MODULO 4: “Apoptosis”

Laboratorio Inmunopatología, Instituto Multidisciplinario de

Investigaciones Biológicas-San Luis (IMIBIO-SL) CONICET-UNSL.

Inmunología,

Fac. de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL)

Especialidad en Bacteriología ClínicaUniversidad Nacional de San Luis, 13 de abril de 2013

Dra. María Silvia Di Genaro

Apoptosis o muerte celular programada, se caracteriza por cambios

morfológicos propios y por mecanismos bioquímicos dependientes de

energía (activación de cistein proteasas, caspasas).

Apoptosis, del griego “caída de las hojas” (Kerr, 1972).

(premio Nobel en 2002)

energía (activación de cistein proteasas, caspasas).

Es vital para la renovación normal de las células, el desarrollo y el

funcionamiento del sistema inmune, atrofia dependiente de

hormonas, desarrollo embrionario,.

Inapropiada apoptosis (aumento o disminución) se asocia con:

Enfermedades neurovegetativas

Daño isquémico, desordenes autoinmunes,

Diferentes tipos de cáncer.

Disminución del volumen celular, membranas celulares extendida,

cromatina condensada debajo de la envoltura nuclear, y

eventualmente celda de aislamiento con la formación de numerosos

vesículas que contienen orgánulos intactos.

Microscopia óptica (Hematoxilina-eosina).

Célula redondeada u ovalada, núcleos picnóticos por

condensación de la cromatina, citoplasma eosinófilo.

Toxic Pathol, 2007

Microscopia electrónica:

Condensación de cromatina agregación de material electrodenso en periferia,

debajo de membrana nuclear, aunque el núcleo puede ser uniformemente denso

budding

Toxic Pathol, 2007

Cuerpo apoptótico

Macrófago

fagocita

cuerpo

apoptótico

Apoptosis vs Necrosis

NECROSIS APOPTOSIS

Características morfológicas

•Pérdida de la integridad de

membrana

•Floculación de la cromatina

•Dilatación de la célula y lisis

•No hay formación de vesículas,

•Deformación de la membrana,

sin pérdida de integridad

•Agregación de la cromatina en

la membrana nuclear interna

•Condensación y/o reducción •No hay formación de vesículas,

lisis completa

•Desintegración (dilatación) de

organelas

•Condensación y/o reducción

celular

•Formación de vesículas

limitadas por membrana

(cuerpos apoptóticos)

•No hay desintegración de

organelas y permanecen

intactas

Características bioquímicas

•Pérdida de la regulación de la

homeostasis iónica

•No requiere energía (proceso

pasivo, también sucede a 4ºC)

•Digestión del DNA al azar

(patrón en mancha del DNA

•Proceso muy regulado, que

implica pasos enzimáticos y de

activación

•Requiere energía (ATP)

(proceso activo, no sucede a

4ºC)

NECROSIS APOPTOSIS

(patrón en mancha del DNA

después de electroforesis en

gel de agarosa)

•Fragmentación postlítica del

DNA (último evento de muerte

celular)

4ºC)

•Fragmentación del DNA en

mono- y oligonucleosomas, no

al azar (patrón en escalera

después de electroforesis en

gel de agarosa)

•Fragmentación prelítica del

DNA (primer evento de muerte

celular)

Significado fisiológico

•Muerte de grupos de células

•Originada por estímulos no

fisiológicos

•Fagocitosis por macrófagos

•Respuesta inflamatoria

•Muerte de células individuales

•Inducida por estímulos

fisiológicos

•Fagocitosis por células

adyacentes o macrófagos

NECROSIS APOPTOSIS

•Respuesta inflamatoria

significativa

adyacentes o macrófagos

•Respuesta no inflamatoria

Señal de muerte celular

Tipo de tejido

Estado de desarrollo del tejido

Medio fisiológico

?

NECROSIS APOPTOSIS

Otros tipos de muerte celular

Mecanismos de Apoptosis

(por receptores) (mitocondrial)

Independiente de

caspasas

infecciones

Expresión de ligandos para los receptores de fagocitosis (expresión de

fosfatidilserina de la bicapa lipidica a la exerna

Cliva SET, el que inhibe un gen

que codifica para una DNAsa

Caspasas:

• cistein proteasa que clivan proteínas

en residuos de acido aspártico.

• Se expresan como procaspasas

inactivas, una vez activadas, activan

otras procaspasas (cascada

proteolítica, que amplifica la señal

apoptótica)

• 10 caspasas han sido identificadas:

• Iniciadoras: caspasas-2, -8, -9, -

10.

• Efectoras: caspasas-3, -6, -7.

• Inflamatorias: caspasas-1, 4, -5.

• Otras: -11 (regula apoptosis en

shock séptico)

• -12 (apoptosis por endoplasmina y

ββββ−−−−amiloide), -13 (bovina), y -14 en

tejido embrionario, no en adulto)

Otras funciones de las caspasas

FasL

DISC DISC ((deathdeath--

inducinginducing

complexcomplex))

TNF

infecciones

Rol de la mitocondria

Toxic Pathol, 2007

Toxic Pathol, 2007

Toxic Pathol, 2007

Fagocitosis de células apoptóticas:

última fase del proceso de apoptosis

Célula fagocíticaCuerpo apoptótico

fagocitado

Asimetría de fosfolípidos y externalización de fosfatidilserina

Métodos para estudiar la Apoptosis

Tener en cuenta:

• Cinética: Medir apoptosis temprana (iniciación) y tardía (ejecución)

• Combinar métodos de diferentes principios.

• Células en cultivo sufren apoptosis in vitro y eventualmente necrosis

secundaria

• Células en apoptosis pueden morir y desaparecer relativamente rápido.

(entonces falsos negativos)

• Tiempo desde inicio a finalización de apoptosis puede ser tan rápido como 2-3

hs.

• Caspasas pueden expresarse transitoriamente.

• Apoptosis puede ocurrir con baja frecuencia.• Apoptosis puede ocurrir con baja frecuencia.

Tipos de ensayos:

1. Alteraciones citomorfológicas

2. Fragmentación del ADN

3. Detección de de caspasas, clivaje de sustratos, reguladores e inhibidores

4. Alteraciones de membrana

5. Ensayos de mitocondrias.

Métodos para estudiar la Apoptosis

Alteraciones citomorfológicas

TEM: método “gold standard” para confrimar apoptosis

Fragmentación del ADN

”escalera de ADN”

Métodos para estudiar la Apoptosis

Apoptosis tardía

TUNEL

Métodos para estudiar la Apoptosis

Método sensible

IHQ

Detección de de caspasas, clivaje de sustratos,

reguladores e inhibidores

Métodos para estudiar la Apoptosis

Figure 5 are of myocardium from 14-week-old rats treated with ephedrine (25 mg/kg) and

caffeine (30 mg/kg). Figure 5A is the interventricular septum stained by anti-phospho-

H2A.X, a histone variant that becomes phosphorylated during apoptosis; note the strongly

stained apoptotic bodies (arrows).

Métodos para estudiar la Apoptosis

Alteraciones de membrana

(Anexina V)

Métodos para estudiar la Apoptosis

Ensayos de mitocondrias.

Potencial transmembrana de mitocondria

Con colorantes flurorescentes lipofííicos.

En apoptosis el potencial de la membrana

esta disminuido, entonces el colorante

permanece monomérico, de color verde.

Puede medirse por citometría de flujo o

por microscopia.

MUCHAS GRACIAS