molekulárny aspekt monogénnych ochorení

Molekulárny aspekt monogénnych ochorení

Typy mutácií, zapríčiňujúcich monogénne ochoreniaMutácie v kódujúcich sekvenciách– model: Hb varianty

Mutácie v nekódujúcich sekvenciách– model: talasémie

Nomenklatúra lokusov, alel a mutáciíLokusová a alelová heterogenita monogénnych ochorení

Typy mutácií

Triedenie mutácií s patogénnym efektomTriedenie mutácií s patogénnym efektom1.1. podľa zmeny na úrovni DNApodľa zmeny na úrovni DNA

2.2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidupodľa dôsledkov na štruktúru polypetidu

3.3. podľa dôsledkov na funkciu polypeptidupodľa dôsledkov na funkciu polypeptidu

4.4. podľa miesta lokalizáciepodľa miesta lokalizácie

1. podľa zmeny na úrovni DNA1. podľa zmeny na úrovni DNA

substitúciesubstitúcie– tranzícia - tranzícia - purín purín > pu> purín alebo pirimidín rín alebo pirimidín >>

pirimidínpirimidín– transverzia – transverzia – purín pirimidínpurín pirimidín

– najčastejšie najčastejšie tranzíciatranzícia C C >> T (8,5 krát) T (8,5 krát)

CpG dinukleotid je mutačné „CpG dinukleotid je mutačné „horúce miesto“horúce miesto“

CC >> metylácia metylácia >> metylc metylcyytozín tozín >> deaminácia deaminácia >> TT– ostatné:ostatné: chyby pri replikácii a v oprave DNA chyby pri replikácii a v oprave DNA

delécie delécie (rozsah 1 bp – desiatky Mb)(rozsah 1 bp – desiatky Mb)– delécie rozsahu 1 – niekoľko bp často vznikajú v delécie rozsahu 1 – niekoľko bp často vznikajú v

repetitívnych sekvenciách (repetitívnych sekvenciách (strand slippage)strand slippage)– nehomologický crossing-overnehomologický crossing-over– nehomologická výmena sesterských chromatídnehomologická výmena sesterských chromatíd

duplikácie – duplikácie – v podstate sú opakom deléciív podstate sú opakom delécií– aj spôsob vznikuaj spôsob vzniku– duplikácia génu duplikácia génu PMP22 – PMP22 – Charcot-Marie-Tooth Charcot-Marie-Tooth

sy.sy.– delécia génu delécia génu PMP22 – PMP22 – myopatia HNPPmyopatia HNPP

expanzie – expanzie – zmnoženie krátkej sekvencie o zmnoženie krátkej sekvencie o niekoľko desiatok až stovákniekoľko desiatok až stovák– najčastejšie trinukleotidu (napr CAG pri najčastejšie trinukleotidu (napr CAG pri

Huntingtonovej choreiHuntingtonovej chorei• normálna variabilita: normálna variabilita: do 27 opakovanído 27 opakovaní• premutácia (instabilita): premutácia (instabilita): 27 – 34 27 – 34

opakovaníopakovaní• variabilná penetranciavariabilná penetrancia: 35 – 39 : 35 – 39

opakovaníopakovaní• mutácia (patológia). mutácia (patológia). nad 39 opakovanínad 39 opakovaní

inzercieinzercie– prerušenie génu inou DNA sekvenciouprerušenie génu inou DNA sekvenciou– najčastejšie sú to transpozabilné elementy najčastejšie sú to transpozabilné elementy

(nspr. L1 pri hemofílii A)(nspr. L1 pri hemofílii A)

inverzie – inverzie – otočenie úseku DNA v dôsledku otočenie úseku DNA v dôsledku intrachromozomálnej rekombinácie intrachromozomálnej rekombinácie – dôsledkom je prerušenie génu (50 % prípadov dôsledkom je prerušenie génu (50 % prípadov

ťažkej HA je zapríčinených inverziou)ťažkej HA je zapríčinených inverziou)fúzované (hybridné) gényfúzované (hybridné) gényvznik – nehomologický crossing-overvznik – nehomologický crossing-over

- translokácia chromozómov- translokácia chromozómovt(9t(9;22) > BCR/ABL > ;22) > BCR/ABL > chronickchronická myeloidná á myeloidná

leukémialeukémiagénová konverzia – génová konverzia – je nerecipročný prenos je nerecipročný prenos sekvenčnej informácie z donorovej sekvencie na sekvenčnej informácie z donorovej sekvencie na akceptorovú sekvenciu akceptorovú sekvenciu – najčastejšie z nefunkčného pseudogénu na fukčný najčastejšie z nefunkčného pseudogénu na fukčný

géngén– dôsledok – vyradenie funkčného génudôsledok – vyradenie funkčného génu

• napr napr SMN1 SMN1 > SMN2 > > SMN2 > spinspinálna svalová álna svalová atrofiaatrofia

2. 2. podľa dôsledkov na štruktúru polypetidupodľa dôsledkov na štruktúru polypetidusubstitúcie sa delia:substitúcie sa delia:– nemé (nemé (silent)silent): - nedochádza zámena : - nedochádza zámena

aminokyselinyaminokyseliny– meniace zmysel meniace zmysel (missense)(missense): zámena : zámena

aminokyselinyaminokyseliny– nezmyselné nezmyselné (nonsense)(nonsense): vzniká STOP kodón: vzniká STOP kodón

UGUGCC (cysteín) (cysteín) (degenerácia kódu)(degenerácia kódu)

UGUUGU (cysteín) (cysteín) UUAAU U (tyrozín)(tyrozín) UGUGAA (STOP) (STOP)

všeobecne: všeobecne: – STOP mutácie sú závažnéSTOP mutácie sú závažné– závažnosť missenese mut. závisí od toho či závažnosť missenese mut. závisí od toho či

postihujú funkčne dôležité doménypostihujú funkčne dôležité domény– aj silent mutácie môžu mať patologický dopad aj silent mutácie môžu mať patologický dopad

(aktivácia kriptického zostrihového miesta)(aktivácia kriptického zostrihového miesta)

2. 2. podľa dôsledkov na štruktúru podľa dôsledkov na štruktúru polypetidu - polypetidu - pokrpokr..

posunové mutácie posunové mutácie (frame-shift)(frame-shift)– úpĺne zmenená sekvencia polypeptidu od úpĺne zmenená sekvencia polypeptidu od

bodu mutáciebodu mutácie– najčastejšie sa však vytvorí najčastejšie sa však vytvorí STOPSTOP kodón kodón– závažný dopad na funkciuzávažný dopad na funkciu– na úrovni DNA sú to predovšetkým malé na úrovni DNA sú to predovšetkým malé

delécia a inzercie, ktoré nie sú násobkom 3 delécia a inzercie, ktoré nie sú násobkom 3 (kodónu)(kodónu)

pridanie nových aminokyselín do pridanie nových aminokyselín do polypeptidupolypeptidu– inzercie násobku 3 bp inzercie násobku 3 bp – expanzie: napr. „CAG“ kódujúci glutamín u expanzie: napr. „CAG“ kódujúci glutamín u

Huntingtonovej choreiHuntingtonovej chorei

33. . podľa dôsledkov na funkciu polypeptidupodľa dôsledkov na funkciu polypeptidu..Z hladiska patológie dôležitý je vplyv na funkciu Z hladiska patológie dôležitý je vplyv na funkciu

polypeptidu a nie zmena na úrovni DNApolypeptidu a nie zmena na úrovni DNAa)a) znížená až nulová funkciaznížená až nulová funkcia (loss-of-function)(loss-of-function)b)b) nová (abnormálna) funkcia nová (abnormálna) funkcia (gain-of-function)(gain-of-function)

a) loss-of-functiona) loss-of-function– môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)– najčastejšie sú recesívne (nie je dôležité presné najčastejšie sú recesívne (nie je dôležité presné

množstvo produktu, napr. enzýmy – 50 % akt. množstvo produktu, napr. enzýmy – 50 % akt. • haploinsuficiencia haploinsuficiencia – polovičná dávka nestačí– polovičná dávka nestačí• dominantný negatívny efekt – dominantný negatívny efekt – nefunkčný nefunkčný

polypeptid blokuje produkt normálnej alelypolypeptid blokuje produkt normálnej alely– všetky typy zmien na úrovni DNA môžu viesť k všetky typy zmien na úrovni DNA môžu viesť k

„loss-of-function“„loss-of-function“

a) loss-of-function a) loss-of-function – pokr.– pokr.všeobecne:všeobecne:

– missense mut., duplikácie, delécia a inzercie missense mut., duplikácie, delécia a inzercie neporuš. čítací rámec zachovajú urč. reziduálnu neporuš. čítací rámec zachovajú urč. reziduálnu funkciufunkciu

– veľké prestavby (delécie, inzercie, inverzie), STOP veľké prestavby (delécie, inzercie, inverzie), STOP mut. úplne eliminujú funkciu alelymut. úplne eliminujú funkciu alely

– prevažná väčšina mutácií je tohto typuprevažná väčšina mutácií je tohto typu

b)b) gain-of-functiongain-of-function― zmenený polypeptid získa novú funkciuzmenený polypeptid získa novú funkciu― môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)môže mať rôzne mechanizmy (4. roč.)― väčšinou sú to špecifické zmeny na DNA úrovni väčšinou sú to špecifické zmeny na DNA úrovni

(exp. CAG, hybridný gén)(exp. CAG, hybridný gén)― mutácia je charakteristická pre dané ochorenie (HD, mutácia je charakteristická pre dané ochorenie (HD,

CML)CML)― nový fenotyp je dominantnýnový fenotyp je dominantný― v tom istom géne sa môže vyskytnúť mut.“loss-of-v tom istom géne sa môže vyskytnúť mut.“loss-of-

function“ (delécia function“ (delécia PMP22PMP22 u HNPP) aj „gain-of- u HNPP) aj „gain-of-function“ (duplikácia u CMT)function“ (duplikácia u CMT)

4. podľa miesta lokalizácie4. podľa miesta lokalizáciea)a) v kódujúcich sekvenciách v kódujúcich sekvenciách

b)b) v nekódujúcich sekvenciáchv nekódujúcich sekvenciách

b) mutácie v nekódujúcich sekvenciách s b) mutácie v nekódujúcich sekvenciách s patogénnym dopadompatogénnym dopadommut. vedúce k nesprávnemu zostrihumut. vedúce k nesprávnemu zostrihu– priamo v zostrihových miestach priamo v zostrihových miestach (splice site m.)(splice site m.)

• v donorovej sekv. (GT) v donorovej sekv. (GT) > > prepis intrónu do prepis intrónu do mRNAmRNA

• v akceptorovej sekv. (AG) v akceptorovej sekv. (AG) >> delécia prísl. delécia prísl. exónuexónu

– v intrónoch v intrónoch >> aktivácia kriptického zostr. miesta aktivácia kriptického zostr. miesta

aj nemá mutácia v exóne môže viesť k aktivácii aj nemá mutácia v exóne môže viesť k aktivácii kript. zostrihového miestakript. zostrihového miesta

>> strata/získanie kódujúcej sekvencie strata/získanie kódujúcej sekvencie

mut. v regulačných sekvenciách namut. v regulačných sekvenciách na– na 5na 5’ konci’ konci

• v TATAv TATA-, CAAT-boxe, v iných oblastiach -, CAAT-boxe, v iných oblastiach promótora, v enhanceroch – ovplyvňujú promótora, v enhanceroch – ovplyvňujú rýchlosť transkripcierýchlosť transkripcie

>> znížené množstvo produktuznížené množstvo produktu– na 3na 3’ konci’ konci

• mutácie poly(A) signálu – nestabilná mRNAmutácie poly(A) signálu – nestabilná mRNA

>> znížené množstvo produktuznížené množstvo produktu

OMIM: Online Mendelian Inheritance in Manhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/

Nomenklatúra lokusov a alelGény: skratka hlavnej funkcie alebo génového produktu (píšu sa kurzívou)

– HBA1 hemoglobín alfa, lokus 1– COL5A2kolagén typ 5, alfa 2 polypeptid

Pseudogény: symbol génu + „P“ (staršie označenie ψ)– HBAP1 pseudogén globínového génu alfa 1 (alebo ψHBA1)– ACTBP2druhý pseudogén aktínového génu beta

„Anonymné“ úseky DNA: symboly „D“symboly: 1-22; X; Y – chromozóm

N - na viacerých chromozómochS - jednotková sekv. („single copy“)Z - repetítívna sekv. na jednom

chromozómeF - repetítívna sekv. na viacerých chrom.

(„family“)- D14S63 - 63. identifikovaný úsek DNA na chromozóme 14- DXS12 - 12. identifikovaný segment chromozómu X- DNF3 - 3. identifikovaná rodina repet. sekvencií na viacerých

chromozómoch

Nomenklatúra mutáciíSubstitúcie aminokyselín:

– používajú sa jedno- alebo trojpísmenkové symboly• X – znamená STOP kodón• niekedy sa používa „p.“ , že sa jedná o polypeptid• napr. p.R117H alebo Arg117His >> substitúcia arginínu za substitúcia arginínu za

histidín v pozícii 117 polypeptiduhistidín v pozícii 117 polypeptidu• G542X G542X >> glycín v poz. 542 nahradený STOP kodónom glycín v poz. 542 nahradený STOP kodónom

Substitúcie nukleotidov:– niekedy sa začína:

• „g.“ – pre genomickú sekvenciu• „c.“ – pre cDNA

– A z iniciačného kodónu (ATG) je vždy +1 (báza pred ním je -1)– číslovanie sa vzťahuje na „sense“ vlákno– intróny sa označujú ako „IVS“ plus jeho číslo– alebo pozíciou posledného nukleotidu v exóne plus („+“) pozícia

subst.príklady: – g.1162G >>A – substitúcia guanínu za arginín v poz. 1162 A – substitúcia guanínu za arginín v poz. 1162

genom. DNAgenom. DNA– g.621+1G >>T T alebo alebo IVS4+1G IVS4+1G >>T – subst. guanínu za T – subst. guanínu za

tymín v 1. pozícii intrónu 4tymín v 1. pozícii intrónu 4

Nomenklatúra mutácií – pokr.delécie a inzercie:

– „„del“ del“ – skratka pre deléciu (staršie označenie „– skratka pre deléciu (staršie označenie „ΔΔ“)“)– „„ins“ ins“ – skratka pre inzerciu– skratka pre inzerciu

delécia aminokyseliny:delécia aminokyseliny:– F508del F508del ((ΔΔF508) – delécia fenylalanínu v pozícii 508F508) – delécia fenylalanínu v pozícii 508

delécia nukleotidu (nukleotidov)delécia nukleotidu (nukleotidov)– c.6232_6236del c.6232_6236del alebo alebo 6232_6236delATAAG – 6232_6236delATAAG – delécia delécia

5 nukleotidov (môžu byť špecifikované) počínajúc nt. 5 nukleotidov (môžu byť špecifikované) počínajúc nt. 6232 z cDNA6232 z cDNA

– g.409_410insCg.409_410insC – inzercia C medzi nt. 409 a 410 – inzercia C medzi nt. 409 a 410 genómovej DNAgenómovej DNA

„Základná www stránka: www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature

Globínové génové rodiny α a β

Chromozóm 16

Chromozóm 11

kb

Štruktúra globínových génov

α-globínový gén

β-globínový gén

chr. 16

chr. 11

Expresia Hb génov v ontogenéze

Typy hemoglobínuTypy hemoglobínu

eembryonmbryonálny álny HbE HbE = = ζζ22 εε22

ffetetálnyálny HbFHbF = = αα2 2 γγ22

adultný typ A, adultný typ A, HbA HbA == αα2 2 ββ22

adultný typ Aadultný typ A2,2, HbAHbA22 = = αα22δδ22

Hb molekula:

Hemoglobinopatie: zmeny štruktúry alebo kvantity Hb reťazcov

abnormálne hemoglobíny(zmena štruktúry)

HbS: kosáčiková anémia beta-globínový

gén Glu6Val

HbC: Glu6LysHbE: Glu26LysHbD: Glu121Gln

a niekoľko 100 ďalších

príčinou je mutácia v kódujúcej sekvencii

talasémie (väčšinou zmena intenzity

syntézy)

nulová tvorba Hb polypeptiduznížená tvorba Hb polypeptidunevyvážená tvorba polypeptidov

talasémie: alfa beta

typy: „nula“ (α0 alebo β0) „plus“ (α+ alebo

β+)

príčinou je najčastejšie mutácia mimo

kódujúcej sekvencie

Mutácia Glu6Val (E6V) v beta-globínovom géne a kosáčiková anémia

Normálne erytrocyty

Kosáčikové erytrocyty (KE)

Prvý dôkaz, že substitúcia nukleotidu vedie k substitúcii aminokyseliny v génovom produkte

Mutácia Glu6Val (E6V) pleiotropia –jedna mutácia a viac fenotypových

prejavov

Glu6Val

abnormálny Hb

anémia

rýchly rozpad KE zhlukovanie KE v cievach

abnormálne erytrocyty (KE)

ukladanie KE v slezine

lokálne nedostatky v zásobovaní krvou

celková slabosť zhorš. mentálne funkcie

rozšírenie srdca zlyhanie srdca

poškodenie srdca p. pľúc p. obličiek

pneumónia zlyh. obličiek zväčš. slezina

Typy mutácií vedúcich k talasémii 1

Term. (skrátia Hb-reťazec). . . 37 38 39 40 . . . pozícia AA. . .His Lys Tyr His . . normálny beta-reťazec. . CACAAGUAUCAC. . mRNA

. . CACAAGUAA mRNA s mutáciou

. . His Lys stop β0 -talasémia

Term. (predĺžia reťazec). . . . . . . .. . UAA (stop)

C A G C Gln Lys Glu Ser + ďalšie AA C-S talasémia

Hb Constant Spring


Frameshift . . . Ser Ile Thr Lys . . . normálny beta-reťazec . . AGU AUC AGU AAC . . mRNA del . . AGU AUC UAA stop . . Ser Ile koniec reťazca β0- talasémia

Poruchy zostrihu (mutácie v akcept. a donor. signálnych sekv.)

GT... ...AG beta-globínový gén

.. . GTGGTTGGT..

...GTGATTGGC..

β0 β+

β0 alebo β+ talasémie


Vznik zostrihového signálu v intróne alebo v exóne

β-globínový génGT.... ..TTAGTTGGTTC

..TTAGTTC.. nová akceptorová signál. sekvenciav intróne:

zostrih v intróne

mRNA (obsahuje časť intrónu)

β+ talasémia

vystrihne sa ako intrón


Mutácie v 5´-signálnych sekvenciách (TATA box, CAAT box...)

5´. . . T A T A. . . .5´. . . T A T A. . . . . .3 ´

. . TATG . . . zníženie intenzity transkripcie β+ talasémia

• Mutácie v poly-A signále (AATAAA)

5´. . . . AATAAA . . . 3´ norm. α- gén

G nevznikne poly (A)

znížená stabilita mRNA

α+ talasémia


Delécie globínových génov (najmä u alfa-globínov)

... 3´ α-globínová rodinaζ ψζ ψα α2 α1

Známe delécie (výber):αα

-α3,7

-α4,2

- α5,2

--SEA

--MED

Stupeň závažnosti závisí od toho, koľko alfa-génov delécia vyradí a či je jedinec heterozygot alebo homozygot (4ά – zdravý, 3 ά – prenášač, 2 ά – mierna talasémia, 1 ά – stredne ťažká t., 0 ά – letálna talasémia

5´. . 5´. .


Mutácie v promotorovej oblasti:beta-globínový gén

-116 -90 -75 „CAAT“ -30 „TATA“ I.exón

5´... CCTCACCCT . . CACACCCTA . . TTGGCCAATCT . ..GTATAAAAGT...........

mutácie: T TG GGAGDôsledok: rôzny stupeň redukcie množstva génového produktu →rôzne β+

talasémie

Mutácie vo vzdialených sekvenciách („enhanceroch“): -16 kb

. . . delécia ...... / / .......... βglobínová rodina bez mutácie

Dôsledok: žiadna expresia génov! – chýba DCR – „dominant control region“ → β0 talasémia

Hemoglobinopatie: záver

Veľká lokusová heterogenita

Obrovská alelová heterogenita - často pri rovnakom fenotypovom (klinickom) prejave

Väčšina mutácií s fenotypovým (klinickým) prejavom je priamo v géne alebo v jeho tesnej blízkosti (regulačné sekvencie): dôsledok pre génovú terapiu a transgenézu

Model pre iné monogénne ochorenia

molekulárny aspekt monogénnych ochorení

Documents