modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología alimentaria r. osta
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Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología
alimentaria
R. Osta
Introducción 1/68
Animal transgénico para la Animal transgénico para la Esclerosis Lateral AmiotróficaEsclerosis Lateral Amiotrófica
Definición4/68
¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?
Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural.
(Directiva 90/220/CEE)
6/68
¿Qué vamos a tratar?.¿Qué vamos a tratar?.
- Modificación genética en organismos unicelulares
-Modificación genética en organismos pluricelulares.
- Aplicaciones de esta metodología y clonación.
- Modificación genética en organismos unicelulares
-Modificación genética en organismos pluricelulares.
- Aplicaciones de esta metodología y clonación.
Indice
6/68
Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante
Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante
Modificación de organismos
unicelulares: bacterias y
levaduras.
¿Si vemos un ¿Si vemos un video?video?
Modificación genética en organimso unicelulares
DefiniciónIntroducción2/68
Pero ,¿qué Pero ,¿qué necesitaremos necesitaremos
recordar?recordar?
Introducción 3/68
Estructura de un gen
PROMOTOR
RNA (cDNA)
IntronesExones
PROTEÍNA
5/68
Recombinación Recombinación homólogahomóloga
Al azarAl azar
TRANSGÉNESISTRANSGÉNESIS
Tipos de transgénesis
6/68
GENOMAGENOMA
GENGEN
TRANSGÉNTRANSGÉN
Tipos de transgénesis
6/68
GENGEN
Al azarAl azar
TRANSGÉNTRANSGÉN
ConcatémerosConcatémeros
Gen crucialGen crucial
Zonas metiladasZonas metiladas
Tipos de transgénesis
GENGEN
TRANSGÉNTRANSGÉN
Recombinaciónhomóloga
Recombinaciónhomóloga
TRANSGÉNTRANSGÉN
Tipos de transgénesis
6/68
•Expresión
•Localización de la expresión
•Regulación de la expresión.
•cDNA, DNA genómico.
•Promotor.
•Enhancer, elementos cis y trans.
¿De qué constará el ADN que queremos insertar?
¿De qué constará el ADN que queremos insertar?
Transgénesis al azar
6/68
s1-antitripsina
humana
s1-antitripsina
humana
Promotor-lactoglobulina
bovina
Promotor-lactoglobulina
bovina
Transgén simpleTransgén simple
Transgénesis al azar
¿Por qué no lo ¿Por qué no lo pones en la pones en la
pizarra que nos pizarra que nos enteraremos enteraremos
más?más?
Transgénesis al azar
Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos.
Knock-out: (fuera de combate)Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen.
Términos utilizadosTérminos utilizados
Transgénesis por recombinación homóloga
-Zona homólogas al gen de interés.
-Resistencia a antibióticos/mismo gen:
- Kanamicina (procariotas)- Neomicina (eucariotas)
¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?
Kn
ock-
ou
t
-Opcional:- Gen marcador- Gen de expresión.
Kn
ock-in
Transgénesis por recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
MMGenGen
marcadormarcador
RR
ResistenciaResistencia
Recombinación homólogaRecombinación homóloga
PromotorPromotor
pp DNADNA
Transgénesis por recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
Recombinación homólogaRecombinación homóloga
DNADNADNADNA
MMMMGen Gen
marcadormarcadorGen Gen
marcadormarcador
RRRR
ResistenciaResistenciaResistenciaResistencia
PromotorPromotor
pp
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
Transgénesis por recombinación homóloga
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
Recombinación homólogaRecombinación homóloga
DNADNADNADNA
MMMMGen Gen
marcadormarcadorGen Gen
marcadormarcador
RRRR
ResistenciaResistenciaResistenciaResistencia
PromotorPromotor
pp
Transgénesis por recombinación homóloga
MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN
MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN
Modos de introducción del transgen
DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARESDIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•DIRECTOS•DIRECTOS
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•DIRECTOS•DIRECTOS
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
Esponda, P.C.B.I. y C.S.I.CEsponda, P.C.B.I. y C.S.I.C
ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•DIRECTOS•DIRECTOS
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.
Modos de introducción del transgen
• Partículas de tungsteno u oro Partículas de tungsteno u oro • Descarga con helio.Descarga con helio.
Características:Características:– Capacidad de introducción limitada.Capacidad de introducción limitada.
HA SIDO MUY HA SIDO MUY UTILIZADA EN UTILIZADA EN
PLANTASPLANTAS
Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•DIRECTOS•DIRECTOS
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
• Microinyección en el Microinyección en el pronúcleo masculino.pronúcleo masculino.
• Microinyección en el Microinyección en el citoplasma del huevo.citoplasma del huevo.
Añaden protección al DNA Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)(polilisinas, etc.)
MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN
Modos de introducción del transgen
Modos de introducción del transgen
•Transgen
•Cigotos
•Introducir el transgén en el cigoto
•Desarrollar el embrión
•Construcción al azar.
•Animales donadores.
•Micromanipulador.
• Madres receptoras
¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?
¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?
•Ovulación cíclica y corta (ratón, rata).
– Machos y hembras donadoras
– Hembras receptoras y machos vasectomizados
•Otras especies
– Tratamientos hormales en las hembras.
– Hembras donadoras y receptoras y machos.
¿Como consigo los cigotos?
¿Como consigo los cigotos?
MicromanipuladorMicromanipulador
Modos de introducción del transgen
MicromanipuladorMicromanipulador
Modos de introducción del transgen
MicromanipuladorMicromanipulador
Modos de introducción del transgen
Pronúcleo masculinoPronúcleo masculino
Modos de introducción del transgen
En animales domésticos (sobre
todo en la especie porcina)
es necesario centrifugar el huevo
debido al vitelo.
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
Agrobacteriumtumefaciens con gen de interes
DNA de la planta
Co-cultivo 48 horas22ºC
Formación de callos
Aislamiento de posiblesplantas transformadas
DNA insertadoen el genoma
Pruebas genéticasque permitancontrolar la inserción del gen
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
• CATIÓNICOSCATIÓNICOS– Su carga positiva reacciona con la
negativa del DNA formando un complejo.
• pH SENSIBLE O ANIÓNICOpH SENSIBLE O ANIÓNICO– Mediante una desestabilización por bajo
pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.
LIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMAS
Modos de introducción del transgen
MÉTODOS “IN VITRO”MÉTODOS “IN VITRO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)
MÉTODOS “IN VITRO”MÉTODOS “IN VITRO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)
Las células modificadas Las células modificadas genéticamente deberán genéticamente deberán
ser introducidas ser introducidas posteriormente en el posteriormente en el
embrión u óvuloembrión u óvulo
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
•QUÍMICOS•QUÍMICOS
•FÍSICOS•FÍSICOS
Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio
•Coprecipitación de DNA y calcio Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato).(presencia de fosfato).
•Introducción por endocitosis.Introducción por endocitosis.•Eficiencia de transfección 1% (max. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)10%)
Características:Características:- Pequeña expresión del transgén.- Introducción de varias copias.- No hay toxicidad para las células.
FOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIO
Modos de introducción del transgen
IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO
IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus
- Liposomas
- Bacterias/Virus
- Liposomas
•DIRECTOS•DIRECTOS
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
-
Espermatozoid
es
- Biolística
-
Microinyección
Modos de introducción del transgen
•QUÍMICOS•QUÍMICOS
•FÍSICOS•FÍSICOS
Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio
•FÍSICOS•FÍSICOS ElectroporaciónElectroporación
ELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓN•Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico.
•Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS.
Características:Características:- Mucha muerte celular
- Tendencia a introducir una sola copia. Método de elección para la recombinación homóloga.
Modos de introducción del transgen
¿Cómo consigo un animal
adulto a partir de células en
cultivo?
¿Cómo consigo un animal
adulto a partir de células en
cultivo?
Modos de introducción del transgen
DOS OPCIONESDOS OPCIONES
Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar
un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos.
1
Células transformadas en indiferenciadas:
CLONACIÓN2
Modos de introducción del transgen
Células ES o indiferenciadasCélulas ES o indiferenciadas
SÓLO AISLADAS EN RATÓNSÓLO AISLADAS EN RATÓNModos de introducción del transgen
NUMEROSOS INTENTOS PERO......NUMEROSOS INTENTOS PERO......
Las células ES no se han aislado en otras especies
animales
(Experiencias realizadas en peces)
Modos de introducción del transgen
OTROS CULTIVOS CELULARES:Fibroblastos, Glándula
mamaria, etc.
Clonación de células somáticas
Modos de introducción del transgen
DOLLYDOLLY
Modos de introducción del transgen
DOLLY DOLLY
G0 :
- Baja la transcripción.
- Baja la traducción.
- Condensación de la cromatina
Modos de introducción del transgen
PRODUCCIÓN DE: Millie,
Christa, Alexis, Carrel y Dotcom
Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90
245
725
Modos de introducción del transgen
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
AplicacionesAplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
AplicacionesAplicaciones
linalol linasa
Gen LIS
Sintesis de linalol
Asociado a los componente de aroma afrutado y floral
Aplicaciones
Introducción del Gen LIS en levadura viníca
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
AplicacionesAplicaciones
Aplicaciones
Producción de proteínas recombinantes en organismos
unicelulares
Transformación
Crecimiento secundario
Purificación proteína
Crecimiento a gran escala
Salida al mercado
Biotecnología de corral
- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animalesque nos interesan.
- Producción de proteínas de interés en
sanidad.Ejemplo (ya creado):Tracy
(Roslin Institute - PPL Therapeutics)
Aplicaciones
TRACYTRACY
s1-antitripsinahumana
s1-antitripsinahumana
Promotor-lactoglobulina
ovina
Promotor-lactoglobulina
ovina
Aplicaciones
Primeros ensayos en ratón:
4.3 Kb Promotor
WAP de ratón
6.6 Kb de AAT-humanocDNA
12.5 gr./litroObtienen microlitros
de leche
Volumen/año gr./año Producción vital
8 litros400 litros10.000 l.
0.04 Kg.2 kg. 50 kg
1 Kg.100 kg.
toneladas
ConejaOvejaVaca
Aplicaciones
Roslin Institute-PPL Therapeutics(lo que sabemos......)
s1-antitripsinas1-antitripsina
FibrinógenoFibrinógeno
Factor VII y Proteína CFactor VII y Proteína C
Factor XIFactor XI
BSSL (lipasa)BSSL (lipasa)
Anticuerpos humanizadosAnticuerpos humanizados
Aplicaciones
POLLY: Primer clon transgénicoPOLLY: Primer clon transgénico
Aplicaciones
1. Cambio de características de organismos
utilizados en la producción de alimentos
2.-Producción de sustancias terapéuticas en
- Organismos unicelulares.
- Biotecnología de corral.
3.Nuevos alimentos
- Cambio cuantitativo
- Cambio cualitativo
Aplicaciones
AplicacionesAplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cuantitativas
- Muchos intentos realizados.
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en
alimentación.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentos
REINO VEGETAL
Aplicaciones
Aplicaciones
Ejemplo (ya creado):Un Salmón (Aqua Bounty Farms):
- Promotor: AFP (proteína anticongelación)- cDNA: Hormona del crecimiento.
LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!
Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cualitativas
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en
alimentación.
Reino vegetal: la mayoría de los alimentos.Reino animal: Proyectos de creación.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal
- Transgénicos clásicos.
- Animales y plantas usados en
alimentación.
- Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt.
- Tolerancia a los herbicidas 54% - Resistencia a insectos (Bt) 37%
- Resistencia vírica 14% - Rasgos cualitativos >1%
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal
- Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor.- RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)
- Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada.
Aplicaciones
Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal
Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro).
- Maíz Bt:Muchisima presion social.
Aplicaciones
¿Qué es un alimento transgénico?
-Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt...
- Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc.
- Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante)
- Animales tratados con proteínas recombinantes...
- Animales alimentados con alimentos transgénicos
Aplicaciones