Možnosti kontroly identity lesného reprodukčného materiálu genetickými metódami

Monika KonnertBayerisches Amt für forstliche Saat- und

Pflanzenzucht, Teisendorf

Elena FoffováNárodné lesnícke centrum, Stredisko

kontroly lesného reprodukčného materiálu, Liptovský Hrádok

Vladimír FoffLIA - Lesnícka informačná agentúra,

Liptovský Hrádok

legislatívnymi predpismi (zákon 217/2004, vyhláška 571/2004) a kontrolami produkcie a dokladov (potvrdenie pôvodu, sprievodné listy)

Ako sa dá zabezpečiť identita lesného reprodukčného materiálu?

analýzou a porovnaním genetických informácií

Stammzertifikat für Vermehrungsgut vonSaatgutquellen und Erntebeständen

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND STAMMZERTIFIKAT-NR.1 D- Es wird bestätigt, dass das nachstehend beschriebene forstliche Vermehrungsgut erzeugt wurde :gemäß EG-Richtlinie gemäß Übergangsregelungen

1. Baumart: Botanische und deutsche Bezeichnung:

2. Art des Vermehrungsgutes: 3. Vermehrungsgutkategorie: 4. Art des Ausgangsmaterials:Saatgut Pflanzenzeile Pflanzgut

Quellengesichert Ausgewählt Geprüft

Saatgutquelle Erntebestand

5. Verwendungszweck: forstlich nicht forstlich

6. Registerzeichen: Eigentümer der Zulassungseinheit:

7. autochthon nicht autochthon unbekannt

8. Ursprung des Ausgangsmaterials (für nicht autochthones Material, falls bekannt):

9. Land und Herkunftsgebiet des Ausgangsmaterials: Land:

Herkunft: Bezeichnung:

10. Höhenlage bzw. Höhenzone des Standorts des Ausgangsmaterials:

11. Reifejahr:

12. Menge des Vermehrungsgutes: kg / Stück2 i.W.:Anzahl und Art der Verpackungseinheiten:Bei Saatgut:Aufbereitungszustand: ungereinigt gesiebt maschinengereinigt

Anteil des reinen Saatgutes an der Gesamtmenge

ca. %

Artreinheit:

ca. %

13. Ist das Material, für das dieses Zertifikat ausgestellt wurde, Ergebnis der Teilung einer größerenPartie, für die bereits zuvor ein Stammzertifikat ausgestellt wurde? Ja Nein

Nr. des Vorläufer-Zertifikates: Menge der Anfangspartie:

14. Dauer der Anzucht in einer Baumschule:

15. Wurde bereits aus Samen erwachsenes Material vegetativ vermehrt? Ja Nein Vermehrungsmethode: Anzahl der Vermehrungszyklen:

16. Anzahl der beernteten Bäume (falls unter 50):Waldort:Ernteverfahren:Handsammlung Netze Sauger Sonstiges .............................Andere sachdienliche Angaben:

Name und Anschrift des Ernteunternehmers:

Name und Anschrift des 1. Empfängers:

17. Name, Anschrift und Betriebsnummer des Lieferanten:

1 Aufbau der Stammzertifikatnummer: BB LLL X IIII JJ, wobei BB = Bundesland, LLL = Landesstelle, X: 1 = Ernte, 2 = Mischung,3 = weniger strenge Anforderungen, 4 = Export, IIII = laufende Nummer, JJ = Baumschuljahr 01.07.-30.06. z.B. 02 steht für 02/032 Nichtzutreffendes streichen

„Ak sa majú biochemicko-genetické metódy naďalej využívať ako nástroj pri kontrole identity LRM, je nevyhnutne nutné zabezpečiť vhodné referenčné vzorky od doby zberu cez jednotlivé stupne

produkcie LRM“

ASP Teisendorf v rokoch 1992-1999 riešil asi 50 kontrolných prípadov pomocou biochemicko-

genetických analýz (dreviny: BK, JH, SM, JD, DB, LP, BO, SC)

Dôvod: Pochybnosti o pôvode nakúpeného sadbového materiálu Problém: Obvykle chýbal vhodný porovnávací (referenčný) materiálVýsledok: Nedostatočná istota výpovedí – len domnienky

Záver z r. 1999:

Ref. vzorka R2z jednotlivých

stromov*

Testovanie osiva

Odhad maximálneho množstva sadbového materiálu z daného zberu Potvrdenie identity

Biochemicko-genetická analýza alebo molekulárno-genetická analýza a porovnanie genetických charakteristík

Výroba sadbového materiálu

Miešanie oddielov osiva

Spracovanie semennej suroviny

Zber semennej suroviny

Ref. vzorka R1reprezentatívna

zmes

Ref. vzorka R3reprezentatívna

vzorka zo spracovaného osiva

Ref. vzorka R4reprezentatívna vzorka zo zmesi

Vzorka sadb. materiálu Ppodľa potreby

Referenčné vzorky sú pre kontrolu identity lesného reprodukčného materiálu použiteľné vtedy, ak:

• pri spracovaní a skladovaní osiva a pri pestovaní sadbového materiálu nedochádza k selektívnym procesom, ktoré by preukázateľne zmenili genetickú štruktúru pôvodného oddielu;

• je možný odber reprezentatívnych vzoriek náhodným výberom, hlavne v prípade, že sa jedná o väčšie a nie vždy homogénne oddiely semien alebo sadbového materiálu;

• sú k dispozícii štandardizované metódy analýzy genetickej štruktúry;

• genetické rozdiely medzi rôznymi oddielmi zozbieraných semien sú preukázateľne väčšie ako rozdiely medzi vzorkami z rôznych štádií spracovania alebo pestovania toho istého oddielu.

Typy markerov vhodné pre overenie identity LRM

Izoenzýmové markeryPre mnoho drevín, na ktoré sa vzťahujú európske legislatívne predpisy, sú k dispozícii štandardizované metódy reprezentatívneho odberu vzoriek ako aj ich biochemicko-genetickej analýzy (Konnert 2004).

Pri drevinách ako je buk, javor horský, lipa malolistá, jelša lepkavá, duby, jaseň, jedľa, smrek, smrekovec a duglaska, sa prejavujú aj dostatočne veľké genetické rozdiely medzi rôznymi oddielmi.

DNA- markery hlavne mikrosatelity jadrovej a chloroplastovej DNA.

Využiteľné napríklad na genetickú identifikáciu stromov, tvoriacich porast, z ktorých boli zbierané semená a neskôr na identifikáciu tých semien alebo semenáčikov, ktoré z deklarovaného zdroja a materských stromov nemôžu pochádzať.

Praktické príklady

Pre ilustráciu možností využitia referenčných vzoriek a genetických analýz na overenie identity lesného reprodukčného materiálu uvádzame štyri príklady z praxe Bavorského úradu pre lesné osivo a sadbový materiál v Teisendorfe.

• dodávka zmluvne pestovaných sadeníc z osiva dodaného zákazníkom• z použitého osiva bola pri zbere odložená referenčná vzorka - R1• Z dodaných sadeníc boli odobraté púčiky - P

Referenčné vzorky umožnili porovnať genetické rozdiely medzi osivom a dopestovaným materiálom izoenzýmovou analýzou.

1. Overenie identity sadeníc smrekovca na vylepšenie ochranného lesa v Alpách

Výsledky:Systém PGMSemená

Dodané sadenice A142%

A315%

A243%

A116%

A373%

A211%

Semená Dodané sadenice

Semená

Dodané sadeniceA1

21%

A43%

A327%

A249%

A124%

A351%

A225%

Systém SKDH

Semená Dodané sadenice

Analyzovaný oddiel smrekovcových sadeníc nepochádza z deklarovaného osiva. 

• na zmluvné pestovanie bolo odovzdané 600 g osiva s klíčivosťou 15%• počet klíčivých semien v 1 kg osiva predstavoval 20 000 ks • v 600 g osiva mohlo byť maximálne 12 000 klíčivých semien• dodaných bolo 8 000 preškôlkovaných sadeníc (1+1),

Selekcia nemôže byť v takom prípade príčinou zistených rozdielov medzi genetickou štruktúrou osiva a sadeníc.

Záver:

K dispozícii sú aj údaje o množstve a kvalite použitého osiva, ktoré jednoznačne podporujú výsledok izoenzýmových analýz:

Výborná využiteľnosť osiva !!!

2. Overenie identity dodávky semenáčikov buka pre certifikačný systém „ZüF“

Referenčné vzorky:

vzorka rastlinného materiálu P (odobratá pri vyzdvihovaní) porovnaná s referenčnou vzorkou osiva R1 (odobratá pri zbere)

Metodika: izoenzýmová analýza – 12 lokusov, 130 semenáčikov a 150 semien

Výsledok: Genetická vzdialenosť D allelická = 2,7 %, Ggenotypová = 5,8 %

rozdiely nie sú štatisticky významné

Výsledok overenia identity je v zmysle postupu „ZüF“ pre tento odiel semenáčikov pozitívny.

3. Overenie identity sadeníc javora horského

Metodika: izoenzýmová analýza – 12 lokusov, 130 semenáčikov a 150 semien

Výsledok:

Výsledok overenia je negatívny, oddiel sadeníc nepochádza z deklarovaného oddielu semien.

Referenčné vzorky: vzorka rastlinného materiálu P (odobratá pri vyzdvihovaní) porovnaná s referenčnou vzorkou osiva R1 (odobratá pri zbere) areferenčnou vzorkou osiva R3 (odobratá po spracovaní/čistení)

Lokus Genetická vzdialenosť (%) medzi

P a R1 P a R3 R1 a R3

GOT-C 19,4*** 20,1*** 8,4

PGI-C 17,2*** 18,9*** 3,8

IDH-A 13,4*** 10,2*** 2,9

Priemer 10 lokusov 7,9** 7,1** 4,8

Sadenice: MAP 2 MAP12 MAP33 15 „160/160/182/182“ „152/152/156/156“ „152/152/152/152“ 29 „160/160/182/182“ „152/152/156/156“ „152/152/152/152“ 38 „156/156/166/166“ „152/152/156/156“ „152/152/152/152“ Potenciálne rodičovské stromy (klony) pre tieto tri semenáčiky podľa MAP33: A „156/156/156/156“ „152/152/152/152“ „152/152/160/160“ B „178/178/184/184“ „152/152/156/156“ „152/152/174/174“ C „166/166/166/166“ „155/155/155/155“ „152/152/152/152“

4. Priradenie sadeníc k materským stromom (klonom) javora horského po analýze jadrovej a chloroplastovej DNA

Semenáčiky 15, 29 a 38 majú na lokuse MAP33 len alelu 152. To znamená, že môžu pochádzať len z tých klonov, ktoré majú túto alelu v homozygotnej alebo heterozygotnej forme. Spomedzi stromov, z ktorých sa uskutočnil zber v semennom sade, to môžu byť len klony A, B, C. Ak vezmeme do úvahy aj lokusy MAP2 a MAP 12, zistíme, že semenáčiky 15 a 29 nemohli pochádzať ani z jedného z uvedených troch klonov, pretože nemajú na týchto lokusoch vždy aspoň jednu alelu rovnakú ako materské stromy. Semenáčik číslo 38 mohol pochádzať z klonu A. Touto metódou sa potvrdilo, že cca. 20% semenáčikov nepochádzalo z deklarovaného oddielu semien.

Využitie v praxi

Certifikačná schéma pre lesný reprodukčný materiál s overiteľným pôvodom je už do praxe uvedená v južnom Nemecku (Bavorsku a Bádensku-Würtembersku).

Realizáciu schémy zabezpečuje súkromné Združenie pre kontrolovateľný pôvod lesného reprodukčného materiálu - ZüF, ktoré vzniklo na jar v roku 2002.

Členom združenia sa môže stať, ktorýkoľvek záujemca registrovaný v Národnom registri producentov lesného reprodukčného materiálu, ale členstvo nie je pre účasť v certifikačnej schéme povinné. Účastníci, ktorí nie sú členmi združenia platia vyššie poplatky za certifikáty.

Zúčastnení pestovatelia predávajú svoje sadenice s „Certifikátom reprodukčného materiálu s overiteľným pôvodom“. Uvádzajú teda na trh „prémiový produkt“ pri ktorom treba počítať s približne o 10% vyššou cenou ako pri „obyčajnom“ reprodukčnom materiáli.

Záujem o prístup k tejto certifikačnej schéme podporuje i skutočnosť, že certifikačný systém lesov PEFC Deutschland v revidovaných Normách PEFC pre Nemecko požaduje kontrolu pôvodu použitého osiva a sadbového materiálu podľa odborne uznávaných a vhodných postupov.

Organizácia certifikačnej schémy

Organization Agency

Certification Agency(free access to any field

related to Certification Schemeat time of certification )

User

Participant(company )

Service Agencies- Yield - Storage

- Genetic Tests

issue ofID-number

certified(seeds ) plants

certificate

Association(open membership )

Advisory Board

information

nomination

contract

contract

information

Organization Agency

Certification Agency(free access to any field

related to Certification Schemeat time of certification )

User

Participant(company )

Service Agencies- Yield - Storage- Genetic Tests

issue ofID-number

certified(seeds ) plants

certificate

Association(open membership )

Advisory Board

information

nomination

contract

contract

information

Záver:

• Spoľahlivosť kontrolných analýz sa zvyšuje a náklady na analýzy sa dajú optimalizovať kombináciou rôznych metód.

• Pre overovanie pôvodu sú potrebné reprezentatívne referenčné vzorky odobraté na dôležitých miestach výrobného procesu lesného reprodukčného materiálu.

• Možnosti overovania pôvodu lesného reprodukčného materiálu s využitím biochemických a molekulárnych metód genetickej analýzy drevín sa neustále vyvíjajú.

• Pri niektorých druhoch drevín je naliehavo potrebný základný výskum (vývoj markerov).

Súčasný stav štandardizácie metodík odberu a analýzy vzoriek vytvára reálnu možnosť využívať genetické metódy na overenie deklarovaného pôvodu lesného reprodukčného materiálu v oveľa väčšom rozsahu ako sa doteraz dalo predpokladať.

V Nemecku sa už používajú pri certifikácii sadbového materiálu s overiteľným pôvodom a v Rakúsku sú súčasťou legislatívne stanovených kontrolných opatrení.