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PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM
DEAE -CELULOSE
• Os assuntos abordados nessa aula são:
- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos para separação de
proteinas e para a separação de imunoglobulinas
unespProf. Helio José Montassier
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
Métodos de
purificação
1 proteína
isolada
Proteínas de uma célula
Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas
moléculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que
interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Método de Dosagem de Proteínas das Frações
Gama-Globulinas Precipitadas com Sulfato de
Amônio.
Método de BRADFORD
Cromatografia de Troca Iônica em
DEAE-Celulose para Purificação de
IgG Bovina
2.- Método para preparação da coluna deDEAE–celulose para a
separação de Ig G
2.1.- Materiais
2.1.1- DEAE – celulose previamente embebido e carregado por tratamento
com soluções de ácido (HCl) em seguida álcali (NaOH).
2.1.2- Fração gamaglobulina previamente precipitada com sulfato de
amônio e dialisada com o mesmo tampão de eluição a ser usado na coluna
de DEAE – celulose. A concentração protéica dessa coluna deve ser
previamente determinada.
2.1.3.- Coluna cromatográfica pequena (seringa de 10ml) já montada e
preparada para ser preenchida com DEAE-celulose e acompanhada de
cânulas de pequenas pinças para regulagem do fluxo da coluna.
2.1.4.- Tampão fosfato 0,01M pH 8,0.
2.1.5.- Frascos pequenos de coleta (frascos do tipo penicilina), rotulados
com a numeração de 1 a 15.
2.2.- Método
2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar
abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna
para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e
com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com
muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente
a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a
coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume
de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado
de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir
o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o
fluxo novamente para 12 gotas por minuto.
2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo
apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da
fração com l do reativo.
2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no
comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M
pH 8,0.
2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene
a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.
Gama-Globulina
3ml
12 gotas/min
Assunto 04- figura 01
Co
nce
ntr
açã
o
Tempo ou volume
Coletor de
frações
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo 1
Mais tampão é
colocado na
coluna,
forçando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina
Componentes da
amostra se
separam e saem
da coluna com
diferentes
volumes de
tampão
Tempo 2 Tempo n
Líquido
que sae
da coluna
é
recolhido
em tubos
de um
coletor de
frações
Os componentes da mistura são
separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
• massa molecular
• carga elétrica
• solubilidade
• afinidade
Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em
tampão
Tempo zero
Um cromatograma, como o
gráfico ao lado, é a maneira
usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia.
Cromatografia de troca iônica
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
Eluição
++
+
+
++
+
+
Moléculas com a mesma carga,
ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
mesma carga;
2) eluição das proteínas adsorvidas.
++
+
+
++
+
+
+
++
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a
interação entre as proteínas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
PIácido
+
básico
-neutro
-COOH -COO
-NH3
H+
+
-
H+
-NH2
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico
das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio
ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em
meio alcalino em relação ao seu pI.
Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido
ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o
pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos
aminoácidos ácidos e básicos.
Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo
com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
_
=
=_
+
++++
(+)
(+)
(+)
(+)
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
Não retidas
DEAE++
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
+
(-)
(-)
(-)
+++
_ =
=
_(-)
Não retidas
CM
Tipos de Resina de troca Iônica
Tipos de Resina de troca Iônica
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH2CH2N+(C2H5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
grãos (beads) da
resina com poros grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
tubos
Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
por competição com o ligante livre
Desprezar
proteínas não
retidas
Lavagem
Eluição
pH 2,0 ou sal
Antígeno A
puro
Anti-A
interage
apenas
com a
proteína A
-
Mistura de proteínas
Coluna
empacotada
com esse gel
Partículas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A
Adsorção
Complexo
Ag-AC é
desfeito
Um dos métodos mais
eficientes para a
purificação de proteínas,
possibilitando um alto
rendimento com número
reduzido de etapas.
A separação de
moléculas tem como
base a interação
específica do analito
(molécula-alvo) com um
ligante imobilizado na
matriz. Forças
envolvidas nessa
interação podem ser não
covalentes
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).
Ex: cromatografia de imunoafinidade
Ligante
grupo-específico
Especificidade
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases,
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Sítios de ligação das proteínas
A, G e L à imunoglobulina, que
permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
de afinidade
Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.
A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Reagente Alvo no ligante
Braço espaçador covalente entre
a resina e o ligante
Ligação reversível não covalente
ligante
Molécula-alvo (analito)
Preparo da resina de afinidade:
Passo 1. Ativação da resina
Passo 2. Acoplar
o ligante