modifikasi teknik kromatografi kolom untuk … · dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih...
TRANSCRIPT
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK Pandanus
conoideus Lamk VARIAN BUAH KUNING
Disusun Oleh:
KURNIA DYAH SUGESTI
M0305041
SKRIPSI
Ditulis dan Diajukan untuk memenuhi sebagian
persyaratan mendapatkan gelar sarjana Sains Kimia
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
ALAM
UNVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
Oktober, 2010
i
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
HALAMAN PENGESAHAN
Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sebelas Maret Surakarta Telah Mengesahkan Skripsi Mahasiswa:
Kurnia Dyah Sugesti M 0305041, dengan judul ”Modifikasi Teknik
Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Pandanus
conoideus Lamk Varian Buah Kuning”
Skripsi ini dibimbing oleh:
Pembimbing I
Dr.rer.nat Fajar Rakhman W,M.Si
NIP 19730605 200003 1001
Pembimbing II
M. Widyo Wartono, M.Si
NIP 19760822 200501 1001
Dipertahankan di depan Tim Penguji Skripsi pada:
Hari : Kamis
Tanggal : 07 Oktober 2010
Anggota Tim Penguji:
1. Dra. Tri Martini, M.Si 1.............................
NIP 19581029 198503 2002
2. Yuniawan Hidayat, M.Si 2. .............................
NIP 19790605 200501 1001
Disahkan Oleh
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Sebelas Maret Surakarta
Ketua Jurusan Kimia,
Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D. NIP 19560507 198601 1001
ii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul
”MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN
TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK PANDANUS CONOIDEUS LAMK VARIAN
BUAH KUNING” adalah benar-benar hasil penelitian sendiri dan tidak terdapat
karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu
perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat kerja atau
pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara
tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Surakarta, Oktober 2010
Kurnia Dyah Sugesti
iii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
MODIFIKASI TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK PEMISAHAN TRIGLISERIDA DARI EKSTRAK (Pandanus conoideus
Lamk) VARIAN BUAH KUNING
KURNIA DYAH SUGESTI Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Sebelas Maret
ABSTRAK
Buah kuning merupakan salah satu varian dari Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk). Perbedaan utama dari ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah adalah kadar asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya dimana dalam ekstrak buah merah mempunyai kadar yang lebih banyak daripada ekstrak buah kuning. Pada penelitian ini telah dilakukan pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning dengan modifikasi teknik kromatografi kolom. Modifikasi dilakukan dengan menambahkan alumina basa dan agen pengoksidasi berupa MnO2 kedalam fasa diam silika gel. Elusi dilakukan dengan menggunakan fasa gerak petroleum eter dan dietil eter. Fraksi yang dihasilkan kemudian diidentifikasi dengan menggunakan IR dan GC-MS.
Pemisahan menggunakan fasa diam silika gel-alumina (2:3) dengan penambahan MnO2 3% menghasilkan 3 fraksi. Spektra FT-IR dari fraksi pertama menunjukkan adanya serapan yang khas untuk beberapa gugus fungsi yaitu ester dari trigliserida dan alkana rantai panjang. Spektra GC-MS menunjukkan metil ester dari asam lemak yaitu asam oleat, palmitat, dan stearat serta teridentifikasi senyawa 1-0-oktadekanoil-1,2-etanadiol dan glikol-1-palmitat yang merupakan produk tak sempurna dari oksidasi trigliseridanya. Komponen trigliserida telah terpisah dari senyawa lain dalam ekstrak buah seperti β-karoten dan tokoferol. Kedua senyawa tersebut merupakan antioksidan yang dapat mencegah oksidasi asam lemak tak jenuh. Dari hasil analisis, diketahui bahwa trigliserida dapat dipisahkan dari senyawa yang lain dengan modifikasi teknik kromatografi kolom tanpa merusak senyawa tersebut karena keberadaan senyawa antioksidan dapat melindungi trigliserida dari reaksi oksidasi.
Kata kunci: Buah kuning, modifikasi kromatografi kolom, trigliserida, senyawa antioksidan, auto-oksidasi.
iv
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
MODIFICATION OF COLUMN CHROMATOGRAPHY TECHNIQUE FOR TRIGLYCERIDES SEPARATION FROM Pandanus conoideus
LAMK VARIANT YELLOW FRUIT
KURNIA DYAH SUGESTI Department of Chemistry, Faculty of Mathematic and Sciences
Sebelas Maret University
ABSTRACT Yellow fruit is one variant of Pandanus conoideus Lamk. The main
different of yellow and red fruit extract is the concentration of unsaturated fatty acid and antioxidant agent where the red fruit much higher than yellow fruit. Triglycerides separated from yellow fruit extract using modification of column chromatography was done. The modification was done by an addition of basisch alumina and oxidizing agent that is MnO2 into stationary phase. Fractions was obtained from separation then determined by IR and GC-MS.
Separation used stationary phase of silica gel-alumina(2:3) by an addition MnO2 3% result 3 fractions. Spectra IR from the first fraction showed the presence of several characteristic functional groups, that is ester from triglycerides and long chain alkane. GC-MS spectrum showed metyl ester from triglycerides such as oleic acid palmitate acid, and stearate acid also new compound was identified as 1-0-octadecanoyl-1,2-ethanediol and glycol-1-palmitate which the unperfect product from triglycerides oxidation. Triglycerides have been separated from other compound in extract such as β-karoten and tokoferol. Both of them are antioxidant that prevent unsaturated fatty acid oxidation. From the analysis result, could be known that triglycerides could be separated from the other compound with modification of column chromatography without changed this compound because the antioxidant were protecting triglycerides from oxidation reaction.
Key word : yellow fruit, modification of column chromatography, triglyserides, ontioxidant agent, auto-oxidation.
v
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
MOTTO
Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu
telah selesai (dari suatu urusan), Kerjakanlah dengan sungguh-sungguh
(urusan) yang lain.
(Alam Nasyrah: 6-7)
Tinta bagi seorang pelajar lebih suci nilainya daripada darah seorang martir
( Muhammad SAW)
Semua yang pasti di dunia ini adalah ketidakpastian itu sendiri dan Tuhan
memelihara ketidakpastian itu pada seluruh umat manusia agar manusia
terus belajar dan terus bermimpi
(Albert Einstein)
Sebaik-baiknya manusia adalah manusia yang memberi manfaat untuk
orang lain
(5 cm)
vi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
PERSEMBAHAN
Kupersembahkan perjuangan ku ini kepada:
Ibu dan bapak yang telah memberikanku kesempatan untuk
membanggakan kalian dengan cara ku
Kakak dan adik tercinta yang selalu mendukungku
Someone yang selalu setia menungguku ur still the one
vii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi yang berjudul “
Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari
Ekstrak Pandanus conoideus Lamk Varian Buah Kuning ” ini disusun atas
dukungan dari berbagai pihak. Dari dasar hati penulis menyampaikan terima kasih
kepada:
1. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret,
Surakarta.
2. Dr.rer.nat. Fajar Rakhman Wibowo,M.Si selaku pembimbing I dan
pembimbing akademik, terimakasih atas bantuan, arahan dan kesabarannya
membimbing selama melakukan penelitian dan penyusunan skripsi ini.
3. M. Widyo Wartono, M.Si selaku pembimbing II, yang telah memberikan
bimbingan dan arahan.
4. I.F. Nurcahyo, Msi., selaku Ketua Laboratorium Kimia Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret.
5. Seluruh Dosen di Jurusan Kimia, Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas ilmu yang berguna dalam
menyusun skripsi ini.
6. Para Laboran di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret atas bantuan dan kerjasama
yang baik.
7. Teman-temanku angkatan 2005 yang senantiasa mendukungku. Special
thank’s for Sulis, Arini, Erma, Lenia, Okly, ijup, Sofi.
8. Semua pihak yang tidak dapat kami sebutkan satu persatu.
Semoga Allah SWT membalas jerih payah dan pengorbanan yang telah diberikan
dengan balasan yang lebih baik.
viii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dalam rangka
untuk menyempurnakan skripsi ini. Akhir kata, semoga karya kecil in dapat
memberikan manfaat bagi ilmu pengetahuan dan bagi pembaca.
Surakarta, Oktober 2010
Kurnia Dyah Sugesti
ix
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .................................................................................... i
HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... ii
HALAMAN PERNYATAAN ...................................................................... iii
HALAMAN ABSTRAK............................................................................... iv
HALAMAN ABSTRACT ............................................................................ v
HALAMAN MOTTO ................................................................................... vi
PERSEMBAHAN ......................................................................................... vii
KATA PENGANTAR .................................................................................. viii
DAFTAR ISI ................................................................................................ ix
DAFTAR TABEL ......................................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xv
BAB I. PENDAHULUAN ............................................................................ 1
A. Latar Belakang Masalah ........................................................... 1
B. Perumusan Masalah................................................................... 2
1. Identifikasi masalah ............................................................. 2
2. Batasan masalah.................................................................... 4
3. Rumusan masalah................................................................. 4
C Tujuan Penelitian ...................................................................... 4
D. Manfaat Penelitian ................................................................... 5
BAB II. LANDASAN TEORI......................................................... ............. 6
A. Tinjauan Pustaka ..................................................................... 6
1. Buah kuning. ........................................................................ 6
2. Komponen-komponen pada ekstrak buah kuning ................ 7
a. Komponen trigliserida ....................................................... 8
1) Trigliserida...................................................................... 8
2) Asam lemak bebas ........................................................ 9
x
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3) Oksidasi asam lemak .................................................... 10
b. Komponen non trigliserida ................................................ 12
1) Karotenoid ..................................................................... 12
2) Tokoferol ....................................................................... 15
c. Aktivitas antioksidan ......................................................... 15
1) Radikal bebas.................................................................. 15
2) Antioksidan.................................................................... 17
3. Kromatografi ....................................................................... 18
a. Kromatografi kolom .......................................................... 18
b. Alumina ............................................................................. 19
c. Silika gel ............................................................................ 21
4. Mangan dioksida(MnO2)...................................................... 22
B. Kerangka pemikiran .................................................................. 23
C. Hipotesis .................................................................................... 24
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ........ .................................... 25
A. Metodologi Penelitian .............................................................. 25
B. Tempat dan Waktu Penelitian .............................................. ... 25
C. Alat dan Bahan .................................................. ...................... 25
1. Alat-alat yang digunakan........................................ ............. 25
2. Bahan-bahan yang digunakan .............................................. 26
D. Prosedur Penelitian..................................................................... 26
1. Clean up sampel....................................................... ........... 26
2. Pembuatan 0,5% rhodamin B dalam etanol ......................... 26
3. Kromatografi lapis tipis ....................................................... 26
4. Kromatografi kolom flash..................................................... 27
E.Teknik pengumpulan dan analisis data........................................ 27
a. Pengumpulan data ................................................................ 27
b. Analisis data ......................................................................... 28
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 29
A. Persiapan sampel ...................................................................... 29
B. Penentuan fasa gerak dan fasa diam ......................................... 29
xi
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
C. Pemisahan dengan kromatografi kolom flash .......................... 33
D. Identifikasi senyawa ................................................................. 36
E. Pengaruh penambahan alumina dan MnO2 .............................. 45
F. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrah buah kuning . 46
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN....................................................... 49
a. Kesimpulan...................................................................................... 49
a. Saran .. ............................................................................................. 49
DAFTAR PUSTAKA ........... ........................................................................ 50
LAMPIRAN.................................................................................................. 54
xii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Beberapa asam lemak yang umum.............................................. 8
Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning ...................... 10
Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa dan kekuatan adsorben
dalam kromatografi ..................................................................... 19
Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan buah kuning ....................... 30
Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi ................................. 35
Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak
buah kuning ................................................................................. 44
xiii
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Buah kuning .......................................................................... 6
Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida dan trigliserida 9
Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak ............................................. 9
Gambar 4. Contoh struktur molekul asam lemak bebas (asam oleat) ..... 10
Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan
propagasi ............................................................................... 11
Gambar 6. Konversi β-karoten ................................................................ 14
Gambar 7. Struktur α-tokoferol .............................................................. 15
Gambar 8. Struktur alumina .................................................................... 20
Gambar 9. Struktur dasar alumina a) asam, b) netral, c) basa ................ 21
Gambar 10. Struktur silika gel .................................................................. 22
Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2 .............. 23
Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al
(2:3)+MnO2 a). 3% dan b). 5% ............................................ 31
Gambar 13. Kromatografi kolom flash ..................................................... 33
Gambar 14. Grafik perubahan masa tabung hasil pemisahan dengan
kromatografi kolom flash ...................................................... 34
Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat ... 35
Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi
pertama .................................................................................. 37
Gambar 17a. Kromatogram GC-MS ekstrak buah kuning murni ............... 38
Gambar 17b. kromatogram GC-MS fraksi trigliserida……………………. 38
xiv
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kolom kromatografi modifikasi............................................ 54
Lampiran 2. Gambar plat pemisahan dengan silika gel dan
silika+alumina (2:3)............................................................... 55
Lampiran 3. Kondisi operasi GC-MS QP2010S Shimadzu ...................... 56
Lampiran 4. Spektrum analisis GC-MS ekstrak buah kuning murni ........ 57
Lampiran 5. Spektrum analisis GC-MS fraksi trigliserida ........................ 59
Lampiran 6. Spektrum FT-IR fraksi trigliserida ........................................ 64
Lampiran 7. Bagan alir cara kerja ............................................................. 65
xv
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Buah merah (Pandanus conoideus Lamk.) merupakan salah satu buah
endemik Papua. Empat varian utama dari P. conoideus dikenal oleh masyarakat
sekitar karena nilai ekonominya sebagai tanaman obat. Keempat varian P.
conoideus diantaranya adalah merah panjang, merah pendek, cokelat dan kuning
(Budi, 2001). Beberapa bukti empiris menunjukkan bahwa P. conoideus varian
kuning (yang kemudian dikenal dengan buah kuning) dapat bertindak sebagai
obat antikanker meskipun mekanisme penghambatan terhadap sel kanker oleh
buah ini belum sepenuhnya dapat diketahui (Astirin, 2008).
Analisis pendahuluan terhadap ekstrak buah kuning terungkap bahwa
ekstrak buah kuning mengandung: total karoten (9.500 ppm); β-karoten (240
ppm); tokoferol (10.400 ppm) dan beberapa asam lemak seperti asam oleat, asam
linoleat dan asam palmitat serta omega 3 dan omega 9 yang dikenal sebagai
antioksidan yang dapat mencegah berbagai penyakit termasuk kanker (Budi,
2001). Kandungan senyawa dalam buah kuning hampir sama dengan varian buah
merah panjang hanya berbeda dalam komposisi asam lemak jenuhnya dan kadar
asam lemak tak jenuh serta senyawa antioksidannya.
Asam lemak terdapat dalam tumbuhan terutama dalam bentuk terikat,
teresterkan dengan gliserol sebagai lemak yaitu berupa triasil gliserol atau
trigliserida (Harborne, 1987; Muchalal, 2004). Ikatan tak jenuh yang ada dalam
asam lemak merupakan pusat aktif yang dapat bereaksi dengan oksigen.
Peroksidasi (auto-oksidasi) lipida dapat menyebabkan kerusakan jaringan tubuh
secara in vivo sehingga menimbulkan beberapa penyakit seperti kanker. Efek yang
merusak ini ditimbulkan oleh radikal bebas (ROO*, RO*, OH*) yang dihasilkan
saat pembentukan peroksida dari asam lemak. Keberadaan antioksidan dalam
ekstrak buah dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi pada lipida.
Senyawa ini dapat memberikan atom hidrogen secara cepat pada radikal peroksida
(ROO*, RO*, OH*) dan mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil.
1
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Autooksidasi yang terjadi pada asam lemak relatif lebih cepat apabila
ekstrak lipida dalam ekstrak buah dipisahkan dari komponen senyawa yang lain.
Sebaliknya apabila dilakukan pemisahan langsung dari bahan awal reaksi
autooksidasinya menjadi lebih lambat. Amplifikasi yang dilakukan dengan
menambahkan oksidator pada proses kolom akan dapat diketahui seberapa besar
kekuatan oksidasi dari asam lemak tak jenuhnya dan ketahanan terhadap reaksi
oksidasi karena keberadaan senyawa antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah.
Penelitian yang telah dilakukan pada ekstrak lipida dari ekstrak buah
merah menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fasa diam modifikasi
yaitu berupa silika gel-alumina (2:3) dan oksidator berupa MnO2 diperoleh hasil
suatu produk turunan asam lemak yaitu berupa dioktil phtalat dan bis(2-etilheksil)
adipat (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten dari buah merah juga
telah dipisahkan dengan menggunakan teknik modifikasi tersebut. Modifikasi fasa
diam tersebut menyebabkan senyawa β-karoten mengalami perubahan (Rumanthi,
2008).
Adanya perbedaan komposisi dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah
kuning dimungkinkan berpengaruh terhadap proses pemisahan senyawanya.
Kandungan asam lemak tak jenuh dalam ekstrak buah merah lebih besar daripada
ekstrak buah kuning, sehingga kemungkinan asam lemak yang bereaksi dengan
oksidator lebih besar pada buah merah. Berdasarkan hal tersebut, pada penelitian
ini dilakukan modifikasi yang sama dengan modifikasi yang dilakukan pada
ekstrak buah merah dengan memperhatikan pengaruh perbedaan kadar asam
lemak dan potensi antioksidan dengan penambahan oksidator yang tinggi, apakah
reaksi yang terjadi akan sekuat pada buah merah jika modifikasi ini dilakukan
pada buah kuning.
B. Perumusan Masalah
1. Identifikasi Masalah
Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) mengandung trigliserida dan
senyawa lain seperti β-karoten dan tokoferol. Komposisi utama dalam ekstrak
buah kuning didominasi oleh asam lemaknya. Kandungan asam lemak tak jenuh
2
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
dalam ekstrak buah kuning sekitar 58,018%, sedangkan kandungan asam lemak
tak jenuh dalam ekstrak buah merah sekitar 65,74%. Selisih asam lemak tak jenuh
dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah merah sebesar 7,722%. Dalam
ekstrak buah merah juga terdapat adanya asam lemak bebas. Selain komposisi
asam lemak, komposisi antioksidan dalam ekstrak buah kuning juga berbeda
dengan ekstrak buah merah. Total antioksidan dalam ekstrak buah kuning sebesar
20.140 ppm (2,014%), sedangkan total antioksidan dalam eksrak buah merah
sebesar 23.700 ppm (2,37 %). Selisih antioksidan dalam ekstrak buah merah dan
ekstrak buah kuning sebesar 3.560 ppm (0,356%).
Asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat dipisahkan dari senyawa
lain dengan berbagai macam teknik pemisahan diantaranya kromatografi kolom.
Penambahan alumina dalam fasa diam dapat mengakibatkan perubahan
irreversibel. Alumina menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-oksidasi
asam lemak (Schultz, 1962). Alumina untuk kromatografi berada dalam bentuk
basa (pH 9,5), asam (pH 4,5 dalam air) dan netral. Alumina basa merupakan
alumina yang lebih reaktif dibandingkan dengan alumina lainnya dan dapat
menyebabkan reaksi polimerisasi, kondensasi dan dehidrasi (Gordon, 1972;
Cannel, 1998). Penambahan oksidator (MnO2) pada fasa diam juga dapat
mengoksidasi senyawa alkohol menjadi aldehid. Ekstrak lipida dari ekstrak buah
merah memerlukan komposisi MnO2 sebanyak 1,5% untuk dapat berubah menjadi
bentuk turunannya (Handayani, 2008). Sedangkan ekstrak β-karoten
membutuhkan MnO2 sebanyak 5% untuk dapat berubah (Rumanthi, 2008).
Modifikasi yang telah dilakukan untuk ekstrak buah merah akan diperoleh
senyawa turunan asam lemak yang berupa dioktil pthalat (Novianti,2010).
Modifikasi yang dilakukan tanpa memisahkan senyawa awal dari komponen yang
lain akan menurunkan produk dioktil pthalat yang dihasilkan. Apabila dilakukan
modifikasi yang sama untuk buah kuning dimungkinkan akan terjadi reaksi yang
sama dan dapat juga berbeda. Mengingat perbedaan kadar antara asam lemak
dalam ekstrak buah kuning dengan ekstrak buah merah serta perbedaan kadar
senyawa antioksidan yang dapat menghambat autoksidasi asam lemaknya.
3
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
2. Batasan Masalah
1. Sari buah kuning yang digunakan adalah sari buah kuning dari papua yang
diproduksi oleh I Made Budi.
2. Teknik yang digunakan untuk memisahkan dan atau mereaksikan
trigliserida didalam ekstrak buah kuning adalah teknik kromatografi kolom
yang dimodifikasi fasa diamnya.
3. Fasa diam yang digunakan adalah campuran silika-alumina basa dengan
perbandingan 2:3 dan penambahan MnO2 3% dan 5%.
3. Rumusan Masalah
1. Apakah dapat dilakukan pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kunig
dengan menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom yaitu berupa
penambahan alumina basa dan oksidator kedalam fasa diam silika gel,
dengan memperhatikan pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak
tersebut.
2. Dengan memperhatikan perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan
antioksidan dalam ekstrak buah merah dan ekstrak buah kuning apakah
dalam fraksi trigliseridanya dapat dihasilkan senyawa turunan asam lemak
(dioktil pthalat) seperti yang diperoleh dalam ekstrak buah merah.
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk memisahkan trigliserida dari ekstrak
buah kuning menggunakan modifikasi kolom kromatografi dengan
memperhatikan adanya pengaruh senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning
serta perbedaan kadar antara asam lemak tak jenuh dan senyawa antioksidannya
sehingga dapat diketahui pada ekstrak trigliserida kemungkinan dihasilkannya
senyawa dioktil ptalat seperti pada ekstrak buah merah.
4
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
D. Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah memberikan
informasi reaksi sekaligus pemisahan trigliserida dari ekstrak buah kuning
menggunakan modifikasi teknik kromatografi kolom dengan memperhatikan
pengaruh dari adanya suatu antioksidan dan perbedaan kadar asam lemak tak
jenuh serta senyawa antioksidan di dalam ekstrak buah kuning dan ekstrak buah
merah.
5
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB II
LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka
1. Buah Kuning
Buah kuning (Pandanus conoideus Lamk.) termasuk dalam famili
Pandanaceae dengan varian kuning. Didaerah asalnya Papua, tanaman ini dikenal
dengan nama sait, mongka memyeri, atau barkum. Buah ini tersebar hampir di
seluruh wilayah Bumi Cendrawasih terutama di Pegunungan Arfak. Buah kuning
berwarna kuning muda. Ukurannya mencapai panjang 102 cm, diameter 20 cm
dan bobot 4 – 7,5 kg. Buah dibungkus dengan daun memanjang, pohonnya
menjulang setinggi 16 – 17 m, ditopang akar – akar tunjang berdiameter 6 – 7 cm
sepanjang 2,5 – 3,7 m. daun berwarna hijau tua, lanset dan ujung meruncing.
Panjang daun 88 – 102 cm dan lebar 6 – 10 cm. seluruh tepi daun ditumbuhi duri
sepanjang 1 mm ( Mangan, 2005 ).
Gambar 1. Buah kuning
Bagi masyarakat Wamena, buah kuning digunakan untuk pesta adat,
namun banyak pula yang memanfaatkannya sebagai obat. Khasiat buah merah dan
buah kuning yang sudah dikonsumsi turun-temurun di Papua dipercaya mampu
menyembuhkan berbagai penyakit seperti penyakit mata, kulit, kanker rahim dan
kanker paru-paru serta kanker hati (Moeljopawiro, 2007).
β-Karoten dalam buah kuning berfungsi memperlambat berlangsungnya
penumpukan flek pada arteri. Interaksinya dengan protein meningkatkan produksi
antibodi. Ini meningkatkan jumlah sel pembunuh alami yang dapat menekan
kehadiran sel-sel kanker dan menangkal radikal bebas senyawa karsinogen
6
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
penyebab kanker. Konsumsi β-karoten rutin membuat tubuh dapat memperbanyak
sel-sel alami pembasmi penyakit. Bertambahnya sel-sel tersebut akan menekan
kehadiran sel kanker dengan menetralisir radikal bebas senyawa karsinogen
penyebab kanker. Tokoferol (vitamin E) berfungsi hampir sama dengan β-karoten
yaitu pencegah penyakit degeneratif. Tokoferol akan mematikan serbuan radikal
bebas dan menetralisir kolesterol dalam darah (Dermawan, 2005; Duryatmo,
2005; Sofia, 2005).
2. Komponen-Komponen pada Ekstrak Buah Kuning
Komponen penyusun buah kuning terdiri dari trigliserida dan non
trigliserida. Asam-asam lemak penyusun trigliserida terdiri dari asam lemak jenuh
dan asam lemak tak jenuh. Asam lemak merupakan asam organik berantai
panjang yang mempunyai atom karbon dari (C4:0) sampai (C20:0). Asam lemak
mempunyai gugus karboksil tunggal dan ekor hidrokarbon non polar yang
panjang, yang menyebabkan kebanyakan lipid bersifat tidak larut didalam air
(Lehninger, 1990). Asam lemak jenuh adalah asam lemak dengan rantai karbon
yang tidak mengandung ikatan rangkap, sedangkan asam lemak tidak jenuh adalah
asam lemak yang mengandung satu atau lebih ikatan rangkap (Poedjiadi, 1994).
Beberapa contoh asam lemak disajikan dalam tabel 1.
Keberadaan ikatan ganda pada asam lemak tak jenuh menjadikannya
memiliki dua bentuk: cis dan trans. Semua asam lemak nabati alami hanya
memiliki bentuk cis (dilambangkan dengan "Z"). Asam lemak bentuk trans
(trans fatty acid, dilambangkan dengan "E") hanya diproduksi oleh sisa
metabolisme hewan atau dibuat secara sintetis. Akibat polarisasi atom H,
asam lemak cis memiliki rantai yang melengkung. Asam lemak trans karena
atom H-nya berseberangan tidak mengalami efek polarisasi yang kuat dan
rantainya tetap relatif lurus.
Warna minyak disebabkan oleh adanya pigmen, karena asam lemak dan
gliseridanya tidak berwarna. Warna orange dan kuning disebabkan adanya pigmen
karoten yang larut dalam minyak tersebut. Apabila minyak dihidrogenasi, maka
akan terjadi pula hidrogenasi pigmen yang dikandungnya, akibatnya terjadi
7
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
pengurangan warna pada minyak. Karoten tidak stabil pada suhu tinggi dan bila
minyak diolah dengan menggunakan uap panas, maka karoten akan kehilangan
warnanya (Ketaren, 1986).
Tabel 1. Beberapa Asam Lemak yang Umum
Nama Rumus
Asam Lemak Jenuh Butirat Kaproat Kaprilat Kaprat Laurat
Miristat Palmitat Stearat
Arakidat Behenat
Lignoserat
CH3(CH2)2COOH CH3(CH2)4COOH CH3(CH2)6COOH CH3(CH2)8COOH CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)12COOH CH3(CH2)14COOH CH3(CH2)16COOH CH3(CH2)18COOH CH3(CH2)20COOH CH3(CH2)22COOH
Asam Lemak Tak Jenuh Palmitoleat
Oleat Petroselinat
Linoleat Linolenat
Elaeostrearat Arakidonat
Erusat
CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
CH3(CH2)3CH=CHCH=CHCH=CH(CH2)7COOH CH3(CH2)4CH=(CHCH2CH)3=CH(CH2)3COOH
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH
a. Komponen Trigliserida
(1). Trigliserida
Trigliserida adalah triester dari gliserol dengan asam-asam lemak, yaitu
asam-asam karboksilat beratom karbon 6 s/d 30. Trigliserida banyak dikandung
dalam minyak dan lemak, merupakan komponen terbesar penyusun ekstrak buah
kuning. Selain trigliserida, terdapat juga monogliserida dan digliserida. Struktur
molekul dari ketiga macam gliserid tersebut dapat dilihat pada Gambar 1.
(Puspasari, 2007).
8
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
R
O
OH
O
OH
R
O
OH
O
O
O
R
O
O
R3
R1
O
O
O
O
R2
monogliserida digliserida trigliserida
Gambar 2. Struktur molekul monogliserida, digliserida, dan trigliserida
R1, R2, dan R3 merupakan rantai hidrokarbon yang berupa asam lemak dengan
jumlah atom C lebih besar dari sepuluh. Senyawa inilah yang akan dikonversi
menjadi ester melalui reaksi transesterifikasi.
Trigliserida yang pada suhu kamar berupa zat padat disebut lemak,
sedangkan trigliserida yang berupa cairan disebut minyak. Secara kimia, lemak
sebagian besar terdiri atas asam lemak jenuh dan minyak mengandung lebih
banyak asam tidak jenuh (Robinson, 1991). Oleh karena itu, molekul trigliserida
bila terkondensasi hasilnya adalah satu molekul gliserol dan tiga asam lemak
dengan melepaskan tiga molekul air.
H2C – OH HOOCR1 H2COOCR1
│ │ HC – OH + HOOCR2 HCOOCR2 + 3H2O │ │ H2C – OH HOOCR3 H2COOCR3
Gliserol Asam Lemak Trigliserida Air
Gambar 3. Reaksi kondensasi asam lemak
Trigliserida yang terkandung dalam minyak merupakan campuran berbagai
macam asam lemak dan kecil kemungkinan yang sejenis (Astuti, 2002). Proses
hidrolisis yang dilakukan biasanya dengan penambahan sejumlah basa yang
dikenal dengan reaksi penyabunan atau saponifikasi. Selain dalam bentuk
trigliserida asam lemak dalam ekstrak buah kuning juga terdapat dalam bentuk
asam lemak bebas.
(2). Asam lemak bebas
Asam lemak bebas adalah asam lemak yang terpisahkan dari trigliserida,
digliserida, monogliserida, dan gliserin bebas. Hal ini dapat disebabkan oleh
pemanasan dan terdapatnya air sehingga terjadi proses hidrolisis. Oksidasi juga
9
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
dapat meningkatkan kadar asam lemak bebas dalam minyak nabati.
HC – (CH2)7 – COOH ║ HC – (CH2)7 – CH3
Gambar 4. Contoh struktur asam lemak bebas (asam oleat)
Tabel 2. Komposisi asam lemak dari minyak buah kuning
Jenis asam lemak Kandungan asam lemak % b/v
Asam myristat 0,055
Asam pentadekanoat 0,182
Asam palmitat 10,083
Asam stearat 3,154
Asam palmitoleat 1,377
Asam oleat 49,83
Asam linolenat 0,504
Asam linoleat 6,307
Asam eikosanoat 0,159
Asam behenat 0,852
(Budi,2004)
(3). Oksidasi asam lemak
Proses oksidasi dapat berlangsung jika terjadi kontak antara sejumlah
oksigen dengan minyak atau lemak, umumnya yang berupa asam lemak tak jenuh.
Mekanisme oksidasi lipida terjadi dari beberapa tahap. Menurut Meyes (1997) dan
Hamilton (1983), autooksidasi lipida berjalan dengan dua tahap. Selama tahap
pertama, oksidasi berjalan lambat dengan laju kecepatan seragam. Tahap pertama
ini sering disebut periode induksi. Oksidasi pada periode induksi ini berlangsung
beberapa waktu sampai pada waktu titik tertentu dimana reaksi memasuki tahap
kedua yang mempunyai laju oksidasi dipercepat. Laju pada oksidasi tahap kedua
beberapa kali lebih cepat dari laju oksidasi tahap pertama. Asam lemak yang
memiliki ikatan rangkap lebih banyak (misal asam linoleat) bereaksi lebih cepat
dibanding yang berikatan rangkap lebih sedikit (metil oleat) sehingga periode
induksinya lebih pendek.
10
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
R1 C C C R2
H
H
H H H
HAsam lemak tidak jenuh
Energi
(panas + sinar)R1 C C C R2
H H H H
HRadikal bebas
+ O2
R1 C C C R2
H
O
H H H
HOPeroksida aktifR1 C C C R2
H
H
H H H
H
+
R1 C C C R2
H
O
H H H
HOH
+ R1 C C C R1
H H H H
H
Hidroperoksida
Radikal bebas
Gambar 5. Mekanisme oksidasi asam lemak pada tahap inisiasi dan propagasi
Mekanisme oksidasi lipida tidak jenuh diawali dengan tahap inisiasi,
yaitu berbentuknya radikal bebas (R*) bila lipida kontak dengan panas, cahaya,
ion metal dan oksigen. Reaksi ini terjadi pada group metilen yang berdekatan
dengan ikatan rangkap –C=C- (Buck, 1991). Ditambahkan oleh Gordon (1990),
tahap inisiasi terjadi karena bantuan sumber energi ekstenal seperti panas, cahaya
atau energi tinggi dari radiasi, inisiasi kimia dengan terlarutnya ion logam atau
metaprotein seperti haem. Tahap selanjutnya adalah tahap propagasi dimana
autooksidasi berawal ketika radikal lipida (R*) hasil tahap inisiasi bertemu
dengan oksigen membentuk radikal peroksida (ROO*). Reaksi oksigenasi ini
terjadi sangat cepat dengan energi aktivitas hampir nol sehingga konsentrasi
ROO* yang terbentuk jauh lebih besar dari konsentrasi R* dalam sistem
makanan dimana oksigen berada (Gordon, 1990). Radikal peroksida yang
terbentuk akan mengekstrak ion hidrogen dari lipida lain (R1H) membentuk
hidroperoksida (ROOH) dan molekul radikal lipida baru (R1*). Selanjutnya
reaksi autooksidasi ini akan berulang sehingga merupakan reaksi berantai. Tahap
terakhir oksidasi lipida adalah tahap terminasi, dimana hidroperoksida yang
11
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
sangat tidak stabil terpecah menjadi senyawa organik berantai pendek seperti
aldehid, keton, alkohol dan asam (Rusmono, 2000). Peranan biologi yang penting
dari lipid adalah sebagai : (1) komponen struktur membran; (2) lapisan pelindung
pada beberapa jasad; (3) bentuk energi cadangan; (4) komponen permukaan sel
yang berperan dalam proses interaksi antara sel dengan senyawa kimia di luar sel,
seperti dalam proses kekebalan jaringan; dan (5) sebagai komponen dalam proses
pengangkutan melalui membran (Wirahadikusuma, 1985).
b. Komponen Non Trigliserida
(1). Karotenoid
Karotenoid adalah suatu senyawa golongan terpena yang merupakan
golongan pigmen yang larut dalam lipida dan tersebar luas, terdapat dalam semua
jenis tumbuhan. Pada tumbuhan, karotenoid mempunyai dua fungsi, yaitu suatu
pigmen pembantu dalam fotosintesis dan sebagai pewarna pada bunga dan buah.
Dalam bunga, karotenoid kebanyakan berupa zat warna kuning sedangkan di
dalam buah dapat juga berupa zat warna jingga atau merah (Harborne, J. B.,
1996). Ada banyak jenis karotenoid yang telah banyak ditemukan. Hidrokarbon
karotenoid seperti β-karoten dan lycopene, dikenal dengan karoten, sedangkan
turunan teroksigenasinya disebut xanthophyl. Di alam, karotenoid stabil terdapat
dalam bentuk all-trans (all-E), tetapi juga ada sejumlah kecil yang terdapat dalam
bentuk cis (Z). Modifikasi atas kerangka karotenoid dasar, terjadi dan
menghasilkan berbagai macam metabolit. Metabolit karotenoid yang paling
penting adalah vitamin A (Richard B. Herbert, 1995). Di antara lebih dari 400
jenis karotenoid yang layak ditentukan sifat-sifatnya dengan baik, hanya sekitar
30 jenis yang mempunyai aktivitas sebagai provitamin A. Untuk manusia dan
hewan-hewan percobaan, kelompok karotenoid yang aktif secara biologis, secara
tidak seragam mengandung paling sedikit satu cincin β-ionon yang tidak
tersubstitusi. Karotenoid yang paling aktif adalah all-trans β-karoten.
β-Karoten adalah salah satu jenis senyawa hidrokarbon karotenoid yang
merupakan senyawa golongan tetraterpenoid (Winarsi, 2007). Adanya ikatan
ganda menyebabkan β-karoten peka terhadap oksidasi. Oksidasi β-karoten akan
lebih cepat dengan adanya sinar, dan katalis logam, khususnya tembaga, besi dan
12
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
mangan. Oksidasi akan terjadi secara acak pada rantai karbon yang mengandung
ikatan rangkap. β-karoten merupakan penangkap oksigen dan sebagai antioksidan
yang potensial, tetapi β-karoten efektif sebagai pengikat radikal bebas bila hanya
tersedia oksigen 2 – 20 %. Pada tekanan oksigen tinggi diatas kisaran fisiologis,
karoten dapat bersifat pro-oksidan (Burton, 1989).
β-Karoten mengandung ikatan rangkap terkonjugasi yang memberikan
karakter pro-oksidan, akibatnya akan sangat mudah diserang melalui penambahan
radikal peroksil.
β-caroten + ROO* β-car*
β-car* + O2 β-car-OO*
β-car* + ROO* produk tak aktif
Radikal β-karoten (β-car*) yang terbentuk bereaksi dengan cepat dan reversible
dengan oksigen untuk membentuk radikal peroksil yang baru (β-car-OO*).
Reaktivitas β-karoten menjadi radikal peroksil dan stabilitas pembentukan
β-car* adalah dua gambaran penting yang memberikan molekul tersebut
kemampuan antioksidan. Reaktivitas β-karoten artinya senyawa tersebut
mempunyai potensi untuk menyerang radikal peroksil yang diturunkan dari
molekul lipida yang lain, walaupun ketika berada pada konsentrasi rendah.
Stabilitas β-car* artinya adalah pada tekanan O2 yang rendah, bentuk tersebut
dapat mendominasi seluruh bentuk radikal peroksil. Radikal β-car* dapat
dilepaskan dari sistem reaksi dengan radikal peroksil yang lain (Burton, 1988).
β-Karoten memiliki 11 ikatan rangkap karbon-karbon yang terkonjugasi.
Zat ini merupakan prekursor biologis bagi vitamin A, yaitu alkohol tak jenuh
berkarbon 20, yang juga disebut retinol. Retinol ini menghasilkan 11-cis-retinal
(Gambar 5). Konversi vitamin A menjadi 11-cis-retinal tidak hanya melibatkan
oksidasi gugus alkohol menjadi aldehid, tetapi juga isomerisasi trans menjadi cis
pada ikatan rangkap C11 – C12 (Hart, 2003). Dalam tubuh, satu molekul β-karoten
akan diubah menjadi dua molekul retinil dan dipecah dalam mukosa dari usus
kecil oleh β-karoten- dioksigenase menjadi retinol, sebuah bentuk dari vitamin A.
Retinol dioksidasi menjadi retinaldehid dan sebagian kecil aldehid ini diubah
menjadi asam retinoat yang juga merupakan salah satu bentuk vitamin A.
13
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Penjelasan tersebut menunjukkan bahwa β-karoten dalam tubuh dapat diubah
menjadi vitamin A melalui reaksi oksidasi enzimatis. Namun, penelitian Lederrer
(1957) menunjukkan bahwa vitamin A dapat dioksidasi menjadi retinen (salah
satu bentuk vitamin A) menggunakan teknik kromatografi dengan penambahan
MnO2 pada fasa diamnya.
Vitamin A secara umum relatif lebih stabil dalam panas, asam dan basa
bila dibandingkan dengan β-karoten, namun vitamin A juga mudah teroksidasi
atau rusak dengan udara, pemanasan suhu tinggi, terkena sinar atau bila berada
dalam lemak yang sudah tengik. Karotenoid berperan penting dalam kesehatan
manusia yaitu bertindak sebagai antioksidan biologi, melindungi sel dan jaringan
dari pengaruh radikal bebas dan oksigen tunggal. Kegunaan karotenoid yang lain
adalah berhubungan dengan potensial oksidatif fungsi sistem imun atau ketahanan
tubuh dan penghambatan perkembangan kanker.
Beta-karoten
↓ [O]
CH2OH
Vitamin A (retinol) ↓Enzim
O H
11-cis-retinal
Gambar 6. Konversi β-karoten
14
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
(b). Tokoferol
Tokoferol merupakan senyawa kimia yang mempunyai aktivitas vitamin
E. Tokoferol dalam minyak dapat berfungsi sebagai antioksidan sehingga minyak
dan karoten yang terkandung didalamnya dapat terlindungi dari oksidasi. Sebagai
antioksidan tokoferol berfungsi sebagai donor hidrogen yang mampu mengubah
radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif, sehingga mampu
merusak rantai asam lemak (Winarsi, 2007). Tokoferol relatif stabil terhadap suhu
tinggi, namun sensitif terhadap oksidasi (Winarno, 1991). Ada dua mekanisme
berbeda untuk menunjukkan kerja vitamin E sebagai antioksidan yaitu (1) vitamin
E bereaksi langsung dengan oksigen dan (2) vitamin E bekerja untuk menangkap
radikal turunan asam lemak tidak jenuh dan menghentikan auto-oksidasi
(Giamalva, 1985). α-Tokoferol (Gambar 6) mempunyai kecenderungan menjadi
pro-oksidan pada dosis tinggi dan menyebabkan tekanan oksidatif yang dapat
memodulasi sinyal transduksi, mengalihkan gen dan mempengaruhi respon sel
seperti perkembangbiakan, diferensiasi dan reproduksi. Untuk itu, α-tokoferol
harus digunakan secara hati-hati (Gulcin, 2005).
O
CH3
HO
H3C
CH3
CH3
H HCH3 CH3
CH3
CH3
Gambar 7. Struktur α-Tokoferol
c. Aktivitas Antioksidan
(1). Radikal Bebas
Radikal bebas merupakan sekelompok zat kimia yang sangat reaktif
karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal
bebas adalah oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas.
Oksidan merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas
merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang tidak
berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1994). Senyawa oksigen reaktif
15
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
(Reactive Oxygen Species = ROS) diproduksi secara terus menerus di dalam
tubuh manusia sebagai akibat proses metabolisme normal (Langseth, 1995).
Selama makanan dioksidasi untuk menghasilkan energi, sejumlah
radikal bebas juga terbentuk. Radikal bebas berfungsi untuk memberikan
perlindungan tubuh terhadap serangan bakteri dan parasit. Namun tidak
menyerang sasaran spesifik, sehingga akan menyerang asam lemak tidak jenuh
ganda dari membran sel, struktur sel, dan DNA. Radikal bebas adalah
oksidan, tetapi tidak semua oksidan merupakan radikal bebas. Oksidan
merupakan senyawa yang dapat menerima elektron dan radikal bebas
merupakan atom atau gugus yang orbital luarnya memiliki elektron yang
tidak berpasangan. Radikal bebas dan senyawa oksigen reaktif yang diproduksi
dalam jumlah yang normal, penting untuk fungsi biologi (Haryatmi, 2004).
Beberapa hipotesis menjelaskan tentang radikal bebas pada diabetes
mellitus, seperti glikosilasi protein non enzimatik, autooksidasi glukosa gangguan
metabolisme glutation, perubahan enzim antioksidan dan pembentukan lipid
peroksidasi. Peningkatan radikal bebas secara umum menyebabkan gangguan
fungsi sel dan kerusakan oksidatif pada membran. Pada kondisi tertentu
antioksidan mempertahankan sistem perlindungan tubuh melalui efek penghambat
pembentukan radikal bebas. Efisiensi mekanisme pertahanan tersebut mengalami
perubahan pada diabetes mellitus. Penangkapan radikal bebas yang tidak efektif
dapat menyebabkan kerusakan jaringan (Rajasekaran et al., 2005 ; Kaleem et al.,
2006). Radikal bebas bereaksi dengan biomembran menyebabkan destruksi
oksidatif asam lemak tak jenuh membentuk aldehid sitotoksik melalui peroksidasi
lipid. Selanjutnya peroksidasi lipid diukur dengan thiobarbituric acid reactive
substances (TBARS) dan lipid hydroperoxides (HPX) yang merupakan
produk akhir dari peroksidasi lipid. Peningkatan peroksidasi lipid pada
membran dan lipoprotein terjadi pada diabetes. HPX yang terbentuk dari
peroksidasi lipid memiliki efek toksik langsung pada sel endothelium dan
juga terdegradasi membentuk radikal hidroksil (OH*). Hal tersebut dapat
terlihat pada sel β pankreas (Pari dan Latha , 2005).
16
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
(2). Antioksidan
Suatu senyawa dikatakan memiliki sifat antioksidan bila senyawa tersebut
mampu mendonasikan satu atau lebih elektron kepada senyawa perooksidan,
kemudian mengubah senyawa oksidan menjadi senyawa yang lebih stabil.
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dikelompokkan menjadi tiga
kelompok, yaitu:
(a). Antioksidan primer(antioksidan endogen atau antioksidan enzimatis),
contohnya enzim peroksidase dismutase, katalase dan glutation peroksidase.
Enzim-enzim ini mampu menekan atau menghambat pembentukan radikal
bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk
stabil. Reaksi ini disebut sebagi chain-breaking-antioxidant.
(b). Antioksidan sekunder (antioksidan eksogen atau antioksidan non
enzimatis). Contoh antioksidan sekunder ialah vitamin E, vitamin C, β-karoten,
isoflavon, asam urat, bilirubin dan albumin. Senyawa-senyawa ini dikenal
sebagai penangkap radikal bebas (scavenger free radical), kemudian mencegah
amplifikasi radikal.
(c). Antioksidan tersier, misalnya enzim DNA-repair, metionin sulfoksida
reduktase, yang berperan dalam perbaikan biomolekul yang disebabkan oleh
radikal bebas (Winarsi, 2005).
Penambahan antioksidan (AH) dengan konsentrasi rendah pada lipida
dapat menghambat atau mencegah reaksi auto-oksidasi. Penambahan tersebut
dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap insiasi dan propagasi dengan
memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) dan
mengubahnya menjadi bentuk lebih stabil.
Tahap inisiasi: R* + AH → RH + A*
Tahap propagasi: ROO* + AH → ROOH + A*
Sementara itu, turunan radikal antioksidan (A*) tersebut memiliki keadaan yang
lebih stabil dibanding radikal lipida dan tidak mempunyai cukup energi untuk
dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal baru (Schultz, 1962,
deMan, 1997).
17
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Pada penghambatan oksidasi lipida, salah satu masalah yang menarik
adalah mekanisme dimana antioksidan menstabilkan vitamin A dan karoten.
Struktur oksida terjadi melalui ikatan oksigen pada bagian tak jenuh dari cincin.
Namun hal ini tidak terjadi pada rantai. Antioksidan fenolik menghambat oksidasi
tersebut. Aktivitas vitamin A sebagai antioksidan diperkuat dengan menggunakan
antioksidan fenolik (Schultz, 1962; Paiva, 1999).
3. Kromatografi
Kromatografi mencakup berbagai proses berdasarkan perbedaan distribusi
antara dua fasa dari penyusun cuplikan. Satu fasa tetap tinggal dalam sistem dan
dinamakan fasa diam, sedangkan fasa yang lain dinamakan fasa gerak untuk
memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan
perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. (Sudjadi, 1988). Pemisahan secara
kromatografi dilakukan dengan cara mengubah langsung beberapa sifat fisika
umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul
untuk melarut dalam cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk melekat
pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penyerapan) dan kecenderungan molekul
untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian) (Gritter, Bobbitt, 1991).
Jika fasa gerak digerakkan melalui fasa diam untuk menghasilkan
pemisahan kromatografi, proses ini dikenal sebagai pengembangan.
Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut
pengembang merambat naik dalam lapisan. Setelah senyawa-senyawa dipisahkan
dengan pengembangan, hasilnya dideteksi (divisualisasi atau ditampakkan). Jika
senyawa-senyawa yang dipisahkan benar-benar dikeluarkan dari sistem, maka
senyawa itu telah dielusi. Senyawa yang telah dipisahkan disebut solut atau
cuplikan (Gritter, 1991).
a. Kromatografi kolom
Kromatografi kolom merupakan kromatografi cair yang dilakukan dalam
kolom besar. Kromatografi kolom merupakan metode terbaik untuk pemisahan
campuran dalam jumlah besar (lebih dari satu gram). Kadang-kadang cara ini
disebut dengan kromatografi cair preparatif. Penggunaan kromatografi kolom
18
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
adalah untuk mendapatkan hasil zat murni secara preparatif dari campuran dan
untuk pemisahan zat pada penentuan kuantitatif maupun kualitatif. Pada
kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada
bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau
tabung plastik. Pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang
disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Walaupun banyak jenis
penyerap telah dipakai untuk kolom, silika gel dan alumina merupakan penyerap
paling banyak digunakan. (Gritter, 1991).
Tabel 3. Urutan kepolaran eluen, elusi senyawa, dan kekuatan adsorben dalam kromatografi
Urutan Polaritas Eluen
Urutan Elusi Senyawa
Urutan Adsorben
Petroleum eter Karbon tetraklorida Benzene Kloroform Dietil eter Etil asetat Aseton Etanol Methanol Air
Hidrokarbon tak jenuh Alkena Hidrokarbon aromatik Eter Aldehida, keton, ester Alkohol Asam karboksilat
Selulosa Gula Asam silika (silika gel) Florisil (magnesium silikat) Aluminium oksida (alumina)
Beberapa kombinasi heksana atau petroleum eter (40 – 60 oC, bp) dan
dietil eter, biasanya dengan asam asetat (90:10:1) atau diisopropil eter dan asam
asetat (98,5:1,5) umumnya digunakan untuk pemisahan lipida non polar.
Mobilitas terbesar ditunjukkan oleh ester kolesterol diikuti oleh triasilgliserol,
asam lemak bebas, kolesterol, diasilgliserol, monoasilgliserol (Holme, 1993).
b. Alumina
Alumina (Al2O3) adalah salah satu adsorben yang digunakan pada
kromatografi. Penyerap ini seringkali dipakai untuk pemisahan alkaloid, zat
warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin, karoten dan asam-asam amino.
(Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina yang diperoleh dari perdagangan dengan
bersifat asam netral atau basa. Alumina, terutama bila bersifat alkali, sering
menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi. Sebagai misal, ia
19
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila
hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti
terpen dan sterol. (Sastrohamidjoyo, 2002). Hal ini dapat dicegah dengan
mencucinya dengan larutan asam atau dengan air (terakhir diikuti dengan
metanol), kemudian direaktivasi pada suhu 200˚C. Pemanasan alumina diatas
suhu 500˚C sebaiknya dihindari; Lederer (1957) menyatakan bahwa permukaan
alumina teatap konstan hingga suhu 528˚C, kemudian menurun sampai 15% pada
suhu 734˚C dan menurun 40% setelah pemanasan pada suhu 938˚C. Satu gram
alumina untuk kromatografi mempunyai luas permukaan sebesar 90m2, darinya
hanya sebesar 6m2 per gram yang tidak berguna sebagai adsorben.
Ald+ Ald+
Od-Od-Od-Od-
OAld+
Od-
O
Od-
Gambar 8. Struktur alumina
Alumina yang digunakan untuk kromatografi berbentuk serbuk putih.
Ukuran partikel alumina berkisar 50 – 200 µm (70 – 290 mesh). Alumina dapat
dihasilkan dengan permukaan asam, basa, dan netral, berdasarkan pH dari
adsorben. Alumina asam mempunyai pH mendekati 4 dan paling berguna untuk
pemisahan senyawa asam seperti asam karboksilat. Alumina asam dapat
menyebabkan dehidrasi alkohol (terutama alkohol tersier). Alumina basa (pH
mendekati 10) berguna untuk pemisahan senyawa basa seperti alkaloid. Alumina
basa dapat menyebabkan hidrolisis ester. Alumina juga dapat menyebabkan
hidrolisis dari lipida alkalilabile (Renkonsen, 1961). Alumina netral (pH
mendekati 7) sering digunakan untuk pemisahan senyawa non polar seperti steroid
(Cannel, 1998; Gordon, 1972).
20
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
O
Al3+
Al3+
Cl
Cl
O
Al3+
Al3+
O
Al3+
O
Al3+ O
O Na
Na
(a) (b) (c)
Gambar 9. Struktur Dasar Alumina (a) Asam, (b) Netral, (c) Basa
Alumina dapat bertindak sebagai katalis superbasa dan menyebabkan
isomerisasi ikatan rangkap pada olefin. Logam Na akan terionisasi dan elektron
yang terlepas akan berpindah ke atom oksigen. Atom oksigen dengan muatan
negatif yang lebih tinggi akan menghasilkan kemampuan donor elektron yang
kuat. Atom oksigen memiliki jumlah elektron yang lebih banyak akan mempunyai
kemampuan donor elektron yang lebih tinggi dan mempunyai kebasaan yang
tinggi pula (Widodo, 2002). Alumina bila digunakan dengan eluen organic akan
menyerap aromatik dan hidrokarbon tidak jenuh, karotenoid, steroid, alkaloid dan
produk alam lainnya. Alumina dapat mengkatalisis reaksi inter maupun
intramolekular, terutama senyawa yang sensitif terhadap basa seperti alkali
(Bratihwaite and Smith, 1995). Pemisahan beberapa lipida menggunakan kolom
alumina menghasilkan peningkatan kemampuan adsorbsi dimulai dari
hidrokarbon, ester kolesterol, trigliserida, kolesterol bebas, asam lemak dan
fosfatida (Holme, 1993).
c. Silika Gel
Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Penyerap ini
seringkali digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa asam-asam aminio,
alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation
organik, sterol dan terpenoid. Silika gel yang digunakan kebanyakan kebanyakan
diberi binder (pengikat) yang dimaksudkan untuk memberikan kekuatan pada
lapisan, dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang banyak
digunakan adalah kalsium sulfat. Tetapi, dalam perdagangan biasanya silika gel
21
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
telah diberi pengikat dengan kode silika gel G (Sastrohamidjoyo, 2002).
Silika merupakan adsorben yang bersifat polar. Adsorben polar ini
berinteraksi dengan molekul yang akan diadsorb melalui beberapa gaya, antara
lain dengan tarikan elektrostatik dan ikatan hidrogen. Silika merupakan asam
lemah karena adanya grup Si-OH, sedangkan alumina merupakan adsorben polar
yang bersifat basa kuat karena keberadaan O2-. Adsorben asam akan lebih
menahan komponen basa untuk menaikkan kebasaannya, demikian juga pada
pada adsorben basa akan cenderung menahan komponen asam. Penanganan silika
gel yang diperoleh secara komersial, biasanya diaktifkan dengan pemanasan pada
suhu 100˚C selama 24 jam kemudian mengerikannya dalam desikator selama 24
jam (Lederer, 1957).
Si
O
O
O
H
Si
O
O
O
H
O
Si
O
O
O
H
Gambar 10. Struktur Silika Gel
4. Mangan Dioksida (MnO2)
Oksidasi benzil dan alil alkohol menjadi aldehid dan keton dapat
dilakukan dengan menggunakan padatan mangan dioksida, MnO2. Kekuatan
oksidasi reagen ini tergantung pada ukuran partikel dan derajad hidrasinya. Reaksi
oksidasi terjadi pada permukaan oksida dan mengakibatkan pembentukan radikal
sebagai intermediet. Produk samping dari reaksi ini adalah manganese (MnO).
Solven seperti petroleum eter, aseton, dan metilen klorida, dimana oksida tidak
dapat larut, digunakan dalam oksidasi. Pentingnya menggunakan solven karena
reaksi terjadi melalui koordinasi substrat dan reagen. Solven dapat mempengaruhi
derajad adsorpsi dan desorpsi alkohol pada mangan dioksida. Jika alkohol primer
atau sekunder digunakan sebagai solven, kompetisi adsorpsi situs alkohol akan
mengurangi hasil produk oksidasi.
22
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Alkohol jenuh juga teroksidasi oleh MnO2, tetapi dengan kecepatan yang
lebih lambat dibandingkan dengan benzil atau alil alkohol. Hal ini menjadikan
reagen MnO2 kemoselektif untuk jenis alkohol ini. Benzil dan alil alkohol primer
diubah menjadi aldehid sedangkan bentuk sekundernya menjadi keton.
C C
H
H CH2OH
C C
H
H CHO
trans-cinamil alkohol trans-cinamaldehid
MnO2
petroleum eter
Gambar 11. Pengubahan vitamin A menjadi retinal oleh MnO2
Mangan dioksida dapat digunakan untuk mengubah vitamin A menjadi retinal
dengan menggunakan petroleum eter sebagai solven (Palleros, 2000; Smith,
1946).
B. Kerangka Pemikiran
Buah kuning merupakan sub spesies dari buah merah, Ekstrak buah
kuning mengandung senyawa-senyawa diantaranya adalah asam lemak yang
berada dalam bentuk trigliserida dan senyawa antioksidan seperti β-karoten dan
tokoferol. Trigliserida dalam ekstrak akan dipisahkan dengan menggunakan
teknik modifikasi fasa diam kromatografi kolom.
Berdasarkan penelitian sebelumnya kandungan asam lemak dan β-karoten
dalam buah merah dapat dipisahkan dan dioksidasi dengan menggunakan metode
kromatografi yang dimodifikasi fase diamnya dengan penambahan alumina dan
MnO2 pada silika gel. Adanya perbedaan warna yang dimiliki oleh buah kuning
dimungkinkan akan terjadi reaksi yang sama karena kandungan asam lemak dan
senyawa antioksidan dalam ekstrak buah kuning hampir seluruhnya sama dengan
ekstrak buah merah, hanya berbeda dalam kadarnya.
Alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi gliserida dan auto-
oksidasi asam lemak serta hidrolisis ester. Alumina juga dapat bertindak sebagai
katalis basa yang dapat menyebabkan isomerisasi pada ikatan rangkap. Sedangkan
MnO2 dapat mengoksidasi benzil dan alil alkohol menjadi bentuk aldehid dan
23
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
keton. Alumina dan silika gel dapat memisahkan lipida menjadi kelas-kelasnya
dimulai dari trigliserida, asam lemak bebas, digliserida dan monogliserida.
Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida dapat mengalami oksidasi yang
diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan oksigen sehingga
menghasilkan glikol dan hasil pemenggalan seperti aldehid dan asam karboksilat
berantai pendek. β-karoten dengan aktivitas vitamin A yang besar dapat dioksidasi
menjadi retinen dengan menggunakan teknik kromatografi yang fasa diamnya
diberi MnO2. β-karoten juga dapat bertindak sebagai antioksidan yang dapat
mencegah terjadinya oksidasi lipida.
Mekanisme yang mungkin terjadi adalah trigliserida, β-karoten dan
tokoferol terpisah bersama-sama. Selama elusi, ketiga senyawa tersebut bertemu
dengan oksidator. β-karoten dan tokoferol yang mempunyai fungsi sebagai
antioksidan akan menghalangi trigliserida yang mempunyai asam lemak dengan
ikatan rangkap untuk mengalami reaksi oksidasi. Sehingga selama pemisahan,
trigliserida akan terlindungi dari oksidator dan dapat dipisahkan dari ekstrak buah
kuning tanpa merusak trigliserida tersebut.
C. Hipotesis
Berdasarkan uraian diatas dapat diambil hipotesis yaitu trigliserida dapat
dipisahkan dari ekstrak buah kuning menggunakan teknik kromatografi yang
dimodifikasi fasa diamnya (penambahan alumina basa dan oksidator kedalam
silika gel). Namun dengan adanya pengaruh fasa diam modifikasi dan antioksidan
dalam ekstrak, mengakibatkan terjadi suatu reaksi yang dapat menghambat
oksidasi asam lemaknya.
Dengan adanya perbedaan daya tahan terhadap oksidasi karena perbedaan
kadar antara asam lemak dan senyawa antioksidan dalam ekstrak buah merah dan
ekstrak buah kuning dimungkinkan akan dihasilkan senyawa dioktil ptalat sebagai
turunan asam lemak yang sama dengan ekstrak buah merah.
24
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Metode Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen di
laboratorium kimia. Penelitian pendahuluan adalah penentuan perbandingan fasa
gerak dan fasa diam untuk kromatografi kolom dengan metode KLT
menggunakan plat modifikasi. Fasa diam berupa campuran silika-alumina(2:3)
dengan penambahan MnO2 3% dan 5%. Setelah diperoleh data KLT dilakukan
pemisahan ekstrak buah kuning dengan kromatografi kolom menggunakan fasa
diam campuran silika-alumina(2:3) dengan penambahan MnO2 3%. Ekstrak buah
kuning dielusikan pada kolom kromatografi menggunakan eluen campuran PE-
dietil eter(1:1). Hasil pemisahan diidentifikasi dengan spektroskopi infra
merah(IR), dan Gas Chromatography – Mass Spectroscopy (GC-MS).
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Dasar Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Sublab Kimia Laboratorium Pusat Universitas
Sebelas Maret Surakarta. Sedangkan identifikasi dilakukan di Laboratorium
Kimia Organik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Gadjah Mada Yogyakarta.Waktu kegiatan penelitian berlangsung pada bulan Juli
2009 – April 2010.
C. Alat dan Bahan yang Digunakan
1. Alat-alat yang digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Kolom kromatografi tekan
2. Alat-alat gelas buatan pyrex
3. GC-MS QP2010S Shimadzu
4. IR Shimadzu FTIR Prestige 21
5. TLC Plate Coater
25
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
6. TLC Chamber
7. Oven
8. Syringe whatman 0,2 µm TF
9. Lampu UV
2. Bahan-bahan yang digunakan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Ekstrak buah kuning dari Papua Irian Jaya produksi I Made Budi
2. Silika Gel 60 GF254 for TLC (Merck)
3. Aluminiumoxid 150 aktiv basisch (Merck)
4. Silica gel 60, 70-230 Mesh ASTM(Merck)
5. Aluminiumoxid 60 aktiv basisch 70-230 Mesh ASTM (Merck)
6. PE teknis (Merck)
7. dietil eter p.a (Merck)
8. metanol p.a (Merck)
9. rodamin B(Merck)
10. MnO2(Merck)
D. Prosedur Penelitian
1. Clean up sampel
Sebanyak 1 g ekstrak buah kuning dilarutkan dalan 10ml dietil
eter. Kemudian ekstrak diinjeksikan pada syring whatman dengan ukuran
pori 0,2 µm. Ekstrak diuapkan untuk mendapatkan ekstrak pekat kembali.
2. pembuatan 0,5 % Rhodamin B dalam etanol
Sebanyak 0,4 g rhodamin B dilarutkan dalam 100ml etanol.
3. Kromatografi Lapis Tipis
KLT awal adalah KLT silika pabrik untuk identifikasi awal dari
ekstrak buah kuning dan untuk penentuan eluen. Ekstrak buah kuning
dielusikan pada plat KLT dengan cara ditotolkan dengan mikropipet. Dan
dimasukkan dalam gelas piala yang berisi eluen campuran PE dan dietil
eter dengan perbandingan (19:1; 9:1; 7:3; 5:5) sebagai larutan pengembang
kemudian dibiarkan terelusi/mengembang. Plat kemudian disemprot
26
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
dengan larutan rhodamin B yang akan memberikan bercak merah muda
pada plat di bawah sinar UV.
KLT selanjutnya menggunakan plat yang telah dimodifikasi. Silika
gel dipanaskan pada 120oC dan alumina dipanaskan pada 150oC selama
satu jam. Untuk plat dibuat bubur silika gel-alumina ditambahkan MnO2
3% dan 5%. Masing-masing bubur adsorben kemudian diratakan pada plat
KLT dan dikeringkan diudara. KLT dilakukan untuk penentuan banyaknya
fraksi buah kuning pada kromatografi kolom. Ekstrak buah kuning
ditotolkan pada plat KLT. Kemudian plat dielusikan dengan eluen
campuran PE:dietil eter(1:1).
4. kromatografi kolom flash
1 g Ekstrak buah kuning dielusi dalam kolom kromatografi dengan
fasa diam silika-alumina(3:2) dengan penambahan MnO2 3%. Eluen yang
digunakan PE-dietil eter dengan perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Eluat yang
dihasilkan kemudian ditampung dalam vial-vial tiap 3 mL dan dikeringkan
dari pelarutnya.
Eluat yang telah kering dari pelarut atau eluen kemudian ditimbang
dan diuji dengan KLT. Nilai Rf yang dihasilkan dibandingkan dengan nilai
Rf dari plat KLT silika gel awal. Nilai Rf yang sama dikumpulkan
kemudian fraksi yang dihasilkan diidentifikasi dengan menggunakan IR
dan GC-MS.
E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data
a. Pengumpulan Data
Penentuan fasa diam dan eluen dengan menggunakan KLT akan diperoleh
data berupa spot-spot hasil pemisahan untuk tiap perbandingan eluen petroleum
eter dan dietil eter dan penambahan MnO2 dalam fasa diam, yang selanjutnya
hasil pemisahan yang baik akan digunakan dalam pemisahan kromatografi kolom.
Pemisahan dengan menggunakan kolom kromatografi akan dihasilkan
eluat. Tiap eluat diuji dengan KLT dan menghasilkan nilai Rf yang kemudian
27
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
dibandingkan dengan nilai Rf awal. Fraksi yang sama dikumpulkan dan kemudian
dilakukan identifikasi.
b. Analisis Data
a. Infrared Spectroscopy (IR)
Identifikasi dengan IR dilakukan untuk menentukan gugus fungsi dari
senyawa-senyawa yang ada dalam fraksi.
b. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)
Identifikasi dengan GC-MS digunakan untuk memperkirakan senyawa-
senyawa yang dihasilkan.
28
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Persiapan Sampel
Ekstrak buah kuning yang digunakan dalam penelitian ini berupa cairan
minyak berwarna cokelat kekuningan. Preparasi awal sampel adalah clean up
ekstrak buah kuning menggunakan whatman TF dengan ukuran pori 0,2 µm.
Filter ini dibuat dengan menggunakan membran PTFE (Politetrafluoroethylene)
yang spesifik untuk pemisahan senyawa organik, filtrasi pelarut non air dan ideal
digunakan pada analisis HPLC, TLC, dan GC. Metode yang digunakan untuk
clean up adalah metode injeksi. Sebanyak 1 gram ekstrak buah dilarutkan dalam
10 ml dietil eter, ekstrak kemudian diinjeksikan pada syring hingga diperoleh
ekstrak encer. Ekstrak dibiarkan agar pelarut menguap hingga diperoleh ekstrak
pekat kembali.
Tujuan utama clean up adalah membersihkan pengotor dan matriks-
matriks lain dalam ekstrak buah kuning yang dapat mengganggu pemisahan.
Ekstrak awal berwarna cokelat kekuningan dan setelah dilakukan clen up
diperoleh ekstrak berwarna kuning pekat. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak
telah bersih dari pengotor dan matriks-matriks lain yang dapat menggangu
pemisahan seperti senyawa tanin dan selulosa.
B. Penentuan Fasa Gerak dan Fasa Diam
Pemisahan trigliserida dalam ekstrak buah kuning diawali dengan
penentuan komposisi fasa diam dan fasa gerak yang akan digunakan. Penentuan
ini dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fasa gerak
yang akan digunakan dalam kromatografi kolom ditentukan dengan menggunakan
plat TLC silica gel 60 F254. Trigliserida dan β-karoten merupakan senyawa non-
polar yang saling bercampur satu sama lain. Kedua senyawa tersebut dapat larut
dalam eluen petroleum eter dan dietil eter sehingga digunakan larutan
pengembang PE dan dietil eter. Perbandingan larutan pengembang yang
digunakan adalah 19:1, 9:1, 7:3, 1:1. Harga rf dari spot yang dihasilkan terlihat
29
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
pada tabel 4. Perbandingan yang digunakan adalah perbandingan fasa gerak yang
memberikan spot terbanyak dengan harga rf yang tinggi.
Tabel 4. Harga Rf dari spot hasil pemisahan ekstrak buah kuning (gambar
plat terlampir pada lampiran 2)
Fasa diam Silika Gel Silika gel :
Alumina (2:3) 19:1* Warna 9:1* warna 7:3* warna 1:1* warna 1:1* Warna 0,53 kuning
** 0,58 kuning
** 0,68 kuning
** 0,8 kuning
** 0,8 kuning
** - - - - - - - - 0,2 Tak
berwarna
* Perbandingan eluen PE:Dietil eter
** lama-kelamaan menjadi pudar kemungkinan karena β-karoten
teroksidasi
Hasil terbaik diperoleh pada perbandingan 1:1 dimana dihasilkan satu spot
berwarna kuning dengan harga rf sebesar 0,8. Untuk perbandingan fasa gerak
yang lebih non polar yaitu pada perbandingan 19:1 dan 9:1 dihasilkan spot yang
tailing dan harga rf rendah, ketika kepolaran dinaikkan dihasilkan satu spot
tunggal dengan harga rf yang relatif rendah sehingga perlu dinaikkan lagi
kepolarannya hingga dihasilkan spot yang tidak tailing dan nilai rf tinggi. Adanya
satu spot mengindikasikan bahwa ekstrak kurang dapat terpisah dengan fasa diam
silika gel saja. Untuk hasil pemisahan yang lebih baik adalah dengan
pencampuran fasa diam antara silika gel dengan alumina. Alumina merupakan
adsorben kuat sehingga interaksinya mengikat solut juga lebih kuat dibanding
silika. Hal ini mengakibatkan senyawa-senyawa dalam ekstrak buah kuning yang
bersifat polar akan semakin tertahan didalam fasa diam sedangkan senyawa non
polar akan terelusi lebih cepat. Alumina yang digunakan adalah alumina yang
teraktifasi basa. Sifat basa pada alumina dapat menyebabkan reaksi saponifikasi
pada trigliserida yang akan berpengaruh pada hasil pemisahan.
Penentuan perbandingan yang digunakan antara silika gel dengan alumina
berdasarkan pada acuan penelitian sebelumnya bahwa asam lemak dan β-karoten
dalam ekstrak buah merah terpisah terpisah baik pada perbandingan 2:3
30
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
(Handayani; Rumanthi, 2008). Diduga terjadi hal yang sama untuk pemisahan
ekstrak buah kuning. Pada perbandingan ini dihasilkan 2 spot dengan harga rf
pada tabel 4. Spot pertama berwarna kuning, namun agak memudar jika dibiarkan
terlalu lama. Spot kedua tidak berwarna dan akan tampak apabila disemprot
dengan rhodamin B dan dilihat menggunakan lampu UV. Rhodamin B adalah
reagen yang digunakan untuk untuk menguji adanya trigliserida dan asam lemak
(Jork,1990). Adanya spot kedua mengindikasikan bahwa asam lemak bebas pada
ekstrak buah kuning telah terpisah dari trigliseridanya.
Kombinasi fasa diam antara silika dengan alumina untuk mendapatkan
hasil pemisahan yang paling baik sedangkan untuk pengubahan senyawanya
dilakukan dengan penambahan MnO2. MnO2 berfungsi sebagai oksidator yang
dapat mengoksidasi trigliserida. Komposisi MnO2 yang ditambahkan adalah 3%
dan 5%. Asam lemak dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan
terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 1,5% (Handayani, 2008),
sedangkan β-karoten dalam ekstrak buah merah bereaksi dengan MnO2 dan
terpisah baik pada konsentrasi minimum MnO2 5% (Rumanthi,2008). Hasil ini
dapat dijadikan pertimbangan bahwa asam lemak yang belum terpisah dari β-
karoten dalam ekstrak buah kuning akan bereaksi dengan MnO2 pada kisaran
konsentrasi >1,5 % dan <5%, sehingga konsentrasi MnO2 yang digunakan adalah
3% dan 5%.
a b
Gambar 12. Plat KLT ekstrak buah kuning dengan modifikasi Si-Al (2:3)+MnO2 (a). 3% dan (b). 5%
Pemisahan dengan komposisi MnO2 5% menghasilkan 4 spot dengan jarak
31
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
rf sebesar 0,8; 0,6; 0,3 dan 0,25. Pada pemisahan dengan komposisi MnO2 3%
menghasilkan 4 spot dengan jarak rf sebesar 0,78; 0,67; 0,33; dan 0,11 seperti
terlihat pada gambar 11. Warna sampel sebelum proses penotolan adalah kuning,
dan pada saat ditotolkan pada plat modifikasi warna ini menjadi pudar.
Kemungkinan yang terjadi adalah warna sampel tertutup oleh warna plat yang
gelap (abu-abu kehitaman), atau dapat dikarenakan langsung terjadi reaksi antara
sampel dengan fase diam saat ditotolkan. Pada saat sampel dielusi tidak
diindikasikan adanya perubahan warna, namun setelah sampel selesai dielusi dan
dikeringkan terlihat adanya dua spot yang tidak berwarna. Plat kemudian
disemprot dengan Rhodamin B dan diamati menggunakan sinar UV. Hasil yang
diperoleh adalah 4 spot dengan karakteristik warna yang hampir sama kecuali spot
pertama yang terlihat lebih jelas sedangkan spot yang lain terlihat agak pudar.
Spot pertama diindikasikan sebagai campuran asam lemak dalam bentuk
trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi dengan MnO2. Spot ketiga dan
keempat merupakan asam lemak bebasnya. Spot kedua dengan jumlah yang
paling sedikit merupakan sisa karoten yang tidak bereaksi dengan asam lemak dan
MnO2.
Pemisahan menggunakan konsentrasi MnO2 5% menunjukkan
karakteristik warna yang sama dengan pemisahan menggunakan konsentrasi
MnO2 3%, perbedaan terdapat pada harga Rf-nya. Pada konsentrasi MnO2 3%
jarak antar spotnya relatif lebih jauh yang menunjukkan bahwa resolusinya lebih
baik. Pada komposisi MnO2 5% spot ketiga tidak terpisah dengan spot keempat.
Komposisi pada perbandingan silika dan alumina 2:3 dan penambahan MnO2 3%
mampu menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik dan harga Rf yang
lebih tinggi serta tidak mengurangi jumlah spot yang dihasilkan dan karakter
warna masing-masing spot, sehingga campuran fase diam inilah yang digunakan
untuk pemisahan dengan kromatografi kolom.
Berdasarkan penentuan fasa gerak dan fasa diam dilakukan pemisahan
dengan kromatografi kolom untuk hasil pemisahan yang lebih baik. Fasa diam
yang digunakan adalah campuran silika dan alumina dengan perbandingan 2:3 dan
penambahan MnO2 3%. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah petroleun
32
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1.
C. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Flash
Pemisahan dengan kromatografi kolom menggunakan kolom berdiameter
2 cm dan panjang 25cm. Total fasa diam yang digunakan adalah 50 g, dengan
perincian MnO2 1,5 g, Silika 19,4 g, dan alumina 29,1 g. Alumina mempunyai
berat molekul yang lebih besar daripada silika gel, sedangka MnO2 mempunyai
berat yang paling ringan sehingga MnO2 akan selalu berada paling atas pada
permukaan kolom. Agar reaksi dapat berjalan sempurna maka MnO2 harus dibuat
sehomogen mungkin dengan yang lain. Salah satu cara adalah dengan metode
kering yaitu dengan memasukkan campuran fasa diam ke dalam kolom yang
berisi pelarut yang paling non polar yaitu PE. Campuran dimasukkan sedikit demi
sedikit dengan komposisi yang sama sehingga akan terbentuk lapisan-lapisan
yang teratur dalam kolom seperti pada gambar 12.
Gambar 13. Kromatografi kolom flash
Fasa gerak yang digunakan adalah petroleum eter dan dietil eter dengan
perbandingan 1:1, 1:2 dan 1:3. Teknik elusi yang digunakan adalah teknik elusi
gradien yang dimulai dari perbandingan fasa gerak yang paling non polar. Asam
lemak merupakam senyawa non polar sehingga digunakan campuran fasa gerak
yang lebih non polar terlebih dahulu agar asam lemak lebih cepat terpisah. Kolom
yang digunakan adalah kolom tekan, sehingga kecepatan alir dari fasa gerak dapat
diatur. Semakin cepat kecepatan alir fasa gerak, semakin kecil tekanan dalam
33
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
kolom kromatografi sehingga reaksi semakin cepat tetapi reaksi tidak maksimal
sehingga hasil pemisahan kurang sempurna. Sebaliknya, semakin lambat
kecepatan alir fasa gerak, semakin besar tekanan dalam kolom dan semakin
maksimal reaksi yang terjadi sehingga akan diperoleh hasil pemisahan yang lebih
sempurna. Kecepatan alir yang digunakan dalam penelitian ini adalah 26 tetes per
menit dan hasil pemisahan ditampung pada tabung reksi kecil setiap 3 ml.
Fraksi yang pertama tertampung berwarna kuning yang merupakan
campuran asam lemak dalam bentuk trigliserida dan β-karoten yang telah bereaksi
dengan MnO2. Kemudian warna kuning tersebut semakin lama semakin hilang
secara keseluruhan.
Hasil elusi yang telah ditampung dalam tabung masing-masing diuapkan
dari pelarutnya dan ditimbang serta diuji dengan plat silika gel menggunakan
larutan pengembang petroleun eter dan dietil eter dengan perbandingan 1:1. Berat
yang diperoleh dapat dilihat pada gambar 14.
Gambar 14. Grafik perubahan massa tabung hasil pemisahan dengan kromatografi kolom flash. Diagram berat eluat dari pemisahan kolom modifikasi menghasilkan dua
puncak yang kemudian eluat yang membentuk kedua puncak tersebut
dikumpulkan menjadi satu sehingga didapat dua fraksi. Masing-masing tabung
dianalisis dengan KLT menggunakan plat silika gel murni untuk
mengelompokkan ke dalam fraksi yang sama. Harga Rf dari masing-masing fraksi
dapat dilihat pada tabel 5.
Asam lemak dalam ekstrak buah kuning terdapat dalam bentuk trigliserida
dan pada pemisahan asam lemak dengan kromatografi kolom yang terpisah
34
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
pertama kali adalah trigliserida dan diikuti dengan asam lemak bebasnya,
digliserida dan monogliserida (Holme,2005). Asam lemak bebas merupakan asam
lemak yang telah terpisah dari trigliserida, digliserida dan monogliseridanya.
Tabel 5. Harga Rf, warna dan berat total tiap fraksi
Fraksi
ke-
Tabung
ke-
rf warna Berat total Identifika
si dengan
rodamin
Identifi
kasi
dengan
SbCl3
1 9-19 0,74 Kuning ± 681 mg Merah
keunguan
merah
2 20-29 0,40 Tak
berwarna
± 23 mg Merah
keunguan
merah
3 30-40 0,15 Tak
berwarna
± 221 mg Merah
keunguan
jingga
· Bentuk spot tidak sama dengan hasil sebenarnya
Gambar 15. Perbandingan Rf plat silika gel awal dengan Rf dari eluat
Masing-masing fraksi dianalisis KLT menggunakan plat silika gel dan
masing-masing fraksi dihasilkan satu spot. Perbandingan mengunakan plat silika
gel awal dengan plat silika gel dari fraksi yang telah melalui modifikasi diperoleh
bahwa asam lemak dalam ekstrak buah kuning dapat mengalami perubahan yaitu
adanya asam lemak bebas yang diturunkan dari hasil modifikasi. Spot ketiga
merupakan asam lemak bebas karena oksidasi dari asam lemak dapat
meningkatkan kadar asam lemak bebasnya. Uji skrining fitokimia terhadap fraksi
35
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
kedua dihasilkan bahwa komponen senyawa dari fraksi kedua mengandung asam
lemak dan karotenoid. Asam lemak yamg dihasilkan pada fraksi kedua
dimungkinkan adalah sisa trigliserida yang tidak bereaksi dengan MnO2 dan
senyawa antioksidan, sedangkan karotenoid pada fraksi kedua adalah sisa karoten
yang tidak bereaksi dengan MnO2.
Ekstrak buah kuning yang dipisahkan dengan plat silika gel menggunakan
eluen PE:dietil eter (1:1) diperoleh satu spot dengan rf 0,8. Setelah dilakukan
modifikasi dengan kolom kromatografi masing-masing tabung dianalisis KLT
dengan plat silika dan diperoleh spot tambahan untuk fraksi yang mengandung
asam lemak yang mengindikasikan asam lemak yang semula tidak terpisah
menjadi terpisah. Fraksi yang dianalisis adalah fraksi pertama dengan harga rf
0,74. menurut Holme (2005) dinyatakan bahwa jika asam lemak dipisahkan
dengan silika yang terpisah pertama kali adalah fraksi trigliserida diikuti oleh
asam lemak bebas kemudian digliserida/monogliseridanya. Dengan kondisi yang
sama pada Holme dapat diperoleh hasil yang sama yaitu fraksi pertama adalah
fraksi trigliserida. Pada penelitian ini diambil hanya fraksi pertama saja yaitu
dengan berat terbanyak karena penelitian hanya ditekankan pada fraksi yang
semula tidak terpisah dengan plat silika saja menjadi terpisah dengan modifikasi,
selain itu dengan modifikasi yang sama yang dilakukan pada ekstrak buah merah
ada senyawa turunan yang masuk pada fraksi trigliserida.
Identifikasi Senyawa
Fraksi pertama diencerkan dengan PE dan dianalisis dengan IR untuk
mengetahui gugus fungsi apa saja yang terdapat pada fraksi pertama. Analisis
spektrofotometer FT-IR terhadap fraksi pertama dari ekstrak buah kuning
memberikan puncak-puncak serapan pada daerah bilangan gelombang seperti
yang ditunjukkan pada gambar 16.
36
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Gambar 16. Puncak-puncak serapan analisis FT-IR terhadap fraksi pertama.
Dari hasil analisis spektroskopi FT-IR memberikan puncak spektrum
dengan puncak-puncak pada daerah bilangan gelombang 2924,09 cm-1 dan
2854,65 cm-1 menunjukkan vibrasi stretching dari C-H sp3 serta didukung pada
daerah bilangan gelombang 1458,18 cm-1 yang menunjukkan vibrasi bending dari
C-H sp3, munculnya puncak serapan pada daerah bilangan gelombang 1743,65
cm-1 menunjukkan adanya vibrasi gugus karbonil C=O dan pada daerah bilangan
gelombang 1165,00 cm-1 menunjukkan vibrasi C-O-C dari ester yang merupakan
serapan ester dari trigliserida serta didukung vibrasi dari alkil rantai panjang ((-
CH2)n) pada daerah bilangan gelombang 725,23 cm-1.
Setelah diketahui gugus fungsi dari fraksi pertama dilakukan analisis lebih
lanjut untuk mengetahui golongan senyawa dengan GC-MS. GC-MS digunakan
untuk mengidentifikasi senyawa yang dihasilkan pada fraksi pertama. Identifikasi
ini digunakan untuk mengetahui jenis asam lemak apa saja yang terdapat pada
fraksi pertama dan kemungkinan senyawa turunan yang dihasilkan. Sebagai dasar
dilakukan analisis yang sama untuk ekstrak awal yaitu ekstrak buah kuning yang
belum dilakukan pemisahan dengan kolom. Ekstrak awal dan fraksi pertama
dianalisis dengan GC-MS model Shimadzu QP2010S dengan kondisi operasi
tertera pada lampiran 2. Hasil kromatogram GC-MS disajikan dalam gambar 17.
C-H sp3
C=O O-C-O
(-CH2)n
C-H sp3
37
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Fraksi yang dianalisis ditransesterifikasi terlebih dahulu untuk menurunkan titik
didihnya sehingga senyawa yang akan teridentifikasi adalah bentuk metil ester
dari asam lemaknya.
a
b
Gambar 17. (a). Kromatogram GC ekstrak buah kuning murni (b). kromatogram GC fraksi trigliserida
Dari hasil analisis GC pada ekstrak dan ekstrak trigliserida diperoleh dua
puncak utama yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa hampir tidak ada
perbedaan antara ekstrak awal dengan fraksi trigliserida setelah dipisahkan dengan
kromatografi kolom. Sehingga dimungkinkan reaksi oksidasi yang dimungkinkan
terjadi pada ekstrak selama dikolom terhalang oleh keberadaan senyawa
antioksidan dalam ekstrak buah kuning.
Identifikasi lebih lanjut dilakukan dengan spektroskopi massa, dari hasil
spektroskopi massa akan diperoleh spektra massa dari masing-masing puncak
yang terdeteksi pada kromatogram GC. Analisis spektra massa didasarkan pada
nilai Similiarity Indeks (SI) yang dibandingkan dengan spektra dari library yaitu
Wiley 229.LIB. spektra massa yang teridentifikasi dan spektra massa senyawa
standar dari Wiley 229.LIB ditunjukkan pada lampiran 3 dan 4.
Berikut analisis spectra massa senyawa yang terdeteksi dengan GC-MS
38
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
yang terkandung dalam ekstrak buah kuning awal dan dalam fraksi trigliserida dan
dibandingkan dengan spectra massa senyawa standar dari Wiley 229 L.IB.
a. Analisis terhadap ekstrak awal
1. Senyawa puncak 1
Senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 25,627 menit dan kelimpahan 20,31 %
dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity
Indeks sebesar 96%. Metal palmitat mempunyai rumus molekul C17H34O2 dengan
m/z 270.
2. Senyawa puncak 2
Senyawa puncak 2 dengan waktu retensi 27,923 menit dan kelimpahan 79,69 %
dibandingkan dengan library adalah senyawa metil oleat dengan Similiarity Indeks
sebesar 96%. Metil oleat mempunyai rumus molekul C19H36O2 dengan m/z 296.
39
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
b. Analisis terhadap fraksi trigliserida
1. Senyawa puncak 1
Senyawa puncak 1 dengan waktu retensi 32,312 menit dan kelimpahan 0,88 %
dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitoleat dengan Similiarity
Indeks sebesar 95 %. Metal palmitoleat mempunyai rumus molekul C17H32O2
dengan m/z 236.
2. Senyawa puncak 2
Senyawa puncak 2 dengan waktu retensi 32,699 menit dan kelimpahan 15,95 %
dibandingkan dengan library adalah senyawa metil palmitat dengan Similiarity
Indeks sebesar 96 %. Metil palmitat mempunyai rumus molekul C17H34O2 dengan
m/z 270.
40
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
3. Senyawa puncak 3
Senyawa puncak 3 dengan waktu retensi 35,842 menit dan kelimpahan 1,62 %
dibandingkan dengan library adalah senyawa glikol-1-palmitat dengan Similiarity
Indeks sebesar 74 %. Glikol-1-palmitat mempunyai rumus molekul C21H44O3
dengan m/z 272.
4. Senyawa puncak 4
Senyawa puncak 4 dengan waktu retensi 36,373 menit dan kelimpahan 77,48 %
dibandingkan dengan library adalah metil oleat dengan Similiarity Indeks sebesar
96 %. Metil oleat mempunyai rumus molekul C19H36O2 dengan m/z 296.
41
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
5. Senyawa puncak 5
Senyawa puncak 5 dengan waktu retensi 36,764 menit dan kelimpahan 1,51 %
dibandingkan dengan library adalah metil stearat dengan Similiarity Indeks
sebesar 95%. Metil stearat mempunyai rumus molekul C19H38O2 dengan m/z 298.
6. Senyawa puncak 6
Senyawa puncak 6 dengan waktu retensi 39,294 menit dan kelimpahan 1,38 %
dibandingkan dengan library adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-etanediol(bentuk
senyawa diol) dengan Similiarity Indeks sebesar 72%. 1-0-oktadekanoil-1,2-
etanediol mempunyai rumus molekul C20H40O3 dengan m/z 292.
42
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
7. Senyawa puncak 7
Senyawa puncak 7 dengan waktu retensi 40,299 menit dan kelimpahan 1,16 %
dibandingkan dengan library adalah metil heptakosanoat dengan Similiarity
Indeks sebesar 80%. Metil heptakosanoat mempunyai rumus molekul C28H56O2
dengan m/z 283.
Berdasarkan hasil analisis dapat diketahui bahwa tidak ada perbedaan
signifikan antara ekstrak murni sebelum dikolom dengan fraksi pertama setelah
dikolom. Terdapat persamaan pada dua puncak utama yaitu metil palmitat dan
metil oleat dengan % area berbeda. Pada ekstrak murni % area untuk metil
palmitat sebesar 20,31% sedangkan untuk metil oleat sebesar 79,69%. Pada fraksi
pertama dari hasil pemisahan terdapat penurunan dari keduanya yaitu metil
palmitat sebesar 15,95% dan metil oleat sebesar 77,48%. Hal ini mengindikasikan
bahwa keberadaan senyawa lain dalam suatu komponen mempengaruhi hasil
analisisnya. Esterifikasi tidak dapat mengubah seluruh trigliserida yang terdapat
pada ekstrak murni menjadi metil ester karena adanya pengaruh senyawa lain
yang dapat mengganggu proses esterifikasi dan memperbesar luas puncaknya.
Kromatografi kolom mampu memisahkan senyawa dari komponen yang lain.
Hasil analisis pada fraksi pertama yang sudah dipisahkan dengan kromatografi
kolom menunjukkan luas area yang lebih sempit dengan puncak yang lebih tajam
dan memaksimalkan proses esterifikasi sehingga puncak-puncak yang tidak
terdeteksi pada ekstrak murni dapat muncul pada fraksi yang telah dipisahkan
dengan kromatografi kolom.
43
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Tabel 6. Perbandingan data GC-MS dengan kandungan dalam ekstrak
buah kuning Data GC-MS Asam Lemak dalam
Ekstrak Buah kuning (Budi,2004)
Ekstrak murni Fraksi pertama %
Area senyawa %
area senyawa Asam
Lemak %
Kandungan - - - - Asam
myristat
0,055
- - - - Asam
pentadekanoat
0,182
20,31 metil palmitat
15,95 metil palmitat Asam
palmitat
10,083
- - 1,51 metil stearat Asam stearat 3,154
- - 0,88 metil palmitoleat
Asam
palmitoleat
1,377
79,69 Metil oleat
77,48 metil oleat Asam oleat 49,83
- - - - Asam
linolenat
0,504
- - - - Asam linoleat 6,307
- - - - Asam
eikosanoat
0,159
- - - - Asam behenat 0,852
- - 1,16 Metil heptakosanoat
- -
- - 1,38 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol
- -
- - 1,62 glikol-1-palmitat
- -
Kromatografi kolom adalah teknik pemisahan senyawa dari ekstrak murni.
Pada saat pemisahan akan terjadi degradasi warna dari senyawa murni yang
berwarna kuning pekat hingga diperoleh fraksi-fraksi yang berwarna kuning
sampai warna kuning hilang secara permanen. Adanya degradasi ini
44
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
mengindikasikan adanya pemisahan senyawa sehingga pada saat dianalisis,
kromatogram menunjukkan waktu retensi yang berbeda untuk senyawa yang
dideteksi sama, yaitu metil palmitat dan metil oleat pada ekstrak murni dan fraksi
trigliseridanya. Berdasarkan literatur disebutkan bahwa selain asam oleat dan
asam palmitat, ekstrak buah kuning juga mengandung asam pentadekanoat, asam
myristat, asam stearat, asam palmitoleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam
eikosanoat. Pada hasil GC-MS senyawa murni asam lemak ini tidak muncul,
tetapi pada hasil GC-MS fraksi pertama muncul asam palmitoleat sebagai asam
palmitoleat, asam stearat sebagai metil stearat.
Berdasarkan hasil analisis teridentifikasi tiga senyawa baru yang tidak
terindetifikasi pada ekstrak murni maupun penelitian yang dilakukuan sebelumnya
oleh Budi (2004). Senyawa tersebut adalah 1-0-oktadekanoil-1,2-ethanadiol
dengan rumus formula C20H40O3 dan glikol-1-palmitat dengan rumus formula
C21H44O3. Munculnya senyawa glikol dan diol terbentuk karena dua atom H pada
trigliserida tersubsitusi oleh atom OH. Asam lemak tak jenuh dalam trigliserida
dapat mengalami oksidasi yang diawali dengan terbentuknya radikal bebas dengan
oksigen membentuk glikol. Adanya senyawa glikol dan diol dihasilkan dari
oksidasi tidak sempurna pada trigliseridanya. Senyawa yang lain adalah metil
heptakosanoat yang mengindikasikan bahwa dalam ekstrak buah kuning
mengandung asam heptakosanoat. Apabila di bandingkan hasil identifikasi fraksi
pertama dengan ekstrak buah kuning murni selisih % kandungan terbanyak adalah
pada metil palmitat sehingga terbentuknya senyawa baru tersebut berasal dari
asam palmitat yang terdapat pada fraksi trigliserida. Sememtara pada fraksi
trigliserida dari ekstrak buah merah selisih % kandungan terbanyak dengan
ekstrak murninya terdapat pada metil oleatnya. Hal ini mengindikasikan
terbentuknya senyawa dioktil pthalat berasal dari asam oleatnya.
D. Pengaruh Penambahan Alumina dan MnO2
Alumina yang digunakan dalam penelitian ini adalah alumina basa, sifat
kebasaan dalam alumina sering menyebabkan reaksi sekunder. Sebagai misal, ia
dapat menyebabkan kondensasi dari aldehid-aldehid dan keton-keton, hingga bila
45
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
hal ini terjadi dapat menyebabkan isomerisasi dari berbagai senyawa seperti
terpen dan sterol (Sastrohamidjoyo, 2002). Alumina merupakan katalis basa yang
mempunyai atom oksigen dengan muatan yang tinggi serta pH mendekati 10.
Adanya alumina dapat meningkatkan aktivitas dari MnO2 sebagai oksidator yaitu
dengan memberikan elektronnya pada MnO2 sehingga MnO2 dapat dengan mudah
melepaskan oksigennya.
Pada konsentrasi MnO2 3%, kemungkinan yang terjadi adalah asam lemak
yang berada dalam bentuk trigliserida bereaksi terlebih dahulu dengan
oksidatornya meskipun reaksi akan terhalang oleh keberadaan senyawa
antioksidan yang berupa β-karoten dan tokoferol mengingat kedua senyawa ini
adalah senyawa yang mudah teroksidasi. Kemungkinan yang terjadi β-karoten
akan teroksidasi terlebih dahulu untuk melindungi oksidasi asam lemaknya.
Setelah β-karoten habis oksidasi asam lemak terjadi tetapi terhalang oleh senyawa
antioksidan yang lain. Kemungkinan yang lain asam lemak teroksidasi terlebih
dahulu tetapi dihalangi oleh keberadaan senyawa antioksidan mengingat
kandungan terbesar dalam ekstrak adalah asam lemak.
E. Pengaruh keberadaan antioksidan dalam ekstrak buah kuning
Antioksidan yang terdapat pada ekstrak buah kuning adalah β-karoten dan
tokoferol. Kedua senyawa ini merupakan senyawa aktif dalam ekstrak buah yang
mampu menangkal adanya radikal bebas dalam tubuh. Keduanya juga merupakan
senyawa yang mudah teroksidasi. Pada saat ketiganya berada bersamaan dengan
konsentrasi oksidator tertentu, maka akan terjadi reaksi yang dapat menyebabkan
perubahan dan dimungkinkan bersifat toksik.
Dari hasil kromatogram GC-MS pada fraksi asam lemak tidak dideteksi
adanya senyawa turunan dari asam lemak. Hal ini mengindikasikan bahwa ada
pengaruh dari senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak buah kuning yaitu β-
karoten dan tokoferol. Penambahan antioksidan dalam konsentrasi rendah dapat
menghambat dan atau mencegah reaksi autooksidasi pada lipida. Penambahan ini
menghalangi reaksi oksidasi lipida pada tahap terminasi maupun propagasi.
Mekanisme ini sering digunakan dalam pengujian aktivitas antioksidan.
46
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
Mekanismenya adalah pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam
lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan
sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). pada tahap
selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen
membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan
menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak
baru (reaksi 3).
Inisiasi : RH R* + H* (1)
Propagasi : R* + O2 ROO* (2)
ROO* + RH ROOH +R* (3)
Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi
lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti
aldehida dan keton. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan
mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks
bukan radikal (reaksi 4).
Terminasi : ROO* +ROO* non radikal (reaksi 4)
R* + ROO* non radikal
R* + R* non radikal
Antioksidan yang baik akan bereaksi dengan radikal asam lemak segera
setelah senyawa tersebut terbentuk. Dari berbagai antioksidan yang ada,
mekanisme kerja serta kemampuannya sebagai antioksidan sangat bervariasi.
Seringkali, kombinasi beberapa jenis antioksidan memberikan perlindungan yang
lebih baik (sinergisme) terhadap oksidasi dibanding dengan satu jenis antioksidan
saja (Medikasari, 2002). Kombinasi antara β-karoten dan tokoferol dalam ekstrak
buah kuning dapat menghalangi oksidasi asam lemaknya. Hal ini dibuktikan dari
tidak adanya derivat asam lemak pada spektra GC-MS.
Fenomena ini berbeda dengan pemisahan pada ekstrak buah merah. Pada
ekstrak buah merah murni yang dipisahkan dengan modifikasi yang sama
dihasilkan senyawa turunan asam lemak yaitu dioktil p-thalat. Perbedaan hasil ini
dimungkinkan karena perbedaan kadar asam lemak tak jenuh dan perbedaan
47
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
kadar senyawa antioksidan yaitu β-karoten dalam ekstrak buah merah dan
ekstrak buah kuning.
Berdasarkan penelitan ini dapat diketahui bahwa keberadaan senyawa
antioksidan dalam ekstrak buah kuning mampu menangkal radikal bebas yang
dihasilkan dari reaksi oksidasi asam lemaknya. Sehingga ekstrak buah kuning
aman dikonsumsi secara langsung. Kelebihan asam lemak dalam tubuh akan
disimpan dalam bentuk trigliserida sebelum masuk pada jalur asam lemak.
48
perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Dari hasil penelitian dan pembahasan dapat diambil kesimpulan bahwa
dengan teknik kromatografi kolom yang dimodifikasi fasa diamnya yaitu
dengan penambahan alumina basa pada silika dan MnO2 3% trigliserida
terpisah dari asam lemak bebas pada ekstrak buah kuning yang terbentuk
dari hasil modifikasi.
2. Dari hasil pemisahan ini pada fraksi trigliseridanya tidak dihasilkan
senyawa turunan dioktil pthalat sebagai senyawa turunan asam lemak.
Sedangkan untuk fraksi trigliserida pada ekstrak buah merah dapat
dihasilkan senyawa dioktil pthalat. Perbedaan hasil ini disebabkan karena
perbedaan jenis asam lemak yang bereaksi dengan oksidator.
B. Saran
Berdasarkan kesimpulan diatas hendaknya dilakukan penelitian lebih lanjut
mengenai:
1. Mekanisme penghambatan reaksi oksidasi oleh β-karoten dan tokoferol
dalam pemisahan trigliserida menggunakan teknik modifikasi fasa diam
kromatografi untuk mengetahui manakah yang dominan menghambat
reaksi oksidasi.
2. Identifikasi fraksi kedua jika fraksi dipisahkan dan dikumpulkan dalam
jumlah yang banyak sehingga dapat diketahui jenis asam lemak dan
senyawa lain.
49