Molecular Biology Presentation

生醫三 Group 13

992334 林思慧992339 黃珮瑄

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LB plate

Negative control

Ligation 13-1 Ligation 13-2

Positive control

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Plasmid DNA13 M P L1 L2 13* P* L1* L2* 13 P L1 L2 13* P* L1* L2*

M:markerL:ligationP:positive

Black:person 1 (思慧 )Blue:person 2 (珮瑄 )* : treated with restriction enzyme

3.0 kb

0.5 kb

1.0 kb

8.0 kb

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Discussion

• 塗菌的時候沒有塗均勻， colonies 沒有分散，挑菌的時候不易找到單一的菌落。

• 塗菌時取的菌液量 (300μl) 太多，菌長得很密。• 跑 DNA 電泳時，因為在 load DNA 不小心太快，

部分 DNA 會被沖到 well 外，使得跑出來的兩組band 亮度稍微不同。

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Summary

• 塗盤– Negative control 知道 Ampicillin 有效抑制雜菌生

長– Positive control 中攜帶抗 Amp gene 的細菌能夠生

長– Ligation 的 LB plate 上都是攜帶抗 Amp gene 的DH5α 菌株

• DNA 電泳– 經酵素切過後， ligation1&2 在 1kb 的位置都有跑出band ，即 transformation 有成功將帶有 DNA 片段的vector 轉入 DH5α 菌株中。

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SDS-PAGE (CBR)

M GST GST

GST-D

GST-D

GST GSTGST

-DGST

-D

Purification No PurificationGST GST-D

+- +-

IPTG

+- +- +- +-

- : No Purification+ : Purification

75kDa

28kDa

7

PVDF membrane (Antibodies)

M GST GST

GST-D

GST-D

GST GSTGST

-DGST

-D

Purification No Purification

75kDa

28kDa

8

PVDF membrane (CBR)

M GST GST

GST-D

GST-D

GST GSTGST

-DGST

-D

Purification No Purification

75kDa

28kDa

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Discussion

• 在封膠的時候有小泡泡，所以膠有龜裂的現象• 可能配膠時沒有做好，所以不管是 maRker 還是蛋

白跑的結果中會看到糊掉的 maRker 或染出直線狀痕跡

• Transfer 過程沒有完全趕掉泡泡，阻擋protein 與 PVDF 結合，但是在這裡不影響實驗結果的觀察

• 可能 Transfer 到 PVDF membrane 上的蛋白量很少，或者抗體作用不完全，導致免疫染色的結果不佳

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Summary

• 經過 IPTG 誘導基因表達並加以純化， western blot 結果在 ~28kDa 有大量蛋白的表現。

• 由 PVDF membrane 上的 CBR 檢測結果可知PVDF membrane 上是有蛋白成功transferred 。利用免疫染色更容易探討單一個蛋白的表現。這個部分實驗可以再次做確認。

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References

• 慧眾生物科技有限公司 -1kb DNA Ladder DL1000 http://www.bioman.com.tw/pr_cont.asp?id=3&myarea=1

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