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C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMICROBIOLOGIA CLINICACL MEDICINA E CHIRURGIA – AA 2014-2015

Modulo 4: DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraNuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: [email protected]

DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI

APPROCCIO GENERALE

Presuppone un’adeguata diagnosi clinica:

corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere lo spettro delleindagini da eseguire

Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette

corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico

Diagnosi di laboratorio indispensabile quando:

sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico

il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati (forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie)

sia necessario seguire “particolari” categorie di pazienti (ad esempio, immunodepressi)

si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati

si ricerchi l’agente eziologico di nuove o gravi patologie

si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata popolazione


APPROCCIO GENERALE

La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può essere eseguita seguendodue approcci differenti:

approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus direttamente nel campione clinico. Ad eccezione dell’isolamento colturale, sono metodiche rapide, in grado di fornire una risposta al quesito diagnostico in poche ore o, al massimo, in giornata.

isolamento virale (coltivazione)

ricerca di particelle virali (microscopia)

ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica, IF)

ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare)

approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei pazienti la presenza di anticorpi controspecifici antigeni virali:

ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici

RICERCA VIRALE


ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE

E’ il GOLD STANDARD tra le metodiche utilizzate in diagnosi virologica.

I virus sono patogeni “intracellulari obbligati”,

quindi:

richiedono l’inoculazione in ospiti viventi adeguati (cioè: sensibili e permissivi)

OSPITI PER L’ISOLAMENTO DI:

Fagi (batteriofagi o virus batterici)

Batteri

Virus animali

Animale

Uova embrionate

Coltura cellulare animale

Virus vegetali

Pianta

Coltura cellulare vegetale


OSPITI PER VIRUS ANIMALI

Animale

Topo, coniglio, maiale

Embrione di pollo (uova embrionate)

Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali)

Colture cellulari

Coltura di cellule adese a substrato (monostrato) oppure in sospensione (tessuto emopoietico: linfociti). Tre tipologie di coltura, a seconda dello spettro di infezione (n specie virali infettanti) e vita media:

Colture “primarie”: cellule ottenute a seguito di separazione chimica/meccanica da campionebioptico. Ampio spettro di infezione virale ma vita a breve termine (1 generazione). Esempio: cellule di rene (canine, umane o di coniglio) per l’isolamento di Paramyxovirus, Enterovirus, Adenovirus.

Colture semicontinue (diploidi): derivano dall’embrione umano. Spettro di infezione simile alleprimarie, possono però essere mantenute per più generazioni (fino a 100). Esempio: fibroblasti fetali umani per isolamento di HSV, VZV, CMV, Adenovirus.

Colture continue o “trasformate”: cellule trasformate (immortalizzate) ed aneuploidi, si replicanoindefinitamente, sebbene presentino uno spettro di infezione più ridotto. Esempio: cellule HeLa, Caco-2, Hep-2.


TECNICA DI ISOLAMENTO

Procedura:

1.Trattamento del campione per limitare la inattvazione virale (es. neutralizzazione pH

urine; decontaminazione batterica in campioni altamente contaminate)

2.Semina del campione

3.Mantenimento ed ispezione delle colture (33-37°C; 1-2 volte al giorno)

4.Rilevazione di avvenuta replicazione virale.

formazione di placche (aree localizzate di lisi/distruzione cellulare)

comparsa di “effetti citopatici caratteristici” (CPE)

5.Tipizzazione del virus

Esposizione del monostrato

cellulare al campione

Effetto citopatico

(CPE o placca)

Rilevazione di antigeni virali

(virus a crescita lenta o CPE-)


TECNICA DI ISOLAMENTO


MATERIALI BIOLOGICI

Virus del morbillo. Cellule A549

(carcinoma gastrico umano).

Virus del morbillo. Sezione istologica di

biopsia polmonare in paziente

immunocompromesso con polmonite.

Sincizio: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, virus-indotta, di singole cellule. Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV, RSV.


CYTOPATHIC EFFECT (CPE)

RSV in coltura cellulare.

Corpi di inclusione: cambiamenti istopatologici cellulari causati, direttamente od

indirettamente, dal virus:

corpi del Negri (Rhabdovirus)

inclusioni di Cowdry di tipo A (Herpesvirus, varicella-zoster)

inclusioni ad “occhio di gufo” (CMV)

CMV: inclusioni ad

“occhio di gufo”


CPE


PLACCA LITICA

Vaiolo su cellule di rene di

scimmia (BSC40). Placca

singola, 48 h. MOI: 1

Vaiolo su cellule di rene di

scimmia (BSC40). Numerose

placche, 48 h. MOI: 100

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4

Formazione di placche litiche,

evidenziate a seguito di

colorazione con cristalvioletto

Molteplicità di infezione (Molteplicity Of Infection, MOI): rapporto tra numero di agenti

infettanti (batteri, virus) e numero di cellule infettate, presenti in un sistema sperimentale.

Consente di isolare, tipizzare e conservare il virus. Possibilità di isolare virus non sospettabili o non conosciuti al momento

dell’isolamento. Importante per HIV (diagnosi precoce in bambini nati da madri sieropositive) e CMV

(diagnosi in bambini da madri con infezione in atto od immunodeficienti) Altamente sensibile e specifica, se associata ad ID sierologica

TUTTAVIA: Richiede lunghi tempi di esecuzione, strumentazione dedicata, elevato “expertise”. E’ necessario un sospetto eziologico, in quanto i virus presentano un tropismo

cellulare. Dipendente dalla presenza di virus vitali nel campione (la refrigerazione inattiva i

virus «enveloped»). Impossibilità di coltivare alcuni virus (HPV, EBV, HBV, HCV, rotavirus). Poco sensibile (in caso di infezioni paucivirali) e specifico, se non associata ad altri

tests (sierologici).


PRO & CON

Le ridotte dimensioni virali (20-300 nm) richiedono l’utilizzo della microscopia elettronica.

Il campione viene attraversato da un fascio di elettroni in un sistema sotto vuoto; in tal modo, viene

proiettata una immagine, ingrandita centinaia di migliaia di volte, su uno schermo a

fluorescenza.

L’osservazione microscopica ha valore identificativo in quanto fornisce informazioni sulla forma,

dimensioni, struttura ed organizzazione virale.

Causa scarsa sensibilità della tecnica, il campione viene generalmente concentrato

(ultracentrifugazione) prima dell’osservazione, tranne che per campioni fecali o lesioni da HSV

(1011 virioni/ml). E’ possibile aumentare la sensibilità mediante utilizzo di anticorpi specifici

(immunomicroscopia elettronica).


OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente utilizzata:

adsorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale

metallico pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido

fosfotungstico).

colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto

negativo); in realtà, anche i virus assorbono una piccola quantità di

colorante che ne mette in evidenza alcuni dettagli strutturali.

SARS

HIV Ebola virus

HBV


OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

Consente di identificare nuovi virus (es. coronavirus della SARS) Rapida (15-30 min) Specifica

TUTTAVIA: Scarsa sensibilità: 106-107 virioni/ml Elevati costi di gestione Richiesta di elevato expertise

MICROSCOPIA ELETTRONICA

PRO & CON

E’ necessario disporre di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici. Tecnica impiegata nella diagnosi di numerose infezioni:

A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare (cellule, feci, sangue-siero) possono essere applicate differenti tecniche:

Immunofluorescenza (IF) Immunoperossidasi Immunoenzimatica

In genere, la sensibilità di queste tecniche è maggiore di quella associata all’isolamento virale.


RICERCA DI ANTIGENI VIRALI

Immunofluorescenza (IF): rivelazione “fluorescente” del complesso Ag-Ab mediante tecnica «diretta» od «indiretta»

IF impiegata per la ricerca di: antigeni virali presenti nelle cellule epiteliali di sfaldamento delle vie respiratorie (BAL,

aspirato naso-faringeo) (adenovirus, coronavirus, VRS, virus influenzali e para) o di occhio e cute (HSV, VZV);

antigene precoce pp65 di CMV nei leucociti infetti.



CMV all’interno di leucocitiCoronavirus in cellule epiteliali di sfaldamento

Immunoperossidasi (IP): rivelazione “colorimetrica” del complesso Ag-Ab similare alla IF, sebbene l’anticorpo sia marcato con perossidasi di rafano che, in

presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione colorimetrica molto utile se applicata a tessuti integri, colorati per l’istochimica (definizione

delle relazioni spaziali tra antigene virale e strutture cellulari).



Ricerca di antigeni specifici mediante ELISA Ricerca immunoistochimica antigenica del West Nile virus nel cervello di hamsters infetti

Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione “colorimetrica” complex Ag-Ab. “sandwich test”: anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad una superficie

plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig

utilizzabile anche per antigeni “solubili” non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione

E’ la metodica più frequentemente impiegata nei laboratori di virologia. Adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida (sangue, liquor,

siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle co-colture infette. Impiegata nella diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici (rotavirus), epatici

(HBV) e HIV.



Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali

Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione)

Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus:

difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus)

a lenta crescita (CMV, VZV)

ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica

Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità

Differenti tipologie di saggi molecolari:

Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA)

Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e rivelazione

elettroforetica

Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che impiega

una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di amplificazione

vs PCR)

Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bDNA, HC):

bDNA: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi alcalina

complementari alla molecola di bDNA)

Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato con sonda

a RNA specifica per la sequenza in esame


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: PCR

HC assay: utilizzato per la ricerca e la genotipizzazione di HPV


RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: HYBRID CAPTURE (HC)

DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLE INFEZIONI VIRALI


RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE)

La prevalente componente proteica della struttura virale rende il virione altamente immunogeno. Nel corso dell’infezione virale vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali:

IgM, si manifestano precocemente (indice di infezione in atto/recente) e solo nella “prima infezione” di soggetto non immune. Scompaiono dopo alcune settimane.

IgG, si presentano più tardivamente ma persistono per anni. Sono prontamente mobilizzate a seguito dei possibili successivi contatti con l’antigene. “Controllo” virale a livello sierico. Più efficaci delle IgM.

IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante ruolo di “barriera” alla penetrazione virale delle mucose.

La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla ricerca di IgM o alternativamente:

sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto

aumento (≥ 4-fold) del titolo anticorpale (2 campioni: fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto.

Generalmente preferita all’isolamento, la diagnosi sierologica risente della reattività crociata tra virus appartenenti alla stessa famiglia (sierotipi)

Le tecniche immunologiche per la ricerca di anticorpi virali comprendono:

saggi FUNZIONALI

saggi su MEMBRANA

saggi di LEGAME


RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE)

SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche attività derivanti dalla formazione dell’immunocomplex:

Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un caratteristico effetto citopatico (CPE). Rappresenta il “gold standard”, sebbene costoso e time-consuming.

Reazione di inibizione dell’emoagglutinazione: Abs specifici in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus (influenza, parainfluenza, morbillo).

Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs specifici si forma un immunocomplesso che lega il Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione dell’immunocomplesso: Ag + eritrociti).


RISPOSTA ANTICORPALE

Titolo anticorpale. Il titolo è il reciproco della più alta diluizione del siero del paziente che mantiene attività rilevabile nei confronti di un antigene noto:

neutralizzare un CPE

inibire la reazione di emoagglutinazione



Nella diagnosi sierologica, il titolo anticorpale ci da informazioni sulla:

sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto

aumento (≥ 4-fold) del titolo anticorpale misurato in 2 campioni (fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto.


SAGGIO DI NEUTRALIZZAZIONE CPE


SAGGI DI INIBIZIONE EMOAGGLUTINAZIONE

SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot): identificazione di Abs diretti verso singole e specifiche proteine virali.

Procedura

1. separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante elettroforesi

2. trasferimento Ags su membrana

3. esposizione al siero in esame

4. sistema di rilevazione colorimetricadell’immunocomplex: Abs anti-Ig umanemarcati con enzima

5. aggiunta del substrato per l’enzima

6. rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)




WESTERN BLOT

SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e radiometrico):

1. adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o microsferule di polistirene)

2. aggiunta del siero in esame

3. rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2ario anti-IgG umanemarcato con:

• EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire con idonei substrati; reazione colorimetrica, misurata allospettrotometro.

• RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo (125I); segnalemisurato con un contatore di raggi .

Sensibilità RIA > EIA. Tuttavia, il saggio EIA viene comunemente preferito perchèautomatizzabile, versatile, standardizzabile.




EIA RIA

DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE


MICROSCOPIA ELETTRONICA

La microscopia elettronica può essere utilizzata anche per valutare il titolo viralepresente in un campione.

1. La sospensione virale viene posta su un retino per ME e colorato.

2. Alla sospensione viene aggiunta una quantità nota di sferedi latex.

3. Il rapporto relativo sfere-virus fornisce una stima della

carica virale.

Non è una tecnica standardizzata e di uso frequente

Richiede un sufficiente numero di particelle virali. Adatto per diagnosi di infezioni con massiva eliminazione virale (Rotavirus)

Aggiunta di anticorpi specifici per aumentare la sensibilità (immunoelettromicroscopia)

Sovrastima del titoloMicrofotografia di una goccia contenente microsfere in lattice (sferiche) ed unità di virus vaccinico (Poxvirus) (più piccole, forma a “mattone”).(Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, 2001)

MISURAZIONE DELLA CONCENTRAZIONEDELLE UNITÀ (VIRALI) INFETTANTI

Titolo virale (ufp/ml)

Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la formazione di placche

(ufp) in cellule animali in coltura od in uova embrionate

Dose letale 50 (LD50)

Numero (titolo) di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie infettate

sperimentalmente

Dose di coltura tessutale (TVD)

Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare

Dose infettante (ID50)

Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta anticorpale, nel

50% di un gruppo di cavie infettate sperimentalmente

CALCOLO DI LD50

Titolo virale = 100 ufp (unità formanti placca) x 105 (fattore diluizione) = 1 x 107 ufp/ml


SAGGIO DI PLACCA (PLAQUE ASSAY)


Formazione di “pocks” emorragici indotte da cowpox virus sulla membrana corion-allantoidea (CAM) di embrioni di pollo, a seguito di incubazione per 3 gg a 37.5°C.


INOCULAZIONE DI UOVA EMBRIONATE


Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg “Microbiology” 4th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig. 48-1

Titolo virale = reciproco della max diluizione virale che causa emoagglutinazione = 32 unità HA/ml

1. Allestire diluizioni seriali “2-fold” del campione (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, …)2. Aggiungere 1% RBC animali (maiale, pollo)3. Incubare a +4°C per 1-2 h4. Lettura risultati


SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE

Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti campioni, numerati da 1 a 7, sono stati diluiti serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo, ed incubati in ghiaccio per 1-2 h. I pozzetti dell’ultima riganon contengono virus (ctrl negativo). Il Titolo è indicato a destra dell’ultima colonna.(Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)


SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE

Tecnica Quantità (per ml)

Conta al microscopio elettronico 1010 particelle EM

Saggio in uova embrionate 109 egg ID50

Saggio di formazione di placca 108 ufp

Saggio di emoagglutinazione 103 unità HA

Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4

sen

sib

ilità


SENSIBILITA’ TECNICA

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