molekulārās metodes mikrobioloģijā
DESCRIPTION
Molekulārās metodes mikrobioloģijā. Teorija 1 . Genomiskās DNS izdalīšana. 20 12 ./20 13 . mācību gada 2 . semestris. Māris Lazdiņš. Lielmolekulāras DNS izdalīšana. 1. Bioloģiskā materiāla iegūšana. 2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
1
Molekulārās metodes Molekulārās metodes mikrobioloģijāmikrobioloģijā
Teorija Teorija 11..
Genomiskās DNS izdalīšanaGenomiskās DNS izdalīšana
2012./2013. mācību gada 2. semestris
Māris Lazdiņš
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
2
Lielmolekulāras DNS izdalīšanaLielmolekulāras DNS izdalīšana
1. Bioloģiskā materiāla iegūšana.
2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska.
3. Šūnu noārdīšana (lizēšana) - mehāniska, ķīmiska.
4. DNS attīrīšana no citiem savienojumiem.
5. DNS izgulsnēšana un šķīdināšana.
6. DNS papildus attīrīšana.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
3
Cik daudz materiāla vajag ?Cik daudz materiāla vajag ?
Vienā diploīdā cilvēka šūnā -
6,6 pg (6,6x10-12g) DNS
Vienā E. coli šūnā -
5,0 fg (5,0x10-15g) DNS
Lai iegūtu 50 g DNS, vajadzētu:
~107 cilvēka šūnu (apmēram, 1 - 2 ml asiņu)
~1010 E. coli šūnu (apmēram, 2 ml tipiskas
E. coli naktskultūras, kas
atbilst ~ 6 mg mitro nogulšņu)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
4
Cik daudz materiāla vajag ?Cik daudz materiāla vajag ?
Reālais DNS iznākums parasti mazāks, piemēram:
~2 mg DNS no 1 g zīdītājdzīvnieku audiem,
10 - 40 g DNS no 1 g augu materiāla,
5 - 20 g DNS no 1 ml baktēriju kultūras
~20 g DNS no 1 ml cilvēka asiņu.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
5
Bioloģiskā materiāla iegūšanaBioloģiskā materiāla iegūšana
• Der jebkuras šūnas un audi, kuros atrodas DNS.
- zīdītāju eritrocīti un trombocīti ir bez kodoliem.
• Jāraugās, lai materiāls būtu tīrs, bez citu organismu vai DNS piesārņojuma.
• No piesārņojuma jāuzmanās arī DNS izdalīšanas laikā,
- reaģenti nedrīkst būtu piesārņoti ar
mikroorganismiem vai citu DNS.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
6
Audu Audu homogenizēšana homogenizēšana
vai vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
7
Audu homogenizēšana vai Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.
Blīvas daudzšūnu struktūras sadala pēc iespējas mazākos gabalos, lai uzlabotu lizējošo šķīdumu piekļuvi materiālam un palielinātu to iedarbības virsmu.
Nav nepieciešama materiāliem atsevišķu šūnu formā:
- baktēriju, raugu kultūras,
- eikariotu šūnu kultūras,
- asinis,
- sperma, amniocīti.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
8
Audu homogenizēšana vai Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.
Strādājot ar audiem,
- īpaši ar augu materiālu,
homogenizācija ir nepieciešama.
Izmanto - gaļas mašīnas,
- dzirnavas;
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
9
Audu homogenizēšana vai Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.
Sasaldē un homogenizē
- piestā,
- speciālos vibrohomogenizātoros,
- koloidālajās lodīšu dzirnavās.
Var iesaldētus audus homogenizēt ar āmuru.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
10
Audu homogenizēšana vai Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.dezintegrēšana.
Daži materiālu veidi viegli sagraujami beržot piestā.
Materiālu parasti iesaldē ar šķidru slāpekli un
saberž smalkā pulverī.
Efektivitāti palielina pievienotas:
- kvarca smiltis,
- stikla pulveris,
- alumīnija oksīda pulveris.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
11
Nažu dzirnavasNažu dzirnavas..
Materiāls tiek samalts ar rotējošiem nažiem.
Lieto audu gabalu homogenizēšani.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
12
Dounča homogenizatorsDounča homogenizators..
(Dounce homogenizer)
Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli.
Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
13
Potera homogenizatorsPotera homogenizators..
(Potter [Elvehjem ] homogenizer)
Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli.
Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
14
Lodīšu dzirnavas.Lodīšu dzirnavas.
Materiāls tiek samalts ar lodītēm vibrējošā kapsulā.
Materiālu parasti iesaldē.
Lieto audu gabalu
homogenizēšani.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
15
Ultraskaņas dezintegrēšana Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).(sonikācija).
Straujās svārstības vidē veiksmīgi iedarbojas uz šūnām un audu gabaliņiem,
radot spēcīgu nobīdes deformāciju.
Jāuzmanās no pārmērīgas parauga sasilšanas un putošanās - veic ledus vannā.
Šūnu un audu suspensijā, notiek arī DNS fragmentācija.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
16
Ultraskaņas dezintegrēšana Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).(sonikācija).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
17
FreFrennča presse.ča presse.
(French Press )
Šūnas ar lielu spiedienu tiek dzītas cauri ļoti smalkai sprauslai.
Pielieto mikroorganismiem ar šūnapvalku (baktērijas, aļģes, raugi)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
18
Homogenizēšana ar stikla daļiņām.
Materiālu vorteksē kopā ar stikla daļiņām.
Lieto audu kultūru, baktēriju suspensijām.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
19
DNSDNS kvanti-tēšanakvanti-tēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
20
DNS koncentrācijas noteikšanaDNS koncentrācijas noteikšana
Izdalītajai un attīrītajai DNS vēlams noteikt koncentrāciju.
To dara spektrofotometriski,
nosakot absorbciju pie 260 nm.
1 OD vienība atbilst ~50 g/ml divpavedienu DNS.
(l=1cm)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
21
DNS DNS tīrībastīrības pārbaude pārbaude
DNS preparāta tīrību var pārbaudīt mērot absorbciju pie 280 nm.
Tīrai DNS - OD260/OD280 = 1,8 (1,75)
Proteīnu piemaisījumi vai fenola paliekas šo vērtību samazina.
RNS - palielina. (tīrai RNS - OD260/OD280 = 2.0).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
22
DNS DNS tīrībastīrības pārbaude pārbaude
Aminoskābju
aromātiskās
sānu grupas
Peptīdsaites
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
23
DNS DNS tīrībastīrības pārbaude pārbaude
Ja paraugā ir proteīnu, RNS u.c. piemaisījumi - kvantitēšana pēc OD260 var izrādīties visai neprecīza.
Ja DNS preparātā ir neliels proteīnu piejaukums, var mērīt arī absorbciju pie 230 nm.
OD260/OD230 < 1.5 norāda uz proteīnu (peptīdsaite) un citu organisku vai neorganisku vielu piesārņojumu paraugā. (normāli vērtībai jābūt 2.0 - 3.0)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
24
DNS kvalitātes pārbaudeDNS kvalitātes pārbaude
DNS preparātu analizē elektroforētiski -
pārbauda, kāds ir raksturīgais DNS fragmentu lielums, salīdzinot ar DNS fragmentu garuma standartiem.
Parastā agarozes elektroforēzē var atdalīt DNS fragmentus līdz 16 000 bp.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
25
DNS kvalitātes pārbaudeDNS kvalitātes pārbaude
Arī lielākie DNS fragmenti migrē kopā ar 16 kb zonu.
Garākus fragmentus (līdz 10 Mb) var izšķirt ar pulsējošā lauka gelelektroforēzi (PFGE).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
26
DNS kvalitātes pārbaudeDNS kvalitātes pārbaude
Liela izmēra dpDNS fragmenti
(> 16 000 bp)
RNS
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
27
DNS kvalitātes pārbaudeDNS kvalitātes pārbaude
Daļēji hidrolizēta DNS
Stipri hidrolizēta DNS
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
28
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
29
Lizēšanas buferos parasti ietver:
Tris - HCl 10 - 100 mM pH 6,5 - 8,0
Savienojums bufersistēmu veidošanai, lai uzturētu noteiktu pH.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
30
TrisTris-bāze-bāze
LD50 / orāli / žurkai = 5 900 mg/kg
kairina ādu, gļotādas Xi
Sintētiska viela (~1940) ar bāziskām īpašībām
(pH ~ 10,5)
Tris(hidroksimetil)aminometāns;Trometamīns; Trizma u.c.
2-Amino-2-(hidroksimetil)--1,3-propāndiols
C4H11NO3
(HOCH2)3CNH2
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
31
TrisTris-bāze-bāze
Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955)
pH 6,5 - 8,5
titrējot ar dažādām skābēm,
visbiežāk HCl => Tris - HCl Bieži lietotās pH vērtības: 6,7 7,0 7,5 8,0
Gatavo 2M izejas šķīdumu ar vajadzīgo pH
2-Amino-2-(hidroksimetil)--1,3-propāndiols
H+
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
32
TrisTris-bāze-bāze
Elektroforēzei bieži izmanto:
Tris - borāta (borskābe)
Tris - acetāta (etiķskābe)
Tris - glicīna
Tris - alanīna (aminoskābes) bufersistēmas.
2-Amino-2-(hidroksimetil)--1,3-propāndiols
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
33
Lizēšanas buferos tāpat kā daudzos citos šķīdumos darbam ar nukleīnskābēm parasti ietver:
EDTA 10 - 100 mM koncentrācijā.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
34
EDTAEDTAEDTA - Etilēndiamīn-N,N,N',N'-tetraetiķskābe
Etilendiamīn-tetraetiķskābe
C10H16N2O8
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
35
EDTAEDTA
Etilendiamīn-tetraetiķskābe LD50 / orāli / žurkai = 2 200 mg/kg
Sintētiska viela (~1935) ar maz izteiktām skābes īpašībām.
EDTA skābes formai maza šķīdība ūdenī (~0,5g/l), tādēļ parasti lieto tās sāļus ar vienvērtīgajiem katjoniem.
Visbiežāk izmanto dinātrija sāli (Na2EDTA), kura ūdenī šķīst daudz labāk.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
36
EDTAEDTAEDTA Savienojums labi saista divvērtīgo metālu
jonus (Ca++, Mg++), kuri nepieciešami nukleāžu un citu hidrolītisko
enzīmu aktivitātei.
Pievieno arī asins paraugiem uzglabāšanas laikā kā pretrecēšanas līdzekli, jo tas saista asins recēšanai nepieciešamos Ca++ jonus (EDTA vakutaineri).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
37
EDTAEDTA
Laboratorijas vajadzībām gatavo 0,5M izejas šķīdumu.
Lai viela pilnībā izšķīstu, ar NaOH šķīdumu titrē līdz pH 8,0
Darba šķīdumos EDTA koncentrācija parasti
1 - 100 mM
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
38
EDTAEDTAPlašāks pielietojums -
kā ūdens mīkstinātājs un dažādu daudzvērtīgo metālu jonu helators rūpnieciskajos un ūdens attīrīšanas procesos;
EDTA sāļi arī kā pārtikas piede-
va - stabilizators (E385; E386);
Medicīnā kā pretinde saindējo-
ties ar smago metālu sāļiem.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
39
Lizēšanas vai ķīmiskās noārdīšanas procesu pamatā veic ar jonisko deterģentu palīdzību.
Bieži tiek izmantots ~ 0,5% SDS
(beigu koncentrācija darba šķīdumā).
! ! !! ! ! Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī.Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
40
SDSSDS
Nātrija laurilsulfāts SLS (sadzīves ķīmijā)
Nātrija dodecilsulfāts NaC12H25SO4
LD50 / orāli / žurkai = 1 288 mg/kg
kairina ādu, gļotādas Xi
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
41
Pussintētiska viela, ko pamatā iegūst no eļļas palmu augļu un kokosriekstu eļļas (bagātas ar laurilskābi).
Ūdens šķīdumiem bāziskas īpašības (pH 9-10).
SDS Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloidālas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām
un hidrofobām vielām.
SDSSDS
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
42
SDSSDS
Pielietojums:
- Audu un šūnu ķīmiska noārdīšana (P., nukleīnskābju izdalīšana),
- Proteīnu denaturēšana
gelelektroforēzē,
(~1 SDS molekula uz 2 aminoskābju atlikumiem)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
43
SDSSDS
SDS Gatavo 10% izejas šķīdumu ūdenī.
Uzglabā istabas temperatūrā, lai SDS nekristalizētos un šķīdums "nesasaltu".
SDS kā deterģents plaši tiek lietots arī sadzīves ķīmijā:
- šampūni,
- tehniskie mazgāšanas līdzekļi,
- šķidrās ziepes.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
44
Lizēšanas gaitā nereti tiek izmantota materiāla apstrāde ar :
Proteināzi K Proteolītisks enzīms.
Aktivitāti iespējams divkāršot paaugstinot temperatūru
no 37°C => 50° - 60°C
virs 65°C sākas strauja enzīma denaturācija.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
45
Proteināze K
Optimālais pH: 7.5 - 12.0
Aktivitātei netraucē denaturējoši aģenti:
- SDS 0,5 - 1,0 %,
- urīnviela 1 - 4 M.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
EC 3.4.21.64
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
46
Proteināzes K
Aktivitātei netraucē :
- jonu helatori (EDTA)
(enzīmam vēlami Ca+ joni, bet tā stabilitātei, ne aktivitātei);
- tripsīna un himotripsīna inhibitori.
Enzīmu iespējams izmantot apstākļos, kad
vairums šūnas enzīmu (nukleāžu) zaudējuši aktivitāti.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
47
Proteināzi K iegūst no sēnes Tritirachium album līnijas Limber.
Endoproteāze. Serīna proteāze. EC 3.4.21.64
Peptīdsaiti šķeļ karboksil grupas pusē no alifātiskajām, aromātiskajām vai hidrofobajām aminoskābēm.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
48
Proteināzi K Parasti izmantotā beigu koncentrācija darba šķīdumos:
0,05 - 1,0 mg/ml
Izejas šķīdumu koncentrācija 20 mg/ml vai 10 mg/ml,
Šķīdina ūdenī vai uzglabāšanas buferī:
20mM Tris-HCl (pH 7.4),
1mM CaCl2
50 % glicerols
Fasē un uzglabā mazos tilpumos - 20o C
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
49
Proteināze K tiek izmantota arī šūnu struktūru noārdīšanai, lai labāk
izdalītu to sastāvdaļas, piemēram, mitohondrijus.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
50
Apstrādi ar Proteināzi K var papildināt vai aizstāt ar joniskā deterģenta CTAB klātbūtni.
Tas ne tikai denaturē proteīnus, bet arī ar tā palīdzību iespējams izgulsnēt nukleīnskābes.
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
51
CTABCTAB Cetiltrimetilamonija bromīds (Heksadecil-trimetil-amonija
bromīds) cetyltrimethylammonium bromide,
hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB C19H42BrN
Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloīdas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
52
CTABCTAB
Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN
Plaši izmanto arī kā antiseptisko līdzeklis pret baktērijām un sēnēm.
LD50 / orāli / žurkai = 410 mg/kg
kairina ādu, gļotādas, acis Xi Xn
izteikti toksisks ūdenī dzīvojošiem
organismiem
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
53
CTABCTAB
Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN
DNS salīdzinoši labi šķīst CTAB šķīdumos ar lielu sāļu koncentrāciju, šādos šķīdumos labi šķīst arī polifenoli un polisaharīdi.
(parasti izmanto NaCl koncentrācijas > 0,8 M).
Samazinot sāļu koncentrāciju, DNS šķīdība CTAB klātienē samazinās, taču polifenolu un polisaharīdu šķīdību tas praktiski neietekmē.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
54
CTABCTAB
DNS nogulsnes šķīdina lielas koncentrācijas (1,2 M) NaCl šķīdumā, atšķaidot izgulsnētās CTAB paliekas un novēršot savienojuma spējas izgulsnēt DNS, kad vēlāk sāļu koncentrācija atkal tiks samazināta.
Samazinot sāļu koncentrāciju (NaCl konc. < 0,5 M), piemēram, pievienojot precipitācijas šķīdumu ar 40 mM NaCl koncentrāciju, DNS tiek izgulsnēta, bet daudzus enzīmus inhibējošie polisaharīdi un polifenoli paliek šķīdumā.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
55
CTABCTAB
CTAB mazāk efektīvi izgulsnē RNS, tādēļ ar šo metodi iegūtajiem DNS paraugiem parasti ir mazāk RNS piemaisījumu.
DNS izdalīšana ar CTAB palīdzību īpaši izdevīga apstrādājot augu valsts paraugus, kuriem raksturīgs liels polifenolu un polisaharīdu saturs.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
56
CTABCTAB
CTAB izmantošana DNS izdalīšanai tika ieviesta ~ 1980. gadā.
Dažkārt CTAB lizējošiem šķīdumiem papildus pievieno arī β-merkaptoetanolu un/vai polivinilpirolidonu, taču tas ievērojami saīsina pagatavoto šķīdumu derīguma laiku (derīgs 2-3 dienas).
Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight
plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC324241/
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
57
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī:
N-Lauroilsarkozīnu (sarkozilu), parasti tā nātrija sāls veidāSodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl
Lurilskābes un sarkozīna (N-metilglicīna) veidots amīds.
C15H29NO3 vai
C15H28NNaO3
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
58
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana
N-Lauroilsarkozīns (sarkozils) vai tā nātrija sālsSodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl
Aktīvs deterģents, ja tā koncentrācija lielāka par 1%, traucē proteināzes K darbību.
Mazās koncentrācijās tiek izmantots arī kā transkripcijas iniciācijas inhibitors.
Tiek izmantots dažādos mazgāšanas līdzekļos un šampūnos.
C15H29NO3 vai
C15H28NNaO3
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
59
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī:
Guanidīna hlorīdu (Guanidīna hidrohlorīdu)
Guanidinium chloride GuHCl
"Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem (diatomaceous earth).
CH6ClN3
Ļoti spēcīgs proteīnus denaturējošsaģents.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
60
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī:
Guanidīna tiocianātu Guanidinium thiocyanate GITC
"Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem.
C2H6N4S
Tāpat ļoti spēcīgs proteīnusdenaturējošs aģents.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
61
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Baktēriju lizēšanai iesaka izmantot
- lizocīmu (lysozyme; muramidase )EC 3.2.1.17
vai
- stafolizīnu (stapholysin; lysostaphin )
- ahromopeptidāzi (achromopeptidase)
u. c. enzīmus,
kuri katalizē baktēriju šūnapvalkus veidojošo lielmolekulāro savienojumu hidrolīzi.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
62
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC 3.2.1.17
Veicina īsto baktēriju šūnapvalku sastāvā ietilpstošo peptidoglikānu (mureīnu) noārdīšanos, katalizējot hidrolīzi glikozīdiskajai saitei starp N-acetilmuramskābi un N-acetilglikozamīnu.
N-acetilglikozamīns N-acetilmuramskābe
(NAG) (NAM)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
63
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC 3.2.1.17
Dzīvnieku nespecifiskās imūnsistēmas sastāvdaļa, izdalās siekalās, pienā, sviedros, gremošanas traktā.
Lielā daudzumā atrodams putnu olu baltumā, izmanto arī pārtikā kā konservantu E 1105
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
64
Šūnu lizēšanaŠūnu lizēšana Rauga šūnu hitīna apvalku noārdīšanu veicina citi enzīmi, piemēram,
Zimoliāze (zymolyase) - EC 3.2.1.39,
ko iegūst no Arthrobacter luteus
vai
Gluzulāzi (glusulase) no vīngkiemežu Helix pomatia
zarnu ekstrakta, kas ir glikuronidāzes,
glikuron-sulfatāzes un celulāzes maisījums u.c.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
65
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Lieto ar buferšķīdumu (ūdeni) piesātinātu fenolu;
Fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu; (25:24:1)
Hloroformu.
Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus, piemēram, hēma gredzenus u.c.
Ūdens un organisko fāzi ņem tilpuma attiecībās 1:1
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
66
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
67
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Vorteksējot izveido abu fāzu emulsiju, lai palielinātu fāzu saskares virsmu.
Centrifugējot fāzes atdalās, starp tām paliek denaturētu piemaisījumu slānis (šūnapvalku polisaharīdi, proteīni u.c.).
DNS atrodas ūdens fāzē, to atsūc un pārnes uz jaunu stobriņu.
Ūdens fāze
Denaturētiepiemaisījumi
Organiskā fāze
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
68
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
!!! Fenola reakcijai jābūt viegli sārmainai vai neitrālai.
Ja reakcija ir skāba, DNS sāk šķīst organiskajā fāzē, kā rezultātā var rasties lieli DNS zudumi.
Fenolam ir tendence oksidēties par benzoskābi, kura paskābina organisko fāzi.
Vēlams fenolu līdzsvarot ar nedaudz sārmainu Tris buferšķīdumu un pievienot kādu antioksidantu (piemēram, oksihinolīnu.)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
69
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana.
Pārdestilētu fenolu izkausē 50-60 oC ūdens vannā.
Pievieno tādu pašu tilpumu 1M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min).Šajā procesā organiskās fāzes tilpums palielināsies.
Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot.
Novāc ūdens/buferšķīduma fāzi.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
70
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana.
Pievieno tādu pašu tilpumu 0,1 M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min).
Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot.
Pārbauda ūdens fāzes pH.Ja pH < 8,0 atkārto fenola līdzsvarošanu ar 1M Tris-Cl pH 8,0.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
71
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana.
Kad buferšķīduma pH vairs nav būtiski samazinājies, pievieno oksihinolīnu (tā beigu koncentrācija organiskajā fāzē 0,1%) un, ja nepieciešams, vēl
citus komponentus (hloroformu, izoamilspirtu).
Iegūto maisījumu uzglabā zem 0,1 M (vai citas koncentrācijas) Tris-Cl pH 8,0.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
72
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Hloroformu izmanto:
lai denaturētu proteīnus un ekstraģētu hidrofobus savienojumus;
maisījumā ar fenolu, arī lai palielinātu organiskās fāzes blīvumu.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
73
Organiskā ekstrakcija.Organiskā ekstrakcija.
Izoamilspirtu izmanto:
lai palielinātu organiskā maisījuma virsmas spraigumu, kas novērš:
- putošanos apstrādes gaitā;- uzlabo ūdens un organiskās fāzes atdalīšanas iespējas.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
74
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
Lai atbrīvotos no dažādiem:
- neorganiskiem sāļiem,
- deterģentiem,
- fenola/hloroforma paliekām,
- mazmolekulārajiem org. savienojumiem;
un palielinātu DNS koncentrāciju,
veic DNS izgulsnēšanu no šķīduma.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
75
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
Izmanto lielmolekulāro NS īpatnību -
to šķīdība jūtami samazinās
50 - 60 % spirtu šķīdumos,
īpaši monovalento katjonu
(Na+, K+, Li+) klātbūtnē.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
76
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
Li+ jonu klātbūtnē labāk izgulsnējas RNS molekulas.
Šo īpašību dažās metodēs izmanto, lai DNS paraugus atbrīvotu no lieliem RNS piemaisījumiem.
Izgulsnēšanai lieto 96o vai 100o etanolu tilpuma attiecībās 2:1 vai (pirmais skaitlis - spirta tilpums)
Izopropanolu tilpuma attiecībās 0,6:1 - 1:1
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
77
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
Var arī izgulsnēt tikai ar lielām ( virs 1M) monovalento katjonu (Na+, K+, Li+) koncentrācijām,
visbiežāk lieto NaCl.
taču šajā gadījumā grūtāk DNS atbrīvot no sāļu paliekām.
NaCl un LiCl parasti sagatavot 5M izejas šķīdumu veidā.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
78
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
DNS efektīvāk izgulsnējas no koncentrētiem DNS šķīdumiem, kuros DNS pavedieni viegli sastop viens otru, saķeras kopā un veido lielus precipitātus.
Optimālā gadījumā visa genomiskā DNS saķeras vienā lielā kamolā, kuru var izcelt no šķīduma ar stikla āķīti vai piesūcot pipetes uzgalim.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
79
DNS izgulsnēšanaDNS izgulsnēšana
Lai DNS veiksmīgi izgulsnētu no ļoti atšķaidītiem šķīdumiem, dažkārt papildus pievieno:
- attīrītu RNS,
- glikogēnu u.c.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
80
DNS savākšanaDNS savākšana
Ja veidojas daudzi sīki DNS precipitātu fragmenti vai tos vispār nevar saskatīt, paraugs jācentrifugē.
Bieži pēc genomiskās DNS sablīvēšanas,
īpaši ja DNS ir daudz,
rodas problēmas ar tās izšķīdināšanu.
Labi izšķīst tikai īsie DNS fragmenti.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
81
DNS attīrīšanaDNS attīrīšana
Lai atbrīvotos no palikušām
- neorganisko sāļu,
- izopropanola,
- fenola paliekām,
veic DNS nogulšņu mazgāšanu ar 700 (800) etanolu.
Šādā etanola koncentrācijā DNS nešķīst,
bet neorganiskie sāļi un citi mazmolekulārie savienojumi daļēji saglabā šķīdību.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
82
DNS attīrīšanaDNS attīrīšana
DNS pārnes stobriņā ar 700 (70%) etanolu,
maisa invertējot (vai vorteksējot),
pārnes uz nākošo stobriņu.
Pēc tam atsūc etanola paliekas, var nedaudz pažāvēt (10-15 min.) telpas apstākļos.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
83
DNS attīrīšanaDNS attīrīšana
Sablīvētu, kārtīgi izkaltētu genomisko DNS vairs
nevar izšķīdināt pat vārot !!!
DNS šķīdina dest. ūdenī vai
TE buferī.
TE 10 mM Tris-HCl, pH 7,5;
1 mM EDTA
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
84
DNS šķīdināšanaDNS šķīdināšana
DNS šķīšanas ātrums atkarīgs no fragmentu garuma, sablīvētības pakāpes un lielmolekulāru piemaisījumu daudzuma.
Pareizi izdalīta genomiskā DNS pilnībā izšķīst tikai pēc 12 - 24 stundām.
Genomiskās DNS šķīdumu iesaka glabāt 4oC
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
85
DNS uzglabāšanaDNS uzglabāšana
Iesaldēšana un atkausēšana rada DNS fragmentāciju.
Izdalīto DNS var fasēt mazos tilpumos,
lai novērstu atkārtotu iesaldēšanu un atkausēšanu.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
86
DNS papildus attīrīšanaDNS papildus attīrīšana
Ja grib atbrīvoties no RNS piemaisījumiem DNS preparātā,
to var darīt ar RN-āžu (ribonukleāžu) palīdzību.
No RN-āzes savukārt atbrīvojas ar atkārtotu fenola (gloroforma) ekstrakciju un DNS pārgulsnēšanu.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
87
RibonukleāzesRibonukleāzes
- enzīmi, kas katalizē RNS molekulu hidrolīzi.
Dažas RN-āzes šķeļ RNS molekulas pēc noteikta nukleotīda un tiek lietotas aptuvenas RNS nukleotīdu secības noteikšanai,
tomēr pārsvarā šķelšana ir nespecifiska vai vairāk saistīta ar RNS telpiskajām struktūrām.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
88
RibonukleāzesRibonukleāzes
RNāze A (pankreātiskā) EC 3.1.27.5
Iegūst no liellopu aizkuņģa dziedzera.
Endoribonukleāze, kas pazīst pirimidīna nukleotīdus un šķeļot veido fragmentus ar fosfātgrupu 3' galā un hidroksilgrupu 5' galā.
Izmanto DNS preparātu atbrīvošanai no RNS piemaisījumiem.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
89
RibonukleāzesRibonukleāzes
RNāze A
Vēlams lietot molekulārās bioloģijas tīrības klases enzīmu,
kurš speciāli attīrīts no DN-āzēm un svešas DNS piemaisījumiem.
RN-āze A ir termoizturīga, šo īpašību izmanto, lai to atbrīvotu no, parasti, termo nestabilajām DN-āzēm.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
90
RibonukleāzesRibonukleāzes
RNāze A
Izejas šķīdumu gatavo ūdunī vai TE buferī ar koncentrāciju 10 vai 1 mg/ml.
Pēc izšķīdināšanas 10 - 30 min. tur vārošā ūdens vannā.
Fasē nelielos tilpumos un glabā -20oC.
Darba šķīdumos parasti lieto koncentrācijas
50 - 5 µg/ml.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
91
DNS attīrīšanaDNS attīrīšana
Papildus attīrīšanai var lietot
jonapmaiņas vai
gelfiltrācijas hromatogrāfijas kolonnas.
Var lietot ultracentrifugāciju CsCl2 gradientā vai pārgulsnēšanu ar PEG (polietilēnglikolu).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
92
......
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
93
Diferenciālā šūnu lizēšana.
Pielieto, lai:
1. no asins paraugiem iegūtu tikai kodolainās šūnas;
2. no šūnām iegūtu tikai genomisko DNS (kodolus).
3. īpašos gadījumos (piemēram spermatozoīdu DNS atdalīšanai no somatisko šūnu DNS u.c.).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
94
Diferenciālā šūnu lizēšana.
1.1.
Tikai nelielai asins šūnu daļai ir kodoli.
Lielā eritrocītu un trombocītu masa,
asins plazmas proteīni,
hemoglobīns u.c. savienojumi
rada tikai papildus piesārņojumu.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
95
Diferenciālā šūnu lizēšana.
1.1.
Izmantojot bezkodolu šūnu palielinātu jūtību pret osmotisko šoku,
tās var noārdīt pirmās un savākt tikai kodolaino šūnu nogulsnes.
Asinīm pievieno vismaz 1 tilpumu (parasti vairāk) mazas sāļu koncentrācijas buferšķīdumu, lai radītu hemolīzi.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
96
Diferenciālā šūnu lizēšana.
1.1.
Plaši tiek izmantots TE buferis.
Pēc centrifugēšanas nogulsnes mazgā
(atkārtoti resuspendē) TE buferī.
Šo procedūru atkārto līdz nogulsnes vairs tikai viegli sārtas. (dažkārt izmanto vienkārši H2O)
Tad tās resuspendē nelielā tilpumā līzes bufera un izdala DNS.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
97
Diferenciālā šūnu lizēšana.
1.1.
Kodolainās šūnas no asinīm var sakoncentrēt arī ar centrifugācijas palīdzību.
Plazma
Kodolaino šūnu slānis
Eritrocīti
Tālākai apstrādei savāc kodolaino šūnu slāni.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
98
Diferenciālā šūnu lizēšana.
Pielieto, lai:
1. no asins paraugiem iegūtu tikai kodolainās šūnas;
2. no šūnām iegūtu tikai genomisko DNS (kodolus).
3. īpašos gadījumos (piemēram spermatozoīdu DNS atdalīšanai no somatisko šūnu DNS u.c.).
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
99
Diferenciālā šūnu lizēšana.
2.2.
Izmanto, lai iegūtu tikai kodolā esošo DNS.
Šūnas ārējā, vienā slānī esošā membrāna, noārdās vieglāk nekā organellas aptverošais divkāršais membrānu slānis.
Izmantojot šo parādību var lizēt šūnu, nebojājot organellu (kodolu, mitohondriju u.c.) membrānas.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
100
Diferenciālā šūnu lizēšana.
2.2.
Pēc tam organellas atdala, lietojot diferenciālo centrifugāciju.
Lielos un blīvos šūnu kodolus var viegli sedimentēt ar neliellu RCP. (~500g).
Šādos apstākļos mitohondriji netiek izgulsnēti.
Tālāk tiek apstrādāti tikai šūnu kodoli.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
101
Diferenciālā šūnu lizēšana.
2.2.
Selektīvai ārējo membrānu lizēšanai lieto nejoniskos deterģentus, kuru iedarbība nav tik agresīva.
Bieži tiek izmantots Tritons X-100
alpha-[4-(1,1,3,3-tetramethyl butyl) phenyl]-omega-hydroxypoly (oxy-1,2-ethanediyl)
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
102
Diferenciālā šūnu lizēšana.
2.2.
Rezultātā atbrīvojas no
- citoplazmatiskajiem iedzimtības faktoriem,
- citoplazmatiskajiem proteīniem un citiem savienojumiem.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
103
DNS izdalīšana.DNS izdalīšana.
Patreiz tiek piedāvāts liels skaits komerciālo komplektu DNS izdalīšanai un attīrīšanai.
http://www.thermoscientificbio.com/fermentas/
http://www.fermentas.com
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
104
DNS izdalīšana.DNS izdalīšana.
Izveidotas arī automātiskas un pusautomātiskas iekārts, kuras pielieto rutīnas medicīniskās analīzēs vai tieslietu medicīnā.
"-" lielas izmaksas un neliels DNS iznākums.
"+" standartizēta procedūra ar labu atkārtojamību.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
105
DNS izdalīšanaDNS izdalīšana
Iepriekš aprakstītās metodes ļauj iegūt vidēja izmēra genomisko DNS,
kas piemērota bakteriofāgu un kosmīdu bibliotēku veidošanai, PCR veikšanai,
nav piemērota izteikti lielmolekulāras DNS iegūšanai.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
106
DNS izdalīšanaDNS izdalīšana
Jebkuras manipulācijas ar DNS -
- fenola ekstrakcija,
- precipitācija,
- šķīdināšana
rada DNS mehānisku fragmentāciju.
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
107
DNS izdalīšanaDNS izdalīšana
Lai to novērstu,
visas manipulācijas veic ar agarozes gabaliņos ieslēgtu
DNS (paraugu).
Pēc PFGE vēlamā garuma DNS fragmenti tiek izdalīti no gela un iekonstruēti atbilstošā vektorā
21.09.2012 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
108
......