modificação de linhagens industriais de saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade...
TRANSCRIPT
![Page 1: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/1.jpg)
Modificação de linhagens Modificação de linhagens industriais de industriais de
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae para o aumento da para o aumento da
produtividade de álcool e produtividade de álcool e floculação condicionalfloculação condicional
Silvia Kazue MissawaSilvia Kazue Missawa
Orientador: ProfOrientador: Profoo Dr Gonçalo Amarante Guimarães Dr Gonçalo Amarante Guimarães PereiraPereira
![Page 2: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/2.jpg)
IntroduçãoIntrodução
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiaeUtilizado processo fermentativoUtilizado processo fermentativo EtanolEtanol CachaçaCachaça CervejaCerveja VinhoVinhoO que é fermentação??O que é fermentação??
![Page 3: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/3.jpg)
Vias Vias MetabólicasMetabólicas
GLICÓLISEGLICÓLISE
FERMENTAÇÃOFERMENTAÇÃO
RESPIRAÇÃORESPIRAÇÃO
(Schüller, 2003)
![Page 4: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/4.jpg)
Processo Fermentativo Processo Fermentativo IndustrialIndustrial
(Meleiro & Maciel-Filho, 2000)
![Page 5: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/5.jpg)
Genes FloculaçãoGenes Floculação
Proteína de membranaProteína de membranaFLO1 e FLO5: agregados são FLO1 e FLO5: agregados são
reprimidos por manosereprimidos por manoseFLO10: agregados são reprimidos na FLO10: agregados são reprimidos na
presença de açucares (maltose, presença de açucares (maltose, sacarose e glicose)sacarose e glicose)
![Page 6: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/6.jpg)
Processo FloculaçãoProcesso Floculação
![Page 7: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/7.jpg)
FloculaçãoFloculação
[ ] cálcio [ ] cálcio [ ] etanol[ ] etanolnutrientesnutrientestemperatura temperatura pHpHatividade mitocondrialatividade mitocondrial
![Page 8: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/8.jpg)
Atividade MitocondrialAtividade Mitocondrial
Deficiência genoma da mitocôndria Deficiência genoma da mitocôndria Altera características da superfície Altera características da superfície
da célulada célulaPET191 - PET191 - gene nuclear gene nuclear (Hutter &Oliver, (Hutter &Oliver,
1998)1998)montagem subunidades citocromo montagem subunidades citocromo
C oxidaseC oxidaseRompimento Rompimento PET191 – PET191 – aumento na aumento na
produção de etanol (43%)produção de etanol (43%)
![Page 9: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/9.jpg)
CONTROL OF CONTROL OF SACCHAROMYCES CEREVISIAESACCHAROMYCES CEREVISIAE FLOCCULATION BY SUGAR FOR INDUSTRIAL FLOCCULATION BY SUGAR FOR INDUSTRIAL
ETHANOL PRODUCTIONETHANOL PRODUCTION Cunha, A.F. Cunha, A.F. 11 , Missawa, S.K. , Missawa, S.K.11 , Gomes, L.H. , Gomes, L.H.22, Reis, S. F., Reis, S. F.33 and Pereira, G.A.G. and Pereira, G.A.G. 11
(1(1) ) Laboratório de Genômica e Expressão - Departamento de Genética e Laboratório de Genômica e Expressão - Departamento de Genética e Evolução Instituto de Biologia –Universidade Estadual de Campinas - Evolução Instituto de Biologia –Universidade Estadual de Campinas - Campinas – São Paulo – BrazilCampinas – São Paulo – Brazil
(2) Universidade de São Paulo – ESALQ – Laboratório de Genética de (2) Universidade de São Paulo – ESALQ – Laboratório de Genética de Leveduras –Piracicaba, SPLeveduras –Piracicaba, SP
(3) Departamento de Parasitologia - Instituto de Biologia - Universidade (3) Departamento de Parasitologia - Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas – Campinas - São Paulo – BrazilEstadual de Campinas – Campinas - São Paulo – Brazil
Submitted to: FEMS YEAST RESEARCHSubmitted to: FEMS YEAST RESEARCH
![Page 10: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/10.jpg)
Objetivos ArtigoObjetivos Artigo
Floculantes condicionaisFloculantes condicionaisProcesso pedido patente Processo pedido patente
(INPI n(INPI no o 0001122)0001122)Transferir a tecnologia para indústriaTransferir a tecnologia para indústria
Engenharia genéticaEngenharia genéticaUso promotor forte e condicionalUso promotor forte e condicional
![Page 11: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/11.jpg)
Construção com o promotor Construção com o promotor MoxBBMoxBB
![Page 12: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/12.jpg)
Northern blotNorthern blot
![Page 13: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/14.jpg)
Construção com o promotor Construção com o promotor ADH2ADH2
![Page 15: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/15.jpg)
Transformação de linhagem industrialTransformação de linhagem industrial
![Page 16: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/16.jpg)
ProblemasProblemas
Desfloculação dos agregados do Desfloculação dos agregados do gene gene FLO5FLO5
Floculação antecipada na linhagem Floculação antecipada na linhagem industrialindustrial
![Page 17: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/17.jpg)
ObjetivosObjetivos
Avaliar o gene Avaliar o gene FLO10FLO10Analisar crescimento das células e Analisar crescimento das células e
produtividade de etanol em produtividade de etanol em linhagens de laboratório e industriaislinhagens de laboratório e industriais
Deletar o gene Deletar o gene PET191PET191 para para aumentar a produtividade de etanolaumentar a produtividade de etanol
![Page 18: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/18.jpg)
Materiais e MétodosMateriais e Métodos
Linhagens S. cerevisiae:Linhagens S. cerevisiae: W303-1a, JD7-7C, HD9315bW303-1a, JD7-7C, HD9315b Pedra2, Fleishman, UvarumPedra2, Fleishman, Uvarum
PlasmídeosPlasmídeos YEp352-FLO5, pYADE4, pYADE4-YEp352-FLO5, pYADE4, pYADE4-
FLO5FLO5
![Page 19: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/19.jpg)
Amplificação e Clonagem do Amplificação e Clonagem do gene gene FLO10FLO10
Amplificação por PCRAmplificação por PCRClonagem em P-gem (Promega)Clonagem em P-gem (Promega)DigestãoDigestãoClonagem no pYADE4Clonagem no pYADE4
![Page 20: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/20.jpg)
Extração de RNA e Northern BlotExtração de RNA e Northern BlotTestes Floculação: Tempo de Testes Floculação: Tempo de
sedimentaçãosedimentação Isolamento e caracterização de Isolamento e caracterização de
linhagens selvagens: RAPDlinhagens selvagens: RAPDTeste produtividade: Cromatógrafo a Teste produtividade: Cromatógrafo a
gás, ou destilação e desimetriagás, ou destilação e desimetria
![Page 21: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/21.jpg)
Resultados ParciaisResultados Parciais
Amplificação do gene Flo10 Amplificação do gene Flo10 FLO10BamF 5´ CGCFLO10BamF 5´ CGCGGATCCGGATCCATGCCTGTGGCTGCTCG 3´ATGCCTGTGGCTGCTCG 3´ FLO10SalR 5´ ACGCFLO10SalR 5´ ACGCGTCGACGTCGACCTATTAAACGATTG CCAG 3´. CTATTAAACGATTG CCAG 3´.
Clonagem do gene Flo10 em PgemClonagem do gene Flo10 em Pgemhind FLO10
3,5KB
hind FLO10
3,5KB4361
23222027
564
bp
λ hind 1 2 3
(1) SalI (3 e 3,5Kb)
(2) BamHI/SalI (3 e 3,5Kb)
(3) ScaI/SalI (1,1; 1,5; 1,8; 2,0Kb)
![Page 22: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/22.jpg)
pYADE4-FLO10
FLO10PromotorADH2
pGEM-FLO10BamH I
FLO10
Sal I
pYADE4BamH I Sal I
Promotor ADH2
Construção do pYADE4-Construção do pYADE4-FLO10FLO10
![Page 23: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/23.jpg)
Extração RNA e NorthernExtração RNA e Northern
0 20 40 0 20 40
pYADE4pYADE4 -FLO10
Tempo (horas)
Concentração de glicose (%) 4 1 0 4 1 0
A
B
0 20 40 0 20 40
pYADE4pYADE4 -FLO10
Tempo (horas)
Concentração de glicose (%) 4 1 0 4 1 0
A
B
![Page 24: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/24.jpg)
Seleção por canavanina emSeleção por canavanina em linhagens industriais linhagens industriais
Célula cresceCAN1canavanina
arginina
Permease da arginina
XX
CAN1
canavanina
arginina Célula não cresce
XXXX Célula cresceCAN1
canavanina
arginina
Permease da arginina
XX
CAN1
canavanina
arginina Célula não cresce
XXXX
![Page 25: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/25.jpg)
Cassete integrativoCassete integrativo
pYADE4-FLO10
ATGFLO10ADH2
Promoter FLO10CAN1
CAN1ADH2
ATGADH2
PromoterCAN1’ CAN1’’
CAN1(Genomic Locus)
+ 205 + 1467
4361
2322
λ hind
3,7 kb
pb
4361
2322
λ hind
3,7 kb
pb
![Page 26: Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa](https://reader036.vdocuments.pub/reader036/viewer/2022062502/5706386b1a28abb823905025/html5/thumbnails/26.jpg)
Próximas EtapasPróximas Etapas
Clonar o gene Clonar o gene FLO10 FLO10 com seu com seu próprio promotorpróprio promotor
Transformação de linhagens Transformação de linhagens industriais com cassete integrativoindustriais com cassete integrativo
Desenvolver estratégia de Desenvolver estratégia de desfloculação (FLO10)desfloculação (FLO10)
Deleção de Deleção de PET191PET191Testes de floculação e produtividadeTestes de floculação e produtividade