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1 MUDANDO DE MÉTODOS DE ANÁLISE AVALIAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DIRCE M.Y.YANO 14.06.10

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MUDANDO DE MÉTODOS DE ANÁLISE

AVALIAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

DIRCE M.Y.YANO

14.06.10

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QUALIDADE EM LABORATÓRIOS DE ENSAIOISO NBR ABNT 17025:2005

“Garantia da Qualidade”

“Conjunto de ações planejadas e sistemáticas para garantir que um produto ou um serviço vai satisfazer os

requisitos da qualidade.”

“Controle de Qualidade”“Conjunto de técnicas e atividades usadas para cumprir

os requisitos da qualidade.

Ações concretas no dia a dia.”

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PORQUE IMPLEMENTAR A ISO?

�Melhorar os processos

�Aumentar segurança

�Melhorar qualidade global

�Aprimorar equipes de trabalho

�Oferecer maior confiança aos cliente

�Diminuir custos operacionais

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REQUISITOS DE GERÊNCIA

ATRIBUIÇÕES E

RESPONSABILIDADES

CONTROLE DE

DOCUMENTOS E

REGISTROS

ORGANIZAÇÃO

RESPONSABILIDADE

SUPRIMENTO DE BENS

AUDITORIAS

NÃO CONFORMIDADES

AÇÕES CORRETIVAS

E PREVENTIVAS

ANÁLISE CRÍTICA

REVISÕES

GESTÃO

LABORATORIAL

ATENDIMENTO AO CLIENTE SERVIÇOS

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REQUISITOS TREQUISITOS TREQUISITOS TREQUISITOS TÉÉÉÉCNICOSCNICOSCNICOSCNICOS

CONFIABILIDADEDOS

RESULTADOS

MÉTODOS DE ENSAIO

CONDIÇÕESAMBIENTAIS

FATORESHUMANOS

EQUIPAMENTOS RASTREABILIDADEMANUSEIO DE

ITENS

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

ABNT NBR ISO/IEC 17025

Elemento 4.6 – Aquisição de serviços e insumos

Requisito 4.6.1 O laboratório deve ter política e procedimentos para seleção e compra de serviços e suprimentos utilizados que afetem a qualidade dos ensaios.Devem existir procedimentos para compra, recebimento e armazenamento de materiais de consumo do laboratório que sejam importantes para os ensaios.

Requisito 4.6.2 O laboratório deve garantir que os suprimentos e materiais de consumo adquiridos que afetem a qualidade dos ensaios não sejam utilizados atéque tenham sido inspecionados ou verificados de alguma outra forma...Devem ser mantidos registros das ações tomadas para verificar a conformidade.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Elemento 4.6 Elemento 4.6 –– AquisiAquisiçção de servião de serviçços e insumosos e insumos

Requisito 4.6.4 O laboratório deve avaliar os fornecedores dos materiais de consumo, suprimentos e serviços críticos que afetem a qualidade de ensaios e calibrações e deve manter registros dessas avaliações, e listar os que foram aprovados.

Requisito 4.6.3Os documentos de aquisição dos itens que afetam a qualidade do resultado do laboratório devem conter dados que descrevam os serviços e suprimentos solicitados.Estes documentos devem ter seu conteúdo técnico analisado criticamente e aprovado antes da liberação.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

AQUISIÇÃO DE INSUMOS

� Aquisição ���� Requisitos ���� Procedimentos

� Registro ���� informações codificação no laboratório

� Controle ���� manutençãoestoque responsável

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

� Desidratados Comercialmente disponíveis

� fornecedor

� avaliação

� validade – lote

� garantia da qualidade

� Formulados

� insumos de qualidade

� pessoal qualificado

� controle de qualidade

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

� Meios prontos para o uso

� Comercialmente disponíveis

� fornecedor

� avaliação

� validade – lote

� controle de qualidade

1010

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

NUTRIÇÃO MICROBIANA

� Os microrganismos realizam reações químicas e organizam as moléculas em estruturas específicas.

� A expressão final dessa organização resulta no crescimento.

Os microrganismos requerem em quantidades diferentes de

macronutrientes e micronutrientes.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

MEIOS DE CULTURA

� Definição

“Formulações de substâncias em forma sólida, líquida ou semi sólida que contêm

constituintes naturais ou sintéticas para promover a multiplicação, crescimento e manter a viabilidade dos microrganismos”.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Quanto à consistência

� Meios líquidos – exemplo: caldo nutriente.

� Meios sólidos – quando acrescentamos um agente solidificante � ágar (carboidrato).

� Meios semi-sólidos – quando acrescentamos menos Agar no meio.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Meios simples

� permitem crescimento de bactérias de fácil crescimento.

Meios enriquecidos

� bactérias de difícil crescimento exigem nutrientes específicos, como adição de vitaminas , ex: biotina, ácido pantotênico.

Quanto à função

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Ágar Baird-Parker

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Ágar m-Endo LES

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Ágar Levine

(Lactose Azul de metileno)

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Ágar Seletivo para Pseudomonas CN

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Ágar XLD

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

� Além de conhecer os meios de cultura, o microbiologista deve também saber como preparar corretamente.

� O êxito do trabalho depende não somente da escolha do meio de cultivo, mas também das condições físicas de cultivo (fatores ambientais) que são diferentes entre os microrganismos.

� Praticamente, a grande maioria dos meios comercialmente disponíveis (usados na rotina do laboratório) se encontram sob a forma de pó, granulados, desidratados, tornando fácil o seu preparo.

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Norma ISO 11133-1/2009 e 11133-2/2004

Parâmetros

� Checagem do pH

� Produtividade

� Seletividade

Tipos de Meios de Cultura

� Sólido

� Semi sólido

� Líquido

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Método

� Quantitativo

� Qualitativo

� Os métodos devem ser escolhidos pelo laboratório, baseados em técnicas aceitas.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

�� Meios sMeios sóólidos, semi slidos, semi sóólidos ou llidos ou lííquidos devem ser quidos devem ser inoculados com uma alinoculados com uma alííquota de microrganismos quota de microrganismos alvo (positivo) e não desejado (negativo).alvo (positivo) e não desejado (negativo).

�� As diluiAs diluiçções devem ser preparadas a partir de ões devem ser preparadas a partir de culturas de trabalho.culturas de trabalho.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Culturas de Trabalho Culturas de Trabalho -- Contagem de cContagem de céélulaslulas

•• A partir da cultura de trabalho (24h), utilizando a escala de MA partir da cultura de trabalho (24h), utilizando a escala de MacFarland acFarland (0,5) = 10(0,5) = 108.8.

•• Preparar os tubos de diluiPreparar os tubos de diluiçção (diluião (diluiçção decimal seriada) atão decimal seriada) atéé 1010--88..

•• Semear 1mL das 5 Semear 1mL das 5 úúltimas diluiltimas diluiçções em profundidade em placas estões em profundidade em placas estééreis.reis.

•• Distribuir aproximadamente de 15 a 20mL de Distribuir aproximadamente de 15 a 20mL de ÁÁgar PCA previamente gar PCA previamente resfriado e mantido a (46 resfriado e mantido a (46 ±± 1)1)ººC. (fazer duplicata).C. (fazer duplicata).

•• Homogeneizar bem. Deixar solidificar.Homogeneizar bem. Deixar solidificar.

•• Incubar as placas em posiIncubar as placas em posiçção invertida na temperatura apropriada do ão invertida na temperatura apropriada do microrganismo por 24h.microrganismo por 24h.

•• Fazer as contagens dentro do limite de especificaFazer as contagens dentro do limite de especificaçção de contagem.ão de contagem.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Meios seletivos e não seletivosMeios seletivos e não seletivos

QuantitativoQuantitativo

Meios sólidos � Inoculação em profundidade

Inoculação em superfície

� Após a incubação, contar as colônias das placas da diluição que proporcionar contagem entre os limites especificados pelo método.

� A contagem será sempre na mesma diluição para os dois meios (avaliação e de referência).

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� Meios SólidosInoculação em superfície

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

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� Meios SólidosInoculação em profundidade (pour plate)

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

CCáálculo da Produtividade (P)lculo da Produtividade (P)

•• Para calcular a produtividade Para calcular a produtividade a contagem devera contagem deveráácorresponder corresponder àà mesma mesma diluidiluiçção para os dois meios.ão para os dois meios.

P = NA / NRP = NA / NR

•• NA= nNA= núúmero total de colônias mero total de colônias obtidas no Meio de Avaliaobtidas no Meio de Avaliaçção.ão.

•• NR= nNR= núúmero total de colônias mero total de colônias obtidas no Meio de Referência.obtidas no Meio de Referência.

ExemploExemplo

�� Meio de AvaliaMeio de Avaliaçção= 200 ufc/mL ão= 200 ufc/mL na diluina diluiçção (ão (--6)6)

�� Meio de Referência= 250 ufc/mL Meio de Referência= 250 ufc/mL na diluina diluiçção (ão (--6)6)

P= (200 / 250) = 0,8 P= (200 / 250) = 0,8

�� A produtividade pode ser A produtividade pode ser expressa em porcentagem (%).expressa em porcentagem (%).

A Produtividade de um meio deve ser ≥0,7 por microrganismo, que pode crescer facilmente no meio.

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MEIOS SELETIVOS E NÃO SELETIVOSMEIOS SELETIVOS E NÃO SELETIVOS

QualitativoQualitativo

Meios líquidos

�� Inocular 1mL de cada diluiInocular 1mL de cada diluiçção: 10ão: 10--44,, 1010--55,, 1010--6 6 ,, 1010--7 7 e 10e 10--88 ..

�� Incubar os tubos na temperatura e tempo adequados para Incubar os tubos na temperatura e tempo adequados para cada microrganismo.cada microrganismo.

�� ApApóós a incubas a incubaçção observar a maior diluião observar a maior diluiçção com crescimento ão com crescimento (turva(turvaçção do meio).ão do meio).

AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

CCáálculo da produtividade (P) lculo da produtividade (P) P = DA / DR

DA= diluiDA= diluiçção com turbidez no Meio de Avaliaão com turbidez no Meio de Avaliaççãoão

DR= diluiDR= diluiçção com turbidez no Meio de Referênciaão com turbidez no Meio de Referência

ExemploExemplo

�� Meio de AvaliaMeio de Avaliaçção = 8 (ão = 8 (úúltima diluiltima diluiçção com turvaão com turvaçção: ão: -- 8)8)

�� Meio de Referência = 10 (Meio de Referência = 10 (úúltima diluiltima diluiçção com turvaão com turvaçção: ão: --10)10)

TP =TP = 8 8 = 0,8= 0,8

1010

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

�� Para o mPara o méétodo qualitativo,o crescimento do todo qualitativo,o crescimento do microrganismo não desejado (negativo) no meio microrganismo não desejado (negativo) no meio seletivo deve ser a inibiseletivo deve ser a inibiçção de crescimento.ão de crescimento.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

Método qualitativo com um tubo ou um frasco

�� Inocular com alInocular com alçça de 1a de 1µµL, o microrganismo alvo L, o microrganismo alvo diretamente no meio a ser avaliado.diretamente no meio a ser avaliado.

�� Fazer o mesmo com microrganismo não desejado.Fazer o mesmo com microrganismo não desejado.

�� Leitura Leitura �� VisualVisual

�� ResultadoResultado�� 0 0 �� sem turbidezsem turbidez

�� 1 1 �� pouca turbidezpouca turbidez

�� 2 2 �� bem turvobem turvo

O valor para microrganismo alvo deve ser 2.O valor para microrganismo alvo deve ser 2.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURACálculo do Índice de Crescimento Absoluto (ICA)

� Dividir a placa em quadrantes e identificar com a numeração 1, 2, 3, 4 e um traço no centro da placa correspondente ao número 5.

�Preparar a suspensão do inóculo a 108UFC/mL.

�Proceder da mesma forma na placa com meio de referência.

Cálculo= Cada estria é dado um valor de 0,2. Multiplicar pelo número de estrias com crescimento.

�Crescimento na estria central é dado o valor de 1.

Cálculo do Índice de Crescimento Relativo (ICR)

�O ICR para um determinado microrganismo é a comparação entre o ICA do meio em avaliação e o ICA do meio de referência.

� Avaliação���� Para todos os microrganismos em um meio de avaliação o ICA deve ser maior ou igual a 3,5.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

•• Exemplo de formulExemplo de formuláário de Avaliario de Avaliaçção de Meio de Culturaão de Meio de Cultura

MR= meio de referênciaMR= meio de referência

AN= AN= áágar nutrientegar nutriente

Meio Tipo Função Incubação Microrg.

Controles

MR Método Critério Caract.

BairdBaird--

ParkerParker SSóólidolido

ProdutividadeProdutividade 24h24h--48h 48h (35 (35 ±± 2)2)ººCC

S. aureusS. aureus

ATCC ATCC 2592325923

TSATSA QuantitativoQuantitativo >70%>70% ColôniasColônias

NegrasNegras

HaloHalo

SeletividadeSeletividade 48h48h

(35 (35 ±± 2)2)ººCCE. coliE. coli

ATCC ATCC 2592225922

ANAN QualitativoQualitativo InibiInibiççãoão --

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

QUALIDADE DA QUALIDADE DA ÁÁGUAGUA

�� ReservatReservatóório de rio de áágua gua �������� conservaconservaçção, higienizaão, higienizaççãoão

�� Deionizador , Osmose Reversa Deionizador , Osmose Reversa �������� controles controles ��������registro.registro.

�� Controles Controles �������� microbiolmicrobiolóógico e fgico e fíísicosico--ququíímico.mico.

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AVALIAAVALIAÇÇÃO DE MEIOS DE CULTURAÃO DE MEIOS DE CULTURA

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REFERÊNCIAS

�� Brasil, MinistBrasil, Ministéério da Agricultura, Pecurio da Agricultura, Pecuáária e do Abastecimento. Secretaria ria e do Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecude Defesa Agropecuáária. ria. InstruInstruçção Normativa não Normativa nºº62 de 62 de 26/08/03.M26/08/03.Méétodos Analtodos Analííticos Oficiais para Anticos Oficiais para Anáálises Microbiollises Microbiolóógicas gicas para Controle de produtos de Origem Animal e para Controle de produtos de Origem Animal e ÁÁguagua. Bras. Brasíília, 2003.lia, 2003.

�� EA/EURACHEM EA/EURACHEM –– EAEA--04/10. 04/10. Accreditation for Microbiological Accreditation for Microbiological LaboratoriesLaboratories. 2002.. 2002.

�� ABNT NBR ISO/IEC 17025ABNT NBR ISO/IEC 17025-- Requisitos Gerais para a Competência de Requisitos Gerais para a Competência de LaboratLaboratóórios de Ensaio e Calibrarios de Ensaio e Calibraçção.ão. 2005.2005.

� ISO. International Standard. ISO3696. Water for Analytical Laboratory Use – Specifications and Test Methods. 1987.

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REFERÊNCIAS

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Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture mediamedia. ISO 11133. ISO 11133--2004.2004.

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REFERÊNCIAS

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