méthodes de diagnostic pour l’épidémio-surveillance des … · 2014-02-28 · une validation...
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Méthodes de diagnostic pour l’épidémio-surveillance des
pathogènes dans l’océan Indien
Isabelle ROBENE (CIRAD) / Emmanuel JOUEN (CIRAD) – 21.11.2013
Outils de détection et diagnostic
ANSES (LSV)
• validation interne
• ring tests
Valorisation
• inscription OEPP
• Brevets
• publications
ANSES Europe
Méthodes réglementaires pour
Organismes de Quarantaine
Contexte local et régional +
Utilisateurs
• Services régionaux de protection des végétaux
• Laboratoires agréés
• Laboratoires de certification…
Connaissance des populations associées aux épidémies
L’hôte, facteur de
structuration
Taxonomie Phylogénie
Diversité infra-
spécifique
Une collaboration régionale autour du diagnostic
• PRPV 2005-2007 Mise au point de méthodes de diagnostic des organismes de quarantaine de la pomme de terre et de la tomate, en collaboration avec le MSIRI (Maurice)
• e-PRPV 2011-2012 Renforcement et coordination des pôles de compétences en diagnostic dans la zone OI:
Madagascar, Seychelles, Maurice et Comores
• Au cours de ces 2 périodes, plusieurs formations sur le diagnostic dispensées aux agents de la zone.
• Production d’outils pour l’épidémio-surveillance dans la zone: – Diagnostic et typage de Xanthomonas citri pv. citri aux Comores (INRAPE/CIRAD)
– Typage et exploration de la diversité génétique de Ralstonia solanacearum à Madagascar (FIFAMANOR/ FOFIFA/CIRAD)
– Diversité et diagnostic des Xanthomonas spp. associées à la gale bactérienne de la tomate, piment et poivron dans l’OI (INRAPE/CIRAD)
Renforcement et coordination des pôles de compétences en diagnostic
• Objectifs : établir un réseau fiable dans la zone OI dédié à la surveillance du territoire et à la certification du matériel végétal.
• Missions en 2011-2012 dans les 4 laboratoires ciblés en 2008 visant à:
√ installer et mettre en route le matériel livré en 2008
√ former les personnels à la PCR (Xaa / semences)
√ réaliser un essai interlaboratoire d’aptitude à la réalisation d’une analyse PCR (begomovirus SWIO)
•
• Bilan: √ laboratoires opérationnels (quelques pannes)
√ compétences PCR acquises mais à entretenir
√ problème du coût du diagnostic PCR (consommables)
√ problèmes d’accès à la littérature scientifique et en particulier aux publications relatives aux méthodes de diagnostic
Quelques exemples de méthodes développées
Détection de Xad, reponsable de la bactériose de l’anthurium par Nested–PCR
spécifique sensible
Méthode moléculaire = Nested-PCR
103
Xad/ml
Prélèvements feuilles + pétioles
Broyage
Extraction ADN total
Deux tests de diagnostic mis au point pour détecter la bactérie Xaa dans les semences
d’oignon
441 pb
401 pb
Duplex nested PCR Triplex PCR quantitative
Tests sensibles et spécifiques pour de la certification de
semences d’oignon
4
Adaptation en
un outil plus
portable
3
3P Evaluation puce
Plateforme 3P
2
Fabrication puce plateforme Biopuce
genopole Toulouse
Oligonucléotides
déposés par
micropipettes
robotisées
Cy3
Extraction des ADN
Marquage
Hybridation
Ech. 1
3P Sélection
marqueurs
ADN
diagnostic
Un Microarray (puce) pour le diagnostic de Ralstonia solanacearum
Une validation des méthodes à différentes échelles
• Essai interlaboratoire régional sur une PCR de détection de begomovirus de la zone OI dans les différents pays de la zone OI lors de l’installation de pôles de diagnostic
• Essai interlaboratoire national en cours pour valider la N-PCR et la qPCR bactériose de l’oignon (LDA Martinique, LDA Mâcon, Anses Réunion, Geves Angers)
• Essai interlaboratoire européen pour valider la méthode N-PCR bactériose de l’anthurium: 15 laboratoires impliqués
A. Chabirand, E. Jouen, O. Pruvost, F. Chiroleu, B. Hostachy, M. Bergsma-Vlami, G. Bianchi, L. Cozzolino, J. Elphinstone, M. Holeva, F. Manole, P. Martini, H. Matoušková, J. Minatchy, G. Op de Beeck, F. Poliakoff, L. Sigillo, F. Siverio, J. Van Vaerenbergh, M. Laurentie and I. Robène-Soustrade. Comparative and collaborative studies for the validation of a Nested PCR for the detection of Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae from anthurium samples. Plant pathology. Accepté, publié on line le 17 juin 2013.
Perspectives
• Identification des bioagresseurs dans la zone
nécessitant la mise en place de méthodes de diagnostic
• Développement de méthodes portables , utilisables au champ
Ex : LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)
• Participation plus importante aux tests interlaboratoires des pays de la zone OI
Répartition mondiale de la maladie
Hawaii
Cuba
Brésil Réunion
Afrique du Sud
Taiwan
Venezuela
Floride
Tahiti
Australie
Italie
Hollande
Allemagne
Costa Rica
Antilles
Californie Turquie
•présent dans la plupart des aires de culture de cette aracée
•organisme de quarantaine UE
•A la Réunion depuis 97
Symptômes de la maladie
La bactériose de l’anthurium provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae
Le dépérissement bactérien de l’oignon provoqué par Xanthomonas axonopodis pv. allii
Oignon Hawaii Barbade
Cuba
Brésil Mascareignes
Afrique du Sud
Japon
Venezuela
USA
• Lésions foliaires, pas de mort de la plante
• Diminution du calibre des bulbes-> baisse du rendement
• Transmission par semences
Bactérie du sol très polyphage
Flétrissement bactérien chez + de 250 espèces végétales et 50 familles botaniques
Fort impact économique : Réunion, Madagascar, Mayotte, Afrique du Sud (perte mondiale estimée à 1 milliard par an pour l’industrie de la pomme de terre
Un phytopathogène d’intérêt majeur pour la Réunion et pour le reste du monde
Distribution mondiale
- Organisme de quarantaine aux Etats-Unis et en Europe
- Intérêt des méthodes de diagnostic pour prévenir l’introduction (germe de pomme terre, bouture de géranium...) et la dissémination