Câu 1: Cấu tạo một nucleotit. Vai trò của nhóm OH ở vị trí C số 3 của phân tử đường deoxyribose là gì ?

Cấu tạo một nucleotit:

- Nucleotit là đơn phân cấu tạo của axit nucleic, được cấu tạo bởi 3 thành phần: H3PO4, đường deoxyribose (C5H10O4) và 1 trong 4 loại bazo nitơ (T, T,G,C hoặc A,U,G,C).

- Sơ đồ cấu tạo của 1 Nu:

- Sơ đố cấu tạo các loại bazo nito:

Vai trò của nhóm OH ở vị trí C số 3 của phân tử đường deoxyribose:

- Là cơ sở để hình thành liên kết photphodiester tạo thành chuỗi polynucleotit.- Nếu mất Oxy ở vị trí C số 3 (3’-OH) thì liên kết photphodiester không được tạo thành, quá trình tổng hợp mạch polynucleotit sẽ bị dừng lại.

Ý nghĩa sinh học: Như trên Ứng dụng: Trong kỹ thuật xác định trình tự Nu của đoạn

AND.Câu 2: Đặc điểm cấu trúc phân đoạn gen ở sinh vật Eukaryot. Phương pháp phát hiện gen có cấu trúc phân đoạn.

Đặc điểm cấu trúc phân đoạn gen ở sinh vật Eukaryot:- Đa số gen trên NST trong nhân TB, ty thể, lục lạp có cấu trúc không liên tục.

- Phổ biến gen có cấu trúc phân đoạn Exon và Intron.

- Mã hoá cho 1 loại chuỗi polypeptid.

- Có đặc tính tái bản, phiên mã, dich mã.

- Khi các gen phân đoạn phiên mã sẽ tạo pre- mRNA có chiều dài

lớn hơn các phân tử mRNA trưởng thành. các pre- mRNA phải trải

qua giai đoạn splicing, gắn chóp 7mtG và đuôi poliA để tạo các

phân tử mRNA trưởng thành bằng cắt đuôi intron.

Phương pháp phát hiện gen có cấu trúc phân đoạn:

Phương pháp phát hiện các đoạn intron và exon gồm 2 phương

pháp 

(1) So sánh trình tự cDNA và trình tự gen

Bước 1. Giải trình tự cDNA

+ Tách mRNA trong tế bào

+ Sử dụng enzyme phiên mã ngược thực hiện phản ứng RT-PCR

tổng hợp đoạn cDNA hai sợi từ sợi đơn mRNA

+ Tạo dòng DNA tái tổ hợp có chứa đoạn cDNA, nhân dòng và

tách dòng gen

+ Giải trình tự đoạn cDNA

Bước 2. Giải trình tự gen

+ Tách chiết DNA hệ gen

+ Phân lập gen bằng kỹ thuật PCR hay RE

+ Tạo dòng DNA tái tổ hợp, nhân dòng và tách dòng gen

+ Giải trình tự gen

Bước 3. so sánh trình tự DNA hệ gen với trình tự cDNA xác định

đoạn intron và exon.

(2) Lai phân tử

+ Nguyên tắc: dùng các phân tử mRNA trưởng thành có đánh dấu

phóng xạ đem lai với phân tử DNA hệ gen, soi trên kính hiển vi

điện tử phát hiện được đoạn exon (có sự bắt cặp bổ sung mRNA-

DNA) và đoạn intron (không có sự bắt cặp bổ sung mRNA -

DNA).

+ Các bước:

Tách chiết DNA hệ gen và mRNA tế bào chất

Phân lập gen

Lai phân tử giữa mRNA- DNA để xác định đoạn exon và intron.

Câu 3: Phân biệt các khái niệm: exon, intron, đoạn đệm, yếu tố di truyền vận động, đoạn xen và gene nhảy. Nêu cơ chế xen của gen nhảy.

* Exon là trình tự nucleotit nằm trong gen cấu trúc và mã hoá cho các axit amin tương ứng trong chuỗi polipiptit.* Intron là trình tự nucleotit nằm trong gen cấu trúc và không mã hoá cho các axit amin.* Đoạn đệm là trình tự nucleotit ngắn không mã hoá thông tin di truyền, có vai trò ngăn cách giữa các cistron của Prokaryot.* Đoạn xen là trình tự nucleotit không mã hoá thông tin di truyền nhưng có thể chuyển từ vị trí này sang vị trí khác trong hệ gen.* Gen nhảy là trình tự nucleotit chứa thông tin di truyền quy định một sản phẩm nào đó và có khả năng chuyển vị trí trong hệ gen gây biến động di truyền.* Yếu tố di truyền vận động (TGE)* Cơ chế xen của gen nhảy- AND bị cắt bởi RE bằng đường zích zắc- Gen nối vào nhờ enzym nối- Sau đố những khoảng trống được lấp đầy- Hậu quả:+ Khi gen nhảy, đoạn xen gắn vào vị trí của AND dẫn đến: Chia cắt gen, mất hoạt tính, tạo đột biến.+ Đột biến ngẫu nhiên- Ý nghĩa:+ Cho biết thông tin hệ gen ở sinh vật không tĩnh mà luôn biến động vfaf gây ra biến đổi về mặt di truyền.+ Gen nhảy hoặc đoạn xen, xen vào vị trí nào đó có thể gây ức chế hoạt động của gen.

Câu 4: Đặc điểm của gen và hệ gen ở tế bào prokaryot- Phổ biến là các gen dacistron, mỗi cistron mã hoá cho một polypeptit.- Trong mỗi cistron các bộ ba mã hoá.- Gen nằm trên NST vùng nhân, plasmid.- Plasmid:+ Phân bố chủ yếu gần màng sinh chất+ Gen kháng chất kháng sinh (do vi khuẩn có gen kháng kháng sinh ở plasmid nên cần xác định phác đồ điều trị và kháng sinh đồ)+ Gen chỉ thị ứng dụng trong chọn dòng.+ Vecto trong tách dòng phân tử và chuyển gen.- Có khả năng tái bản, phiên mã, dịch mã, tái bản plasmid- Vùng điều khiển:+ Operator: Đoạn AND ngắn có ái lực với protein ức chế Ngăn cản sự di truyền của enzym phiên mã+ Promoter: Vùng tín hiệu cho enzym phiên mã Vùng cho enzym phiên mã bám vào

Câu 5: Khái niệm gen, hệ gen, kích thước hệ gen. Cấu trúc hệ gen ở sinh vật Eukaryot.

Khái niệm:* Gen là đoạn hay trình tự chứa thông tin di truyền mã hoá cho 1 sản phẩm: Protein, tARN, rARN.* Hệ gen là toàn bộ các gen trong TB, toàn bộ thông tin di truyền mã hoá cho các sản phẩm.

Cấu trúc hệ gen ở sinh vật Eukaryot:* Gồm có 3 loại hệ gen:+ Hệ gen nhân: Chứa đa số thông tin mã hoá, đặc tính, tính trạng sinh vật.+ Hệ gen ty thể: Có cấu trúc vòng kép, chứa gen mã hoá cho sản phẩm liên quan chức năng ty thể. Chiếm tỉ lệ ít, chủ yếu là protein lấy từ TB chất.

+ Hệ gen lục lạp: Gen liên quan đến quang hợp, chiếm tỉ lệ ít, protein lấy từ TB chất.- Cả 3 hệ gen có mối quan hệ chặt chẽ. Phần lớn các sản phẩm trong TB do hệ gen nhân điều khiển. Hệ gen ty thể và lục lạp chỉ tổng hợp một số lượng ít Protein tham gia vào cấu trúc và chức năng của ty thể, phần lớn lấy từ TB chất do hệ gen nhân. - Gen trong hệ gen có cấu trúc phân loại Exon và Intron.- Có khả năng tái bản, phiên mã và dịch mã tạo ARN, mARN.

Câu 6: Đặc điểm sự phiên mã của gen đa cistron ở tế bào Prokaryot. Tại sao trong quá trình phiên mã lại không cần có sự tham gia của mồi?

Đặc điểm sự phiên mã của gen đa cistron ở tế bào Prokaryot.

- Gen đa cistron phiên mã tạo 1 phân tử mRNA

- Các giai đoạn phiên mã:

Lõi RNA-polymerase cùng nhân tố nhận biết và bám vào

trình tự khởi động trên promoter (hộp TA). Nhân tố tách khỏi

lõi enzyme, RNA polymerase trượt dọc gen theo chiều 3’- 5’,

xúc tác biến tính cục bộ 2 sợi DNA lộ ra sợi khuôn tổng hợp

RNA.

Quá trình tổng hợp RNA bắt đầu, sự lắp ráp các ribonucleotit

tự do thành chuỗi polyribonucleotit theo nguyên tắc bổ sung A-

U, G- C và sợi RNA được sinh ra có chiều 5’- 3’.

Kết thúc: Đoạn kết thúc ra tín hiệu cho RNA-polymerase

dừng phiên mã. Đoạn kêt thúc gồm 2 phần: phần có tỷ lệ GC

cao và một loại base T trên sợi antitemplate.

- Sản phẩm phiên mã là sợi đơn RNA có chiều 5’- 3’, các mRNA

được tổng hợp xong mang thông tin di truyền liên tục và tham gia

ngay vào quá trình dịch mã.

Tại sao trong quá trình phiên mã lại không cần có sự tham gia của mồi?

Ở sinh vật nhân sơ AND có dạng mạch vòng nên không cần mồi để nối ở đầu. Có sự tham gia của các enzyme.

Câu 7: Đặc điểm của sự phiên mã ở tế bào Eukaryot.

- Enzym phiên mã gồm:

+ RNA-polymerase I, enzyme không bị ức chế bởi - amanitin

(chất ức chế tổng hợp RNA), chuyên trách việc phiên mã các gen

để tổng hợp rRNA (28S, 58S và 18S).

+ RNA-polymerase II: enzyme bị ức chế bởi - amanitin, nó cần

cho tổng hợp mRNA

+ RNA-polymerase III: enzyme bị ức chế bởi - amanitin ở nồng

độ cao, phiên mã tổng hợp các tRNA 4S, rRNA 5S.

- Các vùng kiểm soát phiên mã

+ Hộp TA nằm cách điểm khởi đầu phiên mã 25- 30b về phía

trước, có chức năng giúp RNA-polymerase nhận ra và bám đúng

điểm khởi đầu phiên mã.

+ Đoạn kết thúc nằm ở đầu 5’ của gen

+ Operator là trình tự nucleotit ngắn có ái lực với protein ức chế

quá trình phiên mã.

- Các giai đoạn phiên mã:

+ Giai đoạn khởi động: chịu sự kiểm soát của hộp TA. RNA-

polymerase hoạt động phiên mã nhờ nhiều nhân tố TF có bản chất

là protein.

+ Giai đoạn kéo dài: phân tử RNA được tổng hợp từ mạch khuôn

DNA nhờ nhân tố TFIIS.

+ Giai đoạn kết thúc: Kết thúc phiên mã có liên quan đến cấu trúc

kẹp tóc tiếp sau trình tự giàu GC.

- Quá trình hoàn thiện các pre-mRNA

+ Gắn thêm “chóp” 7-methylguanosine ở đầu 5’P của mRNA

+ Gắn thêm còn “đuôi” polyadenine dài 100- 200 A ở cuối phân tử

mRNA

+ Cắt bỏ intron, nối các exon lại với nhau nhờ phức SnRNP của

nhân để tạo phân tử RNA trưởng thành.

Câu 8: Đặc điểm của sự tái bản DNA theo cơ chế nửa gián đoạn của Okazaki ở E.coli. Tại sao tái bản DNA trong tế bào sống lại cần có mồi (primers), mồi lại là trình tự RNA mà không phải trình tự DNA? Cơ chế nối các phân đoạn Okazaki thành một chuỗi polynucleotide.

Đặc điểm của sự tái bản DNA theo cơ chế nửa gián đoạn của Okazaki ở E.coli.

- Hệ enzym tham gia tái bản DNA ở E.coli

+ Enzyme DNA polymerase: DNA polymerase I (đọc và sửa

chữa), DNA polymerase II (xác định sự bắt đầu và kết thúc tổng

hợp), DNA polymerase II (xúc tác tổng hợp chuỗi polynucleotit

mới)

+ DNA gyrase: cắt và làm tháo xoắn ở 2 phía ngược nhau bắt đầu

từ điểm khởi đầu sao chép.

+ DNA helicase: bẻ gẫy liên kết hidro, giải phóng các chuỗi đơn

tạo chạc tái bản.

+ DNA ligase: nối các đoạn okazaki tạo thành sợi DNA dài liên tục

+ RNA polymerase: tổng hợp đoạn mồi tạo đầu 3’OH tự do.

- Cơ chế tái bản DNA theo Okazaki là cơ chế tái bản nửa gián

đoạn gồm các khâu sau:

+ Hiện tượng duỗi xoắn:

+ Khởi đầu tái bản bằng RNA mồi (primer):

+ Kéo dài, loại bỏ mồi và hình thành các phân đoạn Okazaki:

+ Các phân đoạn Okazaki được nối lại nhờ enzyme nối ligase tạo

thành mạch DNA mới:

Tại sao tái bản DNA trong tế bào sống lại cần có mồi

(primers)

- Mồi là trình tự ARN ngắn, ở đầu 3’-OH.

- Quá trình tổng hợp mạch ADN mới được thực hiện theo chiều

5’-3’. Mồi được tổng hợp để tạo 3’-OH là cơ sở hình thành liên kết

photphodiester tạo thành chuỗi polynucleotit.

- Cả 2 mạch đều cần mồi.

- 3’-5’ cần 1 mồi.

- 5’-3’ cần rất nhiều mồi, mỗi mồi hình thành phân đoạn Okazaki.

Mồi lại là trình tự RNA mà không phải trình tự DNA?

- Mồi là trình tự RNA mà không phải là DNA là vì liên quan đến sự khác nhau về chức năng của enzyme RNA-polymerase và DNA-polymerase.

- ARN polymerase có khả năng liên kết các Nu tự do thành chuỗi polyribonucleotit mà không cần mồi có đầu 3’-OH khi có AND khuôn, trong khi đó AND polymerase không có khả năng này.

Cơ chế nối các phân đoạn Okazaki thành một chuỗi polynucleotide.

- Loại mồi bằng cắt tỉa từng Nu một bằng enzym nuclerase.

- Cắt đến đâu là tổng hợp đến đó.

- Khe hở mới được nối bằng AND lirase.

Câu 9: Các con đường vận chuyển protein trong tế bào.

- Hầu hết các protein tổng hợp trong tế bào chất được vận chuyển

đến nhân và các bào quan nhờ tín hiệu dẫn. Tín hiệu dẫn có ngay

trên phân tử protein.

+ Tín hiệu thứ nhất (signal peptide) gồm 1 đoạn khoảng 15- 80 axit

amin, nằm ở đầu NH2 của phân tử protein. Tín hiệu này được cắt

bỏ khi phân tử protein đã vận chuyển đến đích.

+ Tín hiệu thứ hai (signal patch) gồm các đoạn axit amin nằm cách

nhau trên chuỗi peptide. Nhờ cấu trúc không gian của phân tử

protein mà các đoạn này được sắp xếp gấp khúc lại gần nhau, tạo

ra tín hiệu cần thiết. Chúng được giữ lại trong cấu trúc bậc 1 sau

khi các phân tử protein được vận chuyển tới đúng đích.

- Các protein khác nhau có tín hiệu dẫn khác nhau mặc dù chúng

có cùng một đích. Điều đó chứng tỏ tính chất kị nước, cấu trúc

không gian có vai trò quan trọng hơn so với trình tự các aa.

- Vận chuyển protein bằng tín hiệu dẫn được thực hiện theo 3 con

đường khác nhau (kể tên):

+ Vận chuyển theo siêu lỗ: nhờ tín hiệu dẫn loại hai gồm 2 đoạn có

4- 8aa nằm cách nhau khoảng 10aa. Tín hiệu được nhận biết nhờ

liên kết với thụ quan màng nhân, protein được đưa qua siêu lỗ

màng màng nhân nhờ năng lượng giải phóng từ ATP.

+ Vận chuyển đến màng tế bào hoặc màng các bào quan: Sự vận

chuyển chúng cần cả hai loại tín hiệu dẫn và năng lượng ATP.

Trên con đường vận chuyển xảy ra sự tương tác giữa các chuỗi

polypeptit tạo polymer có hoạt tính, các phản ứng đường hóa và

phosphoryl hóa các chuỗi peptit, và tạo cấu trúc không gian đúng

cho các phân tử protein khi vận chuyển tới đúng đích nhờ

chaperon (HSP 60, HSP 70, BiP).

+ Vận chuyển bằng các nang (vesicular transport): Nhờ tín hiệu

dẫn và năng lượng giải phóng từ ATP, các phân tử protein được

“đóng gói” trong loại nang vận chuyển đặc biệt được tách khỏi

màng phía trans của golgi (nơi có pH=7) hoặc từ vùng màng tế bào

có bao phủ clathrin. Protein được vận chuyển từ bào quan này đến

bào quan khác, hoặc tiết ra khỏi tế bào.

Câu 10: Sự vận chuyển protein qua siêu lỗ màng nhân

- Các loại protein được tổng hợp ở tế bào chất và vận chuyển từ tế

bào chất vào nhân qua siêu lỗ màng nhân như: histone, các enzyme

tham gia tái bản và phiên mã, protein điều hòa hoạt động của gen

và kiểm soát biến đổi phân tử mRNA...

- Protein được vận chuyển qua màng nhân nhờ siêu lỗ nằm trên

màng theo 2 cách: khuếch tán và chủ động

+ Những phân tử có kích thước nhỏ hơn 5.000Da có thể khuếch

tán qua lỗ, những phân tử có kích thước lớn hơn (17.000-

44.000Da) phải mất thời gian vài giờ mới có thể vượt qua màng

nhân, những phân tử có kích thước lớn hơn 60.000Da hầu như

không qua siêu lỗ.

+ Protein vận chuyển vào nhân phải có cấu trúc không gian và

thường có tín hiệu dẫn loại hai. Tín hiệu này gồm 2 đoạn có 4-8

axit amin cách nhau khoảng 10 axit amin. Một phân tử protein có

thể có nhiều tín hiệu dẫn. Vị trí các đoạn tín hiệu dẫn nằm bất kỳ

trên chuỗi polypeptit.

- Tín hiệu dẫn được nhận biết nhờ liên kết với thụ quan trong tế

bào, protein được đưa đến miệng siêu lỗ và qua lỗ nhờ năng lượng

giải phóng từ ATP. Lúc đó đường kính siêu lỗ được mở rộng.

- Các protein có chức năng kiểm soát hoạt động của các gen trong

nhân thường được lưu giữ trong tế bào chất và chỉ được vận

chuyển vào nhân khi có nhu cầu.

- Các tín hiệu dẫn thường bị thay đổi do quá trình phosphryl hoá

hoặc không được bộc lộ do tương tác với protein kìm hãm.

- Sự vận chuyển các RNA được kiểm soát tương tự: Các mRNA

phải trải qua bước hoàn thiện, các rRNA phải liên kết với các

protein đặc hiệu trước khi ra ngoài tế bào chất.

Câu 11: Phân biệt khái niệm tính trội, tính lặn và tính trạng trung gian. Cơ sở phân tử của tính trội, tính lặn và tính trạng trung gian.

Khái niệm tính trội, tính lặn và tính trạng trung gian:

- Khái niệm tính trạng trội: là tính trạng được biểu hiện ở con lai

F1 khi cho lai giữa hai cơ thể bố mẹ thuần chủng khác nhau về cặp

tính trạng tương phản

- Khái niệm tính trạng lặn: là tính trạng không được biểu hiện ở

con lai F1 khi cho lai giữa hai cơ thể bố mẹ thuần chủng khác nhau

về cặp tính trạng tương phản và có tính trạng giống 1 bên (bố hoặc

mẹ)

- Khái niệm tính trạng trội hoàn toàn: là những tính trạng do gen

trội hoàn toàn quy định.

- Khái niệm tính trạng trội không hoàn toàn: là tính trạng trung

gian được biểu hiện ở con lai F1 khi cho lai giữa hai cơ thể bố mẹ

thuần chủng khác nhau về cặp tính trạng tương phản.

- Tính trạng trung gian do gen trội không hoàn toàn quy định, vai

trò của gen trội và gen lặn là ngang nhau trong việc hình thành tính

trạng.

Cơ sở phân tử của tính trội, tính lặn và tính trạng trung gian.

- Do sự tương tác giữa các sản phẩm của gen trong sự hình thành tính trạng.

- Trội hoàn toàn (Aa)

+ Sản phẩm của gen trội chiếm tỉ lệ rất lớn, alen lặn ít.

+ A đột biến thành a (a1, a2, a3……)

+ Tổng hợp enzym tham gia và chuyển hoá các chất.

+ Enzym của gen trội chuyển hoá bình thường nên chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm.

+ Enzym của gen lặn đột biến nên không chuyển hoá được cơ chất dẫn đến không có sản phẩm.

KL: Tính trạng do gen trội quy định.

- Trội khong hoàn toàn do tính trạng trung gian

+ Sản phẩm của gen trội và gen lặn cân bằng nhau

+ Đột biến:alen lặn đột biến tổng hợp enzym chuyển hoá được 1 phần cơ chất.

- Bản chất phân tử của tương tác gen

+ Thực chất là các gen không tương tác với nhau mà là sự tương tác giữa các sản phẩm của gen.

Câu 12: Đặc điểm về cấu trúc và chức năng của promoter, operator ở sinh vật Prokaryot và Eukaryot. Ứng dụng promoter trong kỹ thuật sinh học phân tử.

Cấu trúc và chức năng của promoter:

- Promoter của sinh vật Prokaryot (E.coli)

-----TTGACA-------------TATAAT--------- ----------- mRNA

-35 bp -10 bp +1

+ Base đầu tiên được phiên mã ra mRNA được đánh số +1. Vị trí

phía trước +1 gồm 6bp ở xung quanh -10bp là hộp TA (pribnow

box). Đây là vị trí có ái lực với RNA polymerase.

+ Xung quanh trình tự-35bp có trình tự nhất trí. Trình tự nhất trí

làm tăng tốc độ quá trình phiên mã.

- Promoter của sinh vật Eukaryot

------GGGCGGG-------CCAAT--------TATA----- ------mRNA

-110 bp -40 bp -30 bp +1

+ Hộp TA ở phía trước điểm khởi đầu phiên mã khoảng 30bp

(động vật có vú), 60- 120bp (nấm men) có vai trò làm tăng tốc độ

phiên mã do có ái lực với loại protein hoạt hóa chuyển hóa (vị trí

CAP).

+ Trước hộp TA có hai trình tự CCAAT (-40bp) và trình tự giàu

GGGCGGG (-110bp)

- Chức năng của promoter:

+ Là vùng chứa tín hiệu nhận biết của enzym phiên mã và có ái lực

với enzym phiên mã, định hướng sự di chuyển của enzym phiên

mã

+ Điều khiển tốc độ phiên mã của gen nhờ trình tự nhất trí và vị trí

CAP nằm phía trước hộp TA.

Cấu trúc và chức năng của operator:

+ Cấu trúc: là trình tự nucleotit nằm trước điểm khởi đầu phiên mã

và sau trình tự promoter

+ Chức năng: là vùng DNA có ái lực với protein ức chế, khi

protein ức chế bám vào sẽ ngăn cản sự di chuyển của enzym phiên

mã

Ứng dụng promoter trong kỹ thuật sinh học phân tử.

- Thiếu hụt 1 promoter trong gen biểu hiện để biểu hiện 1 gen nào đó.

- Copromoter có khả năng biểu hiện cao có đặc điểm chung sau:

+ Những promoter mạnh có thể tạo ra peptit tái tổ hợp lớn hơn tổng số 10-30% protein.

+ Promoter chỉ hoạt động phiên mã ở mức cơ sở.

+ Promoter có hiệu quả biểu hiện gen cao.

Câu 13: Đặc điểm cơ bản về cấu trúc của hệ gen ty thể và ứng dụng của việc nghiên cứu hệ gen ty thể người.

KN: Gồm tất cả các gen tren AND ty thể.

-Gen của ty thể mã hoá cho các sản phẩm liên quan đến chức năng của ty thể.

- Lượng AND ty thể mã hoá cho các sản phẩm chiếm tỷ lệ ít, chủ yếu các protein trong ty thể lấy từ TB chất do hệ gen nhân điều khiển.

- AND ty thể có cấu trúc vòng kép:

+Bền.

+ Các gen được di truyền theo dòng mẹ.

- Kích thước hệ gen ty thể:

+ ĐV: AND ty thể có từ 15-20 nghìn kb và có cấu trúc vòng.

+ Người: 16569kb

+ TV: 200-2500kb có nhiều dạng cấu trúc (vòng,thẳng, dạng khác)

- Hệ gen ty thể người:

+ Chứa gen liên quan đến chức năng chuyển hoá và tạo năng lượng, có 37 gen mã hoá cho 13 chuỗi polipeptit.

+ Liên quan đến hệ thần kinh (bệnh liên quan đến thần kinh)

Ứng dụng:

- Đối với người:

+ XĐ quan hệ huyết thống+ Giám định hài cốt liệt sĩ, giám định pháp y+ Nghiên cứu nguồn gốc các chủng tộc người+ Phát hiện, điều trị một số bệnh liên quan đến thần kinh+ Điều trị vô sinh- Đối với sinh vật:+ XĐ phả hệ+ Phân loại học phân tử- Đối với TV: + Nghiên cứu tính bất dục ở TV

Câu 14: Hiện tượng biến tính, hồi tính ở phân tử DNA là gì ? Khái niệm về nhiệt độ chảy DNA (Tm). Ứng dụng của hai hiện tượng này trong sinh học phân tử.

Biến tính: Là hiện tượng mạch kép tháo xoắn tạo thành 2 mạch đơn.

- Tác nhân: Enzym, protein, t0 cao 80-950

KN Tm: Giá trị t0 làm cho 2 mạch AND tách nhau gọi là t0

chảy (Tm)

Hồi tính: Là hiện tượng 2 mạch liên kết lại với nhau ở t0 <700C

Ứng dụng: - Phản ứng chuỗi PCR và các phiên bản PCR- Lai phân tử

OD260nm

O Tm t0

Câu 15: Khái niệm lai phân tử và nêu các kỹ thuật lai phân tử và ứng dụng.

Khái niệm: Là hiện tượng 2 trình tự Nu liên kết với nhau bằng liên kết hidro theo nguyên tắc bổ sung.

- Các kiểu lai:+ AND với AND+ AND - ARN+ Protein - Protein

Các kỹ thuật lai phân tử:

Southern blot, Northern blot, Western blot

OD

Câu 16: Phương pháp Southern blot

- Sử dụng một trình tự DNA biết trước lai với đoạn DNA cần tìm.

- Các bước tiến hành có thể thực hiện theo các bước sau:

+ Cắt DNA bởi enzyme giới hạn thành các đoạn DNA nhỏ có thể

dịch chuyển trên gel agasore.

+ Biến tính các sợi DNA kép trên gel agarose bằng phương pháp

xử lý với kiềm.

+ Chuyển DNA đã biến tính sang màng lai.

+ Lai với trình tự DNA đã được đánh dấu bằng phóng xạ hoặc

huỳnh quang.

+ Phát hiện phân tử lai bằng kĩ thuật phóng xạ tự ghi hoặc kính

hiển vi điện tử.

- Ứng dụng :

+ Phương pháp Southern blot cho phép xác định được trình

tự đoạn DNA cần tìm,

+ Có thể phát hiện được đột biến mất đoạn hoặc thêm đoạn

khi so sánh cá thể đột biến với cá thể bình thường.

Câu 17: Khái niệm, quy trình và ứng dụng của phương pháp

Northern blot

- Phương pháp Northern blot là kỹ thuật lai giữa mRNA với trình

tự mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.

- Các bước

+ Tách chiết RNA tổng số và biến tính để RNA không trở về cấu

trúc bậc 2 của nó.

+ Điện di RNA trên gel agarose.

+ RNA được chuyển sang màng và lai với trình tự DNA đặc hiệu

(mẫu dò đặc hiệu)

+ Vị trí và số lượng các đoạn của RNA lai với DNA được phát

hiện trên phim bằng phương phóng xạ tự ghi.

- Các ứng dụng

+ Xác định kích thước và hàm lượng của 1 mRNA đặc trưng trong

1 hỗn hợp RNA.

+ Xác định vị trí chính xác và sự phân bố của một mRNA trong

một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức, từ đó xác định vai trò

của mRNA trong tổ chức đó.

+ Nghiên cứu cấu trúc RNA, phát hiện đột biến.

Câu 18: Phương pháp Western blot

- Kỹ thuật này sử dụng tính gắn bám đặc hiệu của kháng thể với

kháng nguyên tương ứng; và sự xúc tác đặc hiệu của enzyme (được

gắn vào kháng thể thứ hai)

- Bước 1: Tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide

- Bước 2: Chuyển protein từ gel sang màng lai nhờ điện trường

- Bước 3: Nhuộm màng bằng kháng thể đặc hiệu

- Bước 4: Nhuộm màng bằng cộng hợp (kháng thể kháng kháng

thể gắn enzyme)

- Bước 5: Bổ sung cơ chất cho enzyme chuyển hóa để có thể nhìn

thấy vệt protein phản ứng với kháng thể đặc hiệu trên màng.

- Enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành hợp chất có màu có thể

nhìn thấy trên màng.

- Như vậy chỉ vệt protein nào phản ứng với kháng thể thì mới hiển

thị trên màng.

Câu 19 : Khái niệm và phân loại enzym cắt axit nucleic trong tế bào. Khái niệm enzym giới hạn và nêu ứng dụng của enzym giới hạn trong kỹ thuật sinh học phân tử. Hiện tượng metyl hóa phân tử DNA. Tại sao hiện tượng metyl hóa lại ngăn cản hoạt động của enzym giới hạn?

Khái niệm và phân loại enzym cắt axit nucleic trong TB

Khái niệm : Enzym cắt axit nucleic là nhóm enzyme nuclease gồm DN-ase và RN-ase có khả năng bẻ gãy liên kết phosphodiester, kết quả là phân huỷ phân tử DNA hoặc RNA.

Phân loại :

- Nhóm enzyme DNA-ase gồm 2 loại: exonuclease (enzyme cắt DNA ngoại bào) có tác dụng cắt từng cặp nucleotit từ hai đầu của đoạn DNA đi dần vào bên trong. - Enzyme exonuclease có thể cắt tỉa từng cặp nucleotit ở cả hai mạch (cắt kép) hoặc cắt từng nucleotit trên một sợi DNA/RNA (cắt đơn). - Endonuclease (enzyme cắt DNA nội bào) có tác dụng cắt rời DNA/RNA tại những vùng xác định gồm vài cặp nucleotit nằm cạnh nhau định vị trong phân tử DNA/RNA, tạo thành những phân đoạn DNA/RNA nhỏ hơn. - Enzyme endonuclease có thể cắt đơn hoặc cắt kép.- Một loại enzyme endonuclease có thể nhận biết vị trí nhất định bên trong phân tử DNA và cắt đặc hiệu, cắt một lần tại một điểm đó gọi là enzym giới hạn.

- Trình tự nhận biết của RE dài 4-6 nucleotit, RE phát hiện và cắt tại điểm đó tạo đầu bằng hoặc đầu so le.- RE không cắt DNA tế bào chủ vì nucleotit trong trình tự nhận biết đã được methyl hóa và bền vững dưới tác động cắt của RE (thường là A)

Khái niệm enzym giới hạn và nêu ứng dụng của enzym giới hạn trong kỹ thuật sinh học phân tử.

Khái niệm:

- Enzyme cắt hạn chế (enzyme giới hạn) là loại enzyme endonuclease có khả năng nhận biết được điểm cắt và cắt axit nucleic tại điểm xác định. - Trình tự nhận biết đặc thù của RE dài 4- 6 nucleotit, có thể cắt đầu bằng hoặc đầu so le

Ứng dụng:

(1). Tạo DNA tái tổ hợp để thiết lập thư viện hệ gen, thư viện cDNA; chọn dòng phân tử.+ Tách chiết DNA tổng số và tách chiết plasmid (phage)+ Cắt DNA tổng số và mở vòng plasmid bởi cùng 1 loại RE. Nối đoạn DNA vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp nhờ enzyme ligase

(2). Lập bản đồ cắt hạn chế: Là sơ đồ mô tả vị trí cắt của enzyme giới hạn trên phân tử DNA.+ Nghiên cứu sự đa dạng kiểu hình trong quần thể+ Tách chiết DNA tổng số+ Sử dụng RE cắt DNA tổng số + Điện di sản phẩm cắt trên gel agrose và xác định kích thước các đoạn bị cắt và vị trí tương đối của các điểm cắt trên phân tử DNA.

(3). Quy trình thiết lập bản đồ RFLP liên kết với tính trạng+ Sử dụng các kỹ thuật truyền thống hoặc hiện đại (lai, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào…) để phân nhóm các cá thể theo mức độ biểu hiện tính trạng (Thí nghiệm và đối chứng)+ Tách chiết DNA, sàng lọc RE và cắt DNA của thí nghiệm và đối chứng.

+ Điện di sản phẩm cắt và xác đinh đoạn DNA đặc trưng.+ Xác định mối liên quan đến tính trạng.+ Sử dụng phép lai giữa các cặp bố mẹ để đánh giá mức độ liên kết: Khi so sánh hai chỉ thị thu được hai kết quả, (1) Chúng có xu hướng cùng phân ly và hai chỉ thị có mối liên kết ; (2) Sự phân bố không theo quy luật mà hoàn toàn ngẫu nhiên, như vậy chúng không liên kết.+ Thiết lập vị trí của chỉ thị RFLP trên nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật lập bản đồ di truyền.

(4). Kiểm tra sự có mặt của 1 gen, tìm chỉ thị RFLP liên quan đến tính trạng.(5). Phân lập gen.(6). Thiết kế gen, sử dụng trong kỹ thuật chuyển gen.

Hiện tượng metyl hóa phân tử DNA. Tại sao hiện tượng metyl hóa lại ngăn cản hoạt động của enzym giới hạn?

- Hiện tượng metyl hóa là hiện tượng CH3 gắn vào vị trí của bazơ nitơ trong mạch polynucleotit, qua quá trình tái bản CH3, metyl hoá thay đổi cấu trúc không gian của AND dẫn tới enzym giới hạn không nhận biết được vị trí cắt, ngăn cản hoạt động của enzym giới hạn trên sợi AND.

- RE không phân huỷADN mà chỉ phân huỷ AND ngoại lai.

Câu 20: Khái niệm bản đồ cắt hạn chế và bản đồ chỉ thị RFLP liên kết với tính trạng.

Khái niệm bản đồ cắt hạn chế:

Bản đồ cắt hạn chế (bản đồ giới hạn) là sơ đồ mô tả vị trí cắt của RE trên phân tử DNA.

Bản đồ chỉ thị RFLP:Bản đồ RFLP: là sơ đồ mô tả vị trí các chỉ thị (đoạn DNA) liên kết với tính trạng trên NST

Câu 21: Chỉ thị phân tử DNA và quy trình xác định chỉ thị RFLP liên kết với tính trạng.

KN Chỉ thị phân tử DNA (RFLP):

- Chỉ thị phân tử RFLP: Sự liên kết giữa đoạn AND được cắt bởi RE với đặc tính, tính trạng nghiên cứu.

- Bản đồ RFLP: Vị trí của đoạn AND được cắt bởi enzym giới hạn liên kết với đặc tính, tính trạng trong hệ gen.

Quy trình xác định chỉ thị RFLP liên kết với tính trạng.

- Sử dụng các phương pháp truyền thống và hiện đại để phân tích các đặc tính và tính trạng quan tâm, phân nhóm cá thể theo mức độ biểu hiện tính trạng (thí nghiệm và đối chứng).- Tách chiết DNA tổng số- Sàng lọc và lựa chọn enzym giới hạn (RE) và điều kiện phản ứng cắt.- Cắt DNA bằng các loại enzym RE- Điện di sản phẩm cắt của thí nghiệm và đối chứng- So sánh và phân tích sự xuất hiện các băng điện di sản phẩm cắt. Xác định phân đoạn DNA đặc trưng.- Xác định mối liên quan giữa đoạn DNA được cắt bởi RE với đặc tính hay tính trạng nghiên cứu.- Bằng thôi gel và các kỹ thuật khác (ligation, biến nạp, chọn dòng, tách chiết plasmid, xác định trình tự nucleotit, lai phân tử...) có thể nghiên cứu sâu hơn về đoạn DNA này.

Câu 22: Khái niệm điện di và điện di protein? Trình bày nguyên tắc và kỹ thuật điện di protein một chiều và ứng dụng của kỹ thuật này.

Khái niệm điện di: Là sự dịch chuyển phân tử các chất trên giá thể trong môi trường có dòng điện. Giá thể có thể là giấy, gel (acrylamide, agar, agarose, tinh bột).

Nguyên tắc và kỹ thuật điện di protein một chiều:

- Phương pháp điện di một chiều cho phép phân tích các tiểu phần

điện di theo kích thước phân tử.

- Kỹ thuật điện di một chiều được tiến hành theo các bước:

+ Chiết protein

+ Tạo gel điện di gồm gel cô và gel tách

+ Trộn protein với dye và biến tính ở nhiệt độ 1000C trong 1-5

phút

+ Tra mẫu vào giếng điện di

+ Chạy điện di

+ Cố định và nhuộm gel

+ Chụp ảnh để phân tích kết quả.

- Ứng dụng:

+ Kỹ thuật điện di cho phép tách được các tiểu phần có khối lượng

phân tử khác nhau dùng cho các nghiên cứu, phân tích những tiểu

phần đó.

+ Phân tích đa hình protein: số lượng tiểu phần protein, hàm lượng

mỗi tiểu phần protein, kích thước các tiểu phần

+ Xác định chỉ thị phân tử protein cho các đặc tính và tính trạng

Câu 23: Quy trình xác định chỉ thị phân tử protein liên kết với đặc tính hay tính trạng của sinh vật.

KN chỉ thị phân tử protein:

- Là sự liên kết gắn protein với đặc tính, tính trạng của sinh vật

- Các loại chỉ thị Pr:

+ Chỉ thị hàm lượng protein

+ Chỉ thị thành phần protein

+ Chỉ thị thành phần aa

+ Chỉ thị enzyme

Quy trình xác định chỉ thị phân tử protein:

- Sử dụng các phương pháp phân tích quần thể để phân lập các

nhóm cá thể theo mức độ biểu hiện đặc tính hoặc tính trạng quan

tâm (thí nghiệm và đối chứng)

- Chiết rút protein của thí nghiệm và đối chứng

- Điện di protein trên gel

- So sánh kết quả điện di giữa thí nghiệm và đối chứng để tìm sự

khác biệt về protein

- Xác định mối liên quan giữa tiểu đơn vị protein và tính trạng.

- Tách tiểu đơn vị protein ra khỏi bản gel, làm sạch và đem phân

tích khối phổ (trình tự axit amin, đặc tính lý hoá, kích thước phân

tử)

- Kết luận về mối liên quan giữa phân tử protein và tính trang.

Câu 24: Nguyên tắc của kỹ thuật tách chiết DNA từ mô sống.

- Phá vỡ màng TB, màng nhân, bào quan bằng tác nhân hoá học hoặc cơ học trong nito lỏng t0 = -850C

- Loại bỏ các thành phần không mong muốn bằng ly tâm thu ADN

- Tủa AND, làm sạch, hoà tan (lưu giữ).

Câu 25: Kỹ thuật RAPD và ứng dụng của phương pháp phân tích này.

- Kỹ thuật RAPD:+ Là phản ứng khuếch đại phân đoạn DNA ngẫu nhiên

+ Mồi RAPD là một đoạn oligonucleotit ngẫu nhiên.

+ Mồi được thiết kế và tổng hợp ngẫu nhiên, không đòi hỏi thông tin về trình tự gen được nhân bản. Mồi RAPD ngắn hơn mồi PCR (phổ biến là 10 base)

+ Trình tự nucleotit của mồi liên kết bổ sung với nhiều vị trí khác nhau và có khả năng khuếch đại được nhiều phân đoạn DNA có kích thước khác nhau.

+ Nhiệt độ tiếp hợp mồi 320C- 400C. Số chu kì của phản ứng 30- 45 chu kì

- Ứng dụng:

+Sử dụng để phân tích đa hình ADN

+ XĐ chỉ thị RAPD ứng dụng trong chọn giống+ XĐ mối quan hệ và khoảng cách di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu.

Câu 26: Đặc điểm và ứng dụng của các loại gel điện di: aga, agarose, acrylamid trong phân tích sinh học phân tử.

- Gel điện di là giá thể cho phân tử, các chất dịch chuyển trong môi trường có dòng điện.

- Thành phần cấu tạo bản gel là hỗn hợp các chất hóa học tạo thành hệ thống các mắt lưới “bẫy” các phân tử trong đó.

- Gel điện di agar có kích thước mắt lưới lớn sử dụng để phân tích những phân tử có kích thước lớn như protein huyết thanh, hemoglobin.

- Gel agarose có mắt lưới nhỏ hơn gel agar, được sử dụng để phân tích điện di DNA tổng số, sản phẩm RAPD, sản phẩm PCR, sản phẩm cắt bởi RE...

- Nồng độ agarose trong gel tỷ lệ nghịch với kích thước phân đoạn DNA: kích thước phân đoạn càng nhỏ, nồng độ agarose trong gel càng lớn. Gel agarose với nồng độ cao cho phép phân tích các phân đoạn DNA sai khác nhau khoảng 10bp liên quan đến các đột biến điểm.

- Gel polyacrylamid có mắt lưới nhỏ nhất, sử dụng để phân tích các tiểu phần phân tử protein và những đoạn DNA có kích thước nhỏ.

- Sử dụng gel polyacrylamid để phát hiện các phân đoạn DNA nhỏ tới vài chục nucleotit hoặc những đoạn DNA có kích thước nhỏ sai khác nhau ít hơn 10bp.

- Các loại gel trên đều được sử dụng để điện di các tiểu phần phân tử cho việc phân tích đa hình di truyền hoặc tách phân đoạn cho các nghiên cứu sâu: xác định trình tự axit amin, phân tích khối phổ protein, xây dựng bản đồ giới hạn và bản đồ di truyền, phân lập gen...

Câu 27: Điện di DNA? Trình bày các bước của kỹ thuật điện di DNA và ứng dụng của kỹ thuật này trong nghiên nghiên cứu sinh học phân tử.

Điện di DNA: Là hiện tượng các phân tử AND dịch chuyển trên giá thể trong môi trường có dòng điện.

Các bước của kỹ thuật điện di DNA:

(1)Tạo bản gel điện di agarose

+ Cân agarose hòa trong 100ml TAE 1X, nồng độ agarose trong gel khác nhau tùy vào mục đích nghiên cứu (nồng độ agarose trong gel tỉ lệ nghịch với kích thước phân đoạn DNA cần kiểm tra).

+ Đun chín gel cho đến khi hỗn hợp trên trong suốt, khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 60- 700C thì đổ vào khuôn. Để yên khuôn gel trong 30- 45 phút.

(2)Đặt khuôn gel vào bể điện di

(3)Trộn mẫu DNA với dye, tra mẫu vào giêng và chạy điện di ở hiệu điện thế 80- 110V.

(4)Nhuộm gel bằng EtBr 5- 10 phút, chụp ảnh để phân tích.

Ứng dụng:+ Kiểm tra độ tinh sạch và ước lượng hàm lượng, kích thước

DNA trong dung dịch tách chiết

+ Phân tích đa hình DNA: điện di sản phẩm cắt bởi enzyme giới hạn, sản phẩm AFLP, sản phẩm RAPD...

+ Xác định sự có mặt của một đoạn DNA, tách dòng và xác định trình tự gen

Câu 28: Nguyên tắc và kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của DNA theo Sanger.

Nguyên tắc:

+ Xác định trình tự nucleotit của một mạch và theo nguyên tắc bổ sung để suy ra mạch thứ hai.

+ Cần sự tham gia của mồi đơn

+ Sử dụng các deoxynucleotit đánh dấu không có nhóm OH ở vị trí C số 3 (ddNTP). Do vậy trong quá trình kéo dài chuỗi polynucleotit, enzyme polymerase gắn các ddNTP vào chuỗi polynucleotit thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các phân đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotit.

Xác định trình tự DNA theo Sanger gồm 2 khâu:

1. Khuếch đại đoạn AND cần xác định trình tự trong môi trường chứa 4 nu bình thường và 4 loại nu mất nhóm OH ở C số 3.2. Xác định trình tự trên thiết bị tự động.

Câu 29: Đặc điểm cơ bản của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và nêu ứng dụng của PCR. Phân biệt tái bản DNA trong tế bào sống và tái bản DNA bằng PCR.

KN PCR: PCR là phản ứng nhân bản đoạn DNA nhờ enzyme polymerase in vitro và primer trên máy nhân DNA.

Trong vài giờ có thể tạo ra 230 - 235 bản sao một trình tự

DNA.

Đặc điểm:

- Cơ sở của PCR: PCR dựa trên cơ chế tái bản DNA nửa gián đoạn theo cơ chế của Okazaki với sự tham gia của mồi.

- Nguyên tắc của PCR: (1) DNA có thể bị biến tính khi nhiệt độ cao và hồi tính khi nhiệt độ hạ thấp; (2) Nhân bản đoạn DNA dựa trên cặp mồi. Quá trình tổng hợp chuỗi polynucleotit bắt đầu tự

nhóm OH tự do ở 3’ (3’-OH); (3) Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện khi có DNA mẫu, cặp mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và con Mg2+.

- Điều kiện của PCR: Máy PCR, Chu trình nhiệt (nhiệt độ biến tính 800-950C, tiếp hợp mồi 400- 650C, kéo dài: 720C).

- Thành phần phản ứng: DNA mẫu (template), 2 đoạn mồi (mỗi đoạn mồi dài 18-24 base), taq polymerase (enzyme chịu nhiệt được tách từ vi khuẩn thermus aquaticus), 4 loại deoxirinucleotide triphotphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm, ion

Mg2+.

Các giai đoạn của PCR

- PCR là phản ứng chuỗi gồm nhiều chu kỳ (30-35 chu kỳ), mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng sợi kép

thành dạng sợi đơn ở nhiệt độ 940-950C trong khoảng thời gian ngắn.

+ Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống

50o-65oC cho phép hai đoạn mồi gắn vào DNA mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc bổ sung.

+ Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 72oC DNA taq polymerase hoạt động kéo dài đoạn DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA.

- Kết quả: tạo ra 230- 235 đoạn DNA được nhân bản.

Ứng dụng của PCR:

- Sản xuất mẫu dò, khuếch đại số lượng các đoạn DNA và RNA, định lượng bằng PCR, phân tích đột biến, phân tích DNA đa hình, phân lập gen và tách dòng gen.

- Phân tích sinh vật chuyển gen.

Phân biệt tái bản DNA trong tế bào sống và tái bản DNA bằng PCR.

DNA trong tế bào sống DNA bằng PCR

- Các yếu tố tham gia có sẵn

trong tế bào sống: hệ enzym (DNA polymerase, RNA polymerase, DNA gyrase, DNA helicase, DNA ligase), protein (B và SSB)

- Mồi là trình tự RNA ngắn

được tổng hợp trong nhân tế bào.

- Có một mạch bổ sung được

tổng hợp theo chiều tháo xoắn, một mạch bổ sung khác được tổng hợp gián đoạn ngược chiều tháo xoắn.

- Gồm 3 giai đoạn: khởi đầu,

kéo dài và kết thúc. Kết quả tạo ra 2 phân tử DNA con. Tái bản theo chu kỳ tế bào: xảy ra trong nhân tế bào tại kỳ trung gian giữa các lần

- Các thành phần được bổ sung

vào phản ứng: đệm NH4+

(buffer), mạch DNA khuôn, trình tự DNA mồi, enzyme Taq polymerase, dNTP, Mg2+.

- Mồi là trình tự DNA ngắn

được tổng hợp trong ống nghiệm.

- Cả hai mạch bổ sung được

tổng hợp liên tục.

- Là chuỗi phản ứng gồm 28-

30 chu kỳ được đặt trong máy chuyên dụng. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn : biến tính, tiếp hợp mồi, và tổng hợp. Kết quả tạo ra 2k đoạn DNA được nhân bản có cùng kích thước và tương ứng với một

phân bào (hoặc xảy ra trong bào quan ty thể, lục lạp)

gen cần khuếch đại.

Câu 30: Đặc điểm cơ bản của phản ứng RT-PCR và những ứng dụng của kỹ thuật này.

Đặc điểm:

- Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn RNA. Phản ứng phiên mã ngược từ RNA thành DNA nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt độ 500C - 550C trong 30 phút. Sau khi có sản phẩm DNA 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn.

- Phản ứng RT-PCR gồm 2 giai đoạn: (1) tổng hợp trình tự DNA 2 sợi (cDNA) từ sợi RNA làm khuôn; (2) trình tự DNA sợi đôi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.

Sản phẩm PCR cùng với ADN marker được kiểm tra bằng phương pháp điện ới trên gel agarose 0,8-2%. Tiến hành chụp ảnh trên ánh sáng đèn UV để xác định sự có mặt của đoạn ADN được nhân bởi PCR.

Ứng dụng:

+ Nhân RNA của retrovirut hoặc mRNA tách từ tế bào chất.

+RT-PCR được sử dụng để khuếch đại cDNA phục vụ thiết lập thư viện cDNA, chuyển gen, nghiên cứu mức độ biểu hiện của 1 gen…

Câu 31 : Khái niệm vector, đặc tính chung và ứng dụng của vector. Phân biệt vector tách dòng và vector biểu hiện gen.

Khái niệm vector :

- Vector là một đoạn DNA hay phân tử DNA vòng hay không vòng có thể mang một đoạn DNA ngoại lai, có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ, tự nhân lên một cách độc lập so với NST của tế bào chủ. - Các vector hay được sử dụng là plasmid hoặc phage. Vector sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử gồm vector tách dòng và vector biểu hiện.

Đặc tính của vector:Vector có kích thước nhỏ, có khả năng tái bản trong tế bào chủ, có điểm cắt của enzym giới hạn, có chỉ thị chọn lọc.Các đặc tính của vector:

+ Có các trình tự khởi đầu sự sao chép (ori) để có thể tự sao chép và tồn tại độc lập.

+ Vector có kích thước càng nhỏ càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và càng được sao chép nhanh.

+ Vector có trình tự nhận biết để RE cắt hở làm chỗ gắn gen ngoại lai.

+ Có trình tự điều hoà (promoter) và vị trí bám của ribosom (rbs - ribosome binding site) tạo thuận lợi cho sự phiên mã và sự biểu hiện của gen lạ.

+ Vector phải có đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng trong tế bào chủ. Các đặc tính này được mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thường đó là đặc tính kháng kháng sinh giúp vi khuẩn có mang vector sống được trên môi trường có kháng sinh hoặc khả năng sản sinh một enzym chuyển hoá một cơ chất tạo màu phát hiện được trên môi trường thạch.+ Vector phải tồn tại được trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ.

Ứng dụng của vector :

+ Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng bản sao một trình tự DNA nhất định (vector tách dòng).+ Chuyển gen vào tế bào hay cơ thể tạo sinh vật chuyển gen (vector chuyển gen).+ Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng (vector biểu hiện).

Phân biệt vector tách dòng và vector biểu hiện gen:

+ Hai loại vector này đều có đủ 4 đặc tính của một vector+ Vector tách dòng được sử dụng để tách dòng phân tử, vector biểu hiện sử dụng để biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào chủ.+ Hai loại vector này khác nhau về cấu trúc và chức năng. vector tách dòng có điểm ori, vùng chứa gen kháng kháng sinh, vùng có các điểm cắt của RE. vector biểu hiện có thêm vùng điều khiển hoạt động của gen ngoại lai.

Câu 32: Khái niệm, nguyên tắc và kỹ thuật phân lập gen bằng RE, PCR và RT-PCR.

Khái niệm phân lập gen:

- Tách gen từ DNA hệ gen hoặc từ mRNA bằng kỹ thuật sử dụng RE hoặc PCR, kết hợp với kỹ thuật tách dòng và giải trình tự nucleotide.- Có hai phương pháp phân lập gen cơ bản: (1) Phân lập gen bằng kỹ thuật sử dụng RE và (2) Phân lập gen bằng kỹ thuật PCR, RT-PCR.

Nguyên tắc và kỹ thuật phân lập gen bằng RE

- Nguyên tắc: dựa trên bản đồ giới hạn, sàng lọc và lựa chọn RE để phân lập gen quan tâm.

- Các bước

(1). Tách chiết và tinh sạch DNA hệ gen

(2). Cắt DNA bởi enzyme giới hạn

(3). Điện di trên gel agarose

(4). Dựa vào DNA marker xác định được đoạn DNA cần phân lập.

(5.1). Biến tính DNA thành 2 mạch đơn rồi chuyển lên màng lai phân tử, DNA cố định trên

màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp, dùng

kỹ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.

(5.2). Bằng kỹ thuật thôi gel để thu đoạn DNA cần phân lập.

(6). Tách dòng và xác định trình tự nucleotit của gen.

Nguyên tắc và kỹ thuật phân lập gen PCR- Kỹ thuật phân lập gen bằng PCR+ Nguyên tắc: khi đã biết trình tự gen trong họ gen có thể thiết kế và tổng hơp mồi cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn DNA, bằng cách so sánh với các trình tự gen đã công bố trong Genbank có thể xác định được gen cần phân lập.+ Kỹ thuật phân lập gen bằng PCR

(1). Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số(2). Thiết kế primers(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR(4). Nhân đoạn DNA trong máy PCR để phân lập đoạn

gen theo mục đích.(5). Tách dòng gen(6). Xác định trình tự gen(7). So sánh với các trình tự gen đã công bố

Kỹ thuật phân lập gen bằng RT-PCR(1) Thiết kế và tổng hợp cặp mồi (primers)(2). Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số (3) Tạo cDNA bằng phiên mã ngược(4). Chọn điều kiện phản ứng PCR(4). Nhân đoạn cDNA trong máy PCR để phân lập cDNA

đích.(5). Tách dòng cDNA(6). Xác định trình tự cDNA(7). So sánh trình tự cDNA với các trình tự đã công bố

Câu 33: Thư viện hệ gen, thư viện cDNA là gì? Trình bày quy trình thiết lập loại thư viện này.

Thư viện hệ gen:

- Thư viện hệ gen là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành hệ gen đã được gắn vào

vector.

Các bước thiết lập thư viện bộ gen:

(1). Tách chiết DNA

(2). Phân lập gen bằng RE hoặc bằng PCR.

(3). Chọn vector.

(4). Gắn đoạn DNA vào vector tạo vector tái tổ hợp.

(5). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.

(6). Tế bào chủ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp và hình thành nên những

dòng.

(7) Tách dòng tế bào chủ mang vector tái tổ hợp

(8) Tách vector tái tổ hợp từ tế bào chủ, giải trình tự nucleotit và khẳng định gen cần

phân lập.

(9) Lưu giữ các vector tái tổ hợp.

Thư viện cDNA

- Thư viện cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của tế bào được gắn

vào vector tách dòng.

- Mục đích của thư viện cDNA: (i) Nghiên cứu biểu hiện một gen xác định cùng với

những vấn đề liên quan biểu hiện gen, mối tương tác giữa các gen trong quá trình sống.

(ii) Giải mã thông tin di truyền chứa trong các phân tử RNA là vật chất di truyền của một

số loài virus gây bệnh để tìm hiểu bản chất phân tử các bệnh.

Các bước thiết lập thư viện cDNA:

(1). Tách chiết mRNA

(2). Tổng hợp cDNA nhờ enzyme sao mã ngược.

(3). Khuếch đại cDNA bằng RT-PCR

(4). Chọn vector. tạo vector tái tổ hợp gồm plasmid và cDNA.

(5). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.

(6). Tế bào chủ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp và hình thành nên nhữngdòng.

(7). Tách dòng tế bào chủ mang vector tái tổ hợp

(8) tách vector tái tổ hợp từ tế bào chủ giải trình tự nucleotit và khẳng định gen cần

phân lập.

(9) Lưu giữ các vector tái tổ hợp.

Câu 34: Phân biệt khái niệm biểu hiện gen trong tế bào sống và kỹ thuật biểu hiện gen. Hệ biểu hiện gen, nguyên tắc và kỹ thuật biểu hiện gen.

Khái niệm biểu hiện gen:- Hiện tượng gen ngoại lai được biểu hiện trong tế bào chủ (sản phẩm biểu hiện gen thường là protein hoặc mRNA)

Hệ biểu hiện: hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gen:+ Escherichia coli, + Bacillus subtilis,+ Nấm men (saccharomyces cerevisiae) + Tế bào động vật, thực vật

- Tuy nhiên E.coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng

Nguyên tắc: gen ngoại lai gắn vào vector biểu hiện; vector biểu hiện và hệ biểu hiện phải phù hợp,

Kỹ thuật biểu hiện gen(1) Lựa chọn hệ thích hợp để biểu hiện gen.(2) Dựa vào trình tự gen, thiết kế các đoạn mồi để nhân gen.

tổng hợp mồi.(3) Chuẩn bị DNA để nhân gen.(4) Nhân gen bằng PCR từ DNA hệ gen hoặc từ cDNA, (5) Tách dòng gen và đọc trình tự gen (6)Tách plasmid tái tổ hợp (7) Đưa gen vào vector biểu hiện có mang gen chỉ thị và biến

nạp vào tế bào chủ (hệ biểu hiện)(8) Kiểm tra kết quả biểu hiện của gen thông qua sản phẩm.

Câu 35: Nguyên tắc và kỹ thuật tách dòng phân tử. Quy trình tách dòng phân tử. Các phương pháp phát hiện dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp.

KN tách dòng phân tử :- Hiện tượng khuếch đại đoạn DNA tạo ra các bản sao của một gen hay cDNA trong tế bào chủ.- Tách dòng phân tử bào gồm: (1) Tạo vector tái tổ hợp, (2) Nhân bản vector tái tổ hợp trong tế bào chủ và (3) Tách chiết vector tái tổ hợp.- Tách dòng phân tử bao gồm tách dòng gen và tách dòng cDNA

Nguyên tắc và mục đích+ Tách dòng phân tử trên cơ sở tạo vector tái tổ hợp, biến nạp

vào tế bào chủ và nhân bản vector tái tổ hợp trong tế bào chủ. + Dựa vào chỉ thị để nhận biết được dòng tế bào chủ mang

vector tái tổ hợp.- Mục đích của tách dòng gen là tạo ra nhiều bản sao của một gen để xác định trình tự gen, thiết lập thư viện hệ gen.

Kỹ thuật tách dòng phân tử Kỹ thuật tách dòng phân tử gồm các bước:

+ Chọn và xử lý vector, xử lý DNA cần tạo dòng + Tạo vector tái tổ hợp+ Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ+ Nhân dòng và phát hiện dòng cần tìm+ Tách dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp

Phát hiện dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp- Vector và đoạn DNA ngoại lai được trộn lẫn với nhau dới tác dụng của enzym nối DNA ligase. hỗn hợp vector và đoạn DNA ngoại lai được trộn lẫn với tế bào chủ để thực hiện biến nạp. - Có 3 khả năng có thể xảy ra:

+ Tế bào chủ không có vector;+ Tế bào chủ nhận được vector không có gen ngoại lai xen

vào; + Tế bào chủ nhận được vector tái tổ hợp.

- Phát hiện dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp theo 3 phương pháp cơ bản sau: (1). Lai axit nucleic: Có thể thực hiện theo các bước

+ Nuôi cấy các dòng tế bào chủ trên môi trường chọn lọc LB đặc qua đêm ở 37oC

+ Áp màng lai vào đĩa nuôi cấy để chuyển khuẩn lên màng lai, làm tan các khuẩn lạc trên màng lai giải phóng DNA

+ Lai mẫu dò lai với DNA trên màng lai+ Việc phát hiện các phân tử lai thông qua phóng xạ tự ghi.

(2). Dựa vào sự biểu hiện kiểu hình+ Các vector tách dòng được thiết kế mang trình tự điều hoà

của gen Lacz. Khi biến nạp vào tế bào chủ, làm biến đổi tế bào chủ có kiểu hình lac - thành lac+.

+ Các vi khuẩn có kiểu hình lac+ được nhận biết nhờ sự chuyển hoá cơ chất X-gal làm khuẩn lạc có màu xanh.

+ Nếu đoạn DNA ngoại lai được gắn xen vào trình tự điều hoà của Lacz, làm gen không hoạt động, không thực hiện được phản ứng biến đổi x-gal thành màu xanh, vì vậy khuẩn lạc có màu trắng. Người ta có thể nhận biết nhanh chóng bằng mắt thường các khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp. (3). Hiện tượng mất hoạt tính do xen đoạn.

+ Đoạn DNA ngoại lai được xen vào vị trí mở vòng plasmid, làm cho gen kháng thuốc mất hoạt tính.

Hỗn hợp trên được biến nạp vào tế bào chủ E.coli, tế bào chủ có thể có 3 loại kiểu gen và kiểu hình:

+ Tế bào chủ không nhận được vector sẽ không mọc được trên môi trường có tetracyline (hoặc ampiciline);

+ Tế bào chủ nhận được vector nhưng gen ngoại lai không gắn được vào vector, nó sẽ mọc được trên môi trường có ampiciline, tetracycline;

+ Tế bào chủ nhận được vector tái tổ hợp, gen amp bị mất hoạt tính do gen lạ xen vào, gen kháng tetracyline vẫn hoạt động bình thường. Do vậy các tế bào chủ mang vector tái tổ hợp không mọc được trên môi trường chứa ampiciline, nhưng vẫn mọc được trên môi trường chứa tetracycline.

Câu 36: Phân biệt kỹ thuật PCR và RAPD. Đặc điểm của mồi trong PCR và mồi trong RAPD.

PCR RAPD

+ Là phản ứng khuếch đại một phân đoạn DNA đích (gen) cần nghiên cứu

+ Là phản ứng khuếch đại phân đoạn DNA ngẫu nhiên

+ Mồi PCR là 1 cặp mồi chuyên biệt gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R). Mồi F và R có Tm khác nhau, số lượng base khác nhau và không bắt cặp với nhau

+ Mồi RAPD là một đoạn oligonucleotit ngẫu nhiên.

+ Cặp mồi được thiết kế và tổng hợp dựa trên trình tự một gen đã biết trên ngân hàng gen quốc tế. Cặp mồi phổ biến dài từ 18-24bp

+ Mồi được thiết kế và tổng hợp ngẫu nhiên, không đòi hỏi thông tin về trình tự gen được nhân bản. Mồi RAPD ngắn hơn mồi PCR (phổ biến là 10 base)

+ Trình tự nucleotit của mồi chỉ bắt cặp bổ sung với trình tự nucleotit ở một vị trí nhất định trên phân tử DNA và chỉ khuếch đại được một trình tự gen quan tâm

+ Trình tự nucleotit của mồi liên kết bổ sung với nhiều vị trí khác nhau và có khả năng khuếch đại được nhiều phân đoạn DNA có kích thước khác nhau.

+ Nhiệt độ tiếp hợp mồi 400C- 600C (cao hơn ở phản ứng RAPD). Số chu kì của phản ứng 28- 32 chu kỳ

+ Nhiệt độ tiếp hợp mồi 320C- 400C. Số chu kì của phản ứng 30- 45 chu kì

Câu 37: Phân biệt các khái niệm: kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật biểu hiện gen và kỹ thuật chuyển gen.

Khái niệm tách dòng phân tử (gen)- Hiện tượng khuếch đại đoạn DNA tạo ra các bản sao của một gen hay cDNA trong tế bào chủ.- Tách dòng phân tử bào gồm: (1) Tạo vector tái tổ hợp, (2) Nhân bản vector tái tổ hợp trong tế bào chủ và (3) Tách chiết vector tái tổ hợp.- Tách dòng phân tử bao gồm tách dòng gen và tách dòng cDNA

Khái niệm biểu hiện gen:- Hiện tượng gen ngoại lai được biểu hiện trong tế bào chủ (sản phẩm biểu hiện gen thường là protein hoặc mRNA)- Hệ biểu hiện: hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gen:

+ Escherichia coli, + Bacillus subtilis,+ Nấm men (saccharomyces cerevisiae) + Tế bào động vật, thực vật

- Tuy nhiên E.coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng

Khái niệm chuyển gen:

Chuyển gen là kỹ thuật đưa một đoạn ADN ngoại lai vào hệ gen (genome) của một cơ thể đa bào. Đoạn ADN ngoại lai sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được di truyền lại cho thế hệ sau.

Khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng cho thực vật và động vật. Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn ADN ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến nạp (transformed cell).

Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gen therapy). Có trường hợp các tế bào mầm không mang ADN ngoại lai. Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gen therapy) cũng được sử dụng. Các tế bào mầm này mang ADN ngoại lai và được truyền lại cho thế hệ sau.