capaz de degradar celulosa, quitina, almidón, azúcares,
lignina, entre otros (Barnett y Hunter, 1998). Sin embargo su mayor impacto es la
producción de penicilina, que revolucionó los enfoques médicos para el tratamiento de
enfermedades bacterianas (Visagie et al., 2014a); adicionalmente tiene aplicaciones en
otros campos como agentes biocontroladores (Larroche y Gros, 1997) y catalizadores para
la biotransformación (Smith y Calam, 1980).
Este hongo se caracteriza por tener cadenas de conidios paralelas, sin formar columnas;
los conidios son elípticos, lisos, de color verde pálido o amarillento. Las colonias son de
color verde a verde amarillo o amarillo brillante a anaranjado en medios que contienen
azúcar; las hifas superficiales están salpicadas de gránulos amarillos y el reverso y
substrato se colorean profundamente de rojo; en otras condiciones de medio y acidez, el
substrato puede colorearse de amarillo, de anaranjado, o de rojo. Los conidióforos tienen
un tamaño de 100 - 200 micras (Loustau Gomez de Membrillera, 1950; Visagie et al.,
2014b). Adicional a esto se ha descrito como un hongo filamentoso, heterótrofo, saprofito,
aerobio facultativo (Barnett y Hunter, 1998).
En este caso se trabajó con una cepa nativa de Penicillium pinophilum HC1 del cepario del
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Este hongo pertenece
al reino Fungi, subdivisión Ascomycota, Clase Eurotiomycetes, orden Eurotiales, familia
Trichocomaceae, género Penicillium, especie pinophilum (“Mycobank,” 2017).
Penicllium pinophilum ha sido descrito por diversos autores como un hongo celulolítico,
xilanolítico y ligninolítico debido a la capacidad que tiene de producir enzimas como
celulasa, β-glucosidasa, endoglucanasa, xilanasa, y lacasa (Brown et al., 1987;
Claeyseens et al.,1989; Dhakar et al., 2014; Jeya et al., 2010; Maharana, 2016; Pol et al.,
2012; Wood et al., 1986, Mccrae et al., 1989 ), por otra parte este hongo presenta
características como degradación de polietileno (Volke-Seplveda et al., 2002), promoción
de crecimiento vegetal (Visagie et al., 2014; Maity et al., 2014), producción de enzimas
como glucosa oxidasa (Rando et al., 1997), feruloyl/ρ-coumaroyl esterasa (Castanares et
al., 1992) y Poli(3-hidroxibutirato)-depolimerasa (Panagiotidou et al., 2014) y generación
de metabolitos secundarios como ácido 2 metil 4 hidroxibenzoico (Stefano y Nicoletti,
Capítulo 2. Marco Teórico 7
1999), funicona (Stefano et al., 2002), 3-O-metilfunicona (Buommino et al., 2011), ácido
micofenólico (Ramos et al., 2012) y metabolitos fenólicos (Wu et al., 2016)
2.1.2 Conidiogénesis
La reproducción asexual es un modo reproductivo común para un grupo diverso de hongos
que incluye muchas especies importantes desde el punto de vista médico, industrial y
agrícola. Las esporas asexuadas de hongos superiores se denominan conidios y, aunque
hay gran variedad de forma y función conidial, todos los conidios representan propágulos
asexuales no móviles que se forman en la punta de células conidiógenas especializadas,
estos no se forman a través del rompimiento progresivo del citoplasma. El proceso de
conidiación implica temas comunes de desarrollo, incluyendo la regulación temporal y
espacial de la expresión génica, la especialización celular y la comunicación intercelular
(Adams et al., 1998).
La conidiogénesis es el proceso que lleva a la formación de los conidios; este proceso es
un aspecto especializado del crecimiento vegetativo, en el cual la división mitótica del
núcleo es seguida por delimitación y eventualmente separación de una porción de hifa
como un conidio (Moss, 1987); esta puede ser de dos tipos, blástica y tálica. En la
conidiogénesis blástica hay un pequeño brote en la célula conidiógena que da lugar al
conidio; por otra parte en la conidiogénesis tálica se forman conidios por modificación del
micelio preexistente (Sigler, 1989). La conidiogénesis blástica se clasifica en holoblástica
y enteroblástica; la primera hace referencia al proceso en el cual ambas paredes de la
célula conidiógena participan en la formación del conidio, la segunda se refiere al proceso
en el cual no participa ninguna pared o solamente la pared interna de la célula conidiógena,
en ese caso el conidio sale a través de una abertura en la pared de la célula madre, se
rodea de una nueva pared y deja una cicatriz. Este tipo de reproducción se da en varios
hongos como Penicillium spp. y Aspergillus spp. (Dijkterhuis y Samson, 2002).
El género Penicillium, se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada
llamada conidióforo la cual termina en células conidiógenas llamadas fiálides. Las
ramificaciones se ubican formando verticilos. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es
monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poli verticilado son ramas, rámulas,
métulas y fiálides Figura 2 - 2. Los conidios generados en fiálides suelen llamarse
8 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
fialoconidios para indicar su origen (Webster, 1986). En la fiálide, se dan sucesivas
divisiones mitóticas al dividirse el núcleo, cada una de las cuales da como resultado una
nueva célula hija especializada (conidio) (Hansberg y Aguirre, 1990); este proceso se
extiende simultáneamente el extremo apical que luego se estrangula separando la recién
formada célula reproductiva. Se llama conectivo a la porción de pared que une entre sí a
los conidios permitiendo la formación de cadenas, y en algunas especies se aprecia
claramente con el microscopio óptico (Webster, 1986).
Figura 2 - 2 Conidioforos observados en Penicillium, A. conidióforos con fiálide solitaria. B.monoverticilados. C. Bifurcado. D, E. Biverticilado F. Terverticilado. G. Poliverticilado (Visagie et al., 2014)
El ciclo de vida de Penicillium tiene las siguientes fases: adaptación de los conidios al
nuevo ambiente fisicoquímico; germinación de conidios que se extiende en hifas
generando la fase exponencial la cual corresponde al crecimiento del microorganismo; la
fase estacionaria es el equilibrio entre el incremento y decrecimiento de las hifas, luego
estas se diferencian en conidióforos y estas estructuras producen nuevos conidios
(Kolmark, 1984) (Desfarges et al., 1987); el comportamiento descrito se observa en la
Figura 2 - 3.
Capítulo 2. Marco Teórico 9
Figura 2 - 3 Proceso de conidiogénesis (Canteri y Ghoul, 2015a)
En forma más detallada el proceso de germinación da como resultado la formación de un
tubo germinal, cuyo crecimiento temprano se apoya en la movilización y utilización de
compuestos de almacenamiento en el conidio. A medida que el tubo germinal se desarrolla,
contribuye a la biosíntesis y extensión por absorción y metabolismo de los nutrientes del
medio. La extensión de hifas es un ejemplo extremo de crecimiento celular polarizado ya
que la extensión celular está restringida a una estrecha zona definida por el ápice de hifas
que se estrecha. La tasa de extensión se acelera a medida que aumenta la longitud del
tubo germinal y el crecimiento se vuelve auto catalítico (Papagianni, 2004).
En condiciones apropiadas, el micelio vegetativo da lugar a un micelio reproductor que
apoya la producción de estructuras reproductoras. El tipo de reproducción y la morfología
de las estructuras obtenida son clave en la identificación de hongos. Por lo tanto, el conidio
fúngico puede considerarse como el principio y el final del proceso de diferenciación. En
los hongos miceliales, las hifas se crecen por un proceso altamente polarizado de
ramificación celular conocido como extensión de la punta. A medida que la punta se
10 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
extiende, las ramas periódicas se forman en o cerca del vértice de la punta. Estas ramas
también se extienden de una manera polarizada como nuevas puntas. Los dos procesos
de extensión y ramificación de la punta permiten al organismo colonizar y utilizar
eficientemente el sustrato, y rara vez se encuentran en organismos distintos de los hongos,
lo que lleva a que se les denomine marcas del reino fúngico (Heath, 1995)
Para dar inicio al proceso de conidiación es necesario generar estímulos ambientales,
entre los cuales se encuentran la limitación por nutrientes, el estrés osmótico y la
acumulación de moléculas autorreguladoras que informan sobre la generación de
estructuras de reproducción (Roncal y Ugalde, 2003).
Después de la inducción del proceso de conidiación, se llevan a cabo las siguientes cuatro
etapas; las hifas vegetativas de crecimiento apical detienen inmediatamente la extensión
(etapa 1). La célula apical está delimitada por un tabique y comienza a hincharse, con la
concomitante formación de ramas subapicales (etapa 2). La célula apical se diferencia en
una fiálide (etapa 3), que finalmente brota en su punta, dando lugar al primer conidio (etapa
4). Una vez que el primer conidio se ha formado en la fiálide, un nuevo conidio aparece en
intervalos aproximadamente de hora en hora aproximadamente, dando por resultado una
cadena de conidios. Los capullos subapicales formados en las primeras etapas también
se diferencian en fiálides que producen conidios, dando lugar a la formación de estructuras
pinceladas características llamadas “penicilli”, las cuales dan origen al nombre del género
(Penicillium) (Roncal y Ugalde, 2003).
2.1.3 Producción de conidios
La producción industrial de insumos a partir de organismos miceliales (filamentosos) es
más complicada que la de microorganismos unicelulares (bacterias y levaduras), ya que
según la forma en que se desee generar el producto final las condiciones que se deben
controlar varían; generalmente los productos a partir de hongos se formulan con conidios
ya que estas estructuras de reproducción presentan un mayor estabilidad, tolerancia y se
garantiza una mayor concentración de propágulos que con el micelio vegetativo (Stanbury
et al., 2016).
La mayoría de los hongos usados a nivel industrial son capaces de generar conidios, éstos
se buscan en dos tipos de producción: cuando la inducción del proceso de conidiogénesis
Capítulo 2. Marco Teórico 11
activa un metabolismo secundario de interés (Chalier y Crouzet, 1998; Ibba et al., 1987) o
para formulación directa de productos biológicos. Para esto se han desarrollado tres
técnicas básicas con el fin de obtener una alta concentración de conidios: fermentación en
medio solidificado, fermentación en medio sólido y fermentación sumergida (Stanbury et
al., 2016).
La fermentación en medio sólido se refiere a la producción de conidios de manera
superficial en medios químicamente definidos con agar. Una técnica usual es "roll-bottle"
usada para la producción de conidios de P. chrysogenum; ésta consiste en preparar el
medio en botellas cilíndricas luego el medio se enfría a 45°C en un molino de rodillos de
manera tal que el agar se establece como una envoltura cilíndrica dentro de la botella. A
pesar de los problemas técnicos que tiene este tipo de producción proporciona una gran
superficie para el cultivo de conidios en un recipiente de poco tamaño. Por medio de este
tipo de fermentaciones se han obtenido producciones de conidios de P. chrysogenum del
orden de 108 a 1010 conidios/ml (El Sayed, 1992; Hockenhull, 1980) para el caso de P.
camemberti se han obtenido producciones de conidios de 107 conidios/ml (Krasniewski et
al., 2006).
Las fermentaciones en sustrato sólido son aquellas en las cuales el crecimiento se produce
sobre una matriz sólida en ausencia (o casi ausencia) de agua libre (Singhania et al., 2009).
Los microorganismos con crecimiento micelial se adaptan bien a tales sistemas, ya que su
crecimiento en forma de hifas facilita la colonización de sustratos sólidos; este tipo de
contacto entre el organismo de proceso y un sustrato sólido permite el uso de
concentraciones de sustrato muy elevadas pero con un sistema de "liberación lenta", de
esta manera el microorganismo crece en un ambiente similar al natural ya que controla su
alimentación al solubilizar el sustrato. Por este método se induce el proceso de conidiación
debido a que ese sistema se asocia a un medio con limitación de nutrientes (Stanbury et
al., 2016). Para este tipo de fermentaciones es común el uso de cereales como arroz, trigo
(salvado), cebada o maíz; en estos sistemas el proceso de conidiogénesis de un hongo
dado se ve particularmente afectado por la cantidad de agua añadida al cereal antes de la
esterilización y la humedad relativa de la atmósfera, que debería ser lo más alta posible
durante la conidiación (Vezina et al., 1975).
12 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
La producción de conidios en medios solidificados o sólidos por hongos pertenecientes al
filo Ascomycota es normalmente inducida por el desarrollo de hifas que sobresalen en la
atmósfera (Adams et al., 1998). Sin embargo, muchos de estos hongos generan conidios
en cultivo líquido sumergido (un matraz de agitación o fermentador) si se emplea un medio
adecuado con nutrientes limitados (Vezina et al., 1975). El proceso de cultivo líquido
sumergido consiste en el cultivo de un organismo, en un medio líquido definido en un
tanque llamado fermentador, que puede ser aireado y / o agitado (Canteri y Ghoul, 2015a).
Este enfoque es más conveniente que el uso de medios sólidos o solidificados ya que de
esta manera se disminuyen los riesgos de contaminación y se puede generar un proceso
de escalamiento. Esta técnica fue adoptada por primera vez en 1946 al inducir el proceso
de conidiogénesis en fermentación sumergida para Penicillium notatum adicionando 2,5%
de cloruro de calcio en un medio definido de nitrato-sacarosa (Foster et al., 1946). Algunas
producciones reportadas se encuentran en la Tabla 2 - 1
Tabla 2 - 1 Producción de conidios y biomasa para diferentes especies de Penicillium.
Conidios/ml Biomasa
(g/L)
Tiempo
(h)
Vol.
(L) Especie Referencia
4.00x108 - 96 - P. notatum (Foster, et al, 1946)
8.00x107 8,00 80 0,025 P. notatum (Hadley y Harrold, 1958)
3.75X106 2,50 150 2 P.
chrysogenum (Riguelato et al.,1968)
5.88x106 0,20 72 1 P. notatum (Pitt y Poole, 1981)
6.30 x108 12,00 72 60 P. paxilli (Ibba et al., 1987)
2.30x107 8,12 168 0,050 P. oxalicum (Pascual et al., 1997)
1.60 x108 4,00 96 10 P.
camemberti
(Bockelmann et al.,
1999)
3.20 x108 2,20 168 0,050 P.
camemberti (Boualem et al., 2014)
5.00x106 6,40 168 0,050 P.
camemberti (Boualem et al., 2015)
Capítulo 2. Marco Teórico 13
La producción de conidios en fermentación sumergida tiene una serie de ventajas como
permitir un mayor control sobre las variables a evaluar, obtener resultados en poco tiempo
y bajos costos de medio, además se tiene la posibilidad de escalamiento, automatización
y obtención del producto sin operaciones posteriores de separación (Bockelmann et al.,
1999) pero los conidios producidos bajo estas condiciones tienen menor viabilidad y
eficacia (Pascual et al., 2000). Esta última desventaja presente en la fermentación líquida
no se presenta en la fermentación sólida o en medio solidificado, aunque en este sistema
(sólido) se tienen problemas como los costos de maquinaria, la esterilidad y el control de
humedad (Desfarges et al., 1987).
2.1.4 Variables que afectan el proceso de conidiogénesis
El comportamiento del crecimiento en procesos que implican microorganismos miceliales
es un parámetro importante que se debe tener en cuenta durante las fermentaciones
líquidas (Canteri y Ghoul, 2015a). La morfología macro y microscópica de hongos
filamentosos se puede modificar a través de control en variables como el pH, oxígeno
disuelto, agitación y alimentación. Teniendo en cuenta esto, la inducción del proceso de
conidiogénesis es sensible a ciertos tipos de estrés, inductores, variables físicas (aire, luz,
agitación) y limitación de nutrientes (Canteri y Ghoul, 2015a; Roncal y Ugalde, 2003). A
continuación se da una explicación detallada de cada variable.
2.1.5 Inductores
Los inductores son iones o compuestos que activan el proceso de conidiogénesis bajo
condiciones específicas; dentro de estos se encuentran, sales, ácidos y terpenoides. El ion
calcio, permite controlar el tiempo de inicio del proceso de conidiogénesis teniendo en
cuenta que este se relaciona con el tiempo de crecimiento vegetativo (Pitt y Poole, 1981).
En otros casos la inducción de la producción de conidios se asocia con la producción de
metabolitos secundarios como es el caso de la crisogenina, patulina y conidiogenona
producidas a partir de P. chrysogenum (Foster et al., 1946), P. paxilli (Ibba, Taylor,
Weedon, & Mantle, 1987) y P. cyclopium (Roncal et al., 2002) respectivamente. En algunos
casos se genera ácido oxálico como es el caso de P. bilaii (Cunningham & Kuiack, 1992),
o metil cetonas para el caso de P. roqueforti (Chalier y Crouzet, 1998) sustancias que
actúan como inductores. También se ha asociado la producción de conidios con la
14 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
inhibición de metabolitos secundarios como es el caso de la paxilina producida por P. paxilli
(Ibba et al., 1987).
Se ha demostrado que la asociación del calcio con el micelio sigue una cinética bifásica,
la cual consiste en una fase rápida independiente del metabolismo, seguida por una fase
dependiente del metabolismo más lenta. La primera fase se puede explicar como la
adsorción del catión a la superficie celular, mientras que la segunda fase muestra la
cinética de saturación la cual está principalmente mediada por mecanismos de transporte
activo (Canteri y Ghoul, 2015b; Ugalde y Pitt, 1986; Ugalde et al, 1990). El calcio al ser
adsorbido por las paredes inhibe el crecimiento celular; sin embargo, al encontrarse en
concentraciones subóptimas se promueve el crecimiento micelial (Bockelmann, Portius,
Lick, & Heller, 1999). En la Tabla 2 - 2 se presenta el intervalo de concentraciones de calcio
que ha sido reportado en la literatura como inductor de conidiogénesis para diferentes
especies de Penicillium, intervalo que varía entre 0,02 y 50 g/L.
Tabla 2 - 2 Concentraciones de calcio inductoras de conidiogénesis para diferentes especies de Penicillium.
Sustancia Concentración g/L Microorganismo Referencia
CaCl2 5 – 50 P. chrysogenum (Foster et al., 1946)
CaCl2 1,00 P. notatum (Hadley y Harrold, 1958)
CaCl2 10,0 P. griseofulvum (Morton, 1961)
CaCl2 1,11 P. notatum (Pitt y Poole, 1981)
CaCl2 0,99 P. cyclopium (Ugalde y Pitt, 1983)
CaCl2 20,00 P. Paxilli (Ibba et al., 1987)
CaCO3 20,00 P. Urticae (Pazout y Schröder, 1988)
CaHPO4 0,02 P. bilaii (Cunningham y Kuiack, 1992)
CaCl2 4,44 P. oxalixum (Pascual et al., 1997b)
CaCl2 1,60 P. camemberti (Bockelmann et al., 1999)
CaCl2 1,11 P. cyclopium (Roncal et al., 2002)
Capítulo 2. Marco Teórico 15
2.1.6 Variables físicas
El crecimiento de microorganismos filamentosos se ve afectado por condiciones físicas
como pH, temperatura, agitación y aireación, pero se deben tener en cuenta otros factores
físicos que afectan la morfología como la geometría del fermentador, los sistemas de
agitación, la tasa de esfuerzo cortante y la reología (Canteri & Ghoul, 2015).
Los hongos filamentosos pueden presentar dos tipos de crecimiento macroscópicos,
micelial y pellets, cada uno está asociado a una aplicación final determinada, es decir para
el caso de producción de metabolitos secundarios se prefiere el crecimiento en forma de
pellets ya que de esta manera se disminuyen las operaciones de separación posteriores,
mientras para el caso de los bioinsumos, donde el microrganismo es el producto final, es
necesario considerar un crecimiento homogéneo que permita una fácil aspersión en
campo. La morfología macroscópica se puede controlar por medio de condiciones
hidrodinámicas determinadas, como se puede observar en la Figura 2 - 4 donde
velocidades de aire superficial bajas y factores de fricción altos generan la formación de
pellets.
Figura 2 - 4 Factor de fricción en la columna de burbujeo como descriptor del régimen de flujo (García-Soto et al., 2006)
La condiciones apropiadas de aireación se ven afectadas por los iones presentes en el
medio, se ha encontrado que al aumentar la concentración de calcio disminuye la
concentración de oxígeno y se requiere aumentar la agitación o aumentar el flujo de aire
(Bockelmann et al., 1999).
16 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Por otra parte un factor ambiental que afecta el proceso de diferenciación y la morfología
en hongos es el pH, ya que no solo influencia el proceso de conidiogénesis sino también
la formación de pellets (Whitaker & Long, 1973). El crecimiento vegetativo está asociado a
pH bajos, mientras la producción de conidios generalmente está asociada a pH cercanos
al neutro, en este caso es necesario controlar el pH ya que en condiciones cercanas a la
neutralidad se activa la formación de pellets (S. J. Pirt & Callow, 1959). En la Tabla 2 - 3
se encuentran las condiciones utilizadas en diferentes escalas para la producción de
conidios, se puede observar que las condiciones de aireación y agitación utilizadas son
generalmente bajas y en el caso de P. cyclopium no se utiliza agitación, y la temperatura
usualmente se mantiene en 25 °C.
Tabla 2 - 3 Variables físicas reportadas para cultivo sumergido de diferentes especies de Penicillium.
Microorganismo Aireación
vvm Agitación
rpm Temperatura
°C Volumen
L Referencia
P. notatum N.A 125 25 0,025 (Hadley y Harrold,
1958)
P. notatum 1 150 25 2,0 (Pitt y Poole, 1981)
P. cyclopium 0,5 --- 25 2,0 (Ugalde y Pitt,
1983)
P. cyclopium 1,5 --- 25 2,0 (Ugalde y Pitt,
1986)
P. Paxilli 1 367 24 60 (Ibba et al., 1987)
P. Urticae N.A 0,5
250 600
24
0,1 0,6
(Pazout y Schröder, 1988)
P. bilaii N/A 200 22 0,125 (Cunningham y Kuiack, 1992)
P. oxalicum N/A 150 25 0,050 (Pascual et al.,
1997b)
P. camemberti 0,3 100 25 10 (Bockelmann et al.,
1999)
P. cyclopium N/A 150 25 0,005 (Roncal et al.,
2002)
P. camemberti N/A 150 18-30 0,050 (Boualem et al.,
2014)
Capítulo 2. Marco Teórico 17
2.1.7 Limitación de nutrientes
La iniciación de la formación de los conidios para continuar con el crecimiento micelial y
posterior generación de nuevos conidios, se debe a un cambio en la composición de los
nutrientes o a la limitación de uno de los sustratos. El principal efecto de la composición
del medio se da en la transición de las etapas de crecimiento del microorganismo
(germinación, crecimiento vegetativo y conidiación), sin embargo los efectos de activación
o inhibición dependen de los componentes adicionados al medio. (Canteri y Ghoul, 2015).
Uno de los factores más importantes en el proceso de conidiogénesis es la deficiencia
nutricional ya que por medio de ésta se disminuye la tasa de crecimiento activando la
generación de estructuras de reproducción (Pitt y Poole, 1981; Roncal y Ugalde, 2003).
Bajo condiciones nutricionales y ambientales equilibradas, el crecimiento del hongo
permanece normalmente vegetativo. Sin embargo, si las condiciones de crecimiento
cambian y se desequilibran por la deficiencia nutricional y / o por cambios críticos en los
parámetros ambientales esenciales, el patrón de crecimiento vegetativo puede cambiar,
dando lugar a la formación de la morfología reproductiva asexual. El crecimiento se
considera desequilibrado cuando la tasa de crecimiento del organismo está limitada por
factores como la temperatura, concentración de oxígeno, dióxido de carbono y pH; sin
embargo el crecimiento desequilibrado no siempre da lugar al proceso de conidiogénesis,
por ejemplo la limitación de carbono puede causar autolisis (Smith et al., 1981).
La limitación de nitrógeno es el principal desencadenante de la coniodiogénesis (Znidarsic
y Pavko, 2001; Vezina et al., 1965). Algunas especies del género Penicillium generan
conidios bajo condiciones de limitación de la fuente de carbono y nitrógeno, para P.
cyclopium el agotamiento de nitrógeno y su relación con la concentración de calcio son los
factores más importantes que desencadenan el proceso de conidiogénesis, el agotamiento
del nitrógeno y la adición de calcio a un medio con alta relación C: N son las condiciones
que inducen este proceso (Pascual et al., 1997b). La producción de conidios en P.
griseofulvum es inducida por la transferencia del microorganismo a medios libres de
nitrógeno con altas concentraciones de calcio y azúcar (Morton, 1961). Sin embargo para
el caso de P. chrysogenum se encontró que el proceso de conidiogénesis se induce en
medios con limitación de glucosa (Righelato et al., 1968). Por otra parte se encontró para
P. griseofolvum que en ciertas condiciones, la privación de nitrógeno puede inducir
18 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
producción de conidios y este proceso puede revertirse completamente añadiendo un
nuevo suministro de nitrógeno en las primeras etapas del proceso (Morton, 1960); este
comportamiento se confirmó en P. candidum: mediante el control del consumo de nitrógeno
se observó que al agotarse completamente el nitrógeno del medio se desencadena la
producción de conidios, pero al adicionar nuevamente nitrógeno al medio se detiene este
proceso, reanudando el crecimiento vegetativo, con respecto a la fuente de carbono se
encontró para esta especie que las altas concentraciones de glucosa favorecen el
crecimiento vegetativo, mientras que las bajas concentraciones incrementan la formación
de conidios (Canteri y Ghoul, 2015)
Con respecto a la fuente de carbono es necesario tener en cuenta que el tipo y la
concentración de la fuente de carbono son importantes en la evolución y desarrollo de la
fermentación ya que afectan la cinética de crecimiento, la tasa de producción conidios y el
rendimiento final. La concentración inicial de glucosa afecta la longitud de los filamentos,
lo cual muestra que hay una relación entre la tasa específica de crecimiento y la frecuencia
de fragmentación (Papagianni, 1999). Adicional a esto, se debe considerar la fuente de
carbono apropiada para cada microorganismo ya que algunas especies de Penicillium
necesitan crecer con fuentes simples como monosacáridos, disacáridos y alcoholes
provenientes de azucares o complejas como polisacáridos por ejemplo almidón, celulosa,
pectina entre otros (Moss, 1987). En algunos casos los medios complejos con
concentraciones altas de sales generan mejores índices de conidiación; sin embargo, no
se han encontrado explicaciones de la utilidad de estas concentraciones en el medio para
mejorar este proceso (Vezina et al., 1965).
En la Tabla 2 - 4 se encuentran algunas composiciones de fuentes de carbono y nitrógeno
reportadas para el crecimiento de diferentes especies del genero Penicillium, se puede
observar que las fuentes de carbono simples como glucosa o sacarosa son comunes para
el proceso de conidiogénesis, mientras que las fuentes de nitrógeno usadas son nitrato de
sodio o potasio y sulfato de amonio.
Capítulo 2. Marco Teórico 19
Tabla 2 - 4 fuentes de carbono utilizadas en el proceso de conidiogénesis
Fuente carbono
Conc. Fuente
nitrógeno Conc. Microorganismo Referencia
Sacarosa 20 g/L NaNO3 6 g/L P. notatum (Foster et al.,
1946; Hadley y Harrold, 1958)
Sacarosa 5 g/L (NH4)2SO4 1 g/L Aspergillus niger (Broderick y
Greenshields, 1981)
Sacarosa 5 g/L NaNO3 1,3 g/L Aspergillus niger (Broderick y
Greenshields, 1982)
Sacarosa 30 g/L NaNO3 3 g/L P. paxilli (Ibba et al., 1987)|
Glucosa 50 g/L (NH4)2SO4 1,6 g/L P. griseofulvum (Bent y Morton,
1963)
Sacarosa 20 g/L - - P. notatum (Pitt y Poole,
1981)
Glucosa 5 g/L Extracto de
levadura 20 g/L P. roqueforti
(Chalier y Crouzet, 1998)
Glucosa 100 g/L C2H3O2NH4 2,1 g/L P. camembertii (Bockelmann et
al., 1999)
Glucosa 50 g/L KNO3 2,940 g/L
P. oxalicum
(Pascual et al., 2000)
Maltosa Glucosa
Sacarosa Almidon
Asparagina Peptona NaNO3 KNO3
P. sclerotigenum (Cutrim et al.,
2006)
Glucosa 4 g/L NH4Cl 1,8 g/L P. camembertii (Adour et al.,
2006)
Glucosa 50 g/L KNO3 1 g/L P. camembertii (Boualem et al.,
2014)
Glucosa 0,99 -
49,6g/L (NH4)2SO4 2,24 g/L P. camembertii
(Pazout y Schröder, 1988)
Glucosa 50 g/L 50 g/L
KNO3 -
2,3 g/L -
P. oxalicum (Pascual et al.,
1997a)
Glucosa Sacarosa Almidon
H. Arroz * S. Trigo *
20 g/L 20 g/L
21,6 g/L 21,3 g/L 27 g/L
Triptosa Ext. Levad* (NH4)2HPO4
KNO3
7,98 g/L 9,18 g/L 4,63 g/L 7,08 g/L
P. sp. HC1 (Gutierrez-Rojas
et al.,2015)
* H. arroz (Harina de arroz), S. Trigo (Salvado de Trigo), Ext. Levad (Extracto de levadura)
20 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
2.1.8 Régimen operacional
2.1.9 Lote
El crecimiento en cultivos por lote se produce en una cantidad limitada de nutrientes hasta
que el crecimiento se restringe por agotamiento de estos o desarrollo de condiciones
desfavorables. El crecimiento del lote se divide normalmente en varias fases. La primera,
la fase de adaptación (lag), es un período de preparación para el crecimiento que puede
requerir germinación de conidios, adaptaciones fisiológicas, síntesis de sistemas
enzimáticos necesarios para la utilización de sustrato, o eliminación de compuestos
inhibidores llevados con el inóculo (Prosser, 1995b).
La adaptación incluye la formación de enzimas y productos intermedios para apoyar la
reanudación del crecimiento. La duración de esta fase depende no sólo del estado
fisiológico del hongo, sino también de la morfología y el nivel del inóculo. Los inóculos de
conidios requieren un período de germinación (Smith & Calam, 1980), mientras que los
inóculos que presentan precipitación pueden requerir cierto grado de alteración mecánica
antes de la inoculación (Greasham, 1991).
La fase exponencial se caracteriza por un aumento significativo de la masa celular. La tasa
de crecimiento de las hifas depende no sólo de la cepa del hongo, sino también de las
condiciones fisicoquímicas del medio ambiente. Al igual que en los medios sólidos, el
crecimiento exponencial resulta de la auto catálisis mediante la producción exponencial de
ramas, cada una de las cuales se extiende a una velocidad lineal. Se produce una
reducción de la tasa de crecimiento específico cuando el hongo comienza a experimentar
un entorno de crecimiento desfavorable, tal como la limitación de un nutriente requerido,
el desarrollo de un valor de pH adverso o la acumulación de productos finales del
metabolismo que son inhibidores (Papagianni, 2004).
La fase estacionaria se puede definir de forma simplista como el equilibrio entre el aumento
de masa de hifas y su disminución. Sin embargo, si la masa de hifas acumula el material
de almacenaje intracelular durante la fase de crecimiento reducido, puede observar un
aumento ligero en la masa hifal durante el metabolismo endógeno de estos materiales de
almacenaje. Además, si las hifas empiezan a autolizarse, se puede esperar un incremento
en los productos de autólisis (Papagianni, 2004).
Capítulo 2. Marco Teórico 21
2.1.10 Continuo
En el cultivo por lotes, la velocidad de crecimiento es sólo constante durante la fase
exponencial, lo cual representa una limitación con respecto al estudio de la fisiología y las
propiedades de los organismos a tasas de crecimiento específicas submáximas . Esto se
puede conseguir usando un cultivo continuo, en el que se suministra medio fresco al cultivo
a una velocidad constante, mientras que el fluido de cultivo y la biomasa se eliminan a la
misma velocidad de tal modo que el volumen del cultivo permanece constante. Los
estudios de cultivo continuo han demostrado ser valiosos para los estudios fisiológicos,
pero la técnica no es ampliamente utilizada en industrias, a pesar de que puede
proporcionar una mayor productividad que el cultivo por lotes. Los principales problemas
son la necesidad de esterilizar grandes volúmenes de medio continuamente, el
mantenimiento de cultivos axénicos y la regresión de las cepas productoras (Prosser,
1995b).
2.1.11 Lote alimentado
La mayoría de las fermentaciones industriales a gran escala que implican hongos
filamentosos implican cultivo alimentado por lotes en el que la biomasa se cultiva
inicialmente en cultivo discontinuo hasta que el sustrato se utiliza completamente. Luego
se añade nutriente fresco, y se puede obtener el producto deseado, pero de una manera
diferente a la descrita en la sección anterior. Por ejemplo, se puede suministrar una forma
concentrada de un componente, o componentes, del medio original, en lugar de un medio
completo. De forma similar, se puede añadir un precursor del producto. El objetivo es
promover la formación de productos pero no necesariamente aumentar la concentración
de biomasa. El sustrato se convierte inmediatamente al entrar en el fermentador por los
altos niveles de biomasa activa. El metabolismo está dirigido hacia la formación del
producto, en lugar del crecimiento o a la inhibición del sustrato y la represión de catabolitos
se minimiza. El control máximo de los cultivos de lote alimentado se logra mediante la
adición de sustrato en momentos determinados por propiedades específicas del medio que
se monitorea continuamente (Prosser, 1995b).
Una diferencia importante entre el cultivo alimentado y continuo es que la tasa de
crecimiento específico no es constante en el primero; sin embargo, un análisis del cultivo
22 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
por lote alimentado predice el establecimiento de un estado pseudo-estacionario, en el cual
la tasa de crecimiento específico es igual a la velocidad de dilución; a diferencia de la
situación en un quimiostato, el volumen aumenta continuamente en el cultivo alimentado
en lote y, por tanto, disminuye la tasa de crecimiento específico (Pirt, 1975)
2.1.12 Modelos matemáticos
Un modelo matemático es una descripción de un proceso o sistema en forma matemática.
Las ecuaciones matemáticas describen las cinéticas de crecimiento, muestran los cambios
temporales en la biomasa u otras características de crecimiento; por lo tanto, estas
ecuaciones por si mismas son modelos matemáticos (Prosser, 1995b).
Se pueden hacer algunas distinciones entre cinética y otras formas de modelos
matemáticos de crecimiento fúngico. La primera, y más importante, se refiere a la función
del modelo. Las ecuaciones cinéticas se usan generalmente para describir los cambios en
las propiedades de un cultivo en la forma más simple y conveniente. En consecuencia, son
de naturaleza empírica y pueden basarse únicamente en datos experimentales. No
necesitan basarse en ningún conocimiento de los mecanismos de crecimiento
subyacentes, aunque este conocimiento aumentará su fiabilidad (Prosser, 1995b).
Los modelos generalmente funcionan como hipótesis cuantitativas, basadas en conjuntos
de supuestos relativos a un aspecto particular del crecimiento de los hongos, estas
predicciones son utilizadas como una base del trabajo experimental. Generalmente es
necesario verificar la concordancia entre los datos experimentales y los predichos, ya que
esta información proporcionará apoyo a las suposiciones subyacentes del modelo,
mientras que las discrepancias pueden dar lugar a la modificación o rechazo de estos
supuestos (Prosser, 1995b).
Por otra parte los bioprocesos en los cuales se utilizan hongos filamentosos normalmente
se llevan a cabo en fermentación sumergida, para este caso una descripción de todo el
proceso implica el modelamiento de la cinética microbiana y el comportamiento del reactor.
Este último incluye la descripción de los gradientes de concentración en el biorreactor, los
cuales son generados por el patrón de los flujos de la fase líquida y gaseosa. Además, la
descripción de los fenómenos de transferencia de masa es una parte importante en el
modelo de biorreactor, especialmente en los procesos donde se utilizan hongos
Capítulo 2. Marco Teórico 23
filamentosos, es necesario describir la transferencia de oxígeno de la fase de gas a la fase
líquida, ya que estos procesos son a menudo operados con limitaciones de transferencia
debido a la alta viscosidad obtenida durante el proceso de fermentación (Moser, 1988).
La fase biótica en un biorreactor está constituida por una población de células individuales
y por lo tanto es necesario combinar un modelo cinético para células individuales con un
modelo de población cuando la cinética de reacción global se va a cuantificar.
Generalmente se asume que todas las células en la población son idénticas, en este caso
la población puede ser descrita por el mismo vector de estado y se puede aplicar un modelo
de población simple (No segregado). Cuando la diversidad de las células individuales es
descrita en el modelo de población este es normalmente referido como un modelo
segregado. En muchos casos la cinética de las células individuales se hace como un
modelo no estructurado como por ejemplo el modelo de Monod. Estos modelos pueden
describir condiciones de crecimiento equilibradas bastante bien; sin embargo, fallan al
describir el crecimiento en condiciones de estado transiente, por ejemplo en operación por
lote alimentado. Al incluir información del estado celular se puede obtener un modelo
generalmente válido, capaz de describir el crecimiento tanto en estado estacionario como
en estado transiente. Los modelos en los cuales se incluye la información del estado celular
son normalmente llamados modelos estructurados (Nielsen, 1992).
El estado de la célula es determinado exclusivamente por su composición y es
teóricamente posible establecer un modelo estructurado que describa el comportamiento
celular completo, aunque generalmente se incluyen únicamente algunos componentes y
reacciones centrales según el sistema evaluado. El número de componentes intracelulares
incluidos en un modelo estructurado depende del objetivo del modelo que se desee
generar; habitualmente se usan de 2-5 hasta 20 modelos simples estructurados para la
simulación de los procesos microbiológicos examinando el comportamiento a nivel celular
(Nielsen, 1992; Tang et al., 2017).
Para algunos sistemas microbianos no se conocen los mecanismos exactos detrás de los
procesos de diferenciación, por ejemplo germinación de conidios y conidiación, por lo tanto
en estos casos puede ser valioso describir la cinética de forma individual y morfológica,
seguida por una descripción de conversión entre las diferentes formas morfológicas. Este
enfoque hace referencia a la estructura morfológica, y es una valiosa extensión del enfoque
24 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
tradicional del modelo estructurado intracelularmente, especialmente para la descripción
del crecimiento de hongos filamentosos (Nielsen, 1992)
En un modelo morfológicamente estructurado se dividen las células en un número finito Q
de formas morfológicas (o clases) y se asume que la composición intracelular es la misma
para todas las células en cada clase. Este tipo de modelos representa un vínculo entre los
modelos de población segregada y no segregada. Cuando Q=1 se tiene un modelo no
segregado y cuando Q → ∞ se tiene un modelo segregado (Nielsen, 1992).
2.1.13 Modelos de crecimiento para el género Penicillium spp.
A pesar de lo mostrado anteriormente, para el caso de hongos, debido a su crecimiento
filamentoso la complejidad de los modelos tiene mayor diversidad ya que se tienen en
cuenta parámetros como la morfología y la diferenciación (Prosser, 1995a). Por esta razón
para este tipo de microorganismos se encuentran modelos diferentes a los reportados para
bacterias, dentro de estos se encuentran los modelos morfológicos, que consideran el
crecimiento y la forma de la hifa. Los primeros modelos buscaban una relación entre forma
de la hifa y su tasa de crecimiento, asumiendo una forma básica de cilindro para esta
estructura, por lo cual la ecuación se desarrolló en términos del radio de la misma (Prosser
y Trinci, 1979).
En términos generales los modelos matemáticos reportados para el género Penicillium
están enfocados hacia la producción de biomasa o metabolitos secundarios principalmente
penicilina, enzimas como lipasa, debido a que estos productos son los más relevantes a
nivel industrial. Teniendo en cuenta esto se evidencia la necesidad de generar un modelo
para la producción de conidios, que son las estructuras de mayor tolerancia para la
formulación de un producto comercial y un modelo matemático permitiría predecir su
comportamiento y llevar a cabo de manera eficiente los procesos de escalamiento y
optimización.
Algunos modelos reportados para Penicillium están asociados a la producción de penicilina
a partir de P. chrysogenum desarrollados en lote alimentado; sin embargo, estos modelos
presentan diferentes niveles de complejidad: estructurado y mecanístico (Aynsley et al.,
1990), cinético (Nielsen y Jorgensen, 1996), estructurado (Paul y Thomas, 1996), con
multiplicidad cinética (Patnaik, 1999), estructurado con sustratos mixtos (Paul et al., 1998),
Capítulo 2. Marco Teórico 25
no estructurado mecanístico (Birol et al., 2002), macro cinético estequiométrico (Yuan et
al., 2010).
Para el caso de producción de biomasa se encuentran modelos como, no estructurado con
crecimiento diáuxico a partir de P. camembertii en lote (Amnare et al., 2005), morfológico
a partir de P. chrysogenum (Meyerhoff & Bellgardt, 1995), cinético (Monod) a partir de P.
chrysogenum por lote (Goudar & Strevett, 1998), segregado (lote alimentado) a partir de
P. chrysogenum (Tiller et al., 1994). Algunas de las ecuaciones propuestas para la
generación de biomasa se encuentran en la Tabla 2 - 5.
Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de Penicillium
Ecuaciones Simbolos Referencia
𝝁 =𝟏
𝒙
𝒅𝒙
𝒅𝒕
𝝁 =𝑳𝒐𝒈𝒆 𝟐
𝒕𝒅
𝜇 Tasa especifica de crecimiento
𝑡𝑑 tiempo duplicación 𝑥 Biomasa
(Righelato et al.,1968)
𝒅
𝒅𝒕(𝑮. 𝒙) =
𝒙𝒅𝑮
𝒅𝒕+𝑮𝒅𝒙
𝒅𝒕
𝑮 masa total de caldo 𝑥 Biomasa
(Heijnen et al., 1979)
𝒅𝒙
𝒅𝒕= 𝝁𝒙
𝑺
𝑲𝒙𝒙 + 𝑺
𝑪𝑳𝑲𝒐𝒙𝒙 + 𝑪𝑳
−
𝑿𝑽𝒅𝑽
𝒅𝒕
𝑉 volumen 𝐶𝐿 concentración
oxigeno
(Bajpai y Reuß, 1980)
𝒅𝑿
𝒅𝒕= 𝝁𝑿 − 𝑫𝑿
𝝁 = 𝝁𝒔𝒎𝒂𝒙𝑺
𝑲𝒙 + 𝑺
𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato D: Dilucion
(Tiller et al., 1994)
𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺
𝑲𝒙𝑿+ 𝑺
𝑋 biomasa
𝑆 Sustrato
(Menezes et al., 1994)
𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺
𝑲𝒙𝑿+𝑺f
𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato
(Meyerhoff y Bellgardt, 1995)
𝒅𝒙
𝒅𝒕=𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺
𝑲𝒙𝑿+ 𝑺− 𝒌𝒅𝑿
𝑿 = 𝑿𝟎 + 𝒀(𝑺𝟎 − 𝑺)
𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato
𝑆0 Sustrato inicial 𝑋0 Biomasa inicial
𝐾𝑥 cte afinidad
(Goudar y Strevett, 1998)
𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝒂𝟎𝑺
𝑲𝒙 + 𝑺
𝒂𝟎 Crecimiento activo (Paul et al., 1998)
26 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de Penicillium (continuación)
Ecuaciones Simbolos Referencia 𝑑𝑥
𝑑𝑡= 𝜇𝑚𝑥 (1 −
𝑥
𝑥𝑚)
𝑥(𝑡) =𝑥𝑚
1 + (𝑥𝑚𝑥0− 1) 𝑒𝜇𝑚𝑡
𝑋0 biomasa inicial
𝑥𝑚 biomasa máxima 𝝁𝒎 tasa de crecimiento
máxima
(Van De Lagemaat y Pyle, 2005)
𝜇 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆
𝑛
𝐾𝑠 + 𝑆𝑛
𝑑𝑥
𝑑𝑡= 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑥 (1 −
𝑥
𝑥𝑚)
𝑆 = 𝑆0 + 𝑆1(1 − 𝑒𝜇𝑚𝑎𝑥𝑡)
𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato
𝝁𝒎𝒂𝒙 tasa de crecimiento máxima
𝑺𝟏 concentracion en el tiempo de sustrato 𝑺𝟎 Concentracion inicial de sustrato
(Ardestani et al., 2010)
𝜇 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆
𝐾𝑠 + 𝑆
𝑑𝑥
𝑑𝑡= (𝜇 + 𝜇𝑏𝑎𝑙𝑎𝑛𝑐𝑒) − 𝑀𝑥
𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato
𝑀 mantenimiento
(Yuan et al., 2010)
2.1.14 Rutas metabólicas asociadas a la generación de biomasa
La formación de biomasa se asume principalmente de ribulosa-5-Fosfato y Acetyl-CoA,
mientras la producción y consumo de energía únicamente en forma de ATP. No se usan
NADPH y FADH para simplificar el balance electrónico (Yuan, Liu, & Geng, 2010). Cabe
señalar que la red metabólica simplificada mostrada en la Figura 2 - 5 está lejos de ser
completa para los balances de ATP y NADH debido a que se ignoran muchas otras vías
(por ejemplo, la síntesis del producto). Sin embargo, se parte del supuesto que la
producción / consumo de ATP y NADPH son capturados por las rutas consideradas (Yuan
et al., 2010).
Capítulo 2. Marco Teórico 27
Figura 2 - 5 ruta metabólica para la formación de biomasa (Yuan et al., 2010)
En la formación de biomasa las principales rutas son:
Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)
Pentosa fosfato
Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
El proceso de formación de biomasa en términos metabólicos inicia cuando la glucosa
entra a la célula a través de la pared celular y es fosforilada a glucosa-6-fosfato (G6P). En
la ruta de Pentosa Fosfato, una pequeña porción de G6P es oxidada a ribulosa-5-fosfato
la cual es asimilada como biomasa. La parte restante de G6P es oxidada en la ruta EMP.
Como consecuencia de la glicólisis, se forma piruvato, el cual es oxidado a acetyl-CoA y
metabolizado en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) (Godzeski y Stone, 1955).
28 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
A partir de la ruta metabólica explicada anteriormente se generan metabolitos como citrato,
α-cetoglutarato, succinil-CoA, malato y oxaloacetato formados en el ciclo TCA. Estos
metabolitos son usados para sintetizar constituyentes celulares o consumidos para
producir energía para el mantenimiento y crecimiento celular.(Jørgensen et al., 1995).
También se tiene en cuenta que acompañado con el crecimiento aerobio de micelio, la
cadena de respiración suple ATP y NAD constantemente(Smith et al., 1983).
2.1.15 Antecedentes de investigación
El aislamiento de Penicillium sp. codificado como HC1 y posteriormente identificado como
Penicillium pinophilum en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional, se
obtuvo a partir de un tamizaje de microorganismos con actividad celulolítica en suelos
rizosféricos de cultivos de arroz en los departamentos de Tolima y Meta y en suelo
rizosférico y material vegetal de palma de aceite en descomposición, de las regiones de
Guainía y Vichada. A partir de estas muestras se obtuvieron un total de 436 aislamientos
bacterianos y 55 aislamientos fúngicos con actividad celulolítica. De estos últimos se
seleccionaron ocho aislamientos fúngicos (HC1, HC2, HC3, HC4, 7.4, 7.5, 7.5* y 8) con
base en los resultados de actividad enzimática en agar carboximetil celulosa (1% p/v), a
los que se les evaluó la producción de celulasas totales en medios líquidos y se
identificaron por claves taxonómicas. Se encontró que de los ocho aislamientos, cinco
pertenecen al género Penicillium, corroborando así la abundancia de este género en el
suelo y su protagonismo en la degradación de residuos celulósicos (Pedraza-Zapata et al.,
2016).
Los ocho aislamientos seleccionados fueron evaluados en condiciones de microcosmos
sobre tamo de arroz para determinar su capacidad de degradación, midiendo la producción
de CO2 durante sesenta días. Se encontró que con Penicillium pinophilum HC1 se
producen 140,33 ± 2,6 mgCO2/g tamo, superior a los demás aislamientos evaluados,
probablemente debido a su capacidad de producción de enzimas celulolíticas, resultados
que son reportados por Pedraza-Zapata et al. (2016). El tamo tratado con este
microorganismo fue incorporado al suelo y empleado para el crecimiento de plantas de
arroz en condiciones de invernadero, mostrando que esta práctica tiene una influencia
positiva en parámetros como peso seco del tallo, peso seco de la raíz, longitud del tallo y
longitud de raíz (Sanchez-Rodriguez, 2012).
Capítulo 2. Marco Teórico 29
Con base en lo anterior se estableció Penicillium pinophilum HC1 como un hongo
celulolítico y xilanolítico, y fue seleccionado por la alianza Biocultivos S.A – Universidad
Nacional de Colombia-IBUN, como principio activo de un bioinoculante utilizado para
acelerar la degradación de cosecha in situ0 (Gutiérrez, 2017).
Teniendo en cuenta que este aislamiento forma parte de un producto que será
comercializado se vio la necesidad de establecer las condiciones apropiadas de
crecimiento de este microorganismo en escala industrial, para esto inicialmente se
evaluaron las características morfológicas en medios sólidos encontrando que los conidios
obtenidos en este tipo de fermentación presentan porcentajes de germinación y tolerancia
térmica cercanos al 100 % (Gutiérrez, 2017). Posteriormente se evaluaron a escala
laboratorio los medios de cultivo líquido apropiados para el crecimiento de la cepa
seleccionada variando las fuentes de carbono y nitrógeno; a partir de estos resultados se
seleccionaron los medios con mejor producción de conidios, correspondientes a dos
fuentes de carbono (sacarosa y almidon) y dos fuentes de nitrógeno (Fosfato diamonio y
extracto de levadura) (Gutiérrez-Rojas et al., 2015). Adicionalmente se evaluaron
condiciones que inducen el proceso de conidiogénesis tales como la luz, concentraciones
de calcio (Rodriguez y Romero, 2014) y relaciones carbono nitrógeno (Datos sin publicar
(Duran, 2017) ). A partir de los resultados variando las relaciones C:N se encontró que la
mayor producción de conidios se da en fuentes de carbono complejas con relaciones C:N
altas, y la mayor tolerancia térmica a 50 °C se obtiene en fuentes de carbono complejas
con fuente de nitrógeno inorgánica; sin embargo, en el caso de las fuentes de carbono
simples se obtienen buenas producciones (1010 conidios/g) y tolerancias altas a 50°C
(58%) pero dependen de la concentración de carbono inicial (limitada) y la relación C:N
(alta) (Gutiérrez, 2017).
Teniendo en cuenta lo anterior en el presente proyecto se pretende obtener las condiciones
del medio de cultivo en las cuales se presenta la formación de conidios del aislamiento P.
pinophilum HC1, con el fin de generar un modelo matemático para el proceso de
conidiogénesis, ya que de esta manera se pueden mejorar las posteriores fases de
generación del producto, escalamiento y automatización.
3. Materiales y métodos
Esta investigación se dividió en 4 etapas; durante la primera etapa a través de ensayos
preliminares, se establecieron condiciones como medio de cultivo, inóculos y tiempo de
crecimiento; posteriormente, a partir de las condiciones establecidas se iniciaron los
ensayos de limitación de fuente de carbono y de nitrógeno a escala laboratorio (3 litros).
En la tercera fase se establecieron las condiciones para las cinéticas a escala piloto y los
valores iniciales para la iteración del modelo. Por último, con la información obtenida a
escala laboratorio y escala piloto se estableció el modelo y se realizó su validación a escala
piloto empleando una condición de operación diferente a las empleadas para su
establecimiento.
3.1.1 Microorganismo
El microorganismo utilizado durante el desarrollo de este trabajo fue el aislamiento
Penicillium pinophilum HC1, conservado como una suspensión de conidios (1x108
conidios/ml) en crioviales con glicerol al 20% a -20 C Se preparó un banco monospórico
(Anexo B-1), el cual fue caracterizado morfológicamente, macroscópicamente en medio
PDA y microscópicamente con azul de lactofenol.
3.1.2 Tren de inóculo
El tren de inóculo utilizado consta de tres fases, preinóculo, inóculo y producción. El
preinóculo se realizó en Erlenmeyer de 500 mL con 200 mL de medio harina de arroz
(Anexo A); se inoculó con 1 mL de suspensión de conidios y se incubó por 96 horas a 150
rpm y 25 °C. El inóculo consistió en 6 litros de medio sacarosa – cloruro de amonio (Anexo
A) inoculado con 200 mL de preinóculo e incubado a 25°C con aireación constante durante
96 horas. La producción de conidios se realizó en diferentes escalas 100 litros, 20 litros y
Capítulo 3. Materiales y métodos 31
4 litros. Se inocularon los medios bajos condiciones de asepsia, utilizando 2.5% de inoculo.
El medio utilizado y el tiempo de crecimiento variaron según cada caso.
3.1.3 Ensayos preliminares
Los ensayos preliminares constan de dos etapas, la selección del medio de cultivo y la
selección del porcentaje de inóculo, en cada una de estas etapas se realizaron las cinéticas
de sustratos, biomasa y conidios.
La selección del medio de cultivo se realizó a partir de dos medios denominados MB1 y
MB2 (Anexo A), el primer medio tiene como fuente de carbono sacarosa y el segundo
almidón, estos medios fueron seleccionados a partir de resultados previos del grupo de
investigación. (Gutierrez et al, 2017).
La selección del porcentaje de inóculo se realizó variando dos porcentajes de inóculo, 2,5%
y 5%, teniendo como variable de respuesta la generación de conidios en el medio.
Las fermentaciones se realizaron en recipientes de vidrio de 20 litros de capacidad con 15
litros de medio, a 25 °C, con aireación constante. Las cinéticas se realizaron durante un
periodo de 6 días con muestras cada 24 horas. Se cuantificó la biomasa, consumo de
sustrato, pH, recuento de conidios y se determinó la velocidad específica de crecimiento
máxima para cada experimento. Cada ensayo se realizó por triplicado.
3.1.4 Limitación por sustrato
Los ensayos de limitación por sustrato tuvieron como objetivo determinar el
comportamiento del microorganismo frente a diferentes concentraciones de fuente de
carbono y nitrógeno; para este caso se estableció un diseño de experimentos factorial
aleatorizado de dos variables con 4 niveles de concentración inicial de fuente de nitrógeno
((NH4)2HPO4) en un intervalo de 0,07 a 2,7 g/L y 5 niveles de concentración inicial de fuente
de carbono (sacarosa) en un intervalo de 0,274 a 2,5 g/L; las demás sales (Anexo A)
permanecieron constantes. El valor máximo de concentración que se usó para la fuente de
carbono se determinó por medio de ensayos previos.
Las fermentaciones se realizaron en recipientes de vidrio de 4 litros de capacidad con 3
litros de medio, a 25 °C, con aireación constante. Las cinéticas se realizaron durante un
32 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
periodo de 6 días con muestras cada 24 horas. Se cuantificó la biomasa, consumo de
sustrato, pH, recuento de conidios y se determinó la velocidad específica de crecimiento
máxima para cada experimento. Se utilizó como porcentaje de inóculo 2.5%. Cada ensayo
se realizó por triplicado. En la Tabla 3 - 1 se muestran las concentraciones utilizadas en los
ensayos a escala laboratorio.
Tabla 3 - 1 Concentraciones para los ensayos de limitación de sustrato
Ensayo sacarosa
g/L
fosfato di amónico
g/L
C/N
mol/mol
1 0,274 0,070 79,19
2 0,274 0,900 0,702
3 0,274 1,800 0,351
4 0,274 2,700 0,234
5 0,625 0,070 206,8
6 0,625 0,900 1,608
7 0,625 1,800 0,804
8 0,625 2,700 0,536
9 1,250 0,070 413,5
10 1,250 0,900 3,216
11 1,250 1,800 1,608
12 1,250 2,700 1,072
13 1,875 0,070 620,3
14 1,875 0,900 4,824
15 1,875 1,800 2,412
16 1,875 2,700 1,608
17 2,500 0,070 827,1
18 2,500 0,900 6,432
19 2,500 1,800 3,216
20 2,500 2,700 2,144
Capítulo 3. Materiales y métodos 33
3.1.5 Fermentaciones a escala piloto (100 L)
Los ensayos para las cinéticas a escala piloto fueron desarrollados con operación por lote
en un biorreactor de 100 litros aireado. Se utilizaron 80 L de medio (Anexo A), el cual fue
esterilizado con vapor durante 40 minutos. El porcentaje de inóculo utilizado fue 2,5%. El
pH del medio permaneció libre y la temperatura en 25 °C. El flujo de aire se suministró
manteniendo la presión de entrada de aire en 13 psi y el periodo de fermentación fue de 2
días. Con muestreo cada 4 horas durante las primeras 12 horas.
Las concentraciones de fuente de carbono y nitrógeno se seleccionaron con base en los
resultados obtenidos en los ensayos de limitación, es decir se seleccionaron aquellos
ensayos en los cuales se obtuvo una mayor concentración de conidios. En los casos en
que estos valores fueron similares se realizó una discriminación por medio de pruebas de
tolerancia térmica y germinación.
3.1.6 Métodos analíticos
Para cada muestra se determinó concentración de biomasa, amonio residual, sacarosa
residual, conidios, y pH, con el fin de obtener la información necesaria para el ajuste del
modelo matemático, adicional a esto se determinó germinación, tolerancia térmica de los
conidios y morfología del microorganismo.
3.1.7 Cuantificación de biomasa
La biomasa se cuantificó por peso seco, tomando muestras de 10 ml por triplicado y
separando por filtración al vacío con membranas de tamaño de poro de 10 μm, luego esta
se dejó secar en horno a 80 °C hasta peso constante.
3.1.8 Cuantificación de sacarosa residual
La metodología aplicada para la determinación de azúcares reductores fue la técnica DNS
(Miller, 1959). Teniendo en cuenta que el medio tiene como sustrato sacarosa, se realizó
hidrólisis de la misma por medio de invertasa. Las concentraciones se determinaron
usando una curva de calibración previamente elaborada empleando sacarosa hidrolizada.
34 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
(ANEXO B-4). Luego de la reacción, las muestras fueron cuantificadas con un
espectrofotómetro Genesys 10s UV-Vis (Thermo Fisher scientific, USA).
3.1.9 Cuantificación de amonio residual
La concentración de amonio residual en el medio de cultivo se midió por el método de
Berthelot, (Gumel et al., 2012), en este método el hipoclorito y el fenol generan un
compuesto azul al reaccionar con amonio, el cual se puede cuantificar a 640 nm. Luego de
la reacción (ANEXO B-3), la coloración fue cuantificada con un espectrofotómetro Genesys
10s UV-Vis (Thermo Fisher scientific, USA). El amonio residual fue calculado por medio de
una curva de calibración con concentraciones de amonio conocidas.
3.1.10 Cuantificación de conidios
La cuantificación de conidios se realizó, filtrando la muestra a través de jeringas con
algodón, y realizando recuento de la suspensión obtenida en cámara de Neubauer a 40x
cada 24 horas
3.1.11 Tolerancia térmica
Se tomaron 6 alicuotas de 600 µL de suspensión de conidios de cada muestra en
Eppendorf de 1 mL, estas se obtuvieron por medio de filtración utilizando jeringas con
algodón y ajustando la concentración a 1x107 conidios/ml por centrifugación a 6000 rpm
durante 15 minutos. 3 de estas alícuotas se incubaron durante una hora a 45 °C y las
restantes se incubaron durante 1 hora a 50 °C empleando un baño termostatado.
Posteriormente en un área de 1 cm2 de agar-agua (19 g/L) se sembraron alícuotas de 10
µL y se incubaron durante 18 horas a 25 °C. Después se retiró el espacio delimitado de
agar y se observó al microscopio el número de conidios germinados y sin germinar. Todos
los ensayos se llevan a cabo por triplicado.
3.1.12 Modelo
La generación del modelo se realizó a partir de las cinéticas obtenidas en las
fermentaciones a escala laboratorio (4 litros); posteriormente este modelo fue ajustado con
parámetros teóricos adicionales relacionados con características metabólicas asociadas a
Capítulo 3. Materiales y métodos 35
la generación de biomasa, por último se verifico la validez del mismo en escala piloto (100
litros).
3.1.13 Generación de parámetros
La generación de parámetros se realizó a partir de las derivadas de cada una de las
cinéticas; éstas se obtuvieron con el software Table curve 2d (Systat Software Inc, San
Jose Caifornia 2007)®. Posteriormente se estimaron los parámetros del modelo usando
todas las cinéticas simultáneamente; para esto se usó como función objetivo el criterio de
mínimos cuadrados (Ecuación 1) donde 𝑦𝑖 es el valor experimental, 𝑓(𝑥𝑖) es el dato
predicho por el modelo.
𝑅𝑆𝑆 =∑(𝑦𝑖 − 𝑓(𝑥𝑖))2 Ecuación 1
Para la generación del modelo se tuvieron en cuenta las siguientes restricciones:
1. Los sustratos limitantes son únicamente sacarosa y amonio
2. El proceso no tiene limitación de otros nutrientes
3. La temperatura (25 °C), la agitación y el aire son constantes, el pH no es controlado
4. El inóculo es biomasa libre de conidios.
Para la generación de los términos asociados a la tasa de crecimiento (𝜇) inicialmente se
probaron 7 modelos diferentes, mostrados en la Tabla 3 - 2; evaluando el ajuste de los
datos experimentales por medio de la comparación del coeficiente de correlación (R2).
Tabla 3 - 2 Modelos utilizados para la tasa de crecimiento
Modelo Ecuación Nombre
1 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 Monod
2 𝜇𝑥 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 𝑛
𝑘𝑛 + 𝑛
3 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 (1 −
𝑠
𝑠𝑛)
4 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥
𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 +𝑠2
𝑘𝑖
Haldane
36 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Tabla 3 – 2 continuación Modelos utilizados para la tasa de crecimiento
Modelo Ecuación Nombre
5 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (1 − exp (−𝑠
𝑘𝑠)) Teisser
6 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (𝑠𝑛
𝑘𝑠 + 𝑠𝑛) Moser
7 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (𝑠
𝑘𝑠𝑥 + 𝑠) contois
A partir de los resultados obtenidos en el ajuste de los modelos para la tasa de crecimiento,
se realizó un análisis a través de los siguientes fenómenos biológicos :
1. Limitación de fuente de carbono en la generación de biomasa
2. Limitación de fuente de nitrógeno en la generación de biomasa
3. Limitación de fuente de carbono en la producción de conidios
Adicional a esto cada uno de los fenómenos se dividió en las diferentes fases de
crecimiento:
1. Fase de adaptación (Lag)
2. Crecimiento exponencial
3. Fase estacionaria
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente se evaluaron las siguientes constantes:
1. 𝑘𝑠, constante de afinidad para la fuente de carbono
2. 𝑘𝑛, constante de afinidad para la fuente de nitrógeno
3. 𝜇𝑚𝑎𝑥 tasa de crecimiento máxima asociada a la biomasa
4. 𝜇𝑝𝑚𝑎𝑥 tasa de crecimiento máxima asociada a la generación de producto
5. 𝑚1, mantenimiento asociado a la fuente de carbono
6. 𝑚2, mantenimiento asociado a la fuente de nitrógeno
Las constantes se evaluaron siguiendo el siguiente algoritmo de cálculo (Figura 3 - 1).
Capítulo 3. Materiales y métodos 37
Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis
38 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Continuación Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis
Capítulo 3. Materiales y métodos 39
Continuación Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis
40 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Continuación Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis
3.1.14 Análisis de sensibilidad del modelo
El análisis de sensibilidad de modelo se realizó ajustando las ecuaciones propuestas a
cada uno de los perfiles de crecimiento y comparando los valores de las constantes
obtenidas. Se utilizó como variable de respuesta el valor de coeficiente de correlación (R2)
y la comparación de los valores obtenidos se realizó por medio de coeficiente de varianza.
3.1.15 Validación de modelo
La validación del modelo se realizó evaluando el coeficiente de correlación (R2) de los datos
experimentales y los generados por el modelo.
3.1.16 Análisis de estabilidad de modelo
Se realizaron análisis de estabilidad para el modelo seleccionado de la figura 3 - 1; este
análisis se realizó por demostración matemática teniendo como base el siguiente criterio.
𝑥(𝑡) es la función la función asociada a los diferentes fenómenos analizados en el modelo.
𝑥(𝑡) es solución estable si dado que 휀 > 0 tal que
Capítulo 3. Materiales y métodos 41
|𝑥(𝑡) − �̅�(𝑡0)| < 휀 ∀ 𝑡 , 𝑡 > 0
Se llega a
|𝑥0 − �̅�0| < 휀 ^ 𝛿 ≥ 휀
La solución de las ecuaciones diferenciales se realizó tomando el sistema como problemas
de valor inicial.
4. Resultados y Análisis de Resultados
4.1.1 Ensayos preliminares
La fase experimental de este trabajo se realizó en medios aireados a diferentes escalas;
sin embargo, los resultados previos del grupo de investigación se desarrollaron a escala
Erlenmeyer, utilizando como inóculo una suspensión de conidios (Gutiérrez, 2017;
Gutiérrez et al., 2015; Duran, 2017; Tibasosa, 2014). Por esta razón, fue necesario realizar
una fase preliminar con el fin de conocer el comportamiento del microorganismo bajo las
nuevas condiciones establecida, determinar el medio de cultivo y establecer ell porcentaje
de inóculo con el cual se va a trabajar.
Para determinar el medio de cultivo, se estableció como variable de respuesta la máxima
producción de conidios, para esto se realizaron los perfiles de producción de conidios de
cada uno de los medios a evaluar Figura 4-1. A partir de esto se encontró que, la
producción máxima de conidios en los medios MB1 C:N 50:1, MB1 C:N 25:1 y MB2 C:N
10:1 fue de 1.68x105, 4.93x104 y 2.45x104 conidios/ml respectivamente, esta concentración
se alcanza después de la hora 96 de cultivo para cada caso. Adicionalmente se logró
evidenciar que en sistemas con aireación la producción de conidios es mejor para medios
con fuentes de carbono simples (sacarosa) con mayor relación C:N, que para medios con
fuentes de carbono complejas (almidón), al obtener un incremento en la producción a la
hora 120 del 16%
Capítulo 4. Resultados 43
0 24 48 72 96 120 1440
5.0104
1.0105
1.5105
2.0105
MB1 C:N 50:1
MB1 C:N 25:1
MB2 C:N 10:1
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
Figura 4 - 1 Producción de conidios en diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%)
A partir de los resultados obtenidos en los ensayos preliminares, se seleccionó el medio
de MB1, ya que en este medio se obtuvo una producción de conidios mayor comparada
con los medios MB1, este medio generó 1,68x105 conidios/ml.
Los resultados mostrados en la Figura 4 - 1, permiten sugerir un efecto de la fuente de
carbono del medio y la relación C:N del mismo sobre la generación de conidios, donde se
evidenció que la producción de conidios aumenta al aumentar la relación carbono-
nitrógeno utilizando fuentes de carbono simples, en este caso la relación C:N 50:1 del
medio MB1 generó la mayor producción de conidios en el tiempo de fermentación
evaluado.
Estas observaciones coinciden con resultados previos de la línea de investigación a escala
laboratorio en Erlenmeyer, en los cuales se encontró que la mayor producción de conidios
se da a relaciones de C:N 50 y 80 utilizando bajas concentraciones de fuente de carbono
(Gutiérrez, 2017). Aunque las concentraciones iniciales son diferentes y afectan el
comportamiento del microorganismo, estos resultados nos permiten establecer una
tendencia preliminar del microorganismo respecto a estas variables. Un efecto similar se
reportó previamente en estudios con Penicllium camemberti, en donde la presencia de una
relación C:N de 122:1 con glucosa inicial de 100 g/L y C:N 168:1 con glucosa inicial de 60
g/L permitieron la producción de 1.6x108 conidios/ml y 3.2x108 conidios/ml respectivamente
(Bockelmann et al., 1999; Boualem et al.,2014 ).
Para el caso de la producción de biomasa se encontró que la mayor concentración de
biomasa obtenida fue de 6,047±0,46 g/L, 5,26±0,12 g/L y 7,53±0,59 g/L para los medios
44 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
MB1 C:N 50:1, MB1 C:N 25:1 y MB2 C:N 10:1 respectivamente (Figura 4 - 2). A partir de
estos datos se identifica una disminución del 18.7% en el crecimiento de biomasa para el
caso del medio MB1 al aumentar la relación carbono-nitrógeno.
Los resultados obtenidos para la generación de biomasa (Figura 4 - 2), permiten evidenciar
que la fermentación de P. pinophilum HC1 es dependiente de la relación carbono nitrógeno
utilizada en el medio. Un efecto similar se observó en ensayos a escala Erlenmeyer en
donde se encontró que las menores concentraciones de biomasa se obtenían a mayores
relaciones C:N con menores concentraciones iniciales de fuente de carbono (Gutiérrez,
2017).
Este comportamiento es similares al obtenido en P. camemberti ya que para una relación
C:N 122.3:1 se producen 4.0 g/L de biomasa (Bockelmann et al., 1999) y para una C:N
168.44:1 se tiene una biomasa de 2.2 g/L, (Boualem et al., 2014). Con base en esto, los
autores indican una reducción de la biomasa del 45% al aumentar la relación carbono
nitrógeno y disminuir la fuente de carbono de 100 g/L a 50 g/L.
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6
8 MB1 C:N 25:1
MB1 C:N 50:1
MB2 C:N 10:1
Tiempo (h)
Bio
masa g
/L
Figura 4 - 2 Producción de biomasa para diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%)
Estos resultados, podrían permitir asumir un comportamiento general a los hongos del
genero Penicillium en términos de producción de conidios y biomasa en asociación a la
relación C:N utilizada durante la fermentación. Sin embargo, evaluaciones realizadas en
P. chrysogenum han demostrado comportamientos contrastantes a los obtenidos para P.
pinophilum HC1 y los reportados para P. camemberti. Por ejemplo, se ha observado que
Capítulo 4. Resultados 45
P. camemberti produce 8 g/L de biomasa en relaciones C:N de 10:1 (Hadley & Harrold,
1958) y 2.5 g/L de biomasa en condiciones de C:N de 5:1 para estas condiciones el sistema
se encontraba bajo condiciones de limitación de fuente de carbono (Riguelato et al., 1968),
en este caso se definió una disminución del 50% en la relación C:N lo cual ocasionó una
disminución en la generación de biomasa del 68.75 %.
Teniendo en cuenta lo anterior, se puede observar que el género Penicillium según la
especie varía su comportamiento respecto a la concentración inicial de fuente de carbono
y la relación C:N. Para el caso de P. pinophilum se logró evidenciar que sacarosa es una
fuente de carbono adecuada para la generación de conidios, sin embargo las mayores
producciones se obtuvieron al disminuir la concentración de la misma.
Respecto a los experimentos en los cuales se evaluó el efecto del porcentaje de inóculo
(Figura 4 - 3) se observa que el aumento de inóculo favorece la generación de biomasa, al
tener una diferencia del 30% en la hora 120 de crecimiento, sin embargo para todos los
casos se observa que la fase exponencial de crecimiento se da en las primeras 24 horas.
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6MB1 (50:1) 2,5%
MB1 (50:1) 5%
MB2 2,5%
MB2 5%
Tiempo (h)
Bio
masa g
/L
Figura 4 - 3 Cinética de biomasa variando el porcentaje inicial de inóculo
Para los medios evaluados se observó que al disminuir el porcentaje de inóculo los
recuentos de conidios aumentan (Figura 4 - 4), es decir se tiene un aumento del 10% en
la concentración de conidios al disminuir el inóculo del 5% al 2,5%, adicional a esto bajo
las condiciones evaluadas el proceso de diferenciación se da a partir de la hora 96 de
crecimiento.
46 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
0 24 48 72 96 120 1441.0100
1.0101
1.0102
1.0103
1.0104
1.0105
1.0106
MB1 (50:1) 2,5%
MB1 (50:1) 5%
MB2 2,5%
MB2 5%
Tiempo (h)
co
nid
ios/m
l
Figura 4 - 4 Cinética de producción de conidios variando el porcentaje inicial de inóculo
El inóculo utilizado para la evaluación del proceso de conidiogénesis generalmente es una
suspensión de conidios obtenida de medios sólidos (Bockelmann et al., 1999; Broderick y
Greenshields, 1981; Pitt y Poole, 1981; Roncal et al., 2002); sin embargo, en este caso se
decidió iniciar la fermentación a partir de biomasa ya que en pruebas realizadas durante la
fase de exploración (resultados no mostrados en este trabajo), se evidenció que al iniciar
las fermentaciones con conidios provenientes de fermentaciones sólidas el proceso de
germinación de los mismos no es eficiente, es decir el microorganismo permanece por
largos periodos (10 días) en la fase previa a la germinación de los mismos y la generación
de nuevos conidios en medios aireados no se observa. Por otra parte, para garantizar que
el inóculo sea solamente biomasa el microorganismo debe estar en un medio libre de
calcio, esto también fue evidenciado en ensayos previos del grupo de investigación
(resultados sin publicar).
Se evaluó el porcentaje de inóculo ya que está reportada la influencia de este en el proceso
de conidiogénesis (Roncal et al., 2002), teniendo en cuenta que se pasa de un medio libre
de calcio a un medio con fuente de calcio es necesario controlar la cantidad de inóculo con
la cual se inicia el proceso, de lo contrario la producción de conidios no es favorable, la
inducción por iones calcio se da a través de pulsos del mismo en el tiempo, este tiempo se
puede reducir por medio del inóculo (cantidad o concentración) (Hadley y Harrold, 1958).
Los resultados preliminares permitieron confirmar la influencia de la fuente de carbono y el
porcentaje de inoculo en el proceso de conidiogénesis, adicional a esto a partir de estos
datos se establecieron las condiciones para iniciar los ensayos en escala de 3 litros, las
Capítulo 4. Resultados 47
cuales son medio MB1 según el diseño de experimentos de la Tabla 3 - 1 e inoculo al 2.5%,
ya que bajo estas condiciones se obtuvo la mayor producción de conidios. Estas variables
permanecieron fijas durante el desarrollo del trabajo.
4.1.2 Ensayos con limitación de sustratos a escala laboratorio (3 litros)
Los ensayos de limitación se llevaron a cabo en escala de 3 litros con aireación constante
a 25 °C; para estos se utilizó el medio y el porcentaje de inóculo seleccionados en los
ensayos mostrados anteriormente.
Para este caso a partir del diseño factorial se evaluaron las cinéticas de biomasa, sustratos
y producto con el fin de establecer el modelo no estructurado no segregado, además de
seleccionar la concentración inicial de los medios que se evaluaron en escala piloto.
A partir de la Figura 4 - 5 se puede observar que la biomasa es dependiente de la
concentración inicial de sacarosa y fosfato de amonio obteniendo las mayores
productividades en las condiciones de 1.875 g/L de sacarosa y 2.7 g/L de fosfato de
amonio.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,51,0
1,52,0
2,5
Pro
ductivid
ad d
e B
iom
asa g
/Lh
Sac
aros
a in
icia
l g/L
Fosfato de amonio inicial g/L
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Sacarosa g/L
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Fosfa
to d
e a
monio
g/L
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Productividad de biomasa g/Lh
Figura 4 - 5 Comportamiento de la productividad de biomasa variando las
concentraciones iniciales de fosfato de amonio y Sacarosa
Con respecto a la tasa de crecimiento se observó que la mayor fue de 0,1838 h-1 para las
concentraciones de sustrato 2,700 g/L fosfato de amonio y 1,875 g/L sacarosa, además de
tener un comportamiento tipo monod al variar la concentración de sacarosa (figura 4 - 6)
48 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
y la concentración de fosfato de amonio (figura 4 – 7). Resultados similares fueron
obtenidos para P. chrysogenum WIS 54-1255 bajo condiciones de limitación de glucosa
(glucosa inicial inferior a 20 g/L) en un cultivo continuo de dos litros (Riguelato et al., 1968).
A partir de los resultados obtenidos del crecimiento de microorganismo se pueden
establecer condiciones nutricionales favorables para el proceso de conidiogénesis de esa
especie, por ejemplo con respecto al rendimiento en biomasa se puede observar que las
mayores productividades se obtienen en el medio con sacarosa inicial 1.875 g/L (Figura 4
- 5), pero las concentraciones de conidios obtenidas son bajas en estas condiciones
(Figura 4 - 10); este comportamiento es similar al reportado para P. sclerotigenum, donde
los autores al evaluar el efecto de la interacción carbono-nitrógeno en el crecimiento
encontraron que el mejor estado nutricional está asociado al crecimiento micelial y que
esta condición no es necesariamente la mejor para la producción de conidios,
habitualmente estas condiciones inhiben el proceso de reproducción (Cutrim et al., 2006).
Algunos autores afirman que para que la conidiación se produzca en hongos filamentosos
debe haber un control del patrón normal de crecimiento vegetativo. Tal cambio puede ser
promovido por la limitación de la tasa de crecimiento(Smith et al., 1981). Con base en esto
se hallaron las tasas de crecimiento para cada uno de los sistemas (Tabla 4 – 1 y Tabla 4
– 2 ), con el fin de evaluar por medio del coeficiente R2 el comportamiento del sistema.
0.000 0.625 1.250 1.875 2.5000.0
0.1
0.2
0.30,007
0,9
1,8
2,7
Concentracion Sacarosa (g/L)
µ (
1/h
)
Fosfato amonio g/L
Figura 4 - 6 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación fuente de nitrógeno
Capítulo 4. Resultados 49
Tabla 4 - 1 Valores de tasa de crecimiento maxima y constante de afinidad por fuente de
carbono
Fosfato amonio g/L 0,007 0,9 1,8 2,7
𝜇𝑚𝑎𝑥 0,07301 0,1099 0,1076 0,07172
0,01007 0,03312 ~ 1.483e-016 0,01692
R2 0,8593 0,6573 0,7524 0,9543
Por otra parte, comparar el intervalo encontrado para la tasa de crecimiento del
microorganismo (0,07 – 0,24 h-1) coincide con los resultados reportados por diferentes
autores para el mismo género (Tabla 4 - 3). Sin embargo, se observó bajo las tasas de
crecimiento encontradas son más altas (incluir porcentaje) que las reportadas en sistemas
para P. chrysogenum con limitación de glucosa (Righelato et al., 1968), esto permite inferir
que para el caso del género Penicillium la tasa de crecimiento depende no solo de la
especie con la cual se esté trabajando sino también de la fuente de carbono utilizada y las
condiciones de crecimiento establecidas para el sistema.
0.0 0.9 1.8 2.70.0
0.1
0.2
0.30,245
0,625
1,25
1,875
2,5
Concentración fosfato de amonio (g/L)
µ (
1/h
)
Sacarosa g/L
Figura 4 - 7 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación fuente de carbono
Tabla 4 - 2 Valores de tasa de crecimiento máxima y constante de afinidad por fuente de
nitrogeno
Sacarosa g/L 0,245 0,625 1,25 1,875 2,5
𝜇𝑚𝑎𝑥 0,1077 0,2207 0,2456 0,08951 0,07086
𝑘𝑛 0,2869 0,1219 5,2550 0,1134 0,1134
50 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
R² 0,6755 0,9858 0,9971 0,8868 0,9890
Tabla 4 - 3 Valores de tasa de crecimiento de biomasa y otros metabolitos secundarios para Penicillium sp.
𝝁𝒎𝒂𝒙 (𝟏/𝒉) producto Referencia
0,11 Penicilina (Bajpai y Reuß, 1980)
0,06 Penicilina (Tiller et al., 1994)
0,04 Penicilina (Tiller et al., 1994)
0,18 Penicilina (Heijnen et al., 1979)
0,11 Penicilina (Genon y Saracco, 1992)
0,023-0,075 Biomasa (Righelato et al., 1968)
0,130 Penicilina (Menezes et al., 1994)
0,07 Ácido micofenolico (Ardestani et al,. 2010)
0,078 Penicilina (Meyerhoff y Bellgardt, 1995)
0,130 Biomasa (Goudar y Strevett, 1998)
0,033 Penicilina (Paul et al,. 1998)
0,092 Penicilina (Birol et al., 2002)
0,17 Tanasa (Van De Lagemaat y Pyle, 2005)
0,05 Penicilina (Yuan et al., 2010)
0,167 Biomasa (Gougouli y Koutsoumanis, 2010)
A partir de los perfiles generados se determinó el consumo de sacarosa para cada uno de
los medios (Figura 4 - 8) con base en estos resultados se logró evidenciar que el consumo
de sacarosa es proporcional a la sacarosa inicial suministrada al medio y no es
dependiente de la concentración inicial de fosfato de amonio en el medio, excepto para el
medio con concentración inicial de fosfato de amonio cercana a cero, en este caso el
consumo de sacarosa presentó una disminución para las concentraciones iniciales de
1,875 g/L y 2,5 g/L de sacarosa.
Capítulo 4. Resultados 51
0,27
4
0,62
51,
25
1,87
52,
5
0.000
0.005
0.010
0.015
0.0200,007
0,9
1,8
2,7
(NH4)2PO4 g/L
Sacarosa g/L
Sacaro
sa c
on
su
mid
a g
/Lh
Figura 4 - 8 Comportamiento del consumo máximo de sacarosa escala 3L
Con respecto a los resultados obtenidos para el consumo de fuente de carbono se puede
evidenciar que a mayor disposición de fuente de carbono el consumo aumenta , ya que
bajo estas condiciones se genera un mayor crecimiento del microorganismo como se
mostró anteriormente, sin embargo se debe tener en cuenta que el consumo de fuente de
carbono no está asociado únicamente a la generación de biomasa, esta fuente es usada
también para biosíntesis y mantenimiento (Adour et al., 2006), también se ha reportado
para otras especies como P. chrysogenum WIS 54-1255 que la fuente de carbono se usa
principalmente como fuente de energía, los autores llegaron a esta conclusión al aumentar
la concentración por encima de la cantidad necesitada para mantenimiento, adicional a
esto afirman que se obtienen conidios y conidióforos si la cantidad de glucosa es similar a
la cantidad requerida para mantenimiento (Righelato et al., 1968),
Al evaluar el consumo de amonio se encontró que para los diferentes medios evaluados el
microorganismo consume en promedio el 50% de la fuente de amonio suministrada (Figura
4 - 9).
52 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
0,00
70,
91,
82,
7
0
20
40
60
80
1000,274
0,625
1,875
2,5
Sacarosa g/L
Fosfato de amonio g/L
Am
on
io c
on
su
mid
o %
Figura 4 - 9 Porcentaje de amonio consumido a las 144 horas escala 3 L
Adicional a esto se logró evidenciar que el consumo de amonio en algunos casos es
independiente de la concentración de sacarosa inicial en el medio, como en los medios
con fosfato de amonio inicial 0,007 g/L y 1,8 g/L, sin embargo para casos como el medio
0.625 g/L sacarosa y 0.9 g/L de sacarosa el consumo de fosfato de amonio fue del 96%
(Figura 4 - 9).
En cuanto al consumo de amonio a partir de la Figura 4 - 9 se puede observar que el
microorganismo consume en promedio el 50% de la fuente de nitrógeno proporcionado,
este efecto es similar al reportado para P. camemberti para este caso los autores afirman
que la limitación de nitrógeno no tiene un efecto en la conidiogénesis ya que la fuente de
nitrógeno estuvo presente hasta el final de la fermentación y el consumo de la misma fue
del 30 al 50 % (Bockelmann et al., 1999).
Para el caso de la producción de conidios se evidenció que esta variable es dependiente
de la concentración inicial de sacarosa en el medio, obteniendo las mayores producciones
de conidios cuando la concentración de la fuente de carbono es cercana a cero (Figura 4
- 10). En la Figura 4 - 10 se encuentran los valores máximos de producción de conidios
para cada una de las concentraciones de sacarosa y fosfato de amonio evaluado, en este
caso se observó que la mayor producción se encuentra en el intervalo 1x106 a 3.8x106
Capítulo 4. Resultados 53
conidios/ml en los medios con limitación de carbono más alta.
0,0
5,0e+5
1,0e+6
1,5e+6
2,0e+6
2,5e+6
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Conid
ios/m
l
Sac
aros
a g/
L
Fosfato de amonio g/L
0,0
5,0e+5
1,0e+6
1,5e+6
2,0e+6
2,5e+6
Sacarosa g/L
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Fo
sfa
to d
e A
mo
nio
g/L
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0
5e+5
1e+6
2e+6
2e+6
conidios/ml
Figura 4 - 10 Comportamiento de los conidios generados respecto a las concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa
A partir de estos resultados se puede decir que el proceso de conidiogénesis para P.
pinophilum es dependiente de la concentración inicial de fuente de carbono ya que al
aumentar la concentración de sacarosa en el medio se disminuye la producción de
conidios. Un comportamiento similar fue reportado para P. chrysogenum en este caso los
autores reportan que el procesos de conidiogénesis en esta especie se dan principalmente
por limitación de nitrógeno, pero para un aislamiento (WIS 54-1255) encontraron que la
limitación por fuente de carbono es necesaria en la producción de conidios (Righelato et
al., 1968). También fue reportada la inducción por limitación de fuente de carbono para P.
camemberti, este efecto fue evaluado con tres concentraciones de glucosa, los autores
encontraron que al disminuir la cantidad inicial en el medio se obtenía una mayor
concentración de conidios y al usar un medio sin glucosa observaron que el proceso de
conidiogénesis era eficiente (Bockelmann et al., 1999)
En otros casos como P. oxalicum se obtuvieron niveles máximos de conidiación al limitar
la cantidad de nitrógeno y añadir calcio los autores concluyeron que el agotamiento del
nitrógeno y la adición de calcio a un medio con alta relación C: N son los factores que
inducen la conidiación (Pascual et al., 1997). Este efecto también fue observado en P
griseofulvum y P. chrysogenum (Morton, 1961), sin embargo como se ha mostrado para P.
pinophilum la cantidad de nitrógeno en el medio no es significativa si la concentración de
sacarosa se encuentra en concentraciones bajas , esto se puede verificar al observar el
comportamiento del microorganismo bajo diferentes concentraciones de fuente de
54 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
nitrógeno, donde no se da un efecto significativo en términos de la producción de conidios
en concentraciones cercanas a cero de fuente de carbono, para las demás
concentraciones se puede observar que la concentración de nitrógeno en el intervalo
evaluado (0.007 – 2.7 g/L) genera variaciones de máximo 32%.
Adicionalmente, como se puede observar en la Error! Reference source not found.1 para
casos como 0,625 y 2,5 g/L de sacarosa se observa una mayor producción de conidios en
la condición de 0.9 g/L de fosfato di amonio, sin embargo para los dos condiciones
restantes 1,25 y 1,875 g/L de sacarosa el efecto es contrario ya que en esta concentración
de fosfato de amonio presenta la menor concentración de conidios bajo las condiciones
evaluadas, a partir de esto se puede evidenciar que la producción de conidios se puede
optimizar en términos de las condiciones iniciales de fuente de carbono y nitrógeno,
aunque es necesario evaluar bajo estas condiciones la influencia de las variables que se
mantuvieron constantes durante el desarrollo del diseño experimental.
0.07
0.90
1.80
2.70
0.07
0.90
1.80
2.70
0.07
0.90
1.80
2.70
0.07
0.90
1.80
2.70
0.07
0.90
1.80
2.70
0
2
4
6
80,274
0,625
1,25
1,875
2,5
sacarosa g/L
Fosfato de amonio g/L
Lo
g c
on
idio
s/m
l
Figura 4 - 11 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas
La evaluación por limitación de carbono para la producción de conidios se realizó en 7
perfiles de crecimiento asociados a los ensayos 2, 3, 4, 7, 8, 15 y 16. En este caso se
encontraron valores biológicamente estables para los ensayos 2, 3, y 4 como se puede
observar en la Tabla 4 - 18.
Capítulo 4. Resultados 55
Todos los resultados se analizaron estadísticamente por medio del software Sigma Plot ®
(Systat Software Inc, San Jose Caifornia 2007) . Para cada una de las variables de
respuesta se realizó una prueba Anova de dos variables con el fin de identificar el efecto
que tienen la sacarosa inicial, el amonio inicial y la interacción de los dos sobre cada una
de las variables evaluadas.
Para el caso del rendimiento de la biomasa y el consumo de sacarosa se encontró que
todas las variables y su interacción son significativas con un valor de p<0,0001 pero la de
mayor significancia es la concentración inicial de sacarosa, para el caso del consumo de
amonio todas las variables y su interacción también son significativas, pero en este caso
la de variable de mayor significancia es la concentración de amonio inicial. Sin embargo,
para el caso de la producción de conidios la concentración de sacarosa inicial es la variable
significativa con un valor de p<0,0001. (Tabla 4 – 4)
Tabla 4 - 4 Resultados análisis de varianza (ANOVA), para generación de biomasa, producción de conidios, consumo de sacarosa y consumo de amonio.
Biomasa Conidios Consumo de
Sacarosa Consumo de
Amonio
Factor F Valor p F Valor p F Valor p F Valor p
a Sacarosa
121,83 < 0,0001 19,86 < 0,0001 372,19 < 0,0001 7,29 0,0051
b Amonio
21,48 < 0,0001 2,05 0,1283 48,66 < 0,0001 72,59 < 0,0001
ab 3,85 0,0013 0,89 0,5623 21,54 < 0,0001 2,71 0,0131
La concentración inicial de carbono y nitrógeno tienen un efecto en las variables de
respuesta evaluadas (Biomasa y producción de conidios) (Tabla 4 - 4); para el caso de la
biomasa la concentración de sacarosa tiene un efecto significativo sobre esta variable, este
comportamiento se relaciona con los balances estequiométricos del sistema donde se
evidencia que el reactivo limite es la sacarosa (ANEXO E). A pesar de que se ha reportado
que la producción de biomasa se relaciona directamente con la concentración de carbono
y nitrógeno inicial (Duarte, 1995), para este caso específico las concentraciones de
nitrógeno evaluadas no presentan una influencia significativa en el crecimiento del
56 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
microorganismo, probablemente esto se debe a que el sustrato limitante en este caso es
la sacarosa y las cantidades de amonio utilizadas se encuentran en todos los casos en
exceso.
Adicional a esto, al realizar el análisis estadístico por medio de ANOVA se encontró que
únicamente la concentración inicial de sacarosa es significante en la producción de
conidios con un valor p< 0.0001 pero el fosfato de amonio no es significante ya que
presenta un valor p de 0.1283 (Tabla 4 - 4).
Con base en los resultados mostrados anteriormente se seleccionaron los medios que se
utilizaron en la escala de 100 litros, teniendo en cuenta que la variable de respuesta es la
mayor producción de conidios y que en esta la concentración de sacarosa inicial es la que
tiene influencia. Se escogió como medios de evaluación uno por cada concentración de
sacarosa evaluada, cada uno de ellos se nombró como ensayos A, B, C, D y E (Tabla 4 -
5).
Para los casos en los cuales se observaron recuentos sin diferencias significativas se le
realizo a las muestras pruebas de tolerancia térmica y se seleccionaron aquellos medios
que presentaran tolerancias mayores
Tabla 4 - 5 Concentraciones seleccionadas para los ensayos en reactor de 100 L
Ensayo
limitación
Ensayo
Escala piloto
Sacarosa
g/L
Fosfato diamonio
g/L
Relación
C/N
4 A 0,274 2,700 0,234
7 B 0,625 1,800 0,804
11 C 1,250 1,800 1,608
15 D 1,875 1,800 2,412
18 E 2,500 0,900 6,432
Se evaluó el porcentaje de germinación y tolerancia térmica a 45 °C y 50 °C (Tabla 4 - 6)
para los ensayos en los cuales no se encontró una mayor cantidad de conidios entre cada
uno de los bloques analizados, los bloques se analizaron respecto a la concentración inicial
de fuente de carbono. En el caso de los medios con mayor limitación de fuente de carbono,
se encontró una tendencia entre la concentración de fosfato de amonio y el porcentaje de
germinación, donde a mayor concentración de fosfato de amonio se encontró un mayor
Capítulo 4. Resultados 57
porcentaje de germinación del microorganismo, la misma tendencia se observó en cuanto
a la tolerancia térmica. Para los ensayos asociados a las concentraciones iniciales de
sacarosa 1,25 y 2,5 g/L de sacarosa no fue necesario realizar pruebas térmicas ya que
únicamente con el criterio de concentración de conidios se seleccionó el medio con mayor
producción; sin embargo, para los demás medios al realizar las pruebas de germinación y
tolerancia se observó que la concentración apropiada de fosfato de amonio es 1,8 g/L.
Tabla 4 - 6 Resultados germinación y tolerancia térmica ensayos escala 3 litros
Germinación Tolerancia 45 °C
ensayo Sacarosa
g/L Fosfato
diamonio g/L C/N Promedio Desv. Est. Promedio
Desv. Est.
1 0,274 0,070 24,78 90,23 1,960 27,07 1,498
2 0,274 0,900 2,579 97,50 1,015 33,63 1,662
3 0,274 1,800 1,279 97,23 0,802 50,80 1,473
4 0,274 2,700 0,860 98,67 0,737 80,70 1,539
5 0,625 0,070 206,8 N/A N/A N/A N/A
6 0,625 0,900 5,884 0 0 0,00 0,000
9 1,25 0,007 413,5 - - - -
10 1,25 0,070 11,77 - - - -
11 1,25 0,900 5,836 - - - -
12 1,25 1,800 3,922 - - - -
13 1,875 0,070 620,3 0 0 0 0
14 1,875 0,900 17,60 N/A N/A
15 1,875 1,800 8,754 76,57 2,084 0 0
16 1,875 2,700 5,884 0 0 0 0
17 2,5 0,070 827,1 - - - -
18 2,5 0,900 23,53 - - - -
19 2,5 1,800 11,67 - - - -
20 2,5 2,700 7,845 - - - -
Para cada uno de los ensayos mostrados anteriormente se realizaron observaciones
morfológicas, por medio de un microscopio óptico y tinciones con azul de lactofenol, en
este caso se encontró que las estructuras de diferenciación se formaban bajo condiciones
de limitación de nutrientes (Figura 4 - 12 B), mientras que en los medios sin limitación de
nutrientes predomina el crecimiento vegetativo (Figura 4 - 12 A)
58 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
El crecimiento de los hongos depende de condiciones nutricionales y ambientales, si estas
son equilibradas el microorganismo permanecerá en estado vegetativo (Figura 4 - 12 A) ,
de lo contrario el patrón de crecimiento puede cambiar dando lugar a la formación de
morfología asexual (Figura 4 - 12 B). Este cambio se puede dar por deficiencia nutricional
(Smith et al., 1981), en este caso la diferenciación ocurre al pasar el microorganismo de
un medio en equilibrio (sin limitación de nutrientes) a un medio con baja concentración de
fuente de carbono y nitrógeno. Este comportamiento se observó en Penicillium pinophilum
HC1 ya que se observó crecimiento micelial para los medios sin limitación y diferenciación
para los medios con limitación de nutrientes.
Figura 4 - 12 A. Crecimiento vegetativo en medio sin limitación (40x). B. Diferenciación en medio limitado sacarosa y amonio (100x).
A B
Capítulo 4. Resultados 59
4.1.3 Ensayos a escala piloto 100 litros
Los ensayos a escala piloto se llevaron a cabo en reactor de 100 litros, manteniendo la
presión de entrada a 13 psi, sin agitación mecánica, y temperatura de 25 °C; para estos
ensayos se utilizó el medio y el porcentaje de inóculo seleccionados en los ensayos
preliminares (Sección 4.1.1), los medios utilizados fueron los reportados en la Tabla 4 - 5.
Para cada ensayo se realizaron cinéticas durante 48 horas tiempo en el cual se alcanza la
fase estacionaria; este tiempo se estableció a través de ensayo previos (resultados no
mostrados). Para cada caso se establecieron las cinéticas de biomasa, sustratos y
producto.
El comportamiento de la biomasa en el tiempo para el reactor de 100 litros presentó una
fase exponencial durante las primeras 24 horas, alcanzando una concentración máxima
de biomasa de 4,88 g/L para el caso del ensayo E y una cantidad mínima de 0,3 g/L para
el caso del ensayo A (Figura 4 - 13), es decir la mayor producción de biomasa está
asociada al medio con mayor concentración de sacarosa.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
1
2
3
4
5
60,274 2,700
0,625 1,800
1,250 1,800
1,875 1,800
2,500 0,900
Tiempo (h)
sacarosa
g/L
sacarosa
g/L
sacarosa (NH4)2PO4
g/L g/L
Bio
masa (
peso
seco
) g
/L
Figura 4 - 13 Biomasa producida en fermentación de 100 L
Considerando que al realizar el cambio de escala las cinéticas de crecimiento se
modificaron. Por esta razón, se decidió hacer una comparación para los medios evaluados
entre las dos escalas (Tabla 4 - 7). Encontrando que al cambiar de escala la biomasa
máxima presenta una reducción en promedio del 56% excepto para el ensayo E en el cual
la biomasa máxima se duplicó, sin embargo estos valores de biomasa en el reactor de 100
litros se obtuvieron en menores tiempos esto implica que el rendimiento de esta variable
60 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
aumentó en algunos casos como el ensayo B, C y E mientras que para los ensayos A y D
los rendimientos disminuyeron.
La biomasa máxima producida en las dos escalas evaluadas (Tabla 4 - 7) se puede
observar que el rendimiento de la biomasa generada en el reactor de 3 litros es 2 veces
mayor que en el reactor de 100 litros, probablemente esto se debe a que este
microorganismo necesita un mayor control en cuanto a la reología del medio y el estrés
hidrodinámico que tiene durante su crecimiento, especialmente en los casos de limitación
de nutrientes, un efecto similar fue observado para P. chrysogenum al variar diferentes
aireaciones en diferentes escalas encontraron que el flujo de aire utilizado ocasiona una
disminución en la producción de biomasa (Makagiansar et al., 1993).
Tabla 4 - 7 Comparación de biomasa máxima producida en el reactor de 3 y 100 L (Ensayo A 0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato diamonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D 1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L fosfato diamonio)
Ensayo
Biomasa máxima (3 litros)
Biomasa máxima (100 litros)
Diferencias
g/L h g/L h g/L h g/Lh Biomasa* Productividad*
A 2,9676 24 0,1277 0,3433 48 0,0072 -88% -94%
B 5,1088 144 0,0361 2,0550 24 0,0856 -60% 137%
C 3,0726 96 0,0330 2,3442 24 0,0977 -24% 196%
D 5,1471 48 0,1090 2,4550 48 0,0511 -52% -53%
E 2,3538 24 0,1017 4,8850 24 0,2035 108% 100%
* El negativo indica los porcentajes asociados a reducción de biomasa o rendimiento
Las cinéticas obtenidas en el reactor de 100 litros respecto al amonio residual (Figura 4 -
14) muestran que el consumo de amonio se da durante las primeras 24 horas, luego
permanece estable en el medio. Este tiempo coincide con la fase exponencial de
crecimiento del microorganismo.
Adicional a esto se puede observar que después de la hora 24 de crecimiento se inicia una
fase de muerte, en el caso de microorganismos miceliales este proceso está asociado con
Capítulo 4. Resultados 61
la autolisis, debido a que agota la fuente de carbono disponible en el medio. La autolisis
fúngica es un proceso multietapa, el cual tiene en cuenta la permeabilización parcial de la
membrana celular y las fugas de material intracelular en etapas posteriores (White,
McIntyre, Berry, & McNeil, 2002), este proceso se observa principalmente durante el
crecimiento apical, ya que la célula bajo condiciones de estrés migra los nutrientes hacia
las puntas, con el fin de fortalecer las paredes de las estructuras de reproducción (Kikuma,
Arioka, & Kitamoto, 2007). Estas características de muerte celular fúngica han sido
reportadas en procesos industriales como la producción de cefalosporinas y penicilinas
(White, 1999)(Reyes, Martinez, Alfonso, Copa-Patino, & Soliveri, 1990; White et al., 2002).
Este comportamiento es importante para la producción de conidios ya que como se
mencionó anteriormente se debe tener una disminución en la biomasa para obtener una
mayor producción de conidios, adicional a esto se ha reportado en A. oryzae que la
autolisis ocurre durante la formación de conidióforos y conidios, los autores afirman que
los componentes intracelulares se reconstituyeron mediante un proceso autofágico para
que las hifas aéreas se diferenciaran en células específicas como vesículas de
conidióforos, fiálides y conidios (Kikuma et al., 2007).
El comportamiento del amonio residual en el reactor de 100 litros se puede observar en la
Figura 4 - 14, a partir de la cual se puede decir que el mayor consumo de nitrógeno se da
durante las primeras 24 horas de crecimiento pasado este tiempo se estabiliza el sistema,
este tiempo coincide en algunos casos con los tiempo de mayor producción de biomasa,
con esto se puede decir que el crecimiento de biomasa está asociado con el nitrógeno
disponible del medio pero no es un factor limitante del sistema. Esto se puede comprobar
con el balance estequiométrico (Anexo E) del sistema, en el cual se observa que el reactivo
limitante en la producción de biomasa es la fuente de carbono.
Adicional a esto el consumo de nitrógeno está relacionado con la sacarosa disponible en
el medio, ya que en los medios con mayor limitación se encuentran residuales de nitrógeno
mayores, es decir el microorganismo crece en proporción a los nutrientes suministrados.
62 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500.0
0.2
0.4
0.6
0.80,274 2,700
1,875 1,800
0,625 1,800
1,250 1,800
2,500 0,900
tiempo h
Sacarosa (NH4)2PO4 g/L g/L
am
on
io g
/l
Figura 4 - 14 Amonio residual en la fermentación de 100 litros
Para el caso del porcentaje de amonio consumido en cada escala se puede observar que
el consumo es similar excepto los dos últimos ensayos D y E, los cuales corresponden a
las concentraciones más altas de sacarosa evaluadas, adicional a esto se observa que en
promedio el consumo de sacarosa en el reactor es de 58.2%.
Tabla 4 - 8 Comparación porcentaje de amonio consumido ensayos de 3 y 100 L (Ensayo
A 0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato diamonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L
fosfato diamonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D
1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L
fosfato diamonio)
Ensayo Amonio consumido (3 litros)
% Amonio consumido (100 litros)
%
A 62 56
B 60 60
C 55 63
D 70 38
E 51 74
Capítulo 4. Resultados 63
Para el caso de los perfiles generados en términos de sacarosa residual se observó una
tendencia similar a la obtenida para el caso del amonio donde el mayor consumo se da
durante las primeras 24 horas (Figura 4 - 15). También se observa que para todas las
escalas al finalizar el ensayo permanece un residual cercano al 50% de la sacarosa
adicionada al inicio.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500
1
2
3
0,625 1,800
1,250 1,800
1,875 1,800
2,500 0,900
0,274 2,700
Tiempo h
Sacarosa (NH4)2PO4
Sacaro
sa g
/L
Figura 4 - 15 Sacarosa residual para la fermentación de 100 litros
Por otra parte, el consumo de sacarosa en los ensayos del reactor de 100 litros es mayor
comparado con el del reactor de 3 litros, en la escala de 100 litros el consumo de sacarosa
se incrementa en promedio 50%, el aumento de consumo de sacarosa está asociado al
crecimiento celular por lo tanto se puede relacionar esta variable inversamente con la
producción de conidios.
Para el caso de la producción de conidios en el fermentador de 100 litros se evidenció que
la generación de conidios se da a partir de la hora 24 y la mayor producción al igual que
en la escala de 3 litros está en el medio con mayor limitación de glucosa (
Figura 4 - 16).
64 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
0 12 24 36 480
2.0104
4.0104
6.0104
8.0104
2.0105
4.0105
6.0105
8.0105
0,274 2,700
0,625 1,800
1,250 1,800
1,875 1,800
2,500 0,900
tiempo h
Sacarosa (NH4)2PO4
g/L g/Lco
nid
ios/m
l
Figura 4 - 16 Producción de conidios en fermentación de 100 L
A partir de las cinéticas obtenidas en el reactor de 100 litros para la producción de conidios,
mostradas en la
Figura 4 - 16 se puede observar que la producción de conidios se da a partir de la hora 24
para todos los casos, sin embargo para el caso del medio con limitación de sacarosa
(Medio A) la producción de conidios a la hora 48 es 1,4 veces mayor comparado con lo
obtenido en los demás medios bajo las mismas condiciones, esto indica que la limitación
de fuente de carbono induce el proceso de conidiogénesis pero los rendimientos aumentan
si la concentración de sacarosa inicial en el medio es cercana a cero, esto coincide con los
resultados reportados para P. chrysogenum donde a pesar de ser común la inducción en
medios libres de nitrógeno (Morton, 1961) para el caso de la cepa nativa WIS 54-1255 la
producción de conidios se da en medios limitados de glucosa.
Al comparar las concentraciones de conidios obtenidas en las dos escalas se observa que
al realizar el cambio de escala se da una reducción de entre el 9% y el 26% (Tabla 4 - 9),
sin embargo, estas concentraciones se obtienen en menores tiempos lo cual implica que
las productividades en algunos casos se dupliquen.
Capítulo 4. Resultados 65
Tabla 4 - 9 Comparación producción de conidios en escala de 3 y de 100 L (Ensayo A
0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato di amonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L
fosfato di amonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D
1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato di amonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L
fosfato di amonio)
Ensayo
Producción máxima conidios (3 litros)
Producción máxima conidios (100 litros)
Diferencia
log𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠
𝑚𝑙 h log
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠𝑚𝑙ℎ
log𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠
𝑚𝑙 h log
𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠𝑚𝑙ℎ
% *
A 6,4649 144 0,0449 5,8663 48 0,1222 -9%
B 5,1027 144 0,0354 4,1761 48 0,0870 -18%
C 5,3921 72 0,0748 4,8751 48 0,1016 -10%
D 5,1357 72 0,0713 4,3979 48 0,0916 -14%
E 5,5682 144 0,0387 4,0969 48 0,0854 -26%
* El negativo indica los porcentajes asociados a reducción de conidios
En los medios de cultivo seleccionados el microorganismo presentó producción de
conidios; sin embargo, la concentración obtenida fue inferior en periodos de tiempo más
cortos que los presentados en los ensayos de 3 litros como se puede observar en la Tabla
4 - 9; esta disminución está entre el 10-26%. Probablemente este efecto se debe al cambio
en las condiciones reológicas del sistema; este comportamiento es similar al reportado por
otros autores respecto al efecto que tiene el estrés mecánico y la aireación sobre la pared
celular de las hifas, en algunos casos se ha encontrado que bajo algunas condiciones se
puede generar ruptura de la pared celular lo cual implicaría una reducción en la tasa de
crecimiento y en diferenciación (White et al., 2002)
En este caso se puede decir que el proceso de conidiogénesis está relacionado con la
cantidad de biomasa generada por el microorganismo, es decir el medio A, presenta
mayores productividades en cuanto a la producción de conidios, pero la biomasa generada
es cercana a cero, esto comprueba el comportamiento obtenido en la escala anterior,
donde se evidenció el efecto que tiene el crecimiento vegetativo sobre la diferenciación y
66 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
como los medios con limitación en la fuente de carbono y nitrógeno disminuyen el
crecimiento micelial.
Adicional a esto se logró evidenciar que, las mejores condiciones para la producción de
conidios se encuentran en medios limitados de fuente de carbono, en la Figura 4 - 15 se
encuentra la cinética de sacarosa residual en el medio, para este caso se observó que el
mayor consumo de sacarosa se da durante las primeras 24 horas, lo cual coincide con el
comportamiento de consumo de la fuente de nitrógeno. Al comparar el comportamiento de
sacarosa residual con la producción de conidios se puede observar que la generación de
conidios se da en el momento en que se estabiliza el consumo de fuente de carbono.
Capítulo 4. Resultados 67
4.1.4 Modelo matemático
El modelo matemático desarrollado está compuesto por un sistema de ecuaciones
diferenciales asociadas al comportamiento cinético del microorganismo y una ruta
metabólica asociada a la generación de biomasa reportada para P. chrysogenum por Yuan
et al. (2010). El modelo generado durante el desarrollo de este trabajo se caracteriza por
ser el primer modelo cinético para la generación de conidios de una cepa de Penicillium.
La anterior afirmación se puede realizar debido a que los modelos reportados para este
género están asociados principalmente a la producción de metabolitos secundarios como
la penicilina (Aynsley et al., 1990; Nielsen y Jorgensen, 1996; Paul y Thomas, 1996;
Patnaik, 1999; Paul et al., 1998; Birol et al., 2002; Yuan et al., 2010). Adicionalmente, el
modelo generado hace parte del proceso de obtención de un producto biológico celulolítico
de uso agrícola el cual tiene como base de formulación las estructuras de reproducción
asexual (conidios) de Penicillium pinophilum.
Para la generación del modelo, se analizó el comportamiento del microorganismo en
condiciones de limitación de carbono variando la concentración inicial de nitrógeno, como
se mencionó en la sección 3.1.4 esto se realizó por medio de un diseño factorial utilizando
el medio MB1. A partir de este diseño se obtuvieron cinéticas para cada una de las
variables a considerar en el modelo, sustratos, producto y biomasa.
El modelo está constituido por cuatro ecuaciones diferenciales de parámetros en su
mayoría no lineales. Las ecuaciones son capaces de reproducir el crecimiento del hongo,
la evolución de conidios producidos y la degradación de nutrientes sacarosa y fosfato de
amonio.
Los principales supuestos del modelo son:
- Temperatura contante en el medio
- Aireación constante
- El nutriente limitante es el carbono
- La fuente de nitrógeno no es limitante
68 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Biomasa
La evolución de la biomasa se definió por un balance de masa dinámico, se considera una
tasa de crecimiento específica y un término de muerte para el hongo. Se asumió una
cinética de muerte de primer orden.
La primera estimación de modelo se realizó a partir de los modelos de descritos en la Tabla
3 - 2, para este caso se determinaron los parámetros de cada ecuación, solucionando el
sistema de ecuaciones simultáneamente para todos los perfiles de crecimiento, los valores
obtenidos se encuentran reportados en la Tabla 4 - 10.
Tabla 4 - 10 Constantes obtenidas para los diferentes modelos aplicados
parámetro modelo
1 modelo
2 modelo
3 modelo
4 modelo
5 modelo
6 modelo
7
𝝁𝒎𝒂𝒙 0,0097 0,0180 0,0113 0,2877 0,0096 0,0110 0,0110
𝒌𝒔 0,0010 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100
𝒏 ó 𝒌𝒏 -- 0,1000 0,1955 0,0029 -- -- --
Al realizar el análisis de sensibilidad de las constantes para cada una de los perfiles de
crecimiento, se encontró que debido a la complejidad del sistema las constantes no son
adecuadas para el sistema, esto se comprobó comparando cada una las constantes entre
si por medio del coeficiente de varianza. Como se muestra en la Tabla 4 - 11 los
coeficientes obtenidos son altos para considerar adecuados los parámetros generados.
Los resultados del análisis de sensibilidad se encuentran en el Anexo F.
𝑑𝑥
𝑑𝑡= 𝜇𝑥 Ecuación 2
Capítulo 4. Resultados 69
Tabla 4 - 11 Coeficientes de varianza de las constantes obtenidas según el análisis de sensibilidad realizado.
parámetro modelo
1 modelo
2 modelo
3 modelo
4 modelo
5 modelo
6 modelo
7
𝒌𝒅 1214% 223% 127% 38% 61% 75% 94%
𝐦𝟏 453% 321% 92% 94% 78% 259% 145%
𝐦𝟐 636% 240% 107% 150% 214% 228% 265%
𝝁𝒎𝒂𝒙 366% 148% 77% 49% 69% 69% 98%
𝒌𝒔 256% 99% 43% 57% 70% 103% 119%
𝒏 ó 𝒌𝒏 -- 71% 21% 11% -- 34% --
𝒌𝒊 -- -- -- 31% -- -- --
𝝁𝒎𝒂𝒙 456% 104% 11% 30% 55% 87% 84%
Teniendo en cuenta lo anterior se decidió realizar el análisis del sistema por fenómenos
biológicos, utilizando como principal factor la limitación de carbono y nitrógeno. Donde
𝜇𝑚𝑎𝑥 es la velocidad específica de crecimiento máxima cuando 𝑠 ≫ 𝐾𝑆 y la concentración
de los demás nutrientes es constante, 𝐾𝑆 es el valor de la concentración de sustrato
limitante en la que la velocidad específica de crecimiento es la mitad de su valor máximo y
𝑠 la concentración de sustrato en el medio. En la literatura para modelos de crecimiento de
Penicillium sp, el modelo de limitación ha sido ampliamente estudiado para mostrar el
crecimiento micelial (Yuan et al., 2010).
Para el caso de la biomasa se tiene una clara influencia en la tasa de crecimiento por la
limitación de fuente de carbono y nitrógeno como se observa en la figura 4 - 17, es decir
es necesario que los dos términos se encuentren en el sistema de ecuaciones.
70 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,51,0
1,52,0
µ (
1/h
)
Fos
fato
de
amon
io g
/L
Sacarosa g/L
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Fosfato de amonio g/L
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Sacaro
sa g
/L
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Figura 4 - 17 Comportamiento de la tasa de crecimiento respecto a las concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa
Con base en lo anterior se seleccionó la Ecuación 3 para predecir el comportamiento de la
tasa de crecimiento donde el primer término hace referencia a la tasa de crecimiento
máximo, el segundo término está relacionado con la limitación por fuente de carbono
(sacarosa) y el tercer término hace referencia a la limitación por fuente de nitrógeno.
𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 𝑛
𝑘𝑛 + 𝑛 Ecuación 3
La Ecuación 3 corresponde al modelo 2 evaluado previamente, como se observó en la
Tabla 4 - 11 solucionar el modelo con todos los perfiles al tiempo no es una estrategia
adecuada debido a la complejidad del sistema. Teniendo en cuenta esto, es necesario
evaluar las constantes bajo los siguientes supuestos:
1) La evaluación para generación de biomasa se realiza inicialmente sobre la fase
exponencial de los perfiles de crecimiento (Ecuación 2)
2) Limitación por carbono, asumiendo exceso de fuente de nitrógeno tal que 𝑘𝑛 ≫ 𝑛,
generando que el segundo término tienda 1, por lo tanto la ecuación asociada a la
tasa de crecimiento queda reducida a la Ecuación 4; para solucionar esta ecuación
únicamente se consideran aquellos perfiles de crecimiento que presentan limitación
por fuente de carbono, se seleccionaron los perfiles en los cuales al finalizar la
fermentación se tenía nitrógeno residual. A partir de esto se encuentran los valores
de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠.
Capítulo 4. Resultados 71
𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 Ecuación 4
3) Limitación por nitrógeno, asumiendo exceso de fuente de carbono tal que 𝑘𝑠 ≫ 𝑠,
generando que el segundo término tienda 1, por lo tanto la ecuación asociada a la
tasa de crecimiento queda reducida a la ecuación 5 Error! Reference source not
found.; para solucionar esta ecuación únicamente se consideran aquellos perfiles
de crecimiento que presentan limitación por fuente de nitrógeno, se seleccionaron
los perfiles en los cuales al finalizar la fermentación no se tenía nitrógeno residual.
Para este caso se mantiene el valor de 𝜇𝑚𝑎𝑥 encontrado previamente y se itera el
valor de 𝑘𝑛
𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑛
𝑘𝑛 + 𝑛 Ecuación 5
La evaluación por limitación de carbono se realizó en 15 perfiles de crecimiento asociados
a los ensayos 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 y 20, las concentraciones de estos
ensayos se encuentran en la Tabla 3 - 1. Se tomo como valor de inicialización el promedio
obtenido de los valores de la tabla 4 – 1 y 4 – 2. Al realizar el análisis de sensibilidad a este
sistema usando como función objetivo el coeficiente de correlación R2 se encontró que
para todos los ensayos se obtuvieron valores de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 coherentes a los reportados por
otros autores y a los calculados previamente para cada ensayo (
Tabla 4 - 12). Con el fin de obtener un solo valor se generó un 𝜇𝑚𝑎𝑥 promedio de 0,1872
y un 𝑘𝑠 de 0,05765, se verificó este nuevo valor nuevamente para los perfiles de
72 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
crecimiento encontrando valores de R2 de 0,8464 a 0,9834 para 13 de los perfiles
evaluados (Tabla 4 - 13).
Tabla 4 - 12 Valores 𝝁𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 análisis de sensibilidad limitación de carbono
Ensayo 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝒌𝒔 R2
2 0,0091 0,0850 0,8674
3 0,2342 0,2341 0,8349
4 0,1240 0,0026 0,8586
7 0,1533 0,0096 0,7103
8 0,1537 0,0096 0,6848
10 0,0495 0,0123 0,9208
11 0,0360 0,0010 0,7395
12 0,1788 0,0225 0,7167
14 0,1500 0,0700 0,9763
15 0,1500 0,0700 0,9681
16 0,1500 0,0700 0,9601
18 0,9000 0,0500 0,9502
19 0,1254 0,0940 0,882
20 0,2069 0,0764 0,8119
Capítulo 4. Resultados 73
Tabla 4 - 13 Valores coeficientes de correlación R2 con los valores de 𝝁𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 promedio
Ensayo R2 Ensayo R2
2 0,8464 12 0,8735
3 0,9668 14 0,9718
4 0,9834 15 0,9661
7 0,9034 16 0,9522
8 0,9753 18 0,5265
10 0,5371 19 0,8553
11 0,9175 20 0,7876
Para el caso de la evaluación por limitación de nitrógeno se realizó en 6 perfiles que
presentaban esta característica asociados a los ensayos 1, 5, 6, 9, 13 y 17, a partir de esto
se encontraron valores biológicamente válidos para cinco ensayos excepto para el ensayo
6 (Tabla 4 - 14). Al obtener un valor 𝑘𝑛 promedio de 0,09668 se obtuvieron valores de
0,2130 a 0,5265 respecto al coeficiente de correlación R2 estos se pueden observar en la
Tabla 4 - 15
Tabla 4 - 14 Valores 𝒌𝒏 para ensayos de limitación de nitrógeno
Ensayo 𝒌𝒏 R2
1 0,08633 0,74740
5 0,08895 0,22860
6 0,08633 0,66030
9 0,13697 0,23590
13 0,09041 0,29210
17 0,09114 0,27390
Tabla 4 - 15 Valores coeficientes de correlación R2 con el valor de 𝑘𝑛 promedio
Ensayo R2
1 0,5265
5 0,213
6 0,4163
74 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
9 0,2431
13 0,2964
17 0,2733
Los valores reportados para la tasa de crecimiento de biomasa máxima se encuentran en
la Tabla 4 - 3, al comparar estos valores con los hallados para el modelo evaluado se
puede observar que el valor encontrado para la tasa de crecimiento máxima es similar al
reportado para sistemas en los cuales se busca la generación de biomasa (Gougouli y
Koutsoumanis, 2010), esto es congruente con el sistema evaluado, ya que la producción
de conidios está asociada directamente al metabolismo primario del microorganismo.
Teniendo en cuenta la complejidad del sistema biológico evaluado, la estrategia de cálculo
implementada mostró ser adecuada, al permitir hallar valores biológicamente coherentes.
También se evidencio que realizar las comparaciones en términos de las derivadas en
cada punto experimental, se obtienen ajustes con bajas diferencias entre si.
Fuente de carbono
El primer término de la ecuación para fuente de carbono está destinado al crecimiento del
hongo, es decir la fuente de carbono aporta los elementos necesarios para la síntesis de
biomasa y la energía necesaria para este proceso. El segundo término corresponde al
mantenimiento, este término considera el aporte de energía para mantener vivo al
microorganismo y además aporta los materiales necesarios para la formación de productos
extracelulares, en este caso este parámetro fue ajustado a partir de los perfiles de
crecimiento en los cuales se observó consumo de sacarosa luego de alcanzar la fase
estacionaria del sistema (Ecuación 6).
𝑑𝑠
𝑑𝑡= (−
1
𝑌𝑥/𝑠−𝑚1)𝜇𝑥 Ecuación 6
El rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 se obtiene a partir de los perfiles de crecimiento sin generación de
conidios mostrados en la Figura 4 - 18, utilizando la Ecuación 7 se encontró que el
rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 es de 0,6239.
Capítulo 4. Resultados 75
𝑌𝑥/𝑠 =𝑑𝑥/𝑑𝑡
𝑑𝑠/𝑑𝑡=𝑑𝑥
𝑑𝑠 Ecuación 7
0 24 48 72 96 120 1440
1
2
3
4
5
Tiempo (h)
Bio
masa (
peso
seco
) g
/L
0 24 48 72 96 120 14410
15
20
25
Tiempo (h)
Sacaro
sa g
/L
Figura 4 - 18 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de fuente de carbono sacarosa
La determinación de la constante de mantenimiento para sacarosa 𝑚1 se realizó en los
perfiles de los ensayos 10, 11, 12, 16, 18, 19 y 20, puesto que en estos perfiles se observó
fase estacionaria durante el periodo de tiempo evaluado. Sin embargo, únicamente se
observaron valores para la constante de mantenimiento en los ensayos 16 y 19 como se
observa en la Tabla 4 -16 con un valor promedio 𝑚1 de 0,01.
Tabla 4 - 16 Valores 𝒎𝟏 para ensayos con presencia de fase estacionaria.
Ensayo 𝒎𝟏 R2
10 0 0,9202
11 0 0,7395
12 0 0,7167
16 0,01 0,9601
18 0 0,9502
19 0,01 0,8820
20 0 0,8119
A B
76 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
A partir del análisis por fenómenos se logró evidenciar que aunque la mayoría de los
perfiles de crecimiento presentan una influencia significativa en cuanto a la limitación por
carbono, no en todos los casos se encontraron valores biológicamente coherentes, una
posible explicación a esto es que el microorganismo se comporta de manera diferente
según la concentración inicial de nutrientes y la relación carbono nitrógeno, por esta razón
el sistema de ecuaciones propuesto no es adecuado para todos los perfiles de crecimiento.
Fuente de nitrógeno
El modelo utilizado supone que la fuente de nitrógeno, es amonio el cual se incorpora a la
biosíntesis de compuestos nitrogenados (Smith & Berry, 1976), adicional a esto se asume
que el nitrógeno es utilizado para el crecimiento y para el mantenimiento celular; en este
caso este parámetro fue ajustado a partir de los perfiles de crecimiento en los cuales se
observó consumo de nitrógeno luego de alcanzar la fase estacionaria del sistema
(Ecuación 8).
𝑑𝑛
𝑑𝑡= (−
1
𝑌𝑛/𝑠−𝑚2)𝜇𝑥 Ecuación 8
El rendimiento 𝑌𝑥/𝑛 se obtiene a partir de los perfiles de crecimiento sin generación de
conidios mostrados en la figura 4 – 19, utilizando la ecuación 9 se encontró que el
rendimiento 𝑌𝑥/𝑛 es de 4,8085.
𝑌𝑥/𝑠 =𝑑𝑥/𝑑𝑡
𝑑𝑛/𝑑𝑡=𝑑𝑥
𝑑𝑛 Ecuación 9
Capítulo 4. Resultados 77
0 24 48 72 96 120 1440
1
2
3
4
5
Tiempo (h)
Bio
masa (
peso
seco
) g
/L
Figura 4 - 19 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de fuente de amonio
La determinación de la constante de mantenimiento para amonio 𝑚2 se realizó en los
perfiles de los ensayos 10, 11, 12, 16, 18 y 19, puesto que en estos perfiles se observó
fase estacionaria durante el periodo de tiempo evaluado. En este caso, se observaron
valores para la constante de mantenimiento en todos los ensayos propuestos como se
observa en la Tabla 4 - 17 con un valor promedio 𝑚2 de 0,3017
.Tabla 4 - 17 Valores 𝑚2 para ensayos con presencia de fase estacionaria.
Ensayo 10
Ensayo 11
Ensayo 12
Ensayo 16
Ensayo 18
Ensayo 19
𝒎𝟐 0,3305 0,2961 0,3305 0,2110 0,3232 0,3152
R2 0,3706 0,4142 0,3796 0,4524 0,5317 0,4185
Producción de conidios
La tasa neta de producción de conidios está representada por una ecuación asociada al
efecto que tienen la limitación de fuente de carbono en la producción del mismo, en este
0 24 48 72 96 120 1441.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Tiempo (h)
Am
on
io g
/L
A B
78 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
caso no se considera la limitación de fuente de nitrógeno ya que se observó que este factor
no tiene un efecto significativo en esta variable como se mostró en la Tabla 4 - 4. Teniendo
en cuenta esto se decidió usar la Ecuación 10 para representar la producción de conidios
en el tiempo y la Ecuación 11 para representar la tasa neta de producción de conidios en
el tiempo. Para este caso el valor promedio de 𝜇𝑃𝑚𝑎𝑥 es 0,0025 h-1
𝑑𝑝
𝑑𝑡= 𝜇𝑃
1
𝑥 Ecuación 10
𝜇𝑃 = 𝜇𝑃𝑚𝑎𝑥 (𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠) Ecuación 11
La evaluación por limitación de carbono para la producción de conidios se realizó en 7
perfiles de crecimiento asociados a los ensayos 2, 3, 4, 8, y 16.
Tabla 4 - 18 Valores 𝝁𝒑𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 análisis de sensibilidad limitación de carbono
Ensayo 𝝁𝑷𝒎𝒂𝒙 R2
2 0,0022
0,8399
3 0,0032 0,8493
4 0,0034 0,7307
8 0,0024 0,7758
16 0,0013 0,9890
A partir de las ecuaciones mostradas anteriormente se obtuvieron los valores de
coeficientes de correlación mostrados en la Tabla 4 - 19. Donde se puede observar que el
ajuste del modelo aplicado es válido para la mayoría de los perfiles de crecimiento
evaluados.
Tabla 4 - 19 Valores de coeficiente de correlación para cada uno de los ensayos a escala laboratorio 3 litros
Ensayo X S N P
1 0,7859 0,9078 0,8930 0,9911
2 0,9006 0,8423 0,9159 0,7785
3 0,7738 0,9367 0,9789 0,9732
4 0,7038 0,6979 0,8763 0,8753
5 0,6503 0,8283 0,8875 0,7221
Capítulo 4. Resultados 79
6 0,7296 0,7067 0,7167 0,8839
7 0,9878 0,7912 0,7799 0,8612
8 0,7123 0,7966 0,7195 0,9926
9 0,9321 0,6681 0,7191 0,9172
10 0,8638 0,9255 0,9273 0,7660
11 0,8079 0,7802 0,8652 0,7764
12 0,8545 0,8205 0,8095 0,8231
13 0,6083 0,8498 0,9517 0,7356
14 0,7514 0,7377 0,8158 0,8991
15 0,8932 0,9600 0,9407 0,7652
16 0,8832 0,7226 0,7099 0,8395
17 0,8794 0,9773 0,7131 0,8052
18 0,8425 0,9919 0,8061 0,8092
19 0,8399 0,7605 0,9505 0,7156
20 0,9752 0,9113 0,9801 0,7619
Modelo macro cinético
El ajuste de modelo macro cinético se realizó teniendo en cuenta las ecuaciones obtenidas
del balance estequiométrico intracelular (Anexo F), y mostro un ajuste de 85% respecto al
r2
Este modelo ha adoptado la suposición básica que se encuentra en la literatura (Bellgardt,
1983), que todas las reacciones intracelulares están en estado seudo estacionario, o en
otras palabras, no hay una acumulación significativa de los metabolitos intracelulares en
cada paso de simulación. Esta suposición es razonable si se elige el paso de simulación
en muy corto plazo (0,1 h) en comparación con todo el período de fermentación. Sin
embargo, desde un paso de simulación al otro, las variables de estado se someten a
estímulos generados por los cambios del sustrato específico 𝑞𝑠, el cual se asume según la
ecuación 12.
𝑞𝑠 = −𝑑𝑆
𝑑𝑡
Ecuación 12
Con el ajuste macro cinético se incluyó una parte de la ruta metabólica asociada a la
generación de biomasa, lo cual permite tener una aproximación más cercana al
80 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
comportamiento del sistema de la producción de conidios, ya que anteriormente se mostró
la relevancia de la concentración de biomasa en el proceso de producción de conidios.
A partir del balance intracelular mostrado en el Anexo F, se llega al siguiente sistema de
ecuaciones (ecuación 13 – ecuación 17)
𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1 = 𝑞𝑠 Ecuación 13
𝑟𝑔𝑟 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4𝑟𝑇𝐶𝐶 = 2𝑟𝑂2 Ecuación 14
𝜇𝐾𝐵1 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4(𝑟𝐴𝐶 − 𝜇𝐾𝐵2) = 2𝑟𝑂2 Ecuación 15
3𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝑇𝐶𝐶 + 2𝑃/𝑂𝑟𝑂2 = 𝑞𝑠 + 𝜇/𝑌𝐴𝑇𝑃 +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 16
3𝑟𝐺6𝑃 + (𝑟𝐴𝐶 + 𝐾𝐵2) + 2𝑃/𝑂𝑟𝑂2 = (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) + 𝜇/𝑌𝐴𝑇𝑃 +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 17
Organizando el sistema de ecuaciones anterior se llega al siguiente arreglo matricial.
[
1221
𝐾𝐵12𝐾𝐵1 − 4𝐾𝐵2
−𝐾𝐵1 − 𝐾𝐵2 − 1/𝑌𝐴𝑇𝑃0
051−1
0−22𝑃/𝑂0
] [
𝑟𝐺6𝑃𝜇𝑟𝐴𝐶𝑟𝑂2
] = [
𝑞𝑠0
𝑚𝐴𝑇𝑃0
]
Solucionando la matriz anterior se llega a la siguiente expresión de tasa de crecimiento
(Ecuación 18), manteniendo constantes los parámetros mostrados en la Tabla 4 - 20, los
cuales son tomados de la literatura.
Tabla 4 - 20 Parámetros constantes usados en la iteración con la ruta metabólica (Yuan et al., 2010)
Parámetro Valor
KB1 mol/g 0,0001
KB2 mol/g 0,00074
Y ATP g/g 10
Capítulo 4. Resultados 81
m ATP mol/g h 0,0015
P/O 1,5
𝜇𝑟𝑥𝑛 = 211,844 𝑞𝑠 − 0,0144 Ecuación 18
Esta expresión forma el modelo macro cinético en términos de biomasa al sumar la
ecuación 3 y la ecuación 18. En la Figura 4 - 20 se muestra el ajuste de modelo para el
ensayo 4 de limitación.
𝜇𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝜇 + 𝜇𝑟𝑥𝑛 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠
𝑘𝑠 + 𝑠 𝑛
𝑘𝑛 + 𝑛+ 211,844 𝑞𝑠 − 0,0144
Figura 4 - 20 Ajuste del modelo ensayo 4 3 Litros (0,274 g/L de sacarosa, 2,7 g/L fosfato de amonio)
Adicional a esto, se encontró que los parámetros obtenidos a escala laboratorio presentan
un ajuste del 85%. Sin embargo, es necesario incluir parámetros adicionales de
transferencia de masa, como el kla, ya que al realizar el cambio de escala, se tienen
cambios respecto a condiciones como aireación y agitación (Doran, 2013). Por otro lado,
es necesario tener en cuenta que al realizar fermentaciones con un microorganismo
82 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
filamentoso se debe tener control reológico durante el proceso de crecimiento, ya que al
aumentar la concentración celular se disminuye la transferencia de oxígeno en el medio.
Demostración matemática de la estabilidad del modelo no estructurado-no
segregado
Estado estable
𝑑𝑥
𝑑𝑡=𝑑𝑠
𝑑𝑡=𝑑𝑃
𝑑𝑡= 0
Solución trivial Solución no trivial
La solución trivial asume que el valor de
biomasa es cero, es decir no hay biomasa
cargada dentro del reactor y por lo tanto la
biomasa en el tiempo permanece
constante
La solución no trivial toma el valor de
biomasa diferente de cero
- Análisis biomasa
𝑑𝑥
𝑑𝑡
𝑑𝑥
𝑑𝑡= (𝜇 − 𝑘𝑑)𝑥
Solucionando como problema de valor inicial
𝑥(𝑡) = 𝑐𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡
𝑥(𝑡0) = 𝑥0
𝑥0 = 𝑐𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0
𝑐 =𝑥0
𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0
𝑥(𝑡) =𝑥0𝑒
−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡
𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0= 𝑥0𝑒
−(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡)
Dado que 휀 > 0 tal que
|𝑥0𝑒(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡) − 𝑥0̅̅ ̅𝑒
(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡)̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅| < 휀
|𝑥0 − 𝑥0̅̅ ̅|𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡 < 휀𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0
Capitulo 4. Resultados 83
𝑡 = 𝑡0 |𝑥0 − 𝑥0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿
Teniendo en cuenta esto la solución es asintóticamente estable si
(𝜇 − 𝑘𝑑) > 0
- Análisis producción de conidios
𝑑𝑝
𝑑𝑡
𝑑𝑝
𝑑𝑡= (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥
Solucionando como problema de valor inicial
𝑑𝑝 = (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥𝑑𝑡
𝑝(𝑡) = (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥(𝑡 + 𝑐)
𝑝0 = 𝑡0 + 𝑐
𝑐 = 𝑝0 − 𝑡0
𝑝(𝑡) = (𝑡 + 𝑝0 − 𝑡0)
Dado que 휀 > 0 tal que
|(𝑡 + 𝑝0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑝0̅̅ ̅ − 𝑡0)| < 휀
|𝑝0 − 𝑝0̅̅ ̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀
𝑡 = 𝑡0 |𝑝0 − 𝑝0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿
Teniendo en cuenta lo anterior la solución del sistema es estable, en cualquier caso.
- Análisis sacarosa
𝑑𝑠
𝑑𝑡
𝑑𝑠
𝑑𝑡= (−
1
𝑌𝑥/𝑠𝜇 +𝑚)𝑥
84 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
𝑑𝑠
𝑑𝑡= (−
𝑑𝑠𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇 + 𝑚)𝑥
𝑑𝑠
𝑑𝑡= −
𝑑𝑠𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇𝑥 +𝑚𝑥
𝑑𝑠
𝑑𝑡+
𝑑𝑠𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇𝑥 = 𝑚𝑥
𝑑𝑠
𝑑𝑡(1 +
𝜇𝑥
𝑑𝑥𝑑𝑡
) = 𝑚𝑥
𝑑𝑠
𝑑𝑡=
𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
Solucionando como problema de valor inicial
𝑑𝑠 = (𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
)𝑥𝑑𝑡
𝑠(𝑡) = (𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
)𝑥(𝑡 + 𝑐)
𝑠0 = 𝑡0 + 𝑐
𝑐 = 𝑠0 − 𝑡0
𝑠(𝑡) = (𝑡 + 𝑠0 − 𝑡0)
Dado que 휀 > 0 tal que
|(𝑡 + 𝑠0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑠0̅ − 𝑡0)| < 휀
|𝑠0 − 𝑠0̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀
𝑡 = 𝑡0 |𝑠0 − 𝑠0̅| < 휀 = 𝛿
Teniendo en cuenta lo anterior la solución del sistema es estable, en cualquier caso.
Resultados 85
- Análisis amonio
𝑑𝑛
𝑑𝑡
𝑑𝑛
𝑑𝑡= (−
1
𝑌𝑥/𝑛𝜇 +𝑚)𝑥
𝑑𝑛
𝑑𝑡= (−
𝑑𝑛𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇 + 𝑚)𝑥
𝑑𝑛
𝑑𝑡= −
𝑑𝑛𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇𝑥 +𝑚𝑥
𝑑𝑛
𝑑𝑡+
𝑑𝑛𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡
𝜇𝑥 = 𝑚𝑥
𝑑𝑛
𝑑𝑡(1 +
𝜇𝑥
𝑑𝑥𝑑𝑡
) = 𝑚𝑥
𝑑𝑛
𝑑𝑡=
𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
86
Solucionando como problema de valor inicial
𝑑𝑛 = (𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
)𝑥𝑑𝑡
𝑛(𝑡) = (𝑚𝑥
1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡
)𝑥(𝑡 + 𝑐)
𝑛0 = 𝑡0 + 𝑐
𝑐 = 𝑛0 − 𝑡0
𝑛(𝑡) = (𝑡 + 𝑛0 − 𝑡0)
Dado que 휀 > 0 tal que
|(𝑡 + 𝑛0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑛0̅̅ ̅ − 𝑡0)| < 휀
|𝑛0 − 𝑛0̅̅ ̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀
𝑡 = 𝑡0 |𝑛0 − 𝑛0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿
Teniendo en cuenta lo anterior la solución del sistema es estable, en cualquier caso.
El análisis de estabilidad se realizó para el modelo no segregado no estructurado encontrando
que el sistema tiene un comportamiento asintóticamente estable para los casos en que la tasa de
crecimiento sea mayor que la constante de muerte, esto quiere decir que para garantizar la
estabilidad del sistema se debe tener condiciones de concentración de sustrato tales que
satisfagan esta restricción.
Por medio del análisis de sensibilidad realizado para cada uno de los parámetros propuestos, se
evidenció que para el caso de los términos de crecimiento celular la expresión seleccionada es
adecuada. Además, por medio de esta estrategia se lograron obtener valores biológicamente
validos sin tener interferencias por las restricciones matemáticas
Capítulo 5. Conclusiones y Recomendaciones 87
5. Conclusiones y recomendaciones
Conclusiones
- La evaluación del efecto de la concentración inicial de los sustratos sacarosa y fosfato de
amonio, en escala laboratorio mostró el efecto inductor que tiene la limitación de sustratos
en la producción de conidios. Así mismo, los parámetros obtenidos a partir de estos
ensayos fueron el punto de partida para la generación del modelo propuesto.
- Se desarrolló un modelo matemático teniendo en cuenta el efecto limitante de los
sustratos, el cual generó un ajuste apropiado en ciertas condiciones que incluye una parte
de la ruta metabólica del microorganismo asociada al crecimiento, lo que permitió una
mejor simulación de los resultados experimentales.
- El modelo matemático propuesto muestra el efecto positivo que tiene la fuente de carbono
sobre la tasa de crecimiento del microorganismo. Por otra parte, la mayor producción de
conidios se obtiene a bajas tasas de crecimiento en limitación de fuente de carbono. Por
lo tanto un esquema de producción apropiado consistiría en una primera etapa de
producción de biomasa en condiciones de alta concentración de carbono y una segunda
etapa para la producción de conidios en condiciones limitantes de fuente de carbono.
88 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Recomendaciones
- Evaluar el efecto de la fuente de nitrógeno (fosfato de amonio) sobre la calidad y la
producción de los conidios, con el fin de determinar la concentración óptima que permita
obtener una buena producción de conidios.
- Evaluar la influencia de diversos factores, como aireación, temperatura y pH para
aumentar los rendimientos y la productividad del proceso.
- Evaluar el esquema de producción en dos etapas optimizando las condiciones de fuente
de carbono para la formación de biomasa en la primera etapa, de tal manera que se
obtenga su mayor producción la cual deberá ingresar a la segunda etapa en condiciones
restrictivas de carbono para la formación de conidios.
- Evaluar los metabolitos generados al final de la fase exponencial y al inicio de la formación
de conidios, con el fin de identificar aquellos que tengan un efecto inductor sobre la
diferenciación.
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A. Anexo: Medios de cultivo
Medio harina de arroz
Compuesto Concentración g/l Marca
Harina de arroz 20
Triptosa 5 Sharlau
Glucosa 15 Ciacomeq
Medio sacarosa-cloruro amonio (inóculo)
Compuesto Concentración g/l Marca
Sacarosa 20 Riopaila
Cloruro de amonio 2 Ciacomeq
Sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq
Cloruro de potasio 0,5 Campota
Fosfato de potasio di básico 1,0 Merck
Micro elementos ml/L 0,1
Sales medio de crecimiento
Compuesto Concentración g/L Marca
sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq
cloruro de potasio 0,5 Campota
fosfato potasio di básico 1,0 Merck
Carbonato de calcio 0,5 Campota
Micro elementos medio de crecimiento ml/L 0,1
pH 6.5 ajustado con NaOH o H3PO4
Micro elementos inóculo
102 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Compuesto Concentración g/L Marca
Na2MoO4 2H2O 5,0 Panreac
H3BO3 3,0 Panreac
ZnSO4 7H2O 0,01 Panreac
CuSO4 5H2O 0,15 Panreac
MnSO4 2H2O 0,45 Panreac
CoCl2 0,2 Panreac
En solucion HCl 0,1 N
Micro elementos medio de crecimiento
Compuesto Concentración g/L Marca
FeSO4 2,0 Panreac
CaCl2 2,0 Ciacomeq
CoCl2 6H2O 0,2 Panreac
CuCl2 2H2O 0,01 Panreac
NiCl3 6H2O 0,2 Panreac
MnCl2 4H2O 0,03 Panreac
ZnSO4 7H2O 0,1 Panreac
H3BO3 0,3 Panreac
NaMoO4 2H2O 0,03 Panreac
En solución HCl 0,1 N
A. Anexo: Medios de cultivo 103
Medio MB1 50:1
Compuesto Concentración g/L Marca
Sacarosa 10,0 Riopaila
Fosfato diamonio 0,46 Merck
sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq
cloruro de potasio 0,5 Campota
fosfato potasio dibasico 1,0 Merck
Carbonato de calcio 0,5 Campota
Microelementos medio de crecimiento ml/L 0,1
pH 6,5 ajustado con NaOH o H3PO4
Medio MB1 25:1
Compuesto Concentración g/L Marca
Sacarosa 10,0 Riopaila
Fosfato diamonio 0,96 Merck
sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq
cloruro de potasio 0,5 Campota
fosfato potasio dibasico 1,0 Merck
Carbonato de calcio 0,5 Campota
Microelementos medio de crecimiento ml/L 0,1
pH 6,5 ajustado con NaOH o H3PO4
104 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Medio MB2
Compuesto Concentración g/L Marca
Almidón 10,0 Almiyuca
Fosfato diamonio 2,149 Merck
sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq
cloruro de potasio 0,5 Campota
fosfato potasio dibasico 1,0 Merck
Carbonato de calcio 0,5 Campota
Microelementos medio de crecimiento ml/L 0,1
pH 6,5 ajustado con NaOH o H3PO4
B. Anexo: Protocolos experimentales
B-1. Preparación de banco de trabajo
Medio de cultivo
Compuesto Concentración (g/l) Marca
PDA 39 Sharlau
Agua CSP 1L
Procedimiento
1. Preparar cajas de petri con 25 ml de PDA estéril, el medio se esteriliza durante 20
minutos a 121 °C.
2. A caja se adiciona 250 𝜇𝑙 de conidios almacenados a -20 C en viales (1ml) de
glicerol con concentración 108
3. La suspensión de conidios se homogeniza con asa de drigalski
4. Se dejan incubando durante 8 días a 25 °C.
5. Finalizado el periodo de incubación, se adiciona a cada caja 10 ml de solución
Tween 80 0,1% v/v NaCl 0.85% p/v
6. Cada caja se raspa por medio de asas de drigalski y por medio de pipetas de vidrio
se transfiere la suspensión a tubos falcón de 50 ml
7. La suspensión obtenida es filtrada por medio de jeringas con algodón estériles
8. El filtrado obtenido en el paso anterior se lava, centrifugando a 5000 rpm durante
15 min, luego se descarta el sobrenadante y se completa el volumen obtenido
inicialmente con solución de Tween 80-NaCl, esta nueva suspensión homogeniza
106 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
con un vortex y nuevamente se centrifuga a 5000 rpm por 15 minutos se descarta
el sobrenadante, este procedimiento se repite dos veces.
9. Finalizado el proceso de lavado se completa al volumen necesario, con solucion de
Tween 80- NaCl, y se verifica la concentración 2x108 por recuento de conidios en
cámara de Neubauer.
10. La suspensión anterior se mezcla con glicerol al 40% v/v en un proporción 50:50
11. Esta nueva suspensión se almacena en viales de 1 ml a -20 C
12. Cada 6 meses se verifica la viabilidad de estos viales
B-2. Determinación de la concentración de biomasa
Procedimiento
1. Secar papel filtro hasta peso constante
2. Filtrar al vacio 10 ml de muestra
3. Lavar la muestra 3 veces, adicionando 10 ml de agua y filtrando nuevamente
4. Secar a 75 ºC el papel filtro hasta peso constante
5. Pesar el papel con la muestra y cuantificar.
Nota 1: Si se necesita determinar también la concentración de sustratos remanentes en el
medio de cultivo, se debe conservar el filtrado que resulta antes de los lavados.
B. Anexo: Protocolos experimentales 107
B-3. Determinación de amonio mediante la técnica de berthelot y curva
de calibración
Preparación de soluciones
- Solución de fenol 11.1% (11.1 g de fenol/ 100 mL de etanol al 95%).
- Solución de nitroprusiato (0.5 g de nitroprusiato/100 mL agua destilada y almacenar
en botella ambar).
- Citrato alcalino (adicionar 200 g citrato trisodico + 10 g de hidróxido de sodio en
700 mL de agua destilada y aforara a 1000 mL).
- Hipoclorito de sodio, solución comercial al 5.25%.
- Solución oxidante (10 mL de citrato alcalino + 2.5 mL de hipoclorito de sodio
comercial 5.25% que se debe preparar justo antes de adicionar no se debe
almacenar).
- Solución madre se Sulfato de amonio 10mg/L (en agua destilada)
Reactivos
- Solución de fenol 11.1% (11.1 g de fenol/ 100 mL de etanol al 95%)
- Solución de nitroprusiato (0.5 g de nitroprusiato/100 mL agua destilada y almacenar
en botella ambar)
- Citrato alcalino (adicionar 200 g citrato trisodico + 10 g de hidróxido de sodio en
700 mL de agua destilada y aforara a 1000 mL)
- Hipoclorito de sodio, solución comercial al 5.25%:
- Solución oxidante (10 mL de citrato alcalino + 2.5 mL de hipoclorito de sodio
comercial 5.25% que se debe preparar justo antes de adicionar no se debe
almacenar).
- Muestra del sobrenadante del medio de cultivo
108 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Procedimiento
1. Tomar del sobrenadante 100 μl y diluirlo en 4900 μl de agua destilada en un
tubo de ensayo. Atención: con esto se logra una dilución 1:50 que puede ser
insuficiente en ciertos casos, ver la nota aclaratoria al final del protocolo para
determinar la mejor dilución.
2. Adicionar al tubo anterior a 200 μl de fenol, 200 μl de nitroprusiato y 500 μl de
solución oxidante.
3. Agitar los tubos e incubar a temperatura ambiente por una hora en un lugar
iluminado. Se debe desarrollar un color azul aguamarina cuya intensidad será
proporcional a la concentración de amonio en la muestra.
4. Leer a 640 nm.
Preparación del blanco
Es la solución contra la cual se comparan las muestras, se adicionan 5000 μl de agua
destilada a un tubo de ensayo y se continua desde el paso 2. El blanco se debe preparar
al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.
Precauciones: El fenol penetra la piel rápidamente, en particular cuando está líquido,
causando lesiones severas que pueden ser fatales. Es corrosivo sobre los tejidos
corporales, causando severas quemaduras químicas y debido a sus propiedades de
anestésico local, las quemaduras cutáneas pueden ser indoloras. Usar siempre guantes y
gafas para su manipulación y trabajar en un lugar con buena ventilación.
Curva de calibración
Para la elaboración de la curva de calibración se prepara una solución madre de fosfato
de amonio o cloruro de amonio de 10 mg/L a partir de la cual se preparan en tubos de
ensayo las soluciones descritas en la siguiente tabla:
B. Anexo: Protocolos experimentales 109
Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Solución madre de
sulfato de amonio
(mL)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
Agua destilada ( mL) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2
Volumen final ( mL)
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
Concentración
Fosfato de amonio
(mg/L)
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6
Concentración
Amonio
(g/L)
0
1,09X1
0-4
2,18
X10-4
3,27
X10-4
4,36
X10-4
5,45
X10-4
6,55
X10-4
7,64
X10-4
8,73
X10-4
9,82
X10-4
Una vez se tienen las soluciones anteriores en los tubos de ensayo, se continua
con el procedimiento desde el paso 2 y se grafica la absorbancia contra la
concentración de cada muestra. Se hace la regresión lineal correspondiente y se
obtiene así la ecuación de absorbancia (y) en términos de la concentración (x).
CURVA DE CALIBRACION AMONIO
0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.00100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
y=449.62x-0.003
R2=0.9951
Concentración NH4 (g/L)
Ab
so
rban
cia
(640 n
m)
110 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Cada vez que se preparen los reactivos hay que elaborar una nueva curva de calibración.
La ecuación despejada para la curva obtenida con los reactivos actuales es:
Concentración NH4 (g/L) = ((Absorbancia /449.62) + 0.003)*Factor de dilución
Nota 1: El límite de detección de la técnica aquí descrita es 3.6 mg/l, por lo tanto debe
procurarse que la concentración de la muestra a leer se encuentre por debajo de este valor,
de lo contrario será necesario hacer una dilución. Dada la sensibilidad de la técnica, las
diluciones que se deben realizar son muy altas por lo que es necesario emplear micro
pipetas calibradas que permitan tomar los volúmenes correctos. Adicionalmente, es
importante tener en cuenta que la cantidad de reactivos empleada fue establecida para un
volumen de muestra de 5 mL, por lo tanto si se usa un volumen mayor se deben ajustar
los volúmenes de reactivos, y verificar con una muestra de concentración conocida.
B. Anexo: Protocolos experimentales 111
B-4 Cuantificación de sacarosa mediante invertasa y DNS (curva de
calibración)
Preparación de soluciones
- Solucion DNS
43.0 g Tartrato de sodio y potasio,
1.8 g Hidroxido de sodio
1.0 g Acido Dinitro Salicilico (DNS),
100 ml de agua
Disolver en 60 ml de agua el tartrato de sodio y el hidróxido de sodio en agitación
constante, este proceso puede durar aproximadamente 12 horas, el tartrato se
debe adicionar lentamente.
Disolver aparte en 20 ml de agua el DNS, en un recipiente ambar o protegido de la
luz ya que este reactivo es fotosensible.
En un balón aforado adicionar, primero la solución de tartrato y luego la solución de
DNS, homogenizar y aforar a 100 ml. La solución se debe almacenar en recipiente
ambar, en un lugar oscuro.
- Invertasa
0.025 g invertasa / 100 ml buffer acetatos 0.1 M pH 4.6
Buffer acetatos para hidrólisis enzimática
[H+] = keq[CH3COOH]
[CH3COO] Acido AceticoAcetato de sodio
Concentración
mol/L
Peso molecular
g/mol
Densidad
g/ml
[CH3COOH] 0,17 60 1.53
[CH3COO] 0,1 82.03 No Aplica
Para 100 ml, se necesitan 0.66 ml de acido acético glacial y 0.8203 g de acetato de sodio
La solución de invertasa se debe almacenar a 4 °C, periódicamente se debe verificar la actividad enzimática con una solución de concentración conocida.
112 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Procedimiento
1. Tomar 500 μL del filtrado de la muestra
2. Adicionar 500 μL de solución invertasa
3. Incubar durante 30 minutos a 60 °C en baño termostatado
4. Pasar las muestras durante 5 minutos a hielo para detener la reacción
5. Diluir la muestra con agua destilada
6. Tomar 250 μL de la solución obtenida en el paso 5
7. Adicionar 250 μL de solución DNS
8. Incubar en agua a ebullición durante 5 minutos
9. Pasar a hielo durante 5 minutos para detener la reacción
10. Adicionar 2.5 ml de agua
11. Homogenizar las muestras con vortex
12. Leer a 540 nm (durante la lectura mantener las muestras en un lugar oscuro)
Preparación de blanco
Es la solución contra la cual se comparan las muestras, se adicionan 250 μl de agua
destilada a un tubo de ensayo y se continua desde el paso 7. El blanco se debe preparar
al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.
Curva de calibración
Para la elaboración de la curva de calibración se prepara una solución madre de sacarosa
4 g/L a partir de la cual se preparan en tubos de ensayo las soluciones descritas en la
siguiente tabla:
Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8
Solución madre
de sacarosa
(mL)
0 0.625 1.250 1.875 2.500 3.125 3.750 4.375 5.000
Agua destilada ( mL)
5 4.375 3.750 3.125 2.500 1.875 1.250 0.625 0
Volumen final ( mL)
5 5 5 5 5 5 5 5 5
B. Anexo: Protocolos experimentales 113
Concentración
Sacarosa
(g/L)
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
Una vez se tienen las soluciones anteriores en los tubos de ensayo, se continua
con el procedimiento desde el paso 1 y se grafica la absorbancia contra la
concentración de cada muestra. Se hace la regresión lineal correspondiente y se
obtiene así la ecuación de absorbancia (y) en términos de la concentración (x).
CURVA DE CALIBRACION SACAROSA
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.0
0.5
1.0 y=0.2712x-0.0259
R2=0.9923
Concentración Sacarosa (g/L)
Ab
so
rban
cia
(540 n
m)
Cada vez que se preparen los reactivos hay que elaborar una nueva curva de calibración.
La ecuación despejada para la curva obtenida con los reactivos actuales es:
Concentración Sacarosa (g/L) = ((Absorbancia /0.2712) + 0.0259)*Factor de dilución
C. Anexo: Cinéticas ensayos limitación
C-1 Biomasa
Biomasa (Sacarosa 0.274 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
1
2
3
40.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Biomasa (Sacarosa 0.625 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
60.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 115
Biomasa (Sacarosa 1.25 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
1
2
3
40.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Biomasa (Sacarosa 1.875 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6
80.0 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Biomasa (Sacarosa 2.5 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
60.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
116 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
C-2 Sacarosa residual
Sacarosa residual (Sacarosa 0.274 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.1
0.2
0.30.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Sacarosa residual (Sacarosa 0.625 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.70.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 117
Sacarosa Residual (Sacarosa 1.25 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.5
1.0
1.5
2.00.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Sacarosa residual (Sacarosa 1.875 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.50.0 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Sacarosa residual (Sacarosa 2.5 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
1
2
30.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
118 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
C-3 Amonio residual
Amonio residual (Sacarosa 0.274 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.2
0.4
0.6
0.80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Amonio residual (Sacarosa 0.625 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.2
0.4
0.6
0.80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 119
Amonio residual (Sacarosa 1.25 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.2
0.4
0.6
0.80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Amonio residual (Sacarosa 1.875 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.2
0.4
0.6
0.80.0 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
Amonio residual (Sacarosa 2.5 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440.0
0.2
0.4
0.6
0.80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
co
ncen
tracio
n
g/l
120 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
C-4 Producción de conidios
Recuento conidios (Sacarosa 0.274 g/L)
0 24 48 72 96 120 1441.01003
1.01004
1.01005
1.01006
1.01007
0.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
Recuento conidios (Sacarosa 0.625 g/L)
0 24 48 72 96 120 1441.0103
1.0104
1.0105
1.0106
0.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 121
Recuento conidios (Sacarosa 1.25 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
1.0104
2.0104
3.0104
4.0104
2.0105
4.0105
6.0105
8.0105
1.0106
0.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
Recuento conidios (Sacarosa 1.875 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2.0104
4.0104
6.0104
8.0104
1.0105
2.0105
3.0105
4.0105
5.0105
0.0 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
Recuento conidios (Sacarosa 2.5 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
1.0105
2.0105
3.0105
4.0105
5.0105
0.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
Co
nid
ios/m
l
122 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
C-5 pH
pH (Sacarosa 0.274 g/L)
0 24 48 72 96 120 1446.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.00.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
pH
pH (Sacarosa 0.625 g/L)
0 24 48 72 96 120 1443
4
5
6
7
80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
pH
C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 123
pH (Sacarosa 1.25 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6
80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
pH
pH (Sacarosa 1.875 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6
80.0 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
pH
pH (Sacarosa 2.5 g/L)
0 24 48 72 96 120 1440
2
4
6
80.007 g/L Fosfato Amonio
0.9 g/L Fosfato Amonio
1.8 g/L Fosfato Amonio
2.7 g/L Fosfato Amonio
Tiempo (h)
pH
D. Anexo: Derivadas a partir de Table curve 2d
D-1 dx/dt
t ensayo 1 ensayo 2 ensayo 3 ensayo 4 ensayo 5
0 0,1107 0,1005 0,2792 0,1415 0,1834
24 0,0291 0,0558 0,0010 -0,0201 -0,0129
48 -0,0040 0,0111 -0,0499 -0,0403 -0,0093
72 -0,0248 -0,0272 -0,0217 -0,0170 -0,0182
96 -0,0160 -0,0250 -0,0006 -0,0185 -0,0191
120 -0,0001 -0,0176 -0,0111 -0,0112 -0,0147
144 -0,0504 -0,0069 -0,0153 -0,0026 -0,0064
t ensayo 6 ensayo 7 ensayo 8 ensayo 9 ensayo 10
0 0,0079 0,1225 0,1429 0,0234 0,0059
24 0,0254 0,0068 0,0153 0,0195 0,0132
48 0,0821 0,0063 0,0004 0,0380 0,0300
72 0,0284 0,0351 -0,0048 0,0185 0,0336
96 -0,0668 0,0071 -0,0057 -0,0116 -0,0279
120 -0,0323 -0,1636 -0,0039 -0,0248 -0,0273
144 -0,0152 -0,5631 -0,0001 -0,0435 -0,0136
t ensayo 11 ensayo 12 ensayo 13 ensayo 14 ensayo 15
0 0,1185 0,1417 0,3367 0,2963 0,3333
24 0,0097 0,0188 0,0766 0,0398 0,0683
48 0,0336 0,0314 -0,0766 0,0127 -0,0302
72 0,1008 0,0269 -0,0491 -0,0023 -0,0312
96 -0,0770 0,0013 -0,0229 -0,0129 -0,0033
120 -0,0416 -0,0236 -0,0452 -0,0214 -0,0153
144 -0,0150 -0,0394 -0,0766 -0,0285 -0,1361
F. Anexo : Balance estequiométrico intracelular 125
t ensayo 16 ensayo 17 ensayo 18 ensayo 19 ensayo 20
0 0,7390 0,1271 0,3883 0,7951 0,4752
24 -0,0183 -0,0001 -0,0235 -0,0457 -0,0353
48 -0,0258 -0,0015 -0,0166 -0,0269 -0,0250
72 -0,0316 -0,0019 -0,0136 -0,0185 -0,0204
96 -0,0365 -0,0022 -0,0117 -0,0136 -0,0177
120 -0,0408 -0,0024 -0,0105 -0,0102 -0,0158
144 -0,0447 -0,0026 -0,0096 -0,0077 -0,0144
D-2 ds/dt
t ensayo 1 ensayo 2 ensayo 3 ensayo 4 ensayo 5
0 -2,74E-01 -2,74E-01 -2,74E-01 -2,74E-01 -9,61E-03
24 -1,03E+00 -1,03E+00 -1,03E+00 -1,03E+00 -7,47E-03
48 -3,90E-22 -3,90E-22 -3,90E-22 -3,90E-22 -4,86E-03
72 -1,47E-32 -1,47E-32 -1,47E-32 -1,47E-32 -2,72E-03
96 -5,57E-43 -5,57E-43 -5,57E-43 -5,57E-43 -1,38E-03
120 -2,10E-53 -2,10E-53 -2,10E-53 -2,10E-53 -1,04E-04
144 -7,93E-64 -7,93E-64 -7,93E-64 -7,93E-64 -1,83E-03
t ensayo 6 ensayo 7 ensayo 8 ensayo 9 ensayo 10
0 -4,13E-03 -7,79E-03 -2,28E-02 -2,23E-04 -2,39E-03
24 -6,33E-03 -6,09E-03 -9,10E-03 -3,50E-02 -2,58E-02
48 -2,81E-03 -3,52E-03 -2,32E-03 -1,89E-02 -2,46E-02
72 -1,07E-03 -2,25E-03 -2,03E-04 -1,17E-02 -1,00E-02
96 -2,33E-05 -1,39E-03 -4,88E-04 -7,47E-03 -4,57E-04
120 -6,92E-05 -7,48E-04 -9,16E-04 -4,57E-03 -4,89E-04
144 -4,95E-04 -2,32E-04 -1,68E-03 -2,42E-03 -7,77E-04
t ensayo 11 ensayo 12 ensayo 13 ensayo 14 ensayo 15
0 -4,56E-03 -4,08E-03 -2,53E-02 -2,76E-02 -4,90E-03
24 -1,72E-02 -1,53E-02 -6,66E-03 -1,46E-02 -2,46E-02
48 -1,48E-02 -9,50E-03 -4,99E-03 -1,07E-02 -2,53E-02
72 -8,79E-03 -6,69E-03 -6,11E-03 -1,17E-02 -1,54E-02
96 -4,81E-03 -4,87E-03 -8,67E-03 -1,33E-02 -3,07E-03
120 -2,65E-03 -3,53E-03 -1,22E-02 -1,11E-02 -6,79E-04
144 -1,51E-03 -2,47E-03 -1,63E-02 -8,22E-04 -3,63E-03
126 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
t ensayo 16 ensayo 17 ensayo 18 ensayo 19 ensayo 20
0 -7,58E-02 -1,17E-02 -2,83E-02 -1,09E-01 -3,86E-02
24 -1,87E-02 -1,40E-02 -6,07E-02 -1,65E-02 -5,41E-02
48 -1,18E-02 -1,42E-02 -4,70E-02 -4,80E-02 -2,99E-02
72 -1,27E-02 -1,30E-02 -2,26E-03 -2,89E-03 -8,36E-03
96 -4,46E-03 -1,06E-02 -1,24E-03 -3,74E-04 -5,49E-03
120 -5,14E-03 -7,33E-03 -3,09E-03 -4,32E-04 -3,53E-03
144 -1,70E-02 -3,15E-03 -1,64E-02 -4,86E-05 -2,08E-03
D-3 dn/dt
t ensayo 1 ensayo 2 ensayo 3 ensayo 4 ensayo 5
0 -7,00E-03 -4,81E-03 -1,06E-02 -2,84E-02 -7,00E-03
24 -2,64E-13 -2,48E-03 -4,62E-03 -2,68E-03 -2,64E-13
48 -9,98E-24 -1,09E-03 -1,80E-03 -1,08E-03 -9,98E-24
72 -3,77E-34 -3,05E-04 -1,06E-03 -1,17E-03 -3,77E-34
96 -1,42E-44 -1,94E+00 -1,32E-03 -1,69E-03 -1,42E-44
120 -5,37E-55 -1,61E-04 -1,52E-03 -2,36E-03 -5,37E-55
144 -2,03E-65 -6,85E-04 -6,03E-04 -3,09E-03 -2,03E-65
t ensayo 6 ensayo 7 ensayo 8 ensayo 9 ensayo 10
0 -1,71E-02 -3,85E-01 -2,95E-02 -7,00E-03 -8,93E-02
24 -2,88E-03 -6,57E-03 -2,88E-03 -2,64E-13 -1,31E-03
48 -3,30E-04 -2,90E-03 -5,12E-04 -9,98E-24 -7,81E-04
72 -1,82E-04 -9,46E-04 -9,43E-05 -3,77E-34 -3,75E-04
96 -6,38E-04 -4,61E-05 -2,14E-04 -1,42E-44 -3,31E-05
120 -1,75E-05 -1,02E-04 -5,46E-04 -5,37E-55 -2,16E-04
144 -4,13E-04 -1,11E-03 -9,75E-04 -2,03E-65 -1,97E-04
F. Anexo : Balance estequiométrico intracelular 127
t ensayo 11 ensayo 12 ensayo 13 ensayo 14 ensayo 15
0 -2,73E-01 -3,57E-02 -7,00E-03 -8,49E-03 -2,37E-02
24 -2,83E-04 -4,71E-03 -2,64E-13 -1,07E-03 -4,08E-03
48 -4,83E-04 -1,51E-03 -9,98E-24 -3,07E-04 -4,45E-04
72 -6,59E-04 -4,23E-04 -3,77E-34 -1,02E-03 -4,00E-04
96 -7,18E-04 -1,36E-04 -1,42E-44 -7,52E-04 -8,10E-04
120 -6,38E-04 -3,20E-04 -5,37E-55 -2,87E-04 -7,87E+00
144 -4,03E-04 -8,47E-04 -2,03E-65 -1,15E-03 -2,01E-03
t ensayo 16 ensayo 17 ensayo 18 ensayo 19 ensayo 20
0 -3,07E-02 -7,00E-03 -1,06E-02 -2,35E-02 -3,28E-02
24 -7,07E-03 -2,64E-13 -2,58E-03 -3,77E-03 -9,06E-04
48 -1,52E-03 -9,98E-24 -8,81E-04 -9,35E-04 -1,10E-03
72 -2,32E-03 -3,77E-34 -2,19E-03 -4,62E-03 -1,11E-03
96 -1,30E-03 -1,42E-44 -9,55E-05 -9,69E-05 -1,02E-03
120 -8,32E-04 -5,37E-55 -3,16E-04 -5,37E-04 -8,49E-04
144 -9,24E+05 -2,03E-65 -7,81E-04 -6,63E-04 -6,08E-04
D-4 dp/dt
t ensayo 1 ensayo 2 ensayo 3 ensayo 4 ensayo 5
0 0,35649 0,33547 0,30118 0,30235 0,35059
24 0,07434 0,07953 0,07638 0,08081 0,05978
48 0,02090 -0,01511 -0,00561 -0,00167 -0,02179
72 0,00510 -0,01128 -0,00132 0,00003 -0,00677
96 0,00877 0,02817 0,03270 0,03103 -0,00779
120 0,02490 0,04041 0,03995 0,03646 0,00000
144 0,04986 -0,03741 -0,03612 -0,03855 0,00000
t ensayo 6 ensayo 7 ensayo 8 ensayo 9 ensayo 10
0 0,42288 0,32523 0,39525 -0,02820 0,00000
24 0,04653 0,06266 0,03135 0,06564 0,10374
48 0,01378 -0,00523 -0,00563 0,14585 0,09152
72 0,01491 -0,00454 0,02455 0,03286 -0,03667
96 -0,00015 -0,00040 0,00640 -0,00056 0,00000
120 0,00443 0,00303 -0,03138 -0,01042 0,00000
144 -0,02337 0,06253 0,08417 -0,00921 0,00000
128 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
t ensayo 11 ensayo 12 ensayo 13 ensayo 14 ensayo 15
0 0,000000 0,000000 0,474264 3,04E-52 0,45562
24 0,108279 0,086560 0,065678 8,04E-42 0,03916
48 0,073133 0,051907 -0,032847 2,13E-31 -0,01986
72 0,033441 0,019807 -0,019805 5,64E-21 0,00381
96 0,002392 -0,002211 -0,004112 1,49E-10 0,00388
120 -0,014902 -0,012328 0,004153 3,96E+00 -0,01147
144 -0,015822 -0,010149 -0,029586 0,00E+00 0,02640
t ensayo 16 ensayo 17 ensayo 18 ensayo 19 ensayo 20
0 0,37671 0,00000 -0,02563 -0,12718 0
24 0,06630 0,09109 0,07576 0,03973 0
48 -0,01063 0,06567 0,10589 0,00895 0
72 -0,00618 0,02195 0,00201 0,06766 0
96 -0,00105 -0,00501 0,00571 0,01945 0
120 -0,00619 0,00503 0,01653 -0,00969 0
144 0,03775 0,06574 0,02983 0,02556 0
E. Anexo: Balance estequiométrico
𝑞𝐶𝐻2𝑂𝐶𝐻2𝑂 + 𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4 + 𝑞𝑂2𝑂2 → 𝑞𝐶𝐻1.70𝑂0.58𝑁0.15𝐶𝐻1.70𝑂0.58𝑁0.15 + 𝑞𝐶𝑂2𝐶𝑂2 + 𝑞𝐻2𝑂𝐻2𝑂
sacarosa X O2 (NH4)2HPO4 CO2 H2O
C 1 1 0 0 1 0
H 2 1.7 0 9 0 2
O 1 0.58 2 4 2 1
N 0 0.15 0 2 0 0
Variables medidas (𝐸𝑚𝑞𝑚) : sacarosa, fosfato de amonio, biomasa
Variables calculadas (𝐸𝑐𝑞𝑐) oxigeno, dióxido de carbono, agua
𝐸𝑚𝑞𝑚 + 𝐸𝑐𝑞𝑐 = 0 → 𝑞𝑐 = −𝐸𝑐−1 𝐸𝑚 𝑞𝑚
(
1210
0942
11.70.580.15
) . (
𝑞𝐶𝐻2𝑂𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4
𝑞𝑥) + (
0020
1 020
0210
) . (
𝑞𝑂2𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂
) =
(
000000)
(
𝑞𝑂2𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂
) = −(
0020
1 020
0210
)
−1
(
1210
0942
11.70.580.15
) . (
𝑞𝐶𝐻2𝑂𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4
𝑞𝑥)
(
𝑞𝑂2𝑞𝑥𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂
) = −(
0020
11.70.580.15
1020
0210
)
−1
(
1210
0942
) (𝑞𝐶𝐻2𝑂
𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4)
(𝑞𝐶𝐻2𝑂
𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4) = (
−0.025−0.052
)
(
0020
1 020
0210
)
−1
= (
−1010
−0.25000.5
0.5000
7.576.67−6.67−5.67
)
(
𝑞𝑂2𝑞𝑥𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂
) = −(
−1010
−0.25000.5
0.5000
7.576.67−6.67−5.67
)(
1210
0942
) (−0.025−0.052
)
(
𝑞𝑂2𝑞𝑥𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂
) = (
0.74890.6933−0.6683−0.3303
)
F. Anexo: Balance estequiométrico intracelular
Ecuaciones estequiométricas
Fosforilación de glucosa
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑇𝑃𝑞→ 𝐺6𝑃 Ecuación 19
Ya que una pequeña parte de G6P entra a la ruta de pentosa fosfato se tiene
𝐺6𝑃 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝑟𝑔𝑟→ 𝑅5𝑃 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 Ecuación 20
𝑅5𝑃𝑟𝐵1→ 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 Ecuación 21
𝑟𝐵1 = 𝜇𝐾𝐵1 Ecuación 22
El resto de G6P entra a la ruta de glicolisis para formar piruvato
𝐺6𝑃 + 3𝐴𝐷𝑃 + 2𝑁𝐴𝐷 𝑟𝐺6𝑃→ 2 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 3𝐴𝑇𝑃 + 2𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 23
Piruvato es oxidado a acetyl-CoA
𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷 𝑟𝐴𝑐→ 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 +𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 24
En el ciclo TCA, acetyl-CoA es principalmente consumido en las siguientes dos rutas7
𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 + 𝐴𝐷𝑃 + 4𝑁𝐴𝐷𝑟𝑇𝐶𝐶→ 2𝐶𝑂2 + 𝐴𝑇𝑃 + 4𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 25
132 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴𝑟𝐵2→ 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 Ecuación 26
𝑟𝐵2 = 𝜇𝐾𝐵2 Ecuación 27
ATP adiciona es producido en la cadena de respiración(E. Smith et al., 1983)
1 2⁄ 𝑂2 +𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝑃 𝑂⁄ 𝐴𝐷𝑃 𝑟𝑂2→ 𝑃 𝑂⁄ 𝐴𝑇𝑃 Ecuación 28
El consumo de energía en forma de ATP es asumida principalmente para crecimiento
celular y mantenimiento(S. Pirt, 1965)
𝑟𝐵2 =𝜇
𝑌𝐴𝑇𝑃+ 𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 29
𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1 = 𝑞𝑠 Ecuación 30
Balance de carbono de las ecuaciones Ecuación 21 a Ecuación 23
𝑟𝑔𝑟 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4𝑟𝑇𝐶𝐶 = 2𝑟𝑂2 Ecuación 31
La primera parte de la Ecuación 31 corresponde a la producción de NAD y la segunda
corresponde a NADH tomando 𝑟𝑔𝑟 = 𝑟𝐵1 = 𝜇𝐾𝐵1 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 = 𝑟𝐴𝑐 − 𝑟𝐵2 = 𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2,
sustituyendo 𝑟𝑔𝑟 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 por 𝜇𝐾𝐵1 y (𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2), se obtiene la expresión
𝜇𝐾𝐵1 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4(𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2) = 2𝑟𝑂2 Ecuación 32
La producción de ATP está dada por
3𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝑇𝐶𝐶 + 2𝑃 𝑂𝑟𝑂2⁄ = 𝑞𝑠 + 𝜇 𝑌𝐴𝑇𝑃⁄ +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 33
F. Anexo : Balance estequiométrico intracelular 133
Sustituyendo 𝑞𝑠 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 con (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) y (𝑟𝐴𝑐 + 𝜇𝐾𝐵2)
3𝑟𝐺6𝑃 + (𝑟𝐴𝑐 + 𝜇𝐾𝐵2) + 2𝑃 𝑂𝑟𝑂2⁄ = (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) + 𝜇 𝑌𝐴𝑇𝑃⁄ +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 34
F. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 134
G. Anexo: Análisis de sensibilidad del modelo
Modelo 1
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,24 -0,02 0,18 -0,26 0,23 1,34 -5,68 -0,01 0,14 0,02 0,67 0,14 0,01 0,04 0,55 1,50 -0,07 -0,33 2,05 1,77
m1 0,02 0,00 0,01 -0,03 0,00 0,08 -0,66 0,00 0,00 0,00 0,44 0,02 -0,01 0,00 0,13 0,31 -0,01 -0,06 0,45 0,34
m2 0,01 0,00 0,00 -0,02 0,00 0,06 -0,26 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,09 0,23 0,00 -0,01 0,07 0,05
μmax 5,31 0,00 1,03 -0,48 111,36 1,58 -5,68 199,87 52,73 -156,08 0,71 742,06 -0,02 0,16 0,62 1,87 -0,14 -0,20 2,13 1,85
ks 6,73 -0,27 1,62 0,19 1129,95 0,22 0,00 3327,94 531,28 12340,13 0,12 6935,95 -0,02 16,99 -0,01 0,17 0,48 -0,24 0,01 0,10
μpmax 1,79 0,00 2,10 3,89 0,51 0,74 -313 0,00 0,68 0,52 10,55 0,48
-
45,37 2,12 0,37 8,89 12,66 -0,02 1,06 0,89
H. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 135
Modelo 2
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,0014 0,0199 0,0341 0,0001 0,0044 0,0322 0,0000 0,8700 0,0000 0,0337 1,2579 0,6392 0,0526 0,0000 0,0538 0,0512 0,0000 0,0123 0,0303 0,0168
m1 0,0002 0,0027 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1452 0,0000 0,0000 0,9414 0,2310 0,0000 0,0044 0,0036 0,0002 0,0000 0,0021 0,0029 0,0009
m2 0,0000 0,0022 0,0000 0,0000 0,0000 0,0004 0,0007 0,0397 0,0000 0,0000 0,1009 0,0394 0,0000 0,0201 0,0016 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0009
μmax 0,0425 0,1106 0,3073 0,0414 0,0647 0,3074 0,0459 0,8976 0,0122 0,0000 1,4090 0,7455 0,1408 0,1662 0,2132 0,1481 0,0062 0,0868 0,0948 0,0444
ks 0,4763 0,5756 1,8644 0,2294 1,3730 2,1876 0,3507 0,0000 1,0505 1,1177 0,1698 0,0651 1,0143 3,8178 0,3172 0,1985 1,5134 0,7637 0,6601 0,6567
kn 0,5716 0,5265 1,0735 0,6465 0,5722 0,9612 0,3498 0,0000 0,5278 1,0535 0,0000 0,0000 0,3264 0,4093 0,4210 0,3476 1,5040 0,6944 0,3674 0,3887
μpmax 0,8554 0,9889 1,4886 0,4864 1,3862 1,1559 0,6509 5,5795 0,9878 1,1702 5,4954 0,1410 2,7394 0,3330 0,8348 0,7894 0,8532 0,8770 0,9621 0,9060
Modelo 3
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,736 0,835 0,000 0,000 0,307 0,000 0,065 0,000 0,504 0,000 0,092 0,838 0,000 0,482 0,000 0,820 0,062 0,000 0,000 0,895
m1 0,259 0,241 0,660 0,004 0,282 0,000 0,000 0,143 0,535 0,429 0,072 0,883 0,001 0,486 0,366 0,437 0,403 0,064 0,004 0,162
m2 0,000 0,216 0,324 0,000 0,362 0,009 0,001 0,279 0,000 0,708 0,000 0,330 0,000 0,606 0,366 0,244 0,467 0,207 0,000 0,020
μmax 1,021 1,055 0,062 0,085 0,624 0,096 0,408 0,393 0,896 0,281 0,490 1,068 0,352 0,582 0,209 0,987 0,000 0,300 0,085 1,130
ks 0,975 0,993 1,033 0,960 0,729 0,746 0,772 0,433 0,892 0,990 0,000 0,807 0,788 0,000 0,366 0,953 0,767 0,656 0,593 0,993
n 1,427 1,479 1,169 1,238 1,198 1,240 1,425 1,058 1,984 0,615 1,197 1,458 1,096 1,361 1,085 1,545 1,424 1,122 1,478 1,519
μpmax 0,976 0,994 0,994 0,948 0,885 0,942 0,951 0,731 0,999 0,999 0,715 0,979 0,916 0,647 0,845 0,983 0,905 0,928 0,914 0,999
136 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
Modelo 4
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,044 0,285 0,266 0,228 0,372 0,186 0,194 0,190 0,275 0,106 0,236 0,100 0,396 0,377 0,173 0,432 0,220 0,169 0,184 0,225
m1 0,000 0,034 0,039 0,000 0,000 0,087 0,030 0,052 0,117 0,000 0,200 0,076 0,121 0,092 0,302 0,086 0,045 0,065 0,092 0,076
m2 0,001 0,014 0,009 0,000 0,000 0,103 0,050 0,082 0,000 0,000 0,000 0,063 0,143 0,352 0,315 0,273 0,000 0,079 0,000 0,000
μmax 0,921 1,086 1,112 1,080 1,135 0,738 0,880 0,812 0,891 0,344 0,828 0,353 1,059 0,848 1,115 1,039 1,098 0,754 1,110 1,106
ks 4,020 1,022 0,964 1,022 0,981 0,905 0,970 0,950 0,951 1,003 0,894 0,437 1,017 1,149 0,961 0,972 0,987 0,947 0,987 0,987
Kn 1,282 1,015 0,999 1,000 0,969 1,371 1,083 1,115 1,000 1,000 1,000 1,000 0,996 0,978 0,998 0,991 0,993 1,155 0,993 0,982
ki 1,629 1,054 1,047 0,932 1,078 0,854 0,927 0,888 0,916 0,366 0,894 0,584 1,012 1,166 1,052 1,019 1,062 0,874 1,071 1,066
μpmax 0,536 1,006 1,002 1,010 1,061 0,998 0,990 0,989 0,923 1,009 0,835 0,198 1,270 0,771 1,076 1,570 1,052 0,987 1,017 1,258
Modelo 5
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,242 0,272 0,232 0,277 0,433 0,053 0,198 0,200 0,290 0,034 0,091 0,353 0,739 0,392 0,529 0,515 0,229 0,159 0,191 0,229
m1 0,021 0,016 0,011 0,027 0,000 0,000 0,069 0,106 0,078 0,000 0,102 0,131 0,147 0,119 0,198 0,117 0,068 0,101 0,191 0,176
m2 0,006 0,008 0,005 0,011 0,000 0,014 0,050 0,082 0,000 0,000 0,000 0,018 0,032 0,452 0,109 0,080 0,000 0,079 0,000 0,000
μmax 2,879 0,993 0,600 1,142 1,135 0,000 0,871 0,792 0,796 0,000 0,101 0,390 1,489 0,844 0,856 0,965 1,088 0,751 1,086 1,086
ks 3,673 1,038 0,689 1,032 0,944 0,905 0,973 0,957 0,876 3,554 0,722 0,459 1,016 1,162 1,018 0,924 0,991 0,957 1,005 1,004
μpmax 1,845 2,795 2,104 1,043 0,000 2,002 0,990 0,989 0,830 0,712 0,975 0,423 2,322 0,772 1,076 1,875 1,052 0,988 1,017 1,258
H. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 137
Modelo 6
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,350 0,275 0,404 1,026 0,194 0,996 0,998 0,999 0,343 0,034 2,721 0,800 0,691 0,604 0,740 0,730 0,559 0,738 0,993 0,574
m1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,014 0,063 0,120 0,116 0,000 2,117 0,268 0,132 0,080 0,074 0,063 0,036 0,160 0,202 0,127
m2 0,163 0,024 0,107 0,000 0,003 0,000 0,000 0,000 0,013 0,000 0,233 0,045 0,000 0,721 0,000 0,000 0,000 0,075 0,033 0,028
μmax 0,475 0,333 0,576 1,178 0,251 1,113 1,143 1,182 0,439 0,000 2,811 1,496 0,737 0,601 0,681 0,680 0,554 1,097 1,134 0,712
ks 0,331 0,175 0,255 0,969 1,397 0,992 0,990 0,986 0,337 0,989 0,000 1,163 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,178 0,821 0,000
Kn 0,633 0,797 0,295 1,024 0,967 1,014 1,017 1,024 0,140 1,103 1,415 0,873 0,809 1,158 1,097 0,934 0,822 0,517 1,147 0,986
ki 0,771 2,398 0,534 0,994 4,340 1,000 1,000 1,000 4,305 1,257 0,591 0,986 0,839 0,773 0,841 0,864 0,916 0,247 1,001 0,978
μpmax 0,350 0,275 0,404 1,026 0,194 0,996 0,998 0,999 0,343 0,034 2,721 0,800 0,691 0,604 0,740 0,730 0,559 0,738 0,993 0,574
Modelo 7
Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
kd 0,221 0,001 0,680 0,132 0,268 0,199 0,071 0,328 0,073 0,034 0,090 0,070 0,033 0,170 0,150 0,303 0,029 0,079 0,295 0,106
m1 0,023 0,000 0,000 0,011 0,013 0,000 0,000 0,037 0,000 0,000 0,021 0,026 0,000 0,020 0,129 0,053 0,003 0,000 0,052 0,096
m2 0,007 0,000 0,509 0,004 0,000 0,007 0,002 0,010 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,269 0,046 0,040 0,001 0,001 0,010 0,031
μmax 0,499 0,018 0,807 0,178 0,687 0,217 0,079 0,259 0,978 0,000 1,030 1,858 0,008 0,991 0,802 0,332 0,049 0,028 0,315 1,065
ks 2,521 0,001 0,965 1,470 0,489 3,231 2,480 1,522 0,870 1,090 1,843 0,476 2,346 1,146 9,616 0,531 0,382 1,244 0,984 0,945
138 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación
sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum
μpmax 0,765 0,000 0,601 1,070 0,172 1,010 0,675 2,547 0,904 1,187 0,003 0,000 0,869 1,025 0,217 0,769 0,907 0,945 2,843 1,020