Monoklonális ellenanyagok

- egyetlen B-limfocita klón termékei- homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus)- kiszámítható hatás, kevés mellékhatás

- humán szervezetben patológiás körülmények között,plazmasejt klón malignus szaporulata miatt (myeloma multiplex)

- előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben („pharmacology-grade”) állíthatók elő

Monoklonális ellenanyag

Poliklonális ellenanyag

egyetlen B-limfocita klón

többB-limfocita klón

Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea.

Nagy affinitású Monoklonális Ea.

Felismert antigén determinánsok száma

Több (gyakori keresztreakciók)

Egy (de gyakori keresztreakciók)

Legtöbbször egy

Specificitás polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus

Affinitás Változó (többféle ellenanyag)

kicsi nagy

Nem-spec. Immunglobulinok koncentrációja

magas alacsony alacsony

Hozam magas alacsony alacsony

Előállítási költség alacsony magas magas

Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű egyszerű

Mennyiség limitált korlátlan korlátlan

Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló

A poliklonális és monoklonális ellenanyagok jellemzői

Monoklonális ellenanyag előállítás meneteHibridoma technika

Vázlatosan 1.- egér/patkány beoltása antigénnel

- lép vagy nyirokcsomó eltávolítása, homogenizálása

- lépből származó plazmasejtek + B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/mielóma sejtek) fúziója

- Az ellenanyag termelő klónok azonosítása. A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul

LépImmunzálás

Mielóma sejtHGPRT-

B sejtek,HGPRT+

PEG fúzió

HAT szelekció

Sejteket tartalmazó lyukak felülúszójánaktesztelése

Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan 2.

A hibrid sejtek szelekciója

*Hypoxantin-guanin foszforibozil transzferáz

*

HAT= hypoxanthin, aminopterin, thymidin

aminopterin

(1) Egér immunizálása(2) B sejtek izolálása a lépből(3) Myeloma sejtek kinyerése(4) Myeloma és B sejtek fúzionáltatása(5) A sejtvonalak izolálása(6) A megfelelő sejtvonalak kiválasztása szűrőmódszerekkel(7) in vitro (a) vagy in vivo (b) sokszorosítás(8) Monoklonális antitest termeltetés

Monoklonális ellenanyag termelés hatékonyságát befolyásoló tényezők

1. Antigén specifikus B-limfociták aktiválása- egér: beltenyésztett törzsek, genetikailag jellemzett, beoltáshoz kevés antigén

- ellenanyagtermelő hibridsejtek kinyerésének hatásfokát befolyásolja: a) immunizálás módja (adjuváns, oltás helye:IP, talp, farokvéna, lép) b) emlékeztető oltások száma c) utolsó oltás és a fúzió között eltelt napok száma (2-4 nap)

2. A fúziós partnerek- BALB/c egérből származó Sp2/0-Ag14 tetraploid, ellenanyagtermelő képességgel nem rendelkező plazmacitoma sejt (anyagcseredefektussal rendelkezik, HGPRT (hipoxantin-guanin- foszforibozil-transzferáz és Timidin Kináz hiány)

Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei

- Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása

Immunhisztokémia

Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével

- Sejtek elválasztása

CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből

- Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal)

- Komplex antigén keverékek analizálása

- Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata

T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata

- Célzott kemoterápia

CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában

Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással

- Gyógyszer-eliminálás antitestekkel

Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek?

Az emberi antigénekkel immunizált egérben termelt antitestek az egérre specifikus aminosav-szekvenciákkal bíró glikoproteineket jelentenek, tehát emberbe adva fajidegen fehérjeként hatékony immunválaszt indukálnak.

Hogyan kerülhető meg a probléma?

A monoklonális antitestek fejlődése

Egér

Kiméra

Humán

Humanizált

Antigén kötő régió

Homológ régió

Monoklonális ellenanyagok „humanizálása”

1. CAMPATH-1H anti-CD52 monoklonális patkány ellenanyag

Fajidegen ellenanyagok többszöri használata erős immunválaszt indukál. (Probléma: HAMA = humán anti-mouse antitestek)

Ha a patkány immunglobulin antigénkötő régiójával cserélik ki egy humán ellenanyag homológ régióját, az így a keletkező ellenanyagban csak az antigénkötő régió lesz patkány eredetű. (Kiméra)

(Probléma: HACA = humán anti-chimera antitestek, bár ezek kevésbé immunogének)

2. In vitro fág display: átrendeződött VDJ régiókat filamentózus fágok kapszidjának felszínén fejezik ki, majd a nagy affinitással kötődő fágokat antigén-affinitás oszlopkromatográfiával tisztítják. A fágból izolált humán Ig kódoló DNS-t transzgenikus egerekben expresszáltatják.

3. Olyan knock-out egerekben amelyekben az egér saját Ig génjét inaktiválták a humán „germ-line” (még at nem rendeződött) lokusz transzgénként kifejezhető. Így az egérben játszódik le a humán Ig gének átrendeződése és a humán Ig által „megmentett” egér B-sejtek antigének általi szelekciója. Az egér B-sejtekből amelyek human Ig-t termelnek hibridóma készíthető és nagy mennyiségű Ig állítható elő.

In vitro fág display

Szelektív kötődés az antigénhez

Mosás

Amplifikálás

Fág által kifejezett antitestek

(Humán Ig-t kódoló DNS-t szeparálják, transzgén egérben

termeltetik)Gene3

Expresszált humán antitest

Antitestet kódoló humán gének

Fág display vektor

Átrendeződött VDJ gén

egér Ig „knock-out”, transzgén egér

(humán Ig kódoló gének bejuttatása)

VDJ átrendeződésa transzgén

egérben

- Tumorterápia

Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!)

- Immunszuppresszió

Sejttípusra célzott immunszuppresszió lehetősége

Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok

Terápiás monoklonális antitestek elnevezése

A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel (nem igényel tulajdonjogot) illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg.

A nevezéktan részei:

Előtag Cél Forrás Utótag

-ki(n)- interleukin -u- humán

-ci(r)- kardiovaszkuláris -o- egér

-co(l)- colon tumor -xi- kiméra

variábilis

-neu(r)- idegrendszer Stb..

-zu-humanizált stb.

mab

Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában

1. „Naked MAb”, nem konjugált antitestAnti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphomaAnti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3.

vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben)Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumorAnti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!)Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!)

2. konjugált antitestAnti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin)Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

Immunszuppresszív ellenanyagok 1.

1. Anti-TNF-α antitestekinfliximab (Remicade): 1998 óta, kiméraadalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán

2. Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje,TNF-α receptor + Ig Fc-vég(Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!)

Anti-TNF-α terápia indikációi:• Rheumatoid arthritis• Spondylitis ankylopoetica (SPA - M.

Bechterew)• Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica• Crohn-betegség, colitis ulcerosa• (általában - még - nem 1. vonal!)

- Muromonab-CD3 (OKT-3) egér IgG2aCD3 pan-T sejt antigén ellen, szervátültetést megelőzően vagy követően alkalmazott immunszupresszív kezelésre; ma már ritkán használják (fajidegen fehérje!); humanizált változatával I-es típusú diabetes mellitusban folynak vizsgálatok

- Omalizumab (Xolair):IgE elleni humanizált IgG1k monoklonális antitestInd.: allergiás asthma, Churg-Strauss szindróma

- Daclizumab (Zenapax):IL-2 receptor elleni, humanizált antitest.Ind.: transzplantációt követően kilökődési reakció ellen, T-limfocita aktivitás gátlására

- basiliximab (Simulect): mint daclizumab, de kiméra!

- efalizumab (Raptiva): anti-CD11a, humanizált, ind.: psoriasis

Immunszuppresszív ellenanyagok 2.

Regisztrált molekulárisan irányított szerek Név Típus Támadás-

pontIndikáció

Alemtuzumab (Mabcampath)

Daclizumab(Zenapax)

Basiliximab(Simulect)

Rituximab(Rituxan/Mabthera)

Trastuzumab(Herceptin)

Gemtuzumab

Ibritumomab (Y90)EdrecolomabGefitinib Imatinib

Monoclonal antibody, humanized

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, chimeric

Monoclonal IgG1, humanized

Monoclonal IgG4, humanizedCalicheamicinnel konjugált

Monoclonal IgG1, murine

Monoclonal IgG2, murineEGFR-TKIKIT-TKI

CD52

IL-2 R

IL-2 R

CD20

HER2/neu

CD33

CD20

EpCAMEGFR TKTK

CLL, CML

rák, leukemia

rák, lymphoma

emlő-, prosztatarák, NSCLCrák, leukemia

rák, lymphoma

CRCNSCLCGIST, CML

Radio-immunotherápiaPl. Zevalin, Bexxar – monoklonális + izotóp

Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) Az antitesthez enzimet kötnek, mely a később szisztémásan bevitt, ártalmatlan prodrug vegyületet lokálisan alakítja a citotoxikus, hatékony metabolittá

Immuno-liposzómákLiposzómába csomagolt nukleotidok vagy gyógyszer célzása monoklonális antitestekkel (pl. tumorszuppresszor gének bevitele, szövetspecifikus génbevitel)

Nem immunológiai célpontú manipulációkpl. abciximab (ReoPro): thrombocyta-aggregatio gátlása

További lehetőségek monoklonális ellenanyagok felhasználására