Moleküler Biyoloji(2011-2012)

Doç. Dr. Ercan ARICANMoleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

DNA YAPISI VE ANAL İZİ

Genlerde, bir sonraki kuşağa aktarıldığında soyun biçimini ve özelliklerini etkileyen bilgiye GENETİK BİLGİ denir.

1944’e kadar, kromozomlardaki hangi bileşenin genleri ve genetik materyali oluşturdu ğu açık değildi. 1944 yılında nukleik asitin (DNA)

kalıtıma ait bilgiyi ta şıdığı kanıtlanmıştır.

James Watson ve Francis Crick’in DNA’nın ikili sarmal yapısıyla ilgili hipotezlerini ortaya çıkaran öncü çalışmaları, 1953’te Nobel Ödülünü

almıştır.

Genetik Materyal Dört Özellik Göstermelidir…

•Kendini eşleme (replikasyon)

•Bilgi depolama

•Bilgiyi ifade etme

•Mutasyonla çeşitlenme (varyasyon)

Genetik materyalin “replikasyonu” bütün canlı organizmaların temel bir özelliğidir ve hücre döngüsünün bir bölümünde yer alır.

“Depolama” özelliği, bir organizmanın tüm kalıtsal özelliklerinin toplandığı genetik bilgi olarak düşünülebilir. Ancak depolanan bilginin

tamamı ifade edilir yada edilmez.

Hücrelerin çoğu DNA’nın tamamına sahip olduğu halde belirli bir noktada bu genetik potansiyelinin bir bölümünü ifade ederler.

Bakteriler belirli çevre ko şulları kar şısında birçok geni faaliyete geçirir. Omurgalılarda deri hücrelerinde melanin geni aktiftir ama hemoglobin

genleri hiçbir zaman ifade edilmezler.

Depolanan bilginin “ifadesi” karma şık bir i şlemdir ve hücrede bilgi akışının temelini oluşturur.

İlk i şlem, DNA’nın üç tip RNA molekülü; mRNA, tRNA ve rRNA oluşturmak üzere transkripsiyonu (okuma) ile başlar. Bunların içinden

sadece mRNA’nın proteine translasyonu yapılır.

Translasyon (çeviri), rRNA içeren ribozomlarda tRNA’nın da katılımıyla gerçekleşir. tRNA, mRNA’daki kimyasal bilgiyi, proteinleri o luşturan

amino asitlere çevirerek adaptör rolü oynarlar.

Bu işlemler “moleküler genetiğin santral dogmasını” oluşturur. “DNA’dan RNA, RNA’dan protein sentezidir.

Genetik materyal aynı zamanda, mutasyonlar yoluyla organizmalar arasında ortaya çıkan yeni “çeşitlili ğin” de kaynağıdır.

Mutasyon eşey hücrelerinde olursa, gelecek kuşaklara aktarılır ve zamanla populasyon içerisinde yayılır. Kromozomların içinde ve kromozomlar

arasında yer alan yeniden düzenlenmeleri (rekombinasyon) de kapsayan genetik çeşitlilik evrimin ham maddesidir.

1944’e kadar yapılan gözlemler, genetik materyalin protein olduğunu düşündürmüştür.

Bu inanç, üç faktörden kaynaklanmıştır.

•Proteinler hücrelerde bol olarak bulunmaktadır (%50)

•1900’lerin başından ortalarına kadar nukleik asitlerin kimyasal yapıları ile ilgili olarak kabul edilmi ş olan öngörüdür.

DNA ilk olarak 1868 yılında İsviçreli kimyacı Friedric Miescher tarafından çalışılmıştır. Miescher sitoplazmadan “nuklein” adını verdiği asidik bir

maddeyi izole etmiştir.

1910’larda Phoebus A. Levene, nukleotidlerin nukleik asitlerdeki kimyasal yerleşimini açıklamak için “tetranukleotid hipotezini” ön ermiştir.

Son derece basit dört nukleotid birimi DNA’da devamlı tekrarlanmaktadır.

Dört nukleotidin oldukça değişen oranlarda bulunduğunu gösterdiği halde Levene, bu oranın 1:1:1:1 olduğunu varsaymıştır.

Genetikçiler, genetik materyalden beklenen büyük miktarda kimyasal farklılı ğı bu yapının sağlayamayacağı görüşündeydi.

Buna karşın proteinler 20 değişik amino asit içeriyordu ve farklılığın temelini oluşturabilirdi.

•Üçüncü faktör, genetiğin en aktif araştırma alanları ile ilgilidir. 1940’tan önce genetikçilerin çoğu aktarım (transmisyon) genetiği ve mutasyon

çalışmaları ile uğraşmıştır.

1940’lardan sonra, Erwin Chargaff’ın çalışmaları, Levene’nin hipotezinin doğru olmadığının farkına varılmasına yol açmıştır. Chargaff, bir çok

organizma için 1:1:1:1 oranının doğru olmadığını göstermiştir.

DNA’nın genetik materyal olduğu yönündeki kanıt ilk defa bakteri ve bakteriyofajlarla yapılan çalışmalar sırasında elde edilmiştir.

Oswald Avery, Colin MacLeod ve Maclyn McCarty’nin bakterilerde “transformasyon prensibi”nin kimyasal doğası ile ilgili olarak 1944’te

yayınlanan makalesi, DNA’nın genetik materyal olarak kabul edilmesinde ilk adım olmuştur.

Transformasyon Çalışmaları

1927’de İngiliz Sağlık Bakanlığı’nda sağlık memuru olarak görev yapan Frederic Griffith tarafından ba şlatılmıştır.

Griffith Diplococcus pneumonieae nin değişik suşlarını kullanarak deneyler yapmıştır.

Bazı omurgalılarda zatürreye neden olan hastalık oluşturan (virülant) suşlardı, bir kısmı da hastalık oluşturmayan (antivirülant) su şlardı.

Virülans etki bakterilerin sahip oldukları polisakk arit kapsül yapıları ile ilgiliydi.

Virulant su şlarda kapsül bulunurken, avirulant suşlar kapsülsüzdü. Kapsülsüz bakteriler, hayvanın dolaşım sistemindeki fagositik hücreler

tarafından hızla alınıp parçalanıyordu.

Polisakkarit kılıflı virulant bakteri kolayca hücre i çine alınmadığı için çoğalıp zatürreye neden oluyordu.

Diplococcus’un her bir suşu serotipler olarak adlandırılan düzinelerce değişik tipten biri olabilir.

Griffith, genetik materyalle ilgili yeni kavramlara yol açan deneylerinde tip II ve III’ü kullanmı ştır.

Griffith yalnız canlı virulant hücrelerin sıçanda zatürre oluşturabileceğini yapılan çalışmalardan biliyordu. Isıyla etkisiz hale getirilen virulant

bakteriler sıçana verildiğinde avirulant bakteriler gibi zatürre oluşturmuyordu.

Griffith bu deneyde canlı IIR (avirulant) hücrelerd e ısı ile etkisiz hale getirilen IIIS (virulant) hücreleri karı ştırarak sıçana verdi. İki hücre tipi

tek başına verildiğinde sıçanı öldürmediğine göre, Griffith her iki hücrenin birlikte verilmesinin sıçanı öldürmemesini bekliyordu.

Ancak, beş gün sonra çift enjeksiyon yapılan bütün sıçanlar öldü. Ölü sıçanların kan analizlerinde fazla miktarda canlı IIIS tipi (virulant)

bulunduğu saptandı.

Avirulant ölen sıçanların kanında bulunan IIIS bakteriler, polisakkarit kapsül açısından, ısı ile öldürülmüş hücrelerden elde edilen IIIS suşuna benziyordu. Yalnız canlı, IIR bakterilerin verildi ği kontrol sıçan canlıydı

ve zatürre olmamıştı.

Bu bulgu, ısı ile öldürülmüş IIIS fraksiyonu ortamda yok iken, avirulant IIR hücrelerinin, virulant IIIS hücrelerine dönü şmüş olma (mutasyon)

ihtimalini ortadan kaldırıyordu.

Bunun yerine canlı IIR ve ısı ile öldürülmüş IIIS hücreleri arasında bir tip etkileşime gereksinim vardı.

Griffith ısı ile öldürülmü ş IIIS bakterilerinin bir biçimde, canlı avirulentIIR hücrelerinin virulant IIIS’lere dönü şümünden sorumlu olduğu

sonucuna ulaştı.

Bu olayı TRANSFORMASYON olarak adlandırarak her ne kadar kapsül tek başına zatürreye neden olmuyorsa da transformasyonu gerçekleştiren ana maddenin polisakkarit kapsülün bir kısmı ya da kapsül sentezinde rol

alan bir bileşik olabileceğini önerdi.

1931’de Rockefeller Enstitüsünden Henry Dowson transformasyonun in vitro cereyan edebileceğini gösterdi.

1933’e gelindiğinde Lionel J. Alloway, S hücrelerinin kaba özütlerini ve canlı R hücrelerini kullanarak in vitro bir sistem geliştirdi.

1944’te Avery, MacLeod ve McCarty on yıllık bir çalışma sonucunda bugün moleküler genetik alanında klasik sayılan makalelerini yayınladılar.

Transformasyon yapan maddeyi saf olarak elde ettiklerini ve transformasyondan sorumlu molekülün DNA olduğunu bidirdiler.

DNA’nın genetik materyal olduğunu destekleyen ikinci önemli bulgu, Escherichia coli bakterisinin, konakçısı olduğu viruslardan biri olan T2

bakteriyofaj ile enfeksiyonu çalışmalarından elde edilmiştir.

1952’de Alfred Hershey ve Martha Chase faj proteini ve nukleik asitinin bakteri hücresi ile beraber üreme işlemindeki bağımsız işlevini açıkça

ortaya koymuştur.

RNA bazı virüslerde genetik materyal olarak görev yapmaktadır.

1956’da tütün mozaik virüsünden (TMV) saflaştırılan RNA, tütün yapraklarına bulaştırıldı ğında virüsün neden olduğu karakteristik

lezyonlar yapraklarda görülmüştür.

1965 ve 1966’da Norman R. Pace ve Sol Spiegelman, QB fajından RNA’nın ayrıştırılıp in vitro olarak replike olabileceğini göstermişlerdir.

Replikasyon RNA replikaz denilen bir enzime bağlıdır.

Retrovirüslerin replikasyonları olağan dışıdır. Konakçı hücreyi enfekte ettikten sonra RNA’ları tamamlayıcı DNA molekülünün sentezi için kalıp

görevi üstlenir.

Revers (ters) transkripsiyonolarak bilinen bu işlemi, revers transkriptaz denilen RNA-bağımlı DNA polimeraz enzimi yönlendirir. Sentezlenen bu geçiş DNA’sı viral genetik materyali temsil eder ve konakçının genomuna

katılabilir.

Polio virüsü ve AIDS hastalığına neden olan insan kazanılmış bağışıklık eksikliği virüsü (human immunodeficiency virus: HIV) retrov irüslere

örnektir.

DNA’nın yapısını kavramak için nukleik asit kimyasını bilmek gerekir.

Nukleotidler: bütün nukleik asit moleküllerinin yapıtaşlarıdır.

3 bileşeni vardır.:

1. Azotlu baz

2. Pentoz şekeri (5-karbonlu şeker)

3. Fosfat grubu

Azotlu bazlar iki çeşittir:

1. Dokuz atomlu, iki halkalı purinler

2. Altı atomlu tek halka içeren pirimidinler

Nukleik asitlerde yaygın olarak 2 tip purin ve 3 tip pirimidin bulunur.

Purinler: Adenin ve guanin (A ve G)

Pirimidinler: Sitozin timin ve urasil (S, T ve U)

DNA ve RNA’da ortak olarak A, C ve G bulunur; T bazı yalnız DNA’da, U bazı ise yalnız RNA’da vardır.

Nukleik asite adını veren taşıdığı pentoz şekeridir. Ribonukleik asitlerde (RNA) riboz, deoksiribonukleik asitlerde (DNA) deoksiriboz bulunur.

Deoksiribozda C-2’ pozisyonunda hidroksil gurubu yoktur. C-2’ pozisyonundaki hidroksil gurubunun varlığı RNA’yı DNA’dan ayırır.

Azutlu baz + pentoz şekeri = Nukleozit

Nukleozit Difosfatlar ve Trifosfatlar

Nukleotidler nukleozit monofosfat (NMP) olarak da tanımlanırlar. Bir veya iki fosfat ilavesi ile sırasıyla; nukleozit difosfatlar (NDP) ve

nukleozit trifosfatlar (NTP) olu şur.

Trifosfat formu çok önemlidir, çünkü hücrede nukleik asit sentezinde öncü molekül olarak rol alır.

Hücrede ATP’nin ADP ve inorganik fosfata (Pi), GTP’nin de GDP ve inorganik fosfata hidrolizi ile fazla miktarda enerji açığa çıkar.

Sonuç olarak, ATP ve GTP genetik işlemler de dahil birçok hücre faaliyetinde kullanılır.

Polinukleotidler

İki mononukleotid arasında kurulan bağ yapısında, iki şekere bağlı fosfat grubu yer alır. Oluşan bağ fosfodiesterbağıdır. Fosforik asit her iki

taraftaki alkol grubu ile ester bağı yapmıştır.

Aynı bağ RNA’da da bulunmaktadır. Her iki yapıda da bir C-5’ ucu ve bir C-3’ ucu vardır. İki nukleotit birle ştiğinde bir dinukleotit , üç nukleotit

birleştiğinde bir trinukleotit oluşturur.

20 ya da daha az sayıda nukleotit içeren zincire oligonukleotit denir. Daha uzunları polinukleotit olarak adlandırılır.

Yapıları açık formüllerle çizmek zaman alıcı ve karmaşık olduğu için kısa çizim yöntemi geliştirilmi ştir.

Dikey olan çizgiler pentoz şekeri temsil eder, azotlu bazlar tepede, C-1’ konumundadır. Ortasında P olan verev çizgi, bir şekerin C-3’ atomu ile

komşu şekerin C-5’ atomuna bağlıdır ve bu bağ fosfodiester bağını temsil eder.

DNA’da dört bazın mutlaka eş molar miktarlarda bulunması gerekmediği gösterilmiştir. Ayrıca, DNA’nın molekül a ğırlı ğının 106-109 dalton

arasında olduğu bulunmuştur.

Bu değer, tetranukleotit olamayacak kadar büyüktür. Bugün gerçek olan, DNA’nın çok uzun bir polinukleotit zincirine sahip o lduğudur.

Uzun polinukleotit zincir yapısı, DNA’nın molekül ağırlı ğının ve en önemli özelliği olan büyük bir genetik bilgiyi depolayabilme kapasitesini

açıklamaktadır.

Sadece 1000 nukleotit içeren bir polinukleotit için, her birinin dizilimi diğerinden farklı olan 41000değişik yapı oluşturulabilir.

DNA’nın i şlevini kavramanın anahtarı DNA’nın yapısında saklıdır.

1953’de iki genç araştırıcı, James Watson ve Francis Crick, DNA’nın yapısının ikili sarmal şeklinde olduğunu önermiştir (Nature, 302-303).

Watson ve Crick’in önerilerini geliştirilmesi için kritik olan bulgular, başlıca iki kaynaktan gelmektedir. Hidroliz edilmi ş DNA örneğinin bazı

kompozisyon analizi ve DNA’nın X-ışını kırınımı çalışmaları.

1949 ve 1953 arası, Erwin Chargaff ve arkadaşları, birçok organizmadan elde edilen DNA örneklerinden dört bazı ayırmak için kromatografik

yöntemleri kullanmıştır.

1. Herhangi bir türde, DNA’daki adenin bazlarının mikt arı, timin bazlarının miktarı ile orantılıdır. Guanin bazların ın miktarı ise sitozin

bazlarının miktarı ile orantılıdır.

2. Purinlerin (A+G) toplamı pirimidinlerin (C+T) topla mına eşittir.

3. C+G yüzdesinin, A+T yüzdesine eşit olması gerekmez. İki değer arasındaki oran türlere göre büyük değişiklikler gösterir.

Bu sonuçlar, DNA molekülünün baz kompozisyonunun kesin profilini göstermektedir.

X-I şını Kırınımı Analizi

DNA zincirleri X-ı şını bombardımanına tutulduğunda molekülün atomik yapısına göre ışınlar saçılır. Saçılım profili fotoğraf filmi üzerinde

lekeler halinde belirir ve özellikle moleküldeki düzenli yapılar ve genel görünüm ortaya çıkar.

1938’de William Astbury, bu tekniği DNA üzerinde denemiş ve 1947’de Astbury DNA’da 3.4 Å aralıklarla tekrarlayan düzenli bir yapı

saptamıştır.

1950-53 arası, Rosalind Franklin daha saf DNA örneklerinden daha gelişmiş X-ışını verileri elde etmiştir.

Rosalind’in çalışmasıda Astbury’nin gördüğü 3.4 Å’luk tekrarlayan yapıların varlığını doğrulamış ve DNA’nın bir çeşit sarmal yapıda

bulunduğunu ileri sürmüştür.

Watson-Crick Modeli

Watson ve Crick 1953’de DNA’nın yapısını aydınlatmışladır.

Bu modelin özellikleri:

1. İki uzun polinukleotit zinciri, bir merkez eksen etrafında kıvrılarak, sağ-el ikili sarmal yapısını oluşturur.

2. İki zincir birbirine zıt konumludur, yani iki zincirin C-5’ ucundan C-3’ ucuna doğru olan yönleri birbirine göre tersdir.

3. Her iki zincirin bazları düzlemsel yapıdadır ve dizilimleri eksene dik, bazlar arasında 3.4 Å (0.34 nm) mesafe olacak şekilde birbiri ardına

dizilir ve sarmalın içinde yer alır.

4. Karşı zincirdeki azotlu bazlar, hidrojen bağları ile bağlanarak birbirleri ile eşleşirler, DNA’da sadece A=T ve G=C eşleşmesi mümkündür.

5. Sarmalın her bir tam dönümü 34 Å (3.4 nm)’dir. Böylece DNA’nın herbir dönümünde 10 baz yer alır.

6. Molekülün herhangi bir bölümünde eksen üzerinde sıra ile daha geniş olan büyük (majör) oluklar ve daha dar olan küçük (minör) oluklar yer

alır.

7. Sarmalın çapı 20 Å (2 nm)’dur.

Baz eşleşmesi; modelin genetik açıdan en önemli özelliğidir.

Zincirin biri 5’ ucundan 3’ yönüne uzanırken, diğeri 3’ ucundan 5’ yönüne uzanır.

Watson ve Crick’in önerdiği modelin anahtarı özgül baz eşleşmesidir. Chargaff’a göre A’nın miktarı T’ye, G’ninki de C’ye eşittir.

A=T ve G=C baz eşleşmesi, tamamlayıcılığı (complemantarity) kavramının temelidir.

• Neden başka baz eşleşmesi olası değildir?

Watson ve Crick A=G ve C=T baz eşleşmesi olasılığını kabul etmemişlerdir. Çünkü bunlar purin-purin ve pirimidin-pirim idin

arasındaki eşleşmelerdir.

Bu tip bir eşleşmede sarmalın çapı bazı kısımlarda büyük yada 20 Å’dan küçük olacaktır.

• Hidrojen bağının önemi nedir ve bu bağ sarmalı dayanıklı kılacak kadar kuvvetli midir?

Hidrojen bağı, kovalent bağ ile bağlı bir hidrojen atomu ile çiftle şmemiş bir elektron içeren diğer bir atom arasındaki çok zayıf bir elektrostatik

çekimdir.

İkili sarmaldaki bazların konumuna göre A, T ile iki H bağı, G, S ile üç H bağı yapar. Tek başına iki yada üç H bağı çok zayıftır, ancak bunların iki bin yada üç bin tanesi arka arkaya geldiğinde sarmala büyük bir

dayanıklılık sağlar.

Hassas bir ölçümde, DNA’da bir dönüşte Watson ve Crick’in önerdiği gibi 10 değil 10.4 bç bulunduğu gösterilmiştir.

Klasik modelde her bir baz çifti sarmal eksen etrafında yanındaki baz çiftine göre 36°°°° dönüş yaparken yeni ölçümler bunun 34.6°°°° olduğunu

göstermiştir.

Sonuçta, her 360°°°° dönüşte 10 bazdan biraz fazla baz yer almaktadır.

Yazarlar 1953’deki yayınlarından 2 ay sonra Nature’da yaptıkları yayında DNA için özgül bir replikayon modeli – semikonservatif modeli (yarı

koruyucu) önermişlerdir.

Bu ikinci yayında da iki yeni kavram bulunmaktadır:

Genetik bilginin DNA’nın baz dizisinde depolandığı ve bazlardaki değişikli ğin mutasyona ya da genetik değişikli ğe yol açtığıdır.

DNA’nın farklı formları bulunur

Rosalind Franklin’in X-ı şını kırınımı çalışmaları yaptığı DNA’nın B formuna dayanmaktaydı.

Bu form düşük tuz derişiminin olduğu sulu ortamda bulunan formdur ve biyolojik olarak önemli olduğuna inanılan yapıdır

A-DNA yüksek tuz ya da dehidrasyon koşullarında baskın olan yapıdır.

A-DNA, B-DNA’ya göre daha sıkı yapıdadır. Çapı 23 Åolan sarmalın tam bir dönümünde 11 bç yer alır.

A-DNA’da sağ el sarmalıdır ancak bazların yönelişleri bir miktar farklıdır. A-DNA’nın biyolojik ko şullarda bulunabilmesi şüpheli görünmektedir.

Laboratuvar ko şullarında incelendiğinde DNA sarmalının sağ el sarmalı gösteren 3 formu daha bulunmuştur. C, D- ve E-DNA.

C-DNA, A- ve B-DNA’nın izolasyon koşullarında gözlenenden daha da fazla dehidrasyon koşullarında izolasyon yapıldığında görülür.

Samalın tam bir dönüşünde 9.3 baz yer alır dolayısıyla daha sıkıdır. Çapı 19 Å’dur.

Diğer iki form olan D- ve E-DNA baz içeriğinde guanin bulunmayan DNA’ların aldı ğı formdur. Sarmalın tam bir dönüşünde daha az saıda

bç bulunmakta olup sırasıyla 8 ve 7.5’dir.

Z-DNA olarak adlandırılan DNA’nın bir ba şka formu da 1979’da keşfedilmiştir. Sadece C-G bç içeren sentetik DNA oligonukleotitleri

incelenirken bulunmuştur.

Sol el sarmalı özelliğindedir. Çapı 18 Å’dur. Her bir dönü şte 12 bç yer alır ve zikzak konfigürasyonuna sahiptir.

B-DNA’da bulunan büyük oluk Z-DNA’da neredeyse kaybolmuştur.

Jean-François Allemand ve arkadaşlarının yaptığı son çalışmalar DNA yapay bir şekilde uzatılırsa P-DNA denilen yeni ilginç bir form daha

olabileceğini göstermektedir.

P-DNA daha uzun, daha incedir ve B-DNA’da yüzeyde bulunan fosfat grupları iç kısımda yer aldığı için oldukça ilginç bir yapıdadır.

P-DNA’da her bir dönüşte 2.62 baz yer alır.

RNA’nın yapısı kimyasal olarak DNA’ya benzer, ancak RNA tek zincirlidir.

RNA’da deoksiriboz yerine riboz şekeri, azotlu baz timin yerine urasil bulunur.

RNA çoğunlukla tek zincirli oldu ğu düşünülmektedir. RNA molekülleri sentezlendikten sonra bazen kendi üzerine katlanarak ikili sarmal

bölgeler oluşturur.

Genetik materyali RNA olan bazı hayvan virüslerinde RNA ikili sarmal olarak bulunur.

Genetik bilginin ifadesinde en az üç hücresel RNA molekülü işlevseldir:

Ribozomal RNA (rRNA)

Haberci RNA (mRNA)

Taşıyıcı RNA (tRNA)

Bu moleküller DNA’nın bir zincirinin tamamlayıcı (e şlenik) kopyası olarak transkripsiyon sonucunda sentezlenir.

RNA’ların içinde en büyük olanı genelde rRNA’dır ve genellikle hücrede bulunan RNA’ların %80’ini olu şturur.

mRNA molekülleri DNA’daki genetik bilgiyi translasy onun meydana geldiği ribozomlara taşır.

RNA tiplerinin en küçüğü olan tRNA translasyon sırasında amino asitleri ribozoma taşır.

Nukleik Asitlerin Denatürasyonu ve Renatürasyonu

İkili sarmal DNA’nın denatürasyonu sonucu H-bağları kopar, çiftli yapı bozulur ve zincirler birbirinden ayrılır. Ancak kov alent bağlar kırılmaz.

Isı ya da kimyasal yolla uyarılabilen zincirlerin ayrılması sırasında DNA’nın akı şkanlığı azalır, UV absorbsiyonu artar.

Isı sonucu oluşan denatürasyon bazen erime (melting) denir. Isıtılan DNA çözeltisinin UV absorbsiyonundaki artışı, hiperkromik kayma olarak

adlandırılır ve ölçümü çok kolaydır.

G≡C baz çifti, A=T’ye göre bir fazla H bağı içerdiğinden, ısıya karşı daha dayanıklıdır. Bu nedenle, A=T’ye göre daha fazla G≡C çifti içeren

DNA’ların tamamen denatüre olması için yüksek sıcaklıklar gereklidir.

Eğer erime sırasında, DNA’nın 260 nm’deki absorbsiyonu izlenir ve sıcaklığa karşı grafiğe geçilirse, bir erime profili elde edilir. Bu profilin

ya da eğrinin orta noktasına erime sıcaklığı (Tm) denir ve DNA zincirinin %50’sinin açılmı ş ya da denatüre olduğu noktayı gösterir.

Isı ile denatüre edilen DNA yavaşça soğutulursa tamamlayıcı zincirler arasındaki rastgele çarpışmalar sonucu zincirler tekrar bir araya gelir.

DNA Replikasyonu ve Rekombinasyonu

İnsan genomunu oluşturan 23 kromozomda 3x109 (3 milyar) baz çiftinin yer aldığı bilinmektedir. Bu kromozomların DNA’larının hatas ız olarak iki katına çıkartılması için son derece doğru bir mekanizma işlemelidir.

Milyonda bir (10 -6) hata oranı bile her bir replikasyon döngüsünde 3000 hata demektir ve bu da çok büyük bir rakamdır.

Yarı-saklı (semikonservatif) replikasyon olarak bilinen Watson-Crick modeli virüslerde, prokaryotlarda ve ökaryotlarda yapılan çalışmalarla

deneysel olarak da desteklenmiştir.

DNA, yarı-saklı (semikonservatif) replikasyon modeli ile kendini işler

Azotlu bazların yerleşiminden dolayı DNA ikili sarmalının her bir zincirinin tamamlayıcı zincir sentezi için kalıp oluşturabileceğini

Watson ve Crick açık olarak kanıtlamışlardır.

Eğer T varsa karşısına A çekecektir. G varsa karşısına C çekecektir. Her iki kalıp boyunca bu nukleotidler kovalent bağlarla polinukleotit oluşturdu ğu taktirde sonuçta birbirine özdeş iki DNA zinciri

oluşturacaktır.

Kopyalanan her bir DNA molekülünde bir “yeni” bir “ eski” zincir bulunacağından bu tip bir çoğalma yarı-saklı (semikonservatif)

replikasyon olarak tanımlanır.

DNA kopyalanması için, atasal zincirlerin kalıp olarak görev görmesine dayanan iki yol daha düşünülmektedir.

Saklı (konservatif) replikasyontamamlayıcı polinukleotit zincirleri daha önce anlatıldığı gibi sentezlenir, ancak burada iki yeni zincir bir araya

gelir ve atasal zincirler tekrar birleşir.

Parçalı (dispersif) replikasyonatasal zincirler kopyalama esnasında kırılır ve kırılan DNA parçaları iki yeni çift sarmal içind e dağılır. Böylece

herbir zincirde hem eski, hem de yeni DNA bulunur.

Meselson-Stahl Deneyi

1958’de Marthew Meselson ve Franklin Stahl, bakteri hücrelerinin yeni DNA moleküllerini yarı-saklı replikasyon ile sentezlediklerine dair kuvvetli kanıtlar ortaya koyan deney sonuçlarını yayınlamışlardır.

Azot kaynağı olarak sadece 15NH4Cl (amonyum klorür) içeren ortamda E. coli hücrelerini birçok nesil boyunca üretmişlerdir.

Doğal izotopu olan 14N’e göre bir fazla nötron içerir. 15N daha dayanıklıdır. 15N içeren daha yoğun DNA yoğunluk gradient santrifügasyonunda

daha alt kısımlarda yer alır.

Meselson ve Stahl deneyinde, bir çok nesil sonra E. coli hücrelerinde DNA’daki azotlu bazlar da dahil olmak üzere tüm azot taşıyan

moleküller 15N içermiş olur.

Daha sonra hücreler yalnız 14NH4Cl içeren ortama aktarılır. Bu ortamda replikasyon sonucu sentezlenen DNA’lar azotun “hafif” izotopunu taşır.

Daha sonra hücreler yalnız 14NH4Cl içeren ortama aktarılır. Bu ortamda replikasyon sonucu sentezlenen DNA’lar azotun “hafif” izotopunu taşır.

Ökaryotlarda Yarı-Saklı (Semikonservatif) Replikasyon

J. Herbert Taylor , Philip Woods ve Walter Hughes 1957’de Meselson ve Stahl’ın çalışmasının yayınlanmasından bir yıl önce ökaryotlarda da

replikasyonun yarı-saklı mekanizma ile olduğunu gösteren kanıtı sunmuşlardır.

Vicia faba (bakla) bitkisinin kök uçlarını deneylerinde kullanmışlar ve DNA’yı, DNA’nın radyoaktif öncülerinden olan 3H-timidin ile

işaretleyerek ve otoradyografisini alarak replikasyonu izlemeyi başarmışlardır.

İşaretli izotop ortamında birinci replikasyon döngüsü sonucu kardeş kromatidlerin ikisi de rayoaktivite ta şımaktadır, yani her bir

kromatitde bir “yeni” sentezlenen radyoaktif i şaretli DNA zinciri ve bir de işaretsiz “eski” zincir bulunmaktadır.

Replikasyon Orijinleri, Çatalları ve Birimleri

Yarı-saklı replikasyon DNA’nın kopyalandığı genel replikasyon modelidir.

Kromozom üzerinde DNA’nın replikasyonu nereden başlar?

Tek bir orijin mi vardır yoksa sentez birden fazla noktadan mı başlar?

Başlangıç noktası rastgele bir yerde mi bulunur yoksa kromozomda özgül bir bölgede mi yer alır?

Replikasyon başladıktan sonra tek bir yönde mi yoksa orijinden başlayarak her iki yönde mi ilerler?

Başka bir deyişle replikasyon tek yönlü müdür yoksa çift yönlü müdür?

Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan yapıya replikasyon çatalıadı verilir.

Bu çatal önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve replikasyon devam ettikçe ilerler.

Replikasyon çift yönlü ise orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon çatalı oluşacaktır.

Bir orijinden bir replikasyon ba şladıktan sonra replike olan DNA’nın uzunluğunun bir birim oldu ğunu belirtmek için kullanılan terim

replikon terimidir.

John Cairns, E. coli’de replikasyonun bir orijinden başladığını göstermiştir.

oriC olarak adlandırılan bu özgül bölgenin konumu E. coli kromozomu üzerinde haritalanmıştır.

Bakteriyofaj ve bakterilerde DNA sentezi bir noktadan başladığı için, kromozomun tümü bir replikondur. Tek bir halkasal k romozoma sahip

olan bakterilerde bir orijinin bulunması karakteris tiktir.

Başka araştırıcılar tarafından ortaya konan çalışmaların sonucuna göre, replikasyon iki yönlüdür ve oriC’nin her iki yönünde hareket eder.

Bakterilerdeki DNA sentezinde diğer enzimlerin yanı sıra 3 polimeraz görev alır.

DNA Polimeraz I: 1957’de Arthur Kornberg ve arkadaşları E. coli’den in vitro sistemde DNA sentezini yönlendiren bir enzim ayrıştırmı şlardır.

Bu enzim DNA polimeraz I olarak bilinmektedir.

Kornberg DNA polimeraz I’in varlı ğında in vitro DNA sentezi için başlıca iki gereksinim olduğunu saptamıştır:

1. Dört tip deoksiribonukleozit trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP=dNTP)

2. DNA kalıbı

Reaksiyonda 4 dNTP’den herhangi birinin bulunmaması durumunda ölçülebilir bir sentez meydana gelmemiştir.

Kalıp DNA ilave edilmezse DNA sentezi gerçekleşmekte ancak büyük oranda azalmaktadır.

Uzayan DNA zincirine her bir nukleotitin katılım şekli DNA polimeraz I’in özgüllüğüne bağlıdır.

Öncü dNTP’de, d-ribozun 5’-C’una üç adet fosfat grubu bağlıdır. Sentez esnasında uçtaki iki fosfat grubu koparken 5’-C’a bağlı olan fosfat grubu ilave edileceği d-ribozun 3’-OH’ına kovalent bağla bağlanır.

Böylece zincir uzaması, uzayan zincirin 3’ ucuna her seferinde bir nukleotit ilavesi ile 5’-3’ yönünde devam eder.

DNA sentezi devam ettikçe her basamakta açığa çıkan yeni 3’-OH grubu, DNA sentezi ilerlerken sonraki nukleotitin zincire eklenmesini sağlar.

DNA Polimeraz II ve III

Peter DeLucia ve John Cairns, DNA polimeraz I aktivitesine sahip olmayan bir mutant E. coli suşu bulmuştur. İşlevsel enzime sahip

olmayan bu mutatnt suş DNA’sını kopyalayıp üremeyi başarmış ancak hücreler DNA “onarım” yeteneği bakımından oldukça yetersiz

kalmıştır.

1. E. coli’de, in vivoDNA replikasyonu yapabilen başka bie enzim bulunmalıdır.

2. DNA polimeraz I’in in vivo koşullarda ikincil bir i şlevi olabilir. DNA polimeraz I’in DNA sentezinin doğru yapılmasından sorumlu olduğu, ancak tamamlayıcı zinciri sentezleyen gerçek enzim olmayabileceği

düşünülmüştür.

Bu üç enzimin hiçbiri bir kalıptan DNA sentezini başlatamaz, ancak üçü de primer adı verilen (RNA), var olan bir DNA zincirini kalıp boyunca

uzatabilir.

DNA polimeraz enzimlerinin hepsi molekül ağırlı ğı 100.000 dalton olan büyük protein kompleksleridir.

Her üçünün de 3’-5’ eksonukleaz aktivitesibulunur.

Bu özellik, enzimlerin polimerizasyonu tek yönde gerçekleştirme, bir an duraksayıp geri dönerek ilave edilen nukleotidleri çıkarabilme

kapasitelerini ifade etmektedir.

DNA polimeraz I, 5’-3’ eksonukleaz aktivitesi de gösterir. Bu sayede enzim, sentezin başladığı uçtan itibaren nukleotidleri kesebilir ve sonra sentez

yönünde işlemine devam edebilir.

Bu nedenle DNA polimeraz I, RNA primerini de ortamdan uzaklaştırabilir.

Hücrede DNA polimeraz I, DNA polimeraz III’e göre daha fazla miktarda bulunur ve daha dayanıklıdır.

Polimeraz I, primeri uzaklaştırır ve primerler uzakla ştıkça doğal olarak oluşan boşluklarda DNA sentezleyerek bu bölgeleri doldurur.

Eksonukleaz aktivitesi ile, bu işlem esnasında oluşabilecek hataları da onarabilir.

Polimeraz II, UV gibi dış etmenler sonucu hasar gören DNA’nın onarımında rol alır. Enzim replikasyon çatalındaki DNA sentezi bozulduğunda aktive olan bir gen tarafından şifrelenmektedir.

Replikasyonda gerekli olan ve polimerizasyondan sorumlu asıl enzim olarak Polimeraz III görülmektedir.

Enzimin 3’-5’ eksonukleaz aktivitesi, sentez sırasında hata onarımı işlevini görmesini sağlamaktadır.

DNA polimeraz III’ün holoenzimolarak adlandırılan aktif formu, 10 farklı polipeptit zincirinden meydana gelmiş bir dimerdir.

Molekül ağırlı ğı 600.000 daltondan fazladır. Molekül ağırlı ğı 140.000 dalton olan en büyük alt birim olan αααα, εεεε, θθθθ (alfa, epsilon ve teta) alt birimleri ile beraber holoenzimin polimerizasyon aktivitesi gösteren

“çekirdek” (core) enzim kısmını oluşturur.

Kalıp zincirin nukleotit polimerizasyonundan αααα alt birimi sorumludur. Çekirdek enzimin εεεε alt birimi, 3’ – 5’ eksonukleaz aktivitesi gösterir.

Beş alt birimin ( γγγγ, δδδδ, δδδδ’, x, ψψψψ) oluşturdu ğu ikinci grup, γγγγ (gama) kompleks olarak adlandırılan bölgeyi oluşturur.

Bu γγγγ kompleksi, replikasyon çatalında enzimin kalıba “oturtulmasında” rol alır.

Enzimin işlev görmesi için ATP enerjisi gereklidir.

β Alt birimi, polimerizasyon sırasında çekirdek enzimin kalıptan kopmasını sağlar.

Son olarak, ττττ (pi) alt birimi, iki çekirdek polimerazın replikasy on çatalında bir arada tutunmasını sağlar.

Holoenzim ve diğer çeşitli proteinler, replikasyon çatalında neredeyse ribozom kadar büyük olan replizom olarak bilinen bir kompleks

oluşturur.

DNA replikasyonu sırasında birçok karmaşık olayın çözülmesi gerekir.

Bakteri ve virüslerde replikasyon yarı-saklı ve bir replikonda çift yönlü hareket eder.

Sentezin, DNA polimeraz III’ün denetimi altında 5’ den 3’ üne doğru iki replikasyon çatalı oluşturarak gerçekleştiği bilinmektedir.

Bu replikasyon çatalları sentezin başladığı noktadan iki zıt yöne doğru hareket etmektedir.

1. Sarmalın yer yer açılması ve her iki zincirde sentezin devam etmesi için bu “açık” konfigürasyonun dayanıklı olmasını sağlayan bir

mekanizmanın olması gerekir.

2. Sarmalın açılması ve zincirin daha aşağı kısımlarda tekrar sarılması sonucu ortaya çıkan gerilimi azaltmak için de bir mekanizma

bulunmalıdır.

3. DNA polimeraz III’ün polimerizasyonu yönlendirebilmesi için bir çeşit primer sentezlenmelidir. Gerçekten bir primer vardır, ancak primerin

DNA değil RNA olması şaşırtıcıdır.

4. RNA primeri sentezlendikten sonra DNA polimeraz III, atasal molekülün her iki zincirinin tamamlayıcısı olan DNA zincirini

sentezlemeye başlar. Replikasyon çatalının ilerleme yönünde olan kesintisiz sentez, iki zincirin birbirine antiparalel olduğu için ancak

zincirlerden birinde gerçekleşebilir. Di ğer zincirdeki sentez zıt yönde ve kesintilidir.

5. Replikasyonun tamamlanmasından önce RNA primerlerinin uzaklaştırılması gerekir. Oluşan geçici boşlukların bulundu ğu yerler,

kalıp DNA eşlenikli ği ile doldurulmalıdır.

6. Boşlukları doldurmak için yeni sentezlenen DNA, yanındaki DNA zinciri ile birleştirilmelidir.

7. Kopyalama sırasında DNA polimerazlar eşlenik bazları doğru biçimde yerleştirmektedir, ancak hata olma olasılığı da vardır. Bazen

sentezlenen zincire yanlış bazlar ilave edilebilir. Sentez işleminin bir parçası olan bir hata okuma mekanizması (proofreading) DNA sentezi

sırasında oluşan hataları düzeltir.

DNA sarmalı açılmalıdır

Bakteri ve virüslerin halkasal kromozomlarında, DNA sentezinin başladığı bir orijin noktası bulunur. Bu bölge E. coli kromozomunda çok iyi

çalışılmıştır.

Replikasyon orijini olan oriC, 9 ve 13 bazdan oluşan (9mer ve 13mer olarak adlandırılır) tekrar dizilerinin bulundu ğu 245 baz çifti içerir.

DnaA denen özgül bir protein ilk basamakta sarmalın açılmasından sorumludur. DnaA proteininin bazı alt birimleri bir çok 9mer dizisine

bağlanır. Bu bağlanma, sarmalın daha fazla açılmasında ve kararlılı ğında rol alan DnaB ve DnaC proteinlerinin bağlanmasını

kolaylaştırır.

H bağlarını kırıp ikili sarmalı denatüre etmek için norm alde ATP hidrolizi ile sağlanan enerjiye gereksinim duyan bu tip proteinler helikazlar

olarak adlandırılır.

Tek zincire bağlanan proteinler (single-stranded binding proteins, SSBP)olarak bilinen diğer bazı proteinler bu konformasyonu daha da kararlı

kılarlar.

Sarmalın açılması devam ettikçe, replikasyon çatalının önünde oluşan sarılma gerilimi çoğu kez üstün kıvrılma (super coiling) meydana

getirir.

Halkasal moleküllerde üstün kıvrılmalar, DNA’daki ek bükülmeler ve dönüşler sonucu oluşturulur. Bu durum aynen bir lasti ğin uzatılıp, bir

ucundan büküldüğünde ortaya çıkan sarmal yapıya benzer.

DNA topoizomerazlar olarak adlandırılan geniş bir enzim ailesinin üyesi olan DNA giraz enzimi, bu tip üstün kıvrılmaları gevşetir. Giraz enzimi tek zincirde ya da her iki zincirde “kırıklar” olu şturur, aynı zamanda

üstün kıvrılma oluşumu sırasında meydana gelen bükülmeleri ve düğümleri “açma” hareketleri de katalizler.

Oluşan kırıklar sonra tekrar birle ştirilir. Bu çe şit replikasyonlarda ATP hidrolizinden açığa çıkan enerji kullanılır.

DNA polimeraz kompleksi ve diğer ilgili enzimler hep birlikte, molekülü DNA sentezine katılacak şekilde düzenlerler ve hepsi replizomun bir

parçasını oluştururlar.

DNA sentezinin başlaması için RNA primerine gereksinim vardır.

Sarmalın küçük bir bölümü açıldıktan sonra sentez başlayabilir. DNA polimeraz III’ün polinukleotit zincirini uzatması için , serbest 3’-OH

gurubu olan bir primer gereklidir.

Önce, kalıp DNA üzerinden DNA’ya eşlenik olan kısa bir RNA parçası sentezlenir. RNA sentezi, primaz denilen RNA polimerazın bir çeşidi

tarafından sentezlenir.

Primazın sentezi başlatması için serbest 3’ ucu gerekmemektedir. DNA polimeraz III i şte bu kısa RNA parçasına 5’-deoksiribonukleotitleri

eklemeye başlayarak DNA sentezini başlatır.

Daha sonraki bir aşamada, RNA primeri uzaklaştırılmalı ve yerini DNA’ya bırakmalıdır. Bu reaksiyon DNA polimeraz I tarafından katalizlenir.

RNA primerinin olu şumu, virüsler bakteriler ve çeşitli ökaryotikorganizmalarda tanımlanan, evrensel bir işlemdir.

Antiparalel zincirde DNA sentezi kesintili ve kesintisiz olarak gerçekleşir

DNA polimeraz III, DNA sentezini yalnız 5’-3’ yönünde gerçekleştirebilir. Sentez, replikasyon çatalı boyunca ve çatalı açarak zincirin birinde bir

yönde, diğerinde zıt yönde aynı anda gerçekleşir.

Replikasyon çatalı açıldıkça ve aşağı doğru hareket ettikçe, sadece bir zincir sürekli DNA sentezi için kalıp olarak kullanılabilir. Bu zincire

kesintisiz DNA zinciri (leading DNA strand) denir.

Kesintili DNA zinciri (lagging DNA strand) olarak adlandırılan diğer zincirde, sentez için birçok başlangıç noktası gereklidir ve sonuç olarak

bu zincirde kesintili DNA sentezi yapılır.

Kesintili DNA sentezini destekleyen kanıtlar, Reiji Okazaki, Tuneko Okazaki ve ark. tarafından elde edilmiştir.

E. coli’de bakteriyofaj DNA’sının replikasyonu sırasında yeni sentezlenen DNA’nın bir kısmının, kalıp zincire H bağlarıyla tutunan 1000-2000 nukleotitlik küçük parçalar halinde bulundu ğunu göstermişlerdir.

RNA primeri bu şekildeki her bir parçanın bir kısmını oluşturmaktadır. Okazaki parçaları (fragmanlar) olarak adlandırılan bu parçacıklar, sentez devam ettikçe, molekül ağırlı ğı gittikçe artan daha uzun DNA

zincirlerine dönüşmektedir.

Kesintili DNA sentezinde, RNA primerini uzaklaştıracak ve Okazaki fragmanlarını birle ştirecek enzimlere gereksinim vardır.

Bilindi ği gibi, primerin uzakla ştırılması ve eksik nukleotitlerin yerine konulmasında DNA polimeraz I enzimi sorumludur.

Fragmanları birle ştirme i şi ise DNA Ligaz enzimine aittir. DNA ligaz, fosfodiester bağının oluşumunu katalizleyerek kesintili sentezlenen

zincirler arasındaki boşluğu kapatır.

Sentez kesintili ve kesintisiz zincirlerde aynı anda yapılır

Bu iki zincir aynı replikasyon çatalında aynı anda mı kopyalanır, yoksa bu işlemler enzimin iki ayrı kopyasını içeren farklı olaylar mıdır?

Kesintili zincir bir ilmek olu şturdu ğu taktirde, her iki zincirde birden dimetrik enzimin yönlendirdi ği nukleotit polimerizasyonu gerçekleşir.

100-200 baz çiftinin sentezinden sonra enzimin kesintili kol üzerindeki monomeri sentezi tamamlamış bir Okazaki fragmanına rastlar ve o

noktada zinciri terk eder.

Hemen arkasından kesintili kalıp zincirde yeni bir ilmek oluşur ve işlem tekrarlanır. İşlem oluşumu kalıbın yönünü değiştirir ancak, kesintili

zincirde sentezin 5’-3’ olan gerçek yönünü etkilemez.

Holoenzimin replikasyon çatalında sentezi kolaylaştıran diğer bir önemli özelliğide, enzimin ββββ alt biriminin yeni olu şan DNA sarmalını saran

kıskaç-benzeri dimer yapısıdır.

Bu ββββ alt birim kıskacı, çekirdek enzimin (nukleotitlerin ilavesini katalizleyen αααα, εεεε ve θθθθ alt birimleri) polimerizasyon süresince kalıptan

ayrılmasını engeller.

Replikasyon çatalı açılırken, holoenzimin tümü ana sarmal boyunca hareket ettiği için ββββ alt birim dimerine kaygan kıskaçdenir.

Hata okuma (proofreading) ve düzeltme DNA replikasyonunun ayrılmaz parçasıdır.

DNA replikasyonunun temeli, her nukleotiti tamamen kalıp zincirin eşleniği olan yeni bir zincirin sentezlenmesidir.

DNA polimeraz, sentezi çok doğru yaptığı halde kusursuz değildir ve zaman zaman eşlenik olmayan bir nukleotit hatalı olarak zincire

girebilir.

Bu tip hataları gidermek için polimeraz I ve III, 3’ – 5’ eksonukleazaktivitesi göstererek yanlış eşleşen nukleotiti saptar ve yapıdan çıkarır

(3’-5’ yönünde).

Yanlış eşleşmiş nukleotit çıkartıldıktan sonra sentez 3’-5’ yönünde yeniden devam eder.

Eksonukleaz hata okuması (exonuclease proofreading)denen bu işlem sentezin doğrulu ğunu arttırır.

Holoenzim yapısındaki DNA polimeraz III’ün εεεε alt birimi, hata onarım basamağına doğrudan katılır.

DNA replikasyonu uygun bir model ile açıklanabilir

İlerleyen çatalda helikaz enzimi ikili sarmalı açar. Sarmal açılınca, tekrar sarmal oluşmasını engellemek için, açılan zincire tek zincir yapılarına

özgül olarak bağlanan proteinler bağlanır.

İlerleyen replikasyon çatalında, DNA giraz oluşan üstün kıvrılmaların yarattığı gerilimi azaltma işlevi görür.

Polimeraz dimerinin çekirdeğini oluşturan her bir monomer, kalıp zincirlerden birine ββββ-alt birimlerinin olu şturdu ğu kaygan kıskaç

yardımıyla bağlanır.

Sentez, kesintisiz zincirde sürekli olarak gerçekleştirilirken, kesintili zincir sentezin her iki zincirde de aynı anda devam etmesini sağlamak için

“ilmek” olu şturmalıdır.

Kesintili zincirdeki replikasyonda, RNA primerinin yerini DNA’nın alması için DNA polimeraz I ve Okazaki parçalarının birleşmesi için de DNA

ligaz işlevi gereklidir.

Replikasyon çeşitli genler tarafından kontrol edilir.

Ligaz eksikliği ya da hata okuma-eksikliği gibi pekçok mutasyon, kopyalamanın bazı safhalarını engeller ya da ciddi ölçüde bozar.

Genetik analizlerde, genellikle bir koşulda kendini gösteren ancak başka bir şekilde gözlenmeyen koşullu mutasyonlar (kondisyonel

mutasyonlar) kullanılır.

E. coli’de polimeraz I, II ve III’ün alt birimleri, çe şitli genler tarafından şifrelenir.

Ökaryotik DNA sentezi prokaryotik DNA sentezine benzer ancak daha karmaşıktır.

Bakteri ve ökaryotlarda DNA ikili sarmalı replikasy on orijininde açılarak iki replikasyon çatalı meydana gelir ve DNA polimerazın yönlendirdiği sentez, kesintisiz zincirde ve kesintili zincirde çift

yönlü olarak devam eder.

Ökaryotik polimerazların DNA sentezi için bakteriyel sistemlerde olduğu gibi;

4 tip deoksiribonuklezit trifosfat

Bir kalıp

Bir primer’e ihtiyacı vardır.

Ancak ökaryotik hücrelerde, hücre başına düşen DNA miktarı daha fazla olduğu için ve bu DNA proteinlerle kompleks yapmış

durumda bulunduğu için, bakterilerin kar şılaşmadığı sorunlarla yüz yüze gelir.

Çoklu Replikasyon Orijini

Prokaryotik ve ökaryotik DNA replikasyonu arasındaki en belirgin fark, E. coli kromozomunda bir replikasyon orijini bulunurken, ökaryotik kromozomda birçok replikasyon orijini bul unmasıdır.

Birden fazla replikasyon orijininin bulunması;

1. Ökaryotlarda, bakterilere göre daha fazla DNA vardır

2. Ökaryotik DNA polimerazın saniyede 50 nukleotit olan sentez hızı, bakteriyel polimeraza göre 20 kat daha yavaştır.

Bu koşullarda, tek bir orijinden ba şlayan tipik bir ökaryotik replikasyonu ancak bir ayda tamamlanabilecektir.

Mayadan elde edilen replikasyon orijinlerine, özerk replike olan diziler (Autonomously replicating sequences, ARS)denir.

ARS’ler sentezin etkin olarak başlamasına katkı sağlayan diğer kısa dizilerin yanında yerleşim gösteren 11 bç’lik birimlerden

oluşmuştur.

Polimerazın bu kadar büyük DNA arasından ARS dizilerini nasıl bulduğu ili şkin açıklama; S fazından önce başlayan bir

mekanizmanın bulunmasıdır.

Hücre döngüsünün G1 fazı sırasında bütün ARS dizilerine bazı protein grupları bağlanır ve orijin tanıma kompleksi (origin

recognition complex, ORC)meydana gelir.

ARS dizilerinde yada ORC proteinlerini şifreleyen genlerde her hangi bir mutasyon olursa, DNA sentezinin başlaması gerçekleşmez.

Bu tanıma kompleksleri G1 fazında oluştuğu ve S fazından önce sentez başlamadığı için, sentezin gerçek başlama sinyalinde yer alan daha

başka proteinler de bulunmalıdır.

Bu proteinlerin en önemlileri, özgül kinazlardır.

Kinazlar, hücre döngüsünün ayrılmaz bir parçası olan fosforilasyonun kilit enzimleridir.

ORC’ye bağlandıklarında, DNA polimerazın bağlanmasına açık olan bir ön replikasyon kompleksi (pre-RC)oluşur.

Kinazlar aktive olduklarında, sadece başlama kompleksini tamamlamış olmazlar, aynı zamanda DNA sentezinin tetiğinide

çekerler ve her replikasyonda DNA sentezi tamamlana kadar tekrar ön-RC oluşmasını engellerler.

Bu mekanizma önemlidir, çünkü kopyalanması tamamlanan DNA parçasını, kopyalanmamış DNA’dan ayırt eder.

Böylece kopyala işlemi düzenli ve etkin biçimde sürdürülür.

Ökaryotik DNA polimerazlar

Enzimin toplam olarak 6 formu saflaştırılıp çalı şılmıştır.

Polimerazın DNA’ya bağlanabilmesi için, önce sarmalın topolojisinin değişmesi gerekir.

Orijin bölgesinde sentezin başlaması tetiklenince, ikili sarmal A=T zengin bir bölgeden açılarak helikaz enziminin girişini sağlar.

Helikaz, DNA sarmalını daha da açarak ilerler.

Polimerazın sentezi başlatmasından önce, DNA ile kompleks yapmış olan histon proteinlerinin uzaklaştırılması yada modifikasyonu

gerekir.

DNA sentezi ilerledikçe, histonlar yeni sentezlenen dublekslerle bir araya gelerek, karakteristik nukleozom yapısını yeniden oluşturur.

Ökaryotlarda, hücre döngüsünün S fazında yeni histon proteinlerinin sentezi, DNA sentezi ile birlikte gerçekleştirilir.

DNA polimerazlardan üçü (αααα, δδδδ ve εεεε) ökaryotik hücrelerde çekirdek DNA’sının replikasyonu için gereklidir.

Diğer ikisinin (ββββ ve ζζζζ) (beta ve zeta) DNA tamirinde rol aldığı düşünülmektedir.

Altıncısı ise (γγγγ) mitokondri DNA’sının sentezinde yer alır. Polimeraz γγγγ, her ne kadar çekirdek genleri tarafından sentezlense de replikasyon

işlevi bu organelle sınırlıdır.

Çekirdek DNA’sının sentezinin başlatılmasında, polimeraz αααα ana enzim olarak görülmektedir.

Enzimin 4 alt biriminden ikisi, kesintili ve kesintisiz zincir üzerinde RNA primerinin sentezlenmesinden sorumlu olan primaz olarak

işlev görür.

Diğer bir alt birim, e şlenik deoksiribonukleotitleri RNA primerine takarak primeri uzatır.

Böylece, DNA sentezinin ilk evresi başlamıştır. RNA primerine kısa bir DNA dizisi eklendikten sonra, polimeraz değişimi olarak bilinen

işlem gerçekleşir.

Polimeraz αααα kalıptan ayrılır, onun yerini pol. δδδδ alır. Bu form, “yüksek işlevselliğe” ve hata düzeltme işlevini yapabilmesini sağlayan 3’-5’

eksonukleaz aktivitesine sahiptir.

Ayrıca pol. αααα’ya göre sentez hızını 100 kez arttırır. Pol. δδδδ’nın yönlendirdiği DNA sentezi devam ederken, zincir uzar ve hata

onarımı yapılır.

Üçüncü enzim formu olan pol. εεεε, pol. δδδδ ile aynı özellikleri taşır, ancak değişik hücre koşullarda çalıştığı var sayılmaktadır.

Mayada, pol. εεεε aktivitesini engelleyen mutasyonların ölümcül olması, enzim işlevinin kopyalama sırasında gerekli olduğuna işaret

etmektedir.

Ökaryotlarda çok fazla replikon olduğu için bakterilere göre çok daha fazla DNA polimeraz molekülü bulunur.

Ökaryotlarda, bakteriye göre daha fazla sayıda daha küçük replikon bulunması, ökaryotlardaki daha yavaş sentez hızının yaratabileceği

sorunları ortadan kaldırır.

Doğrusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur.

Prokaryotik ve ökaryotik DNA sentezi arasındaki fark, kromozomların yapısı ile ilgilidir.

Bakteri ve fajların çoğunda bulunan kapalı halkasal kromozomların tersine, ökaryotlardaki kromozomlar doğrusaldır.

Replikasyon sırasında kromozomun telomerik bölgesinin bir parçası olan doğrusal kromozom “uçlarında” özel bir sorunla kar şılaşır.

Kesintisiz zincirdeki sentez normal olarak kromozom ucuna kadar devam ederken, kesintili zincirde, RNA primeri uzaklaştığında

sorun ortaya çıkar.

Kesintili sentez sırasında oluşan 3’-OH grubuna nukleotit ilavesi yapılarak yeni oluşan boşluklar doldurulmalıdır.

Ancak burası kromozomun ucu olduğu için, 3’-OH grubunu sağlayacak kalıp zincir yoktur.

Dolayısıyla, her sentezin sonunda kromozom, teorik olarak, RNA primerinin boyu kadar kısalacaktır.

Telomerazolarak adlandırılan enzimin bulunması, daha karmaşık yapıdaki organizmaların bu problemi nasıl çözdüğünün

anlaşılmasına olanak sağlamıştır.

Tetrahymena’da telomerlerin çoğu 5’-TTGGGG-3’ dizisi ile sonlanır. Telomeraz, her replikasyon sonrası telomerin kısalmasını önlemek için, TTGGGG tekrar dizilerini yine aynı diziyi içe ren kromozom

ucuna ilave etmektedir.

DNA’nın ucunda TTGGGG dizisi bulunmasa da enzim yinede bu diziyi kromozomun ucuna eklemektedir.

O halde, TTGGGG, ne bir sinyal nede telomerazın işlev görmesi için gereklidir.

Enzim, yapısında katalitik aktivitesi için gerekli olan kısa bir RNA parçası bulunduran çok özgün yapıda ribonukleoproteindir.

Telomerik DNA dizilerinin evrim sürecinde çok sıkı korunmuş diziler olması, telomerlerin işlevlerinin oldukça kritik oldu ğunu gösterir.

Telomerin boyunun kısalmasıyla hücre yaşlanmasının moleküler mekanizması arasında bir bağlantı olduğu bilinmektedir.

Ökaryotlarda, somatik hücrelerin çoğunda telomeraz aslında aktif değildir ve bu nedenle, her hücre bölünmesi sonucu kromozomların

telomerleri kısalır.

Birçok bölünmeden sonra telomerde ciddi aşınmalar olur ve hücre daha fazla bölünme kapasitesini yitirir. Diğer yandan kanser hücrelerinde telomeraz aktivitesi korunmuştur, bu hücreler

ölümsüzdür.

DNA rekombinasyonu, replikasyonda olduğu gibi özgül enzimler tarafından gerçekleştirilir.

Önemli oranda DNA dizi homolojisi içeren iki kromozom boyunca eşdeğer pozisyonlardaki genetik değiş-tokuşa, genelyada

homolog rekombinasyondenir.

Homolog rekombinasyon, belirli ortak özelliklere sahip çeşitli modellerle açıklanmaya çalışılmıştır.

Robin Holliday ve Harold L.K. Whitehouse’un 1964’de, bağımsız olarak ortaya koyduğu modellere dayanmaktadır.

Değiş-tokuşun kusursuz olması DNA zincirleri arasındaki eşleniğe bağlıdır.

Bütün modellerin temelinde genetik rekombinasyonu gerçekleştirebilmek için bir dizi enzimatik i şlemler yer alır.

Süreç, iki eşleşmiş DNA dubleksi yada homologları ile başlar. Her bir çiftte, aynı pozisyonda endonukleaz aracılığı tek zincirde kırık

oluşur (a).

Zincirlerin kesim sonucu ortaya çıkan uçları yer değiştirir ve arkasından diğer dubleksin tamamlayıcı ipliği ile eşleşir (b).

Boşta kalan uçlar ligaz ile birleştirilerek heterodubleks DNA molekülleri adı verilen hibrit çiftler olu şturulur (c).

Değiş-tokuş sonucu çapraz köprü yapısı ortaya çıkar. Çapraz köprünün pozisyonu, dallanma (branch) göçü olarak adlandırılan

işlemle kromozom boyunca hareket eder (d).

Bu hareket, fermuarın açılıp kapanmasına benzer biçimde, her bir dubleksin yer değiştiren zincirinin e şlenik bazları arasındaki

H bağlarının kırılıp tekrar birle şmesiyle gerçekleşir.

Bu hareket sonucu her iki homolog üzerindeki heterodubleks DNA’nın uzunluğu artar.

Dubleksler ayrıldığında (f), ve alttaki kısım 180° döndüğünde (g), ki formu (chi form) denilen düzlemsel bir ara yapı oluşur ve

karakteristik Holliday yapısı ortaya çıkar.

Daha önce değiş-tokuşta yer almamış karşı homologlardaki iki zincir endonukleazla kırılırsa (h), ve tekrar birleşme olursa (i),

rekombinant dubleksler meydana gelir.

Gen konversiyonu (dönüşümü), DNA’nın rekombinasyonu sonucu ortaya çıkar.

Başlangıçta, Carl Lindegren’in mayada ve Mary Mitchell’in Neurospora’da saptadığı gen dönüşümü iki yakın bağlantılı gen

arasındaki karşılıklı olmayan (nonresiprokal) genetik değiş-tokuş olarak adlandırılır.

Örneğin, her biri değişik mutasyon taşıyan iki Neurospora suşunu çaprazlarsak (a+ X +b), genler arasındaki karşılıklı (resprokal)

rekombinasyonla ++ ve abgenotipleri taşıyan spor çiftleri oluşur.

Bunun aksine, tek taraflı değiş-tokuşta bu çiftlerden yalnız biri meydana gelir.

Bu olayların sıklığı öngörülen mutasyon hızına göre daha yüksektir ve dolayısıyla mutasyondan kaynaklandığı söylenemez.

Bunlar, gen konversiyonu olarak isimlendirilir, çünkü, genetik değiş-tokuşun olduğu yerde bir allel bir şekilde başka bir allele

“dönüşmüştür”.