n khoa h c vÀ cÔng ngh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

TRẦN VŨ THIÊN

PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP

HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG

TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP.Hồ Chí Minh – 2021

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: TSKH. Hoàng Ngọc Anh

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Phùng Văn Trung

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …

Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa

học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng

… năm 201….

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

3

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Các độc tố tự nhiên từ cây cỏ, nấm, sinh vật biển, ốc sên hoặc động vật có một vai trò quan trọng

trực tiếp hoặc gián tiếp trong sự phát triển thuốc.

Nọc độc động vật chứa nhiều độc tố nhằm để săn mồi hoặc tự vệ. Rất khó để có thể xác định chính

xác loại nọc độc hoặc số lượng độc tố nó tạo ra. Nọc độc động vật và độc tố của nó (từ rắn, bò cạp, rết, ốc,

thằn lằn, ếch, cá và côn trùng) đã được khảo sát để tìm ra hoạt tính sinh học và khả năng trị liệu của nó.

Những độc tố đó đã được chỉ ra là thể hiện nhiều hoạt tính dược học như: gây độc cơ, độc thần kinh, hạ

huyết áp, xuất huyết, ức chế sự kết tập tiểu cầu, chống đông máu, kháng viêm, giảm đau, kháng ung thư và

diệt khuẩn. Bakhle đã cho thấy thuốc Catopril được tạo thành từ nọc loài rắn Brazil, Bothrops juraraca, nổi

lên như thuốc kiểm soát hạ huyết áp và trụy tim khi bị nhồi máu cơ tim. Cobrotoxin được phân lập từ loài rắn

hổ mang Đài Loan, Naja naja atra , được cho là có ảnh hưởng làm giảm đau. Hanalgesin, một độc tố thần

kinh alpha (α-neurotoxin) dây dài từ loài rắn hỗ chúa (King Cobra) thể hiện hoạt tính giảm đau trên chuột, nó

tạo ra giảm đau ở nổng độ 16-32 ng/g mà không gây ra nhiều tác dụng phụ lên thần kinh hay cơ. Crotamine

cũng được báo cáo là có ảnh hưởng làm giảm đau ở nồng độ thấp nhưng không rõ ràng trong độc tính in

vivo. Ảnh hưởng gây giảm đau của Crotamine cao hơn Morphin khoảng 30 lần và được chứng minh là liên

quan đến cả cơ chế giảm đau trung ương và ngoại biên. Batroxobin, một enzym từ nọc loài rắn Bothrops

atrox (loài rắn lục tìm thấy ở Nam và Trung Mỹ) có đặc tính giống huyết khối có khả năng cầm máu ở nồng

độ thấp và chống đông máu ở nồng độ cao.

Hoạt tính giảm đau cũng được chứng minh từ nọc bò cạp và những độc tố peptide của nó. Peptide có

hoạt tính giảm đau-kháng khối u từ nọc bò cạp Bothus martense thể hiện tính ức chế mạnh trên cả đau nội

tạng và ngoài da cũng như hoạt tính kháng khối u trên khối u E. ascites và tế bào xơ hóa S-180. Những độc

tố beta (β-toxins) từ nọc bò cạp cũng được sử dụng như công cụ dược lý trong nghiên cứu việc kích hoạt điện

áp kênh ion Na+.

Cardiotoxin 3 (CTX 3), một polypeptide chứa 60 amino axit với hoạt tính kháng ung thư được phân

lập từ rắn Naja naja atra. CTX 3 ức chế sự phát triển của dòng tế bào K562 phụ thuộc vào nồng độ và thời

gian khảo sát. Một độc tố protein bền nhiệt (drCT-I) có KLPT 7.2 kDa được phân lập từ loài rắn lục Ấn Độ

(Daboia russelli russelli) có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào chết theo chương trình apoptosis.

Phospholipase A2 (PLA2), được phân lập từ nọc loài Bothrops newweidii có hoạt tính gây độc tế bào trên

dòng tế bào gây khối u ác tính B16 F10. Nọc độc từ loài bò cạp đen Heterometrus bengalensis ức chế sự phát

triển của dòng tế bào U937 và K562. Chlorotoxins lần đầu tiên được phân lập từ nọc của loài bò cạp Leiurus

quinquestriatus, có độc tính trên dòng tế bào khối u não, nó có thể liên kết với nhiều khối u não trước khác

nhau với tính đặc hiệu trên 90%. Bengalin, một protein có KLPT cao được tách từ nọc bò cạp đen Ấn Độ

Heterometrus bengalensis cũng thể hiện hoạt tính kháng ung thư trên dòng tế bào U937 và K562.

Xuất phát từ những dược tính nêu trên và nhằm tìm ra các hợp chất có khả năng trị liệu hiệu quả để

phát triển việc điều chế thuốc mới trong tương lai, nên luận án này tập trung vào nghiên cứu phân lập và xác

định cấu trúc của một số chất mới từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus (phân bố ở An Giang) và từ nọc rắn

cạp nong Bungarus fasciatus (phân bố ở Vĩnh Phúc).

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

4

Nghiên cứu phân lập, khảo sát hoạt tính và xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính chống

đông máu từ nọc bò cạp H. laoticus và một số hợp chất có hoạt tính giảm đau và kháng tăng sinh tế bào ung

thư từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus, nhằm ứng dụng trong y dược.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

Phân lập và làm sạch một số hợp chất mới từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus.

Khảo sát hoạt tính chống đông máu, giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thư của nọc toàn phần, và

các phân đoạn tách ra từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus.

Xác định cấu trúc của một số hợp chất có hoạt tính sinh học đã được làm sạch bằng phương pháp

cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

Trình bày tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế về nọc bò cạp và nọc rắn cùng một số

phương pháp được sử dụng để phân lập, làm sạch và xác định cấu trúc bậc một của toxin, peptide, protein tách

ra từ nọc bò cạp và nọc rắn.

CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là nọc bò cạp đen H. laoticus (An Giang) và nọc rắn cạp nong B. fasciatus

(Vĩnh Phúc).

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu và thực nghiệm

2.2.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus và rắn cạp nong B. fasciatus

Hình 2.1. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H. laoticus

5

Hình 2.2. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus

2.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học

Khảo sát hoạt tính của các phân đoạn và toxin, protein tách ra trên các mô hình: hoạt tính đông-chảy

máu trên mô hình cắt đuôi chuột của Barker [99], Liu [100]; Tác động giảm đau ngoại biên được nghiên

cứu bằng mô hình đau quặn bằng acid acetic của Koster [103]; Tác động giảm đau trung ương được nghiên

cứu bằng mô hình (kích thích nhiệt) nhúng đuôi chuột của Lanhers và Williamson [103]; Khảo sát khả năng

gây độc tế bào ung thư lên tế bào ung thư vú MCF7 và ung thư phổi A549 theo phương pháp khảo nghiệm

MTT của Tim Mosmann [104- 106].

2.2.3. Phân tích thống kê kết quả

Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (Standard error of mean: sai

số chuẩn của giá trị trung bình). Phần mềm sử dụng thống kê là Minitab 14.0, các biểu đồ được vẽ bằng phần

mềm SigmaPlot 11.0. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05 (độ tin cậy là 95%).

2.2.4. Xác định cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học

KLPT và cấu trúc của các chất có hoạt tính chống đông máu tách ra từ nọc bò cạp H.laoticus được xác

định bằng phương pháp khối phổ (ESI-MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và

13C-NMR)

KLPT và trình tự amino acid của các protein tách ra từ nọc rắn B.fasciatus được xác định bằng phương

pháp khối phổ MALDI-TOF/TOF-MS, HR-ESI-MS/MS, hệ RP-HPLC ghép nối hệ Q Exactive HF Benchtop

Orbitrap MS/MS.

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN

3.1. Kết quả về bò cạp H. laoticus

3.1.1. Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H. laoticus

Từ nọc bò cạp H. laoticus thô, tiến hành chạy sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu được 5 phân đoạn

(PĐ1 - PĐ5) với sắc ký đồ như Hình 3.1.

6

Hình 3.1. Sắc ký đồ của nọc bò cạp H.laoticus

Khối lượng chạy sắc ký lọc gel của từng phân đoạn sau khi đông khô được thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Khối lượng 5 phân đoạn nọc bò cạp H. laoticus sau khi chạy lọc gel

Phân đoạn Lượng nọc

thu được (mg)

% từng phân đoạn/ tổng

lượng nọc thu được

1 (PĐ1) 66,700 4,348

2 (PĐ2) 126,200 8,227

3 (PĐ3) 188,200 12,269

4 (PĐ4) 451,200 29,415

5 (PĐ5) 701,600 45,740

Trong 5 phân đoạn thu được, phân đoạn 5 (PĐ5) chiếm tỷ lệ cao nhất với 45,740%, kế đến là phân

đoạn 4 là 29,415%.

Qua kết quả sắc ký lọc gel cùng với kết quả khảo sát tác động chống đông máu của năm phân đoạn

(PĐ1 – PĐ5) ở hai liều thử nghiệm là 1/10 LD50 và 1/20 LD50 (PL2) [9] cho thấy, trong 5 phân đoạn (PĐ1 –

PĐ5) thì có ba phân đoạn có tác động đến quá trình đông – chảy máu là các phân đoạn: PĐ2, PĐ4 và PĐ5

(Bảng 3.2 và 3.3). Do phân đoạn 5 có hàm lượng nhiều và KLPT tương đối nhỏ nên trong nghiên cứu này đã

chọn phân đoạn 5 để tiếp tục phân lập và làm sạch nhằm xác định hoạt chất chính trong các phân đoạn thứ

cấp được tách ra bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) và khảo sát tác động

chống đông máu của chúng trên chuột.

3.1.2. Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)

Quá trình phân tách phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)

với các thông số của quá trình chạy sắc ký:

- Tốc độ dòng : 2 mL/phút.

- Thể tích mỗi lần tiêm mẫu : 100 µL

- Thời gian rửa giải : 0 – 35% dung môi B trong 70 phút.

- Mật độ quang tại bước sóng : 226 nm.

- Cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm).

Với điều kiện trên, từ phân đoạn 5 đã phân tách thành 24 phân đoạn thứ cấp (Hình 3.2).

Các phân đoạn thứ cấp này được thu lại, đông khô và bảo quản để khảo sát tác động đông - chảy máu

trên chuột.

7

Hình 3.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) trên cột XDB - C18 (9,4 × 250 mm, 5 µm) của

phân đoạn 5 (PĐ5) nọc bò cạp

3.1.3. Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông -

chảy máu

24 phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 thu được sau khi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-

HPLC) được sử dụng để khảo sát tác động chống đông – chảy máu.

Qua kết quả khảo sát cho thấy, trong 24 phân đoạn thứ cấp tách ra từ phân đoạn 5 thì có 6 phân đoạn

thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 gây ra thời gian chảy máu và thời gian đông máu dài hơn so với chất

chứng (PL5), nghĩa là 6 phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 này có hoạt tính tác động lên quá

trình đông - chảy máu. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và 3.5.

Bảng 3.4. Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5

Mẫu

Thời gian khảo sát (phút)

20 30 60 90 120

Thời gian chảy máu (giây)

Chứng 64,00±3,06 27,00±0,97 67,00±3,25 69,00±5,78 80,50±2,72

PĐ 5.5 210,00±4,83 41,30±7,90 19,00±1,26 9,67±2,11 12,00±0,37

PĐ 5.10 125,00±4,91 85,00±6,66 18,00±0,52 88,50±5,49 40,00±7,06

PĐ 5.11 123,33±9,82 43,00±4,05 76,70±4,98 36,70±3,21 19,67±3,47

PĐ 5.16 139,00±5,50 54,67±3,75 16,67±1,52 46,00±5,13 30,33±4,40

PĐ 5.19 102,70±4,67 43,00±5,52 35,70±3,15 36,30±3,84 90,33±4,01

PĐ 5.22 180,00±7,42 37,70±3,44 18,00±1,71 53,33±0,56 22,33±2,09

8

Hình 3.3. Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5 lên thời gian chảy máu

Bảng 3.4 và hình 3.3 cho thấy: Các phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian chảy máu trên chuột

theo chiều giảm dần sau: 5.5 > 5.22 > 5.16 > 5.10 > 5.11 > 5.19, trong đó phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời

gian chảy máu nhiều nhất, gấp 3,3 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.5: 210,00 giây, lô chứng: 64,00 giây),

kế sau phân đoạn 5.5 là phân đoạn 5.22 gây ra thời gian chảy máu gấp 2,8 lần so với lô chứng (phân đoạn

5.22: 180,00 giây, lô chứng: 64,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19 gây ra thời gian chảy máu thấp nhất, gấp

1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 102,70 giây, lô chứng: 64,00 giây).

Bảng 3.5. Thời gian đông máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính từ PĐ5

Mẫu


20 30 60 90 120

Thời gian đông máu (giây)

Chứng 293,00±3,82 287,50±6,88 371,50±0,67 268,50±5,33 366,00±9,34

PĐ 5.5 458,70±9,73 360,33±1,93 341,30±8,59 383,70±8,42 284,30±1,86

PĐ 5.10 630,50±6,35 410,00±3,61 431,00±8,05 400,50±5,36 369,50±2,28

PĐ 5.11 409,00±6,73 427,70±8,27 405,00±6,08 367,30±8,03 266,33±4,51

PĐ 5.16 481,00±6,78 381,30±2,26 424,00±7,72 368,00±5,54 395,00±3,39

PĐ 5.19 470,00±7,89 498,00±5,70 531,00±6,35 445,00±4,23 403,00±7,33

PĐ 5.22 563,70±7,46 372,30±4,44 322,30±8,53 302,33±3,84 373,70±4,63

Thời

gian

chảy

máu

(giây)


9

Hình 3.4. Tác động của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính của PĐ5 lên thời gian đông máu

Bảng 3.5 và hình 3.4 cho thấy: phân đoạn thứ cấp 5.5 gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với

lô chứng (phân đoạn 5.5: 458,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn 5.22 gây ra thời gian đông máu

gấp 1,9 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.22: 563,70 giây, lô chứng: 293,00 giây), phân đoạn thứ cấp 5.19

gây ra thời gian đông máu gấp 1,6 lần so với lô chứng (phân đoạn 5.19: 470,00 giây, lô chứng: 293,00 giây).

3.1.4. Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22

Sau khi khảo sát tác động lên quá trình đông – chảy máu của các phân đoạn thứ cấp tách từ phân

đoạn 5 thì kết quả thu được là có 6 phân đoạn thứ cấp ảnh hưởng đến thời gian đông - chảy máu trên chuột

là: 5.5; 5.10; 5.11; 5.16; 5.19 và 5.22. Do phân đoạn 5.5 và 5.22 có hoạt tính chống đông máu mạnh hơn các

phân đoạn còn lại (đã khảo sát ở mục 3.1.3) nên được chọn để tiếp tục tiến hành làm sạch, xác định hoạt chất

chính của hai phân đoạn này và khảo sát thêm hoạt tính chống đông máu.

3.1.4.1. Làm sạch phân đoạn 5.5

Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.5 với các thông số của quá trình chạy sắc ký:





- Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm).

Hình 3.5. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.5

Thời

gian

đông

máu

(giây)


10

Tiến hành chạy mẫu thì phân đoạn 5.5 có phân đoạn chính là 5.5.1. Tiếp tục làm sạch phân đoạn

5.5.1 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.5 thu được toxin 5.5.1 có sắc ký đồ là:

Hình 3.6. Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.5.1

3.1.4.2. Làm sạch phân đoạn 5.22

Quá trình làm sạch phân đoạn thứ cấp 5.22 với các thông số của quá trình chạy sắc ký:





- Cột XDB - C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm).

Hình 3.7. Sắc ký đồ RP-HPLC của phân đoạn thứ cấp 5.22

Khi chạy sắc ký làm sạch thì phân đoạn 5.22 có phân đoạn chính là 5.22.3. Tiếp tục làm sạch phân

đoạn 5.22.3 với điều kiện tương tự như phân đoạn 5.22 thu được toxin 5.22.3 có sắc ký đồ là:

Hình 3.8. Sắc ký đồ RP-HPLC của chất có hoạt tính chống đông máu 5.22.3

11

Hai toxin 5.5.1 và 5.22.3 thu được sau quá trình chạy sắc ký RP-HPLC sẽ tiếp tục được khảo sát

thêm hoạt tính chống đông máu.

3.1.5. Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và toxin 5.5.1, toxin 5.22.3, 5.21.1 (dipeptide Leu –

Trp)

Sau khi làm sạch được các hợp chất: 5.5.1, 5.22.3, tiến hành khảo sát hoạt tính chống đông máu của

những chất này cùng với chất 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp, do tác giả Võ Đỗ Minh Hoàng phân lập được cũng

từ bò cạp H. laoticus nhưng từ phân đoạn 5.21 [8]) cùng với phân đoạn 5. Kết quả cho thấy:

● Cả 5.5.1, 5.22.3 và 5.21.1 (dipeptide Leu-Trp) đều thể hiện hoạt tính chống đông máu (Bảng 3.6):

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình đông máu ở chuột

Mẫu

Thời gian sau khi tiêm (phút)

20 30 60 90 120


Chứng 307,7±17,4 290,67±9,58 286,00±6,31 256,3±20,4 229,7±13,2

PĐ 5 422,3± 8,4 * 391,7±48,1 * 387,5±35,0 360,2± 6,5 358,8±26,6 *

5.5.1 442,5±20,6 ** 426,2±25,6 ** 366,2±25,0 ** 428,3±51,1 296,3±37,4

5.21.1 (Leu-

Trp) 401,5±31,2 340,8±29,1 300,3± 2,1 460,5±41,7 313,3±24,9 *

5.22.3 556,5±87,2 ** 426,2± 3,7 * 388,0±46,3 * 367,0±25,5 * 261,8±16,4

* p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng

- 5.5.1 liều 2,48 mg/kg (1/5 LD50 12,4 mg/kg) có thời gian đông máu dài hơn lô chứng trong suốt

thời gian thử nghiệm. Trong đó, ở các thời điểm điểm 20, 30, 60 phút , 5.5.1 có thời gian đông máu dài hơn

có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Ở thời điểm 90 và 120 phút, 5.5.1 có thời gian đông máu dài hơn lô

chứng nhưng sự khác biệt này chưa có ý nghĩa thống kê.

- 5.22.3 ở liều 2,48 mg/kg có thời gian đông máu dài hơn nhóm chứng và có ý nghĩa thống kê trong

suốt 120 phút thử nghiệm.

- 5.21.1 (Leu-Trp) ở liều 2,48 mg/kg có thời gian đông máu dài hơn lô chứng (nhưng ngắn hơn 5.5.1

và 5.22.3) trong suốt thời gian thử nghiệm. Tuy nhiên, tại thời điểm 120 phút, 5.21.1 (Leu-Trp) có thời gian

đông máu dài hơn có ý nghĩa thống kê so với lô chứng.

● Về thời gian chảy máu: cả 5.5.1, 5.21.1 (Leu-Trp) và 5.22.3 đều thể hiện khả năng kéo dài thời

gian chảy máu tốt hơn so với lô chứng tương tự như thời gian đông máu (Bảng 3.7).

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất khảo sát lên quá trình chảy máu ở chuột.

Mẫu


20 30 60 90 120


Chứng 79,5 ± 13,7 43,33±1,94 45,83 ± 3,95 40,67 ± 5,02 49,67 ± 7,85

PĐ 5 386,2± 88,7 * 187,0±64,6 * 86 ± 2,38 119,3 ± 29,2 * 183± 80,7

5.5.1 248,2± 66,7 *

314 ±58,6 *

146,7 ± 46,0 *

65 ± 14,5 40,2± 10,3

5.21.1 (Leu-

Trp) 314,5 ± 85,2 *

84,8 ±16,7 81,2 ± 15,4 61,8 ± 14,8 68,8 ±16,4

5.22.3 233,0 ± 30,6 ** 179,0 ± 41,4 * 218,7 ± 78,5 **

151,5 ± 57,4 83,8 ± 13,7


Sau quá trình khảo sát thì 5.22.3 là hợp chất có hoạt tính chống đông máu tốt trong số các hợp chất

cùng khảo sát (5.22.3 kéo dài thời gian đông máu có ý nghĩa thống kê sau 90 phút tiêm mẫu). Tiếp theo tiến

12

hành khảo sát thêm hoạt tính đông - chảy máu của 5.22.3 ở thời gian ngắn hơn, đó là ngay sau khi tiêm mẫu

(phút 0), kết quả được thể hiện ở bảng 3.8 và 3.9:

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu

Mẫu


0 5 10 20 30 60 90 120


5.22.3 384,5 ±

68,2**

176,8 ±

34,7**

120,7 ±

13,8**

113,8

± 15,4*

101,0 ±

13,0*

83,33 ±

7,28*

67,83 ±

5,85*

59,17

± 5,79

Chứng 84,33 ±

4,72

75,83 ±

2,88

71,00 ±

4,57

67,83

± 2,59

64,33 ±

2,75

60,50 ±

3,37

46,83 ±

2,63

41,67

± 7,83


Bảng 3.9. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu

Mẫu


0 5 10 20 30 60 90 120


5.22.3

549,7

±

40,2**

428,5

±

25,0*

421,5

±

14,0**

392,8

±

23,2**

397,8

±

24,1**

367,7

±

27,9*

335,3

±

14,2**

317,2

±

22,9**

Chứng 337,0

± 12,3

306,2

± 26,9

291,7

± 13,9

282,50

± 9,98

281,5

± 14,7

279,5

± 13,1

240,17

± 6,97

232,83

±

5,62


Ảnh hưởng mạnh của 5.22.3 lên thời gian chảy máu sau 10 phút đầu tiên sau khi tiêm mẫu và mạnh

nhất là ngay sau khi vừa tiêm mẫu xong (phút 0) và ảnh hưởng này kéo dài mang tính thống kê đến phút 90

so với lô chứng (Bảng 3.8, hình 3.9).

Hình 3.9. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu.

Sự sai khác có ý nghĩa thống kê: * p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng.

Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu kéo dài suốt 120 phút khảo sát. Ảnh hưởng mạnh nhất

của 5.22.3 lên thời gian đông máu là ngay sau khi vừa tiêm mẫu xong (phút 0) và ảnh hưởng này kéo dài

mang tính thống kê đến phút 120 so với lô chứng (Bảng 3.9, hình 3.10).

13

Hình 3.10. Ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian đông máu.

Sự sai khác có ý nghĩa thống kê: * p <0,05; ** p <0,01 so với nhóm chứng

Như vậy, tác động của 5.22.3 lên thời gian đông – chảy máu cao nhất là ngay sau khi vừa tiêm mẫu

(phút 0). Ngoài ra có sự khác biệt lớn trong suốt thời gian khảo sát, điều này có thể xảy ra do tác động của

5.22.3 bị giảm theo thời gian (Bảng 3.8 và 3.9; Hình 3.9 và 3.10).

Mặt khác, kết quả ảnh hưởng của 5.22.3 lên thời gian chảy máu lớn hơn nhiều thời gian đông máu

ngay sau khi vừa tiêm mẫu (phút 0) (thời gian chảy máu tăng 4,6 lần so với chứng còn thời gian đông máu

tăng 1,6 lần so với chứng) (Hình 3.9, 3.10). Tại phút 20 thì 5.22.3 tăng thời gian chảy máu 2,9 lần so với

chứng còn thời gian đông máu tăng 1,8 lần so với chứng.

Như vậy, sau quá trình khảo sát hoạt tính đông – chảy máu thì 5.22.3 là hợp chất có hoạt tính chống

đông máu tốt nhất sau 60 phút trong số các hợp chất cùng khảo sát: 5.22.3 kéo dài thời gian có ý nghĩa

thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian chảy máu tăng 4,8 lần còn thời gian đông máu tăng 1,4 lần so với

nhóm chứng); tương tự 5.5.1 cũng kéo dài thời gian có ý nghĩa thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian

chảy máu tăng 3,2 lần còn thời gian đông máu tăng 1,3 lần so với nhóm chứng). Còn 5.21.1 kéo dài thời

gian nhưng không có ý nghĩa thống kê sau 60 phút tiêm mẫu (thời gian chảy máu tăng 1,8 lần còn thời gian

đông máu tăng 1,1 lần so với nhóm chứng).

3.1.6. Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.5.1 và 5.22.3) bằng MS và NMR

3.1.6.1. Cấu trúc của toxin 5.5.1

Sau khi đã làm sạch được toxin 5.5.1 có hoạt tính chống đông máu, tiếp theo tiến hành xác định

KLPT bằng phổ khối lượng phun sương điện (ESI-MS) trên máy LCQ DECA XP+ MS (Thermo Finnigan,

United States). Theo dữ liệu khối phổ, KLPT của 5.5.1 là 267,867 Da (Hình 3.11) gần bằng với KLPT của

Adenosine (267,2 Da), bên cạnh đó 5.5.1 được tiến hành đo thêm phổ 1H-NMR và

13C-NMR để xác định

chính xác cấu trúc.

14

Hình 3.11. Phổ MS của 5.5.1

Phổ NMR của 5.5.1 (PL6)

Để xác định cấu trúc của toxin 5.5.1 thì 5.5.1 được đo phổ 1H-NMR và

13C-NMR với dung môi DMSO-d6

trên máy cộng hưởng từ hạt nhân 500 MHz (Bruker AM500 FT-NMR). Thu được kết quả phổ 1H-NMR và

13C-NMR của 5.5.1 cùng với số liệu phổ tham khảo của Adenosine từ nguồn HMDB, BMRB và

ChemicalBook như Bảng 3.10.

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.5.1 và hợp chất tham khảo

C

(Số)

5.5.1

Hợp chất tham khảo

Adenosine

[PL7] Adenosine

[PL8] Adenosine

[PL9]

δCa,b

δHa,b

δCc,d

δHa,e

δCf,e

δHf,b

δCc,b

δHc,b

2 152,3 8,33(s) 152,0 8,38 155,2 8,28 (s) 155,3 8,19

4 149,0 148,9 151,1 151,2

5 119,3 119,6 121,8 121,9

6 156,1 155,4 158,4 158,4

8 139,8 8,13 (s) 141,4 8,16 143,2 8,11 (s) 143,3 8,31

1’ 87,8 5,87 (d) 88,9 5,90 90,9 6,02 (d) 91,0 6,05

2’ 73,3 4,61(q) 74,3 4,64 76,4 4,80 (s) 73,4 4,43

3’ 70,6 4,14 (m) 71,0 4,17 73,3 4,43 (dd) 76,4 4,79

4’ 85,8 3,96 (q) 86,2 3,99 88,4 4,30 (q) 88,6 4,29

5’ 61,6 3,55 (m);

3,65 (m) 62,0

3,58

3,69 64,2

3,94 (dd)

3,85 (dd) 64,2

3,88

3,88

6-NH2 7,31 (s) 7,41

2’-OH 5,40 (m) 5,51

3’-OH 5,41 (m) 5,24

5’-OH 5,14 (d) 5,48 a,c,f

đo trong DMSO-d6, D2O, H2O; b,d,e

500 MHz, 50MHz, 400MHz.

[PL7]: Tham khảo dữ liệu phổ từ ChemicalBook.

[PL8]: Tham khảo dữ liệu phổ từ HMDB (Human Metabolome Database).

[PL9]: Tham khảo dữ liệu phổ từ BMRB (Biological Magnetic Resonance Data Bank).

Phổ 1H-NMR cho thấy: các proton ở δH: 3,0 – 4,5 ppm (-O-C-H) là H-C-2’, H-C-3’, H-C-4’, H-C-5’;

0,5 – 6,0 ppm (-OH- Alcol) là C-2’-OH, C-3’-OH, C-5’-OH; Ở 7,3 ppm là proton của amine gắn với vòng

15

Purine (C-6-NH2); Proton (vòng Purine) ở 8 – 8,5 là H-C-2, H-C-8; Do ảnh hưởng của cả N và O nên H-C-1’

ở khoảng 5,9 ppm.

Phổ 13

C-NMR cho thấy: Năm nguyên tử carbon sp3 liên kết trực tiếp với nguyên tử oxi (50 – 100 ppm)

là (C-1’, C-2’, C-3’,C-4’, C-5’) cộng hưởng tại 87,8; 73,3; 70,6; 85,5 và 61,6 ppm, trong đó có bốn carbon

methine C-1’, C-2’, C-3’, C-4’ và một carbon methylene C5’. Có năm carbon sp2 C=C (100 – 150 ppm):

C-2, C-4, C-5, C-6, C-8 cộng hưởng tại 152,3; 149,0; 119,3; 156,1 và 139,8 ppm, do việc cho điện tử từ hai

nguyên tử nitơ nên C-2, C-4, C-6, C-8 có trường thấp hơn C-5 (119,3 ppm).

Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và

13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo (ChemicalBook,

BMRB, HMDB) thì 5.5.1 chính là adenosine với cấu trúc như hình 3.12.

A

8

4

5

N 6

N

N

2

1'

2'3'

4'

O

NH2

OHOH

5'HO

N

Hình 3.12. Cấu trúc của toxin 5.5.1 (Adenosine)

A: Cấu trúc phẳng của Adenosine ; B : Cấu trúc không gian của Adenosine

3.1.6.2. Cấu trúc của toxin 5.22.3

Sau khi làm sạch đươc hợp chất 5.22.3 có hoạt tính chống đông máu và cũng tiến hành xác định

KLPT bằng phổ khối lượng (ESI-MS) thì KLPT của 5.22.3 là 317,133 Da (Hình 3.13). KLPT của chất này

gần bằng với KLPT của chất 5.21.1 là 317,974 Da (chất 5.21.1 là dipeptide Leu-Trp đã được tác giả Võ Đỗ

Minh Hoàng phân lập từ phân đoạn 5.21 bò cạp H. laoticus [8]). Bên cạnh đó chất 5.22.3 cũng được đo thêm

phổ 1H-NMR và

13C-NMR để xác định cấu trúc.

Hình 3.13. Phổ MS của 5.22.3

16

Phổ NMR của 5.22.3 (PL10)

Do 5.21.1 và 5.22.3 có KLPT gần giống nhau là 317 Da nhưng thu được ở hai phân đoạn thứ cấp

khác nhau của cùng loài bò cạp H. laoticus (phân đoạn 5.21 và 5.22) khi làm sạch bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao pha đảo (RP-HPLC), có nghĩa là các chất 5.21.1 và 5.22.3 là 2 chất đồng phân của nhau. Vì vậy, do

hợp chất 5.21.1 đã được xác định là Leu-Trp nên hợp chất 5.22.3 có thể là Ile-Trp. Để xác định chính xác cấu

trúc thì hợp chất 5.22.3 được đo phổ 1H-NMR và

13C-NMR trong dung môi DMSO-d6 với máy cộng hưởng

từ hạt nhân 500 MHz (Bruker AM500 FT-NMR). Thu được kết quả phổ 1H-NMR và

13C-NMR của hợp chất

5.22.3 cùng với số liệu phổ tham khảo của Ile-Trp từ [107] như Bảng 3.11.

Phổ 1H-NMR cho thấy: proton (δH): (Alkan) R-CH3 (0,7 – 1,3 ppm) là H-C-5’, và H-C-6’; R-CH2-R

(1,2 – 1,4 ppm) là H-C-4’; R3-CH (1,4 - 1,7 ppm) là H-C-3’; Ở 7 - 8 ppm là proton của vòng thơm (H-C-8,

H-C-9, H-C-10, H-C-11); N-H (Amid) ở 8 – 9 là (C-2 - NH – C-1’); N-H (Pirol) ở khoảng 11 ppm là

(C-5 - NH – C-7). Proton dạng Hα ở -CH-N- (3,5 – 5,0 ppm) là H-C-2 và H-C-2’. Proton dạng Hβ ở -N-C-

CH2- (2,0 – 3,0 ppm) là H-C-3.

Phổ 13

C-NMR cho thấy: Hai nguyên tử carbon sp3 không kề nguyên tử có độ âm điện mạnh dạng R-

CH3 (8 – 30 ppm): C-5’, C-6’ cộng hưởng tại 11,1 và 14,6 ppm; carbon sp3 dạng R-CH2-R (15 – 55 ppm): C-

3, C-4’ cộng hưởng tại 36,4 và 23,4 ppm, do ảnh hưởng của vòng Pirol nên C-3 có trường thấp hơn C-4’;

carbon sp3 dạng -CH-R3 (20 – 60 ppm): C-3’cộng hưởng tại 26,9 ppm. Carbon sp

3 kề nhóm gây hiệu ứng

rút điện tử -C-N- (30 – 65 ppm): C-2, C-2’ cộng hưởng tại 56,7; 53,0 ppm (do ảnh hưởng của vòng Pirol nên

C-2 có trường thấp hơn C-2’). Hai carbon nhóm C=O dạng acid, amid (155 – 185 ppm): C-1 và C-1’ cộng

hưởng tại 172,7 ppm. Có tám carbon sp2 C=C (100 - 150): C-4, C-5, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11, C-12 trong

đó có ba carbon bị thế hoàn toàn (C-4, C-7, C-12) cộng hưởng tại 109,3; 136,0 và 127,0 ppm và nhờ nối trực

tiếp với nitơ nên C-7 (136,0 ppm) có trường thấp hơn hai carbon C-4 và C-12; năm carbon sp2 dạng methine

còn lại (C-5, C-8, C-9, C-10, C-11) cộng hưởng tại 123,7; 111,3; 120,9; 118,3 và 118,0 trong đó C-8, C-9, C-

10, C-11 là bốn carbon của nhân thơm (110 – 175 ppm).

Qua số liệu phổ MS, 1H-NMR và

13C-NMR cùng với so sánh số liệu phổ tham khảo thì hợp chất

5.22.3 chính là dipeptide Isoleucine – Triptophan (Ile – Trp) với cấu trúc như hình 3.14.

17

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5.22.3 và hợp chất tham khảo

C

(Số)

5.22.3 Hợp chất tham khảo

(Ile -Trp) [107]

δCa,b

δHa,b

δCa,b

δHa,b

1’ 172,7 165,2

2’ 53,0 3,58 (d) 63,0 3,78

3’ 26,9 1,81 (t) 39,7 1,97

4’ 23,4 1,45 (m)

1,12 (m) 24,5

1,55

1,24

5’ 11,1 0,82 (t) 11,3 0,92

6’ 14,6 0,91 (d) 15,3 1,01

1 172,7 167,4

2 56,7 4,54 (d) 55,1 4,13

3 36,4 3,17 (m)

3,06 (m) 28,8

3,22

3,07

4 109,3 109,1

5 123,7 7,18 (d) 124,2 7,06

7 136,0 136,5

8 111,3 7,33 (d) 110,6 7,28

9 120,9 7,05 (t) 120,5 7,01

10 118,3 6,97 (t) 118,2 6,93

11 118,0 7,53 (d) 118,9 7,59

12 127,0 128,2

5-NH-7 10,87 (s) 10,83

2-NH-1’ 8,59 (d) 7,96 a đo trong DMSO-d6 ;

b 500 MHz.

A

5'

4'

3'

2'

6'

NH2

1'

NH

2

13

4

5

NH

12

7

8

11

9

10

O

O

HO

Hình 3.14. Cấu trúc của toxin 5.22.3 (Ile-Trp)

A: Cấu trúc phẳng của Ile – Trp ; B : Cấu trúc không gian của Ile - Trp

Như vậy, từ nọc bò cạp H. laoticus đã phân lập được hai hợp chất có hoạt tính chống đông máu đó

là: 5.5.1 và 5.22.3. Hai hợp chất này được xác định cấu trúc tương ứng là adenosine và dipeptide Ile – Trp.

Cho đến nay trong các tài liệu đã công bố chưa có thông tin về việc phát hiện trong nọc bò cạp H. laoticus có

adenosine và các dipeptide Leu-Trp và Ile-Trp hay hoạt tính chống đông máu của các hợp chất này. Vì vậy,

đây là lần đầu tiên adenosine và dipeptide Ile – Trp phân lập được từ nọc bò cạp H. laoticus.

3.2. Kết quả về rắn cạp nong B. fasciatus

3.2.1. Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B. fasciatus

18

Nọc rắn cạp nong B .fasciatus được tiến hành sắc ký trên cột với gel Superdex HR75 tách ra làm 5

phân đoạn (BF1 – BF5) (Hình 3.15). Khối lượng của các phân đoạn sau khi đông khô được trình bày trong

bảng 3.12.

Bảng 3.12. Khối lượng 5 phân đoạn nọc rắn B. fasciatus sau khi chạy lọc gel.

Phân đoạn mg % từng phân đoạn/tổng lƣợng nọc

thu đƣơc

BF1 7,8026 5,895

BF2 21,5760 16,301

BF3 53,9840 40,786

BF4 11,8528 8,955

BF5 37,1442 28,063

Trong các phân đoạn thu được thì phân đoạn BF3 chiếm nhiều nhất (gần 41%).

3.2.2. Xác định KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng phương pháp điện di

Khảo sát thành phần protein thì bằng chạy điện di trên gel polyacrylamide 15% có mặt 10% SDS,

cho thấy (Hình 3.16):

- Phân đoạn 1 (BF1) chứa các protein có KLPT lớn hơn 116,0 kDa, các protein khác có KLPT nằm trong

khoảng 66 kDa và nhỏ hơn, ngoài ra còn có các polypeptid có KLPT nằm khoảng 13-15 kDa tương đương

với KLPT của enzyme phospholipase A2

- Phân đoạn 2 (BF2) chứa các protein có KLPT nằm trong các khoảng: 66 kDa, 30,0 kDa và 13-15 kDa.

- Phân đoạn 3 (BF3) chứa chủ yếu các polypeptide có KLPT 13-15 kDa đó là các phospholipase A2 .

- Phân đoạn 4 (BF4) chứa chủ yếu các phospholipase nằm khoảng 13-15 kDa và các neurotoxin của nọc rắn

có KLPT khoảng từ 6- 10 kDa.

- Phân đoạn 5 (BF5) chứa các phospholipase nằm khoảng 13-15 kDa và neurotoxin nọc rắn có KLPT

khoảng 7,0 kDa.

Hình 3.15. Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn

cạp nong B.fasciatus

Hình 3.16. Hình điện di nọc rắn cạp nong

B.fasciatus

19

Kết quả chạy điện di cho thấy được sơ bộ KLPT của các phân đoạn đã tách ra từ nọc rắn cạp nong B.

fasciatus. Trong đó, thành phần phospholipase với KLPT ở khoảng 13 – 15 kDa có mặt trong tất cả các phân

đoạn.

3.2.3. Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn theo

phương pháp gây đau quặn bằng acetic acid

Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong toàn phần và các phân đoạn (BF1 – BF5) được

tiến hành thử nghiệm ở liều 0,34 mg/kg theo phương pháp mô tả như ở mục 2.4.4.1. Sau 30 phút cho dùng

thuốc, tất cả các chuột được tiêm phúc mô dung dịch acetic acid 0,7%, sau đó quan sát biểu hiện đau quặn

của chuột tại các thời điểm 5-10 phút, 20-25 phút, 35-40 phút và ghi nhận đươc kết quả như sau (Bảng 3.13,

hình 3.17):

Bảng 3.13. Số lần đau quặn của chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF1 – BF5.

Mẫu


5 – 10 20 – 25 35 – 40

Số lần đau quặn

Nhóm chứng

(nước muối sinh lý) 15,38 ± 1,93 9,88 ± 1,68 6,63 ± 1,16

Nhóm đối chứng

(Aspirin 50,0 mg/kg) 5,38 ± 1,48** 2,13 ± 0,58** 0,38 ± 0,18**

BF 6,75 ± 2,02** 4,38 ± 1,18* 2,13 ± 0,58*#

BF1 3,50 ± 1,35** 3,13 ± 0,99** 0,63 ± 0,26**

BF2 6,29 ±1,19** 4,43 ± 1,17* 1,29 ± 0,52**

BF3 10,25 ± 2,24 3,25 ± 1,05** 1,75 ± 0,70**

BF4 2,43 ± 1,45** 1,00 ± 0, 54** 0,85 ± 0,34**

BF5 7,25 ± 1,97* 4,13 ± 1,04* 2,38 ± 1,12*

(*) p< 0,05, (**) p<0,01 có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng ở cùng thời điểm.

(#) p<0,05 có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng ở cùng thời điểm.

Kết quả khảo sát (bảng 3.13, hình 3.17) cho thấy nọc toàn phần (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)

với liều 0,34 mg/kg đều có tác dụng giảm đau ngoại biên tốt hơn so với nhóm chứng (nước muối sinh lý

NaCl 0,9%). Trong đó phân đoạn BF4 với liều 0,34 mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại biên tốt nhất rồi đến

phân đoạn BF1 và đều mang ý nghĩa thống kê.

Bên cạnh đó, phân đoạn BF4 có tác dụng giảm đau ngoại biên tốt hơn nọc rắn toàn phần (BF) cùng ở

liều 0,34 mg/kg và tốt hơn nhóm đối chứng (Aspirin liều 50,0 mg/kg) tại các thời điểm khảo sát và có tác

dụng giảm đau tốt nhất so với các phân đoạn khác. Kế sau phân đoạn BF4 là phân đoạn BF1.

3.2.4. Tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn của

nó theo phương pháp gây đau bằng kích thích nhiệt

Tác dụng giảm đau trung ương của nọc rắn cạp nong toàn phần và các phân đoạn (BF1 – BF5) cũng

đươc tiến hành thử nghiệm ở liều 0,34 mg/kg theo phương pháp mô tả như ở mục 2.4.4.2. Sau 30 phút cho

dùng thuốc tiến hành đo thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột tại các thời điểm 30 phút, 60 phút, 90 phút

và 120 phút, ghi nhận kết quả cho thấy (Bảng 3.14, hình 3.18):

20

Bảng 3.14. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF1 –

BF5.

Mẫu


Trƣớc tiêm 30 60 90 120

Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột (giây)

C 1,74±0,15 1,55±0,14 1,74±0,10 1,73±0,14 1,73±0,06

ĐC 2,04±0,08 5,31±0,50** 6,51±0,44** 2,96±0,29* 2,17±0,12*

BF 1,56±0,08 1,52±0,07 1,47±0,17 1,65±0,18 1,38±0,17

BF1 1,43±0,09 1,45±0,08 1,79±0,10 1,72±0,12 1,73±0,05

BF2 1,33±0,08 1,53±0,13 1,51± 0,17 1,49±0,11 1,41± 0,09

BF3 1,44± 0,07 1,42± 0,07 1,42±0,05*## 1,83±0,14 1,69±0,14

BF4 1,42±0,08 1,29±0,08 1,49±0,07 1,72±0,17 1,58±0,12

BF5 1,56±0,07 1,41±0,05 1,44±0,09 1,48±0,07 1,44± 0,08*##

-Nhóm C: nước muối sinh lý

-Nhóm ĐC: Morphin Chlorhydrat 5,0 mg/kg


(##) p<0,01 có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng ở cùng thời điểm.

Nọc toàn phần và các phân đoạn (BF1 – BF5) nọc rắn cạp nong ở liều 0,34 mg/kg chưa có tác dụng

giảm đau trung ương, thời gian phản ứng giật mạnh đuôi ở các nhóm này nhanh hơn so với nhóm chứng

(nước muối sinh lý) và nhóm đối chứng (Morphin Chlorhydrat 5,0 mg/kg).

Hình 3.17. Số lần đau quặn của chuột do ảnh

hưởng của BF1 – BF5

Hình 3.18. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi

chuột do ảnh hưởng của BF1 – BF5

Như vậy, khi khảo sát tác dụng giảm đau (ngoại biên và trung ương) thì phân đoạn BF4 với liều 0,34

mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại biên tốt hơn nọc rắn toàn phần cũng ở liều 0,34 mg/kg và tốt hơn thuốc

Aspirin ở liều 50,0 mg/kg tại các thời điểm khảo sát. Do đó, phân đoạn BF4 được tiến hành phân tách tiếp

để xác định hoạt chất chính có tác dụng gây giảm đau trong phân đoạn này.

3.2.5. Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus có hoạt tính giảm đau bằng sắc ký lỏng

hiệu năng cao (RP-HPLC)

21

Quá trình phân tách phân đoạn BF4 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) với các thông số của

quá trình chạy sắc ký:



- Thời gian rửa cột : 15 % đến 45 % B trong 60 phút.


- Cột Jupiter C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm).

Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) trên cột phân tích C18 thu được 15 phân đoạn thứ

cấp, trong đó có năm phân đoạn thứ cấp BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 và BF4.15 khá sạch (Hình 3.19) và

được chọn để khảo sát tiếp hoạt tính giảm đau.

Hình 3.19. Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF4 trên cột Jupiter - C18 (4.6 × 250 mm, 5µm)

3.2.6. Hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4

3.2.6.1. Giảm đau ngoại biên

Quá trình khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12,

BF4.14 và BF4.15) với nồng độ thử nghiệm là 1/10 LD50 (LD50 = 3,36 mg/kg) thu được kết quả ở Bảng 3.15

và Hình 3.20.

Bảng 3.15. Số lần đau quặn của chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15.

Mẫu


5 – 10 20 – 25 35 – 40

Số lần đau quặn

Nhóm chứng

(nước muối sinh lý) 19,33 ± 1,76 8,67 ± 1,14 5,11 ± 0,79


(Aspirin 50,0 mg/kg) 12,63 ± 1,58* 7,38 ± 1,03 4,63 ± 1,41

BF4.7 14,13 ± 3,46 4,25 ± 1,19* 2,00 ± 0,50*

BF4.11 12,11 ± 3,17 3,67 ± 1,26*# 2,22 ± 0,68*

BF4.12 7,44 ± 2,95* 1,33 ± 0,41**## 0,67 ± 0,24**##

BF4.14 10,75 ± 3,17 6,50 ± 1,68 3,38 ± 0,80

BF4.15 12,00 ± 2,63* 4,78 ± 1,10* 2,33 ± 0,78*


(#) p<0,05, (##) p<0,01 có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng ở cùng thời điểm.

22

Hình 3.20. Số lần đau quặn của chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15

Kết quả cho thấy: các phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 và BF4.15) ở liều 0,34

mg/kg đều có tác dụng giảm đau ngoại biên. Trong đó phân đoạn BF4.12 tốt hơn thuốc Aspirin liều 50,0

mg/kg từ sau 20 phút khảo sát. Bên cạnh đó, phân đoạn BF4.11 cùng liều có tác dụng giảm đau tốt hơn thuốc

Aspirin từ 20 – 25 phút khảo sát.

3.2.6.2. Giảm đau trung ương

Phương pháp khảo sát tác dụng giảm đau trung ương của năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11,

BF4.12, BF4.14 và BF4.15) với nồng độ thử nghiệm là 1/10 LD50 (LD50 = 3,36 mg/kg) thu được kết quả ở

Bảng 3.16 và Hình 3.21.

Bảng 3.16. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột ở liều 0,34 mg/kg do ảnh hưởng của BF4.7 –

BF4.15.

Mẫu


Trƣớc

tiêm 30 60 90 120

Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột (giây)

Nhóm chứng

(nước muối sinh lý)

2,56 ±

0,33 2,84 ± 0,19 3,08 ± 0,38 2,51 ± 0,31 2,63 ± 0,42


(Morphin Chlorhydrat 5,0

mg/kg)

1,50 ±

0,13

9,74 ±

0,26**

9,57 ±

0,43**

9,49 ±

0,51**

7,85 ±

1,04**

BF4.7 2,15 ±

0,18

2,95 ±

0,22##

3,01 ±

0,34##

3,88 ±

0,50##

3,17 ±

0,39##

BF4.11 2,65 ±

0,20

3,36 ±

0,35##

3,86 ±

0,40##

3,26 ±

0,24##

3,37 ±

0,24##

BF4.12 2,40 ±

0,24

3,27 ±

0,45##

2,95 ±

0,34##

3,02 ±

0,26##

2,51 ±

0,35##

BF4.14 2,09 ±

0,14

2,69 ±

0,17##

2,76 ±

0,27##

2,50 ±

0,22##

2,80 ±

0,19##

BF4.15 2,43 ±

0,19

3,21 ±

0,21##

3,11 ±

0,24##

2,73 ±

0,28##

2,73 ±

0,17##

(**) p<0,01 có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng ở cùng thời điểm.

(##) p<0,01 có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng ở cùng thời điểm.

23

Hình 3.21. Thời gian phản ứng giật mạnh đuôi chuột do ảnh hưởng của BF4.7 – BF4.15

Kết quả cho thấy: các phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 và BF4.15) ở liều 0,34 mg/kg

chưa có tác dụng giảm đau trung ương.

Qua kết quả khảo sát hoạt tính giảm đau thì năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12,

BF4.14 và BF4.15) đều có tác động giảm đau ngoại biên ở liều 0,34 mg/kg. Tác động giảm đau ngoại biên

của phân đoạn BF4.12 là tốt nhất rồi đến phân đoạn BF4.11. Trong khi đó các phân đoạn tách ra từ phân

đoạn BF4 nọc rắn cạp nong cùng liều chưa có tác dụng giảm đau trung ương.

Do BF4.11 và BF4.12 có hoạt tính giảm đau ngoại biên tốt nhất nên chúng được làm sạch lại và tiếp

tục được xác định KLPT bằng các phương pháp phổ.

3.2.7. Xác định KLPT của protein BF4.11 và protein BF4.12 có hoạt tính giảm đau ngoại biên

KLPT của BF4.11 và BF4.12 được xác định bằng phổ khối lượng phun sương điện phân giải cao HR-

ESI-MS/MS (6500 Agilent). Kết quả phổ HR-ESI-MS/MS thu được như PL11 và PL12.

Khối lượng phân tử của BF4.11 đo được là 13038 Da.

Khối lượng phân tử của BF4.12 đo được là 13036 Da.

Trong nọc rắn cạp nong, protein có khối lượng phân tử nằm trong vùng 13-15 kDa thường là các

phospholipase A2. Do đó, protein 4.11 và 4.12 là phospholipase A2.

Như vậy, từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus đã phân lập được hai protein BF4.11 và BF4.12 có hoạt

tính giảm đau ngoại biên và có KLPT lần lượt là 13038 Da và 13036 Da.

Trước đây đã từng có các nghiên cứu về hoạt tính giảm đau của các hợp chất từ loài rắn, tuy nhiên

các hợp chất này có cấu trúc và KLPT tương đối khác so với các protein trong nghiên cứu này. Cụ thể, như

hợp chất cobrotoxin, một neurotoxin phân lập từ rắn N. naja atra có tác dụng làm giảm đau trung ương trong

thử nghiệm nhúng đuôi chuột. Crotamine (KLPT là 4,8 kDa), một polypeptide chứa 42 gốc amino acid với 3

cầu –S-S- được phân lập từ loài rắn đuôi chuông Nam Mỹ Crotalus durissus terrificusas. Mặc dù crotamine

gây tê liệt với chuột ở liều cao, nhưng nó tạo ra tác dụng giảm đau ở liều thấp hơn mà không có bất kỳ độc

tính nào rõ ràng trong thử nghiệm in vivo. Tác dụng gây giảm đau của crotamine cao hơn khoảng 30 lần so

với morphine và đã được chứng minh là liên quan đến cả cơ chế trung ương (thử nghiệm nhúng đuôi chuột

bằng kích thích nhiệt) và ngoại biên (phương pháp gây đau quặn do acetic acid gây ra). Gần đây một hợp

chất được phân lập cũng từ loài rắn C. durissus terrificusas này là crotalphine (KLPT là 1534,6 Da) chứa 14

gốc amino acid thể hiện hoạt tính giảm đau kéo dài sau khi uống. Ngoài ra, hannalgesin, một neurotoxin

chuỗi dài phân lập được từ loài rắn Ophiophagus hannah, thể hiện hoạt tính gây giảm đau trung ương ở

24

chuột theo phương pháp thử nghiệm nhúng đuôi chuột bằng kích thích nhiệt. Độc tố thần kinh này đã được

chứng minh là tạo ra giảm đau trong phạm vi liều 16–32 ng/g mà không gây ra bất kỳ rối loạn thần kinh hoặc

cơ [69].

Như vậy có thể thấy rằng các hợp chất này hầu như là các neurotoxin hoặc polypeptide ngắn, còn các

protein BF4.11 và BF4.12 trong nghiên cứu này là các hợp chất có KLPT tương đương các phospholipase

A2.

3.2.8. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của nọc rắn cạp nong B. fasciatus

Bên cạnh việc khảo sát hoạt tính giảm đau thì nọc thô và các phân đoạn từ nọc rắn cạp nong B.

fasciatus còn được khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư nhằm tìm kiếm các hoạt tính mới từ nọc loài rắn

này để ứng dụng trong y – dược.

3.2.8.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5).

Khả năng gây độc tế bào ung thư của nọc thô (BF) của rắn cạp nong và các phân đoạn (BF1 – BF5)

được thử nghiệm trên tế bào ung thư vú MCF-7 với các nồng độ khác nhau 1; 10; 50 và 100 µg/mL theo

phương pháp phân tích MTT. Phân tích kết quả sau 24 h, 48 h và 72 h. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết

quả được thể hiện qua Bảng 3.17 (PL4) và PL13 (hình A, B, C).

Bảng 3.17. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 –

BF5)

Thời gian

(Giờ, h)

Nồng độ

(ug/mL)

Chứng BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF

Lƣợng tế bào sống (%)

24

1

100

99,92 101,24 101,53 100,37 100,23 99,60

10 101,08 100,55 88,36 102,64 100,74 87,01

50 101,61 100,87 77,99 101,29 102,43 76,27

100 100,23 102,22 69,32 100,95 100 67,75

48

1

100

101,23 100,09 99,46 100,69 101,97 100

10 100,96 101,23 91,67 100,67 100,86 93,33

50 100,19 100 74,63 101,85 101,11 73,84

100 100,26 100,31 53,59 100,82 100,36 56,17

72

1

100

100,30 100,47 100,70 104,25 102,54 98,89

10 102,62 99,89 82,83 101,58 102,01 81,07

50 100,52 100,83 55,89 101,86 102,34 57,15

100 101,38 102,14 20,16 100,52 101,10 19,68

Kết quả cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn từ nọc

rắn cạp nong theo nồng độ và thời gian khảo sát, và trong năm phân đoạn thử nghiệm (BF1 – BF5) thì chỉ có

phân đoạn BF3 cùng với nọc thô (BF) là có ảnh hưởng gây độc tế bào MCF-7 sau 24 h, 48 h, 72 h được thể

hiện ở Bảng 3.18.

Bảng 3.18. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

Phân đoạn Thời gian

(Giờ, h)

Nồng độ (µg/mL)

1 10 50 100


BF3 24

100 88,36 77,99 69,32

48 91,67 74,63 53,59

25

72 82,83 55,89 20,16

BF

24

100

87,01 76,27 67,75

48 93,33 73,84 56,17

72 81,07 57,15 19,68

3.2.8.2. Khả năng gây độc tế bào ung thư phổi A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5).

Nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5) thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư phổi A549 ở các

nồng độ khác nhau 1; 10; 50 và 100 µg/mL cũng được tiến hành như mục 3.2.8.1, thu được kết quả thể hiện

qua Bảng 3.19 (PL4) và PL13 (hình D, E, F).

Bảng 3.19. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5)

Thời gian

(Giờ, h)

Nồng độ

(ug/mL)

Chứng BF1 BF2 BF3 BF4 BF5 BF


24

1

100

107,34 100,41 100,70 101,19 99,24 99,70

10 104,71 101,02 90,10 101,04 100,09 89,13

50 103,98 103,28 81,47 101,92 99,85 80,52

100 100,70 104,91 73,01 103,30 101,77 70,19

48

1

100

104,54 101,82 99,10 100,63 100,37 99,97

10 102,72 100,32 85,40 100,08 99,75 86,37

50 103,57 100,61 71,77 99,73 100,96 73,77

100 102,87 101,97 55,95 100,21 100,10 53,71

72

1

100

101,19 100,63 97,52 101,35 101,09 98,69

10 100,28 100,58 71,24 99,90 100,65 69,60

50 101,30 100,23 49,97 100,60 101,79 46,17

100 100,32 100,23 16,80 100,95 100,53 13,91

Kết quả cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư phổi A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn từ

nọc rắn cạp nong theo nồng độ và thời gian khảo sát, và cũng trong năm phân đoạn thử nghiệm (BF1 – BF5)

thì cũng chỉ có phân đoạn BF3 cùng với nọc thô (BF) là có ảnh hưởng gây độc tế bào A549 sau 24 h, 48 h,

72 h được thể hiện ở Bảng 3.20.

Bảng 3.20. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của nọc thô (BF) và phân đoạn BF3

Phân đoạn Thời gian

(Giờ, h)


1 10 50 100


BF3

24

100

90,10 81,47 73,01

48 85,40 71,77 55,95

72 71,24 49,97 16,80

BF

24

100

89,13 80,52 70,19

48 86,37 73,77 53,71

72 69,60 46,17 13,91

Hoạt tính của phân đoạn BF3 và nọc thô BF lên tế bào ung thư phổi A549 cũng phụ thuộc vào nồng

độ và thời gian khảo sát, tăng nồng độ và thời gian thì lượng tế bào sống giảm đi.

26

Như vậy, nọc thô BF và phân đoạn BF3 có khả năng gây độc cả tế bào ung thư vú MCF-7 và ung

thư phổi A549 với khả năng ức chế tăng theo nồng độ và thời gian khảo sát (biểu hiện là lượng tế bào ung

thư giảm dần khi tăng nồng độ và thời gian khảo sát). Do đó, phân đoạn BF3 tiếp tục được phân lập nhằm

xác định hoạt chất chính trong phân đoạn này có khả năng gây độc cả hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và

A549.

3.2.9. Phân lập phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)

Quá trình phân tách phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) như trình bày ở mục

2.4.5 với các thông số của quá trình chạy sắc ký:



- Thời gian rửa cột : 25 % đến 40 % B trong 75 phút.


- Cột Jupiter C18 (10 x 250 mm, 5 µm)

Kết quả sau quá trình sắc ký thu được 4 phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3 và BF3.4) (Hình

3.22). Các phân đoạn thứ cấp này được thu lại (thu tự động), đông khô và tiếp tục được khảo sát hoạt tính

gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549.

Hình 3.22. Sắc ký đồ RP-HPLC phân đoạn BF3 trên cột Jupiter - C18 (10 × 250 mm, 5µm)

3.2.10. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp

(BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4) từ phân đoạn BF3

3.2.10.1. Khả năng gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3,

BF3.4)

Các phân đoạn thứ cấp BF3.1 – BF3.4 và phân đoạn BF3 được thử nghiệm với các nồng độ khác

nhau 1; 10; 50 và 100 µg/mL trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 theo phương pháp MTT được tiến hành

như mục 3.2.8.1 và so sánh lượng tế bào sống sau 24 h, 48 h và 72 h thu được kết quả thể hiện ở Bảng 3.21

và PL14 ( hình G, H, I).

27

Bảng 3.21. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.4)

Thời gian

(Giờ, h)

Nồng độ

(ug/mL)

Chứng BF3.1 BF3.2 BF3.3 BF3.4 BF3


24

1

100

100,13 102,37 100,10 100,76 99,73

10 102,02 100,92 94,39 100,65 90,22

50 101,79 100,36 89,49 102,97 82,59

100 100,34 100,18 73,45 100,26 69,15

48

1

100

100,76 101,93 100,54 102,30 99,30

10 102,20 100,34 90,04 101,78 85,33

50 101,43 101,78 79,57 102,35 70,81

100 101,63 101,93 67,60 101,58 50,65

72

1

100

100,12 100,96 99,21 102,09 98,74

10 102,48 102,46 82,91 101,23 70,27

50 102,04 99,65 73,23 101,08 53,33

100 101,94 101,52 56,32 101,15 22,50

Kết quả khảo sát cho thấy khả năng gây độc tế bào MCF-7 của phân đoạn BF3 và bốn phân đoạn

(BF3.1 – BF3.4), theo đó chỉ có phân đoạn BF3.3 (cùng với BF3) là có khả năng ức chế tế bào MCF-7 được

thể hiện ở Bảng 3.22.

Bảng 3.22. Khả năng gây độc tế bào ung thư MCF-7 của phân đoạn BF3 và BF3.3

Mẫu Thời gian

(Giờ, h)


1 10 50 100


BF3.3

24

100

94,39 89,49 73,45

48 90,04 79,57 67,60

72 82,91 73,23 56,32

BF3

24

100

90,22 82,59 69,15

48 85,33 70,81 50,65

72 70,27 53,33 22,50

Kết quả cho thấy hiệu quả tác động của phân đoạn BF3.3 lên tế bào ung thư vú MCF-7 tăng theo nồng

độ và thời gian, thể hiện rõ nét ở mốc nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL sau 72 h.

3.2.10.2. Khả năng gây độc tế bào ung thư phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3,

BF3.4).

Các phân đoạn thứ cấp BF3.1 – BF3.4 và phân đoạn BF3 cũng được thử nghiệm trên dòng tế bào

ung thư phổi A549 theo phương pháp MTT với các nồng độ khác nhau là 1; 10; 50 và 100 µg/mL. Tiến hành

như mục 3.2.8.1, thu được kết quả thể hiện qua Bảng 3.23 và PL14 ( hình J, K, L).

Bảng 3.23. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và (BF3.1 - BF3.4)

Thời gian

(Giờ, h)

Nồng độ

(ug/mL)

Chứng BF3.1 BF3.2 BF3.3 BF3.4 BF3


24

1

100

101,02 101,34 101,94 103,23 99,23

10 99,86 101,29 97,47 99,52 90,78

50 101,55 102,29 85,96 100,79 81,64

28

100 99,42 99,68 78,03 102,26 72,32

48

1

100

101,20 100,47 100,23 103,61 98,41

10 100,11 102,07 94,87 100,30 82,54

50 101,27 99,07 79,31 102,19 64,05

100 100,07 102,03 67,40 100,70 41,54

72

1

100

102,17 101,69 99,04 101,20 99,09

10 99,72 102,15 87,31 101,20 70,32

50 100,18 101,56 70,82 100,52 48,90

100 100,11 99,32 56,48 100,45 20,13

Kết quả cho thấy, chỉ có phân đoạn BF3.3 (trong bốn phân đoạn BF3.1 – BF3.4) cùng với phân đoạn

BF3 là có khả năng gây độc tế bào ung thư phổi A549 sau 24, 48 và 72 h. Thể hiện cụ thể trong Bảng 3.24.

Bảng 3.24. Khả năng gây độc tế bào ung thư A549 của phân đoạn BF3 và BF3.3

Mẫu Thời gian

(Giờ, h)


1 10 50 100


BF3.3

24

100

97,47 85,96 78,03

48 94,87 79,31 67,40

72 87,31 70,82 56,48

BF3

24

100

90,78 81,64 72,32

48 82,54 64,05 41,54

72 70,32 48,90 20,13

Ảnh hưởng của phân đoạn BF3.3 trên tế bào ung thư phổi A549 cũng tăng theo nồng độ và thời gian,

thể hiện rõ nét ở mốc nồng độ 50 µg/mL, 100 µg/mL sau 72 h.

Nhìn chung phân đoạn BF3 thể hiện hoạt tính ức chế cả 2 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư

phổi A549. Khả năng ức chế tùy thuộc nồng độ và thời gian, sau 72h và ở nồng độ 100 µg/mL thì % sống

của tế bào MCF-7 và A549 giảm xuống đến gần 20% (MCF-7 giảm đến 22,50%; A549 giảm đến 20,13%) so

với nhóm chứng. Trong khi cũng ở nồng độ 100 µg/mL và sau 72h thì phân đoạn BF3.3 ức chế khả năng

sống của tế bào MCF-7 còn 56,32%, và A549 giảm xuống đến 56,48% so với nhóm chứng, nghĩa là nó làm

giảm khả năng sống của tế bào MCF-7 và A549 khoảng 50%. Nồng độ này có thể được xem như là IC50.

3.2.11. Khả năng gây độc tế bào thường HK2 ở người của nọc thô (BF), các phân đoạn (BF1 – BF5) và

các phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3, BF3.4).

Từ kết quả nọc thô (BF), phân đoạn BF3 (trong năm phân đoạn BF1 – BF5) và phân đoạn BF3.3 thể

hiện khả năng gây độc cả tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thử phổ A549 với hoạt tính gây độc tăng dần theo

nồng độ và thời gian khảo sát và để đánh giá khả năng ảnh hưởng lên tế bào bình thường thì nọc thô và các

phân đoạn này tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính gây độc trên dòng tế bào thận HK2 bình thường ở người.

Kết quả đáng chú ý là cả nọc thô (BF), các phân đoạn (BF1- BF5) và (BF3.1 - BF3.4) không gây ảnh hưởng

lên tế bào HK2 ở ba mốc thời gian 24 h, 48 h hoặc 72 h và nồng độ (1; 10; 50; 100 µg/mL) như khi thử

nghiệm trên tế bào MCF-7 và A549 (PL15).

Hoạt tính gây độc tế bào của PLA2 từ nọc rắn đã từng được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây

(Sobrinho et all., 2016) thì hoạt tính của PLA2 còn tùy thuộc trên loài rắn và dòng tế bào đem thử nghiệm

(PL16). Tuy nhiên, giá trị IC50 thường trong dãy từ 40 - 200 µg/mL. Hoạt tính gây độc tế bào của PLA2 loài

rắn cạp nong trong nghiên cứu này cũng nằm trong dãy đó (100 µg/mL). Phospholipase trong bảng PL16 hầu

29

như được phân lập từ loài rắn lục (viper), còn dữ liệu về hoạt tính gây độc tế bào ung thư của phospholipase

loài rắn cạp nong không nhiều, cụ thể, hai enzyme là nigexine từ rắn hổ Cobra Naja nigricollis [108] và

PLA2 từ rắn biển Lapemis hardwickii [109] có nồng độ ức chế IC50 từ 39 - 69 µg/ml (thấp hơn giá trị IC50

của phân đoạn BF3.3 nhưng thử nghiệm khác dòng tế bào).

Mặt khác, theo nghiên cứu của Bazaa [110] sau khi khử hoạt tính enzyme của PLA2 phân lập được từ

loài Macrovipera lebetina transmediterranea bằng p-bromophenacyl bromide thì cho thấy (sau khi khử hoạt

tính enzyme) không làm ảnh hưởng gì đến hoạt tính kháng khối u của PLA2 này. Điều đó cho thấy hoạt tính

kháng khối u không phải do hoạt tính enzyme của PLA2.

3.2.12. Xác định cấu trúc bậc một (trình tự amino acid) của protein 3.3 có hoạt tính gây độc tế bào ung

thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549

3.2.12.1. Xác định KLPT của BF3.3 dựa trên MALDI TOF/TOF MS

Bốn phân đoạn thứ cấp (BF3.1, BF3.2, BF3.3 và BF3.4) thu được từ phân đoạn BF3 bằng RP-HPLC

sau đó được xác định KLPT bằng phổ khối lượng nguồn ion hóa năng lượng laser (MALDI-TOF/TOF-MS,

Bruker Daltonis GmbH). Phổ MS được ghi dưới dạng ion dương trong dãy m/z từ 5-20 kDa. Kết quả đo phổ

MS như hình 3.23.

Hình 3.23. Phổ MALDI-TOF/TOF-MS của các phân đoạn (BF3.1 – BF3.4) nọc rắn B. fasciatus

Phân tích các phân đoạn BF3.1, BF3.2, BF3.3 và BF3.4 bằng MALDI-TOF/TOF-MS cho thấy sự

xuất hiện của các protein trong các phân đoạn này. Nhiều tín hiệu phổ ở m/z gần 13000 là của ion đơn điện

tích. Trong nọc cạp nong B. fasciatus chỉ có PLA2 mới có thể có KLPT ở khoảng dãy này. Tín hiệu phổ ở

m/z gần 6500 là của ion điện tích đôi của cùng protein, trong khi tín hiệu ở m/z 7300 – 7400 có thể là của

toxin ba ngón tay (three finger toxins).

Kết quả phân tích cũng cho thấy, phân đoạn BF3.2 và BF3.3 chỉ chứa một protein và BF3.3 có

KLPT là 13093 Da. Các tín hiệu ở dãy lớn hơn m/z 13093 của BF3.3 có thể là của ion phụ (ion [Mass +

Na]+/ [Mass+K]

+) trong phương pháp đo phổ MALDI MS.

30

3.2.12.2. Xác định trình tự amino acid của protein 3.3 dựa trên LC-MS/MS

Phân đoạn BF3.3 có hoạt tính gây độc cả hai dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi A549

được làm sạch lại bằng RP-HPLC rồi phân tích bằng khối phổ phân giải cao (HR-MS). Cũng giống như khi

xác định bằng MALDI-TOF/TOF-MS, phổ HR-MS cũng cho thấy tín hiệu phổ của protein 3.3 có một tín

hiệu mạnh nhất ở m/z 1310,08897 (z = 10) (Hình 3.24A) tương ứng với KLPT là 13090,89 Da. Bên cạnh đó

tín hiệu ở m/z 1311,68909 tương ứng với khối lượng 13106,89 Da, sự khác nhau về KLPT giữa 2 protein này

gần 16 Da có thể là kết quả của sự oxy hóa methionine. Còn những tín hiệu ở giá trị m/z thấp hơn có thể là

sản phẩm của sự phân giải protein.

Hình 3.24. Khối phổ phân giải cao (HR-MS) của BF3.3.

Protein 3.3 sau đó được phân giải bởi Tripsin và phân tích bằng LC-MS/MS. Kết quả phân tích cho

thấy các mảnh peptide của protein 3.3 hầu hết là giống với các mảnh peptide của phospholipase A2 1 (Mã số

UniProt KB là Q90WA7) và các mảnh peptide của protein 3.3 này đã được xác định (PL17, PL18).

A. HR-MS của BF3.3 ở Z=10.

B. HR-MS mở rộng tại mũi

chính (Z=10).

31

Nếu ở tín hiệu phổ khối thấp nhất, m/z 1309,2841 (Hình 3.24B) là của protein 3.3 tương ứng với

KLPT là 13082,84 Da thì với KLPT này cũng chỉ sai khác với KLPT theo lý thuyết của PLA2 1 (13082,91

Da) là 5,35ppm. Kết quả so sánh trình tự amino acid của protein 3.3 với Q90WA7 thì 100% trình tự amino

acid của protein 3.3 được xác định từ đoạn amino acid (28-145) của Q90WA7 (Hình 3.25 và PL19). Vì vậy,

protein 3.3 chính là phospholipase A2 1 (Q90WA7, đoạn amino acid 28 - 145).

Hình 3.25. Trình tự amino acid của protein 3.3

PLA2 1 (Q90WA7) là một protein thu được do sinh tổng hợp, còn PLA2 (protein 3.3) trong nghiên

cứu này là protein lần đầu tiên được phân lập từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus với KLPT là 13093 Da.

32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

1. KẾT QUẢ TỪ BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS

1.1. Thành phần nọc bò cạp H. laoticus:

Sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel với gel Sephadex G-50 tách được 5 phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) có

khối lượng phân tử khác nhau.

1.2. Hoạt tính chống đông máu của nọc bò cạp H. laoticus

Trong 5 phân đoạn (PĐ1 – PĐ5) thì PĐ2, PĐ4 và PĐ5 có hoạt tính chống đông máu. Tiếp tục phân tách

PĐ5 bằng RP-HPLC thu được 24 phân đoạn thứ cấp và tiếp tục khảo sát tác động lên quá trình đông - chảy

máu của 24 phân đoạn thứ cấp này thì có 6 phân đoạn thứ cấp 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 có hoạt tính

tác động lên quá trình đông - chảy máu, trong đó 5.5 có hoạt tính cao nhất, kế đến là 5.22.

1.3. Cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.5 và 5.22 của nọc bò cạp

H. laoticus:

Từ phân đoạn 5.5 và 5.22 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC) trên cột phân

tích C18 đã thu được 2 hợp chất sạch tương ứng với các hợp chất 5.5.1 và 5.22.3. Sử dụng phổ ESI-MS và

NMR đã xác định được hợp chất 5.5.1 có KLPT là 267,867 Da và có cấu trúc là adenosine; còn hợp chất

5.22.3 có KLPT là 317,133 Da và có cấu trúc là dipeptide Ile – Trp.

Adenosine và dipeptide Ile-Trp là những hợp chất lần đầu tiên đƣợc phân lập ra từ nọc bò cạp

H. laoticus và được xác định là có hoạt tính chống đông máu.

2. KẾT QUẢ TỪ RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS

Khảo sát nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus thu được kết quả như sau:

2.1. Thành phần nọc rắn cạp nong B. fasciatus:

Sử dụng phương pháp sắc ký trên gel Superdex HR75 đã phân tách nọc rắn cạp nong B. fasciatus

thành 5 phân đoạn (BF1 – BF5), trong đó hàm lượng phân đoạn BF3 là nhiều nhất.

2.2. Khảo sát khối lƣợng phân tử của từng phân đoạn đã tách ra:

Bằng phương pháp điện di đã khảo sát sơ bộ được KLPT của 5 phân đoạn đã tách ra từ nọc rắn cạp

nong B.fasciatus và cả 5 phân đoạn (BF1 – BF5) đều chứa phospholipase A2 (PLA2) với KLPT khoảng 13

kDa.

2.3. Khảo sát hoạt tính sinh học và cấu trúc hợp chất có hoạt tính:

2.3.1. Tác dụng gây độc tế bào ung thư từ nọc cạp nong B. fasciatus

Nọc thô (BF), phân đoạn BF3 và phân đoạn thứ cấp BF3.3 (tách ra từ phân đoạn BF3) có hoạt

tính gây độc cả 2 dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (A549) ở nồng độ 10 µg/mL. Thể hiện rõ

rệt ở nồng độ 50 µg/mL và 100 µg/mL sau 24 h. Ngoài ra, hiệu quả gây độc tế bào ung thư của BF, BF3 và

BF3.3 tăng khi tăng nồng độ và thời gian mẫu thử. Các phân đoạn còn lại (BF1, BF2, BF4, BF5) không có

khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (A549) ở cùng nồng độ và thời gian khảo sát.

Từ phân đoạn thứ cấp BF3.3 sử dụng phổ MALDI TOF/TOF MS và LC-MS/MS đã xác định

được protein 3.3 có KLPT là 13093 Da, là phospholipase A2 và có trình tự amino acid là:

NLLQFKNMIQ CAGSRLWVAY VKYGCYCGPG GTGTPLDQLD RCCQTHDHCY

DNAKKFGNCI PYFKTYEYTC NKPDLTCTDA KGSCARNVCD CDRAAAICFA AAPYNLANFG

INKETHCQ

33

Hợp chất này có hoạt tính gây độc cả 2 dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (A549)

và nó lần đầu tiên được phân lập từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus.

2.3.2. Tác dụng giảm đau của các hợp chất từ nọc cạp nong B. fasciatus

Giảm đau ngoại biên:

Cả 5 phân đoạn (BF1 – BF5) đều có hoạt tính giảm đau ngoại biên ở liều 0,34 mg/kg, trong đó phân

đoạn BF4 có hoạt tính giảm đau ngoại biên tốt nhất. Tiếp tục phân tách phân đoạn BF4 bằng RP-HPLC trên

cột phân tích C18, cho thấy: Năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 và BF4.15) từ phân

đoạn BF4 cũng đều có tác động giảm đau ngoại biên ở liều 0,34 mg/kg, trong đó tác động giảm đau ngoại

biên của phân đoạn BF4.12 là tốt nhất rồi đến phân đoạn BF4.11. Từ BF4.11 và BF4.12 bằng phổ HR-ESI-

MS/MS đã xác định được hai protein BF4.11 và BF4.12 có KLPT lần lượt là 13038 Da và 13036 Da.

Giảm đau trung ƣơng:

Năm phân đoạn (BF1 – BF5) và năm phân đoạn thứ cấp (BF4.7, BF4.11, BF4.12, BF4.14 và

BF4.15) từ phân đoạn BF4 ở liều 0,34mg/kg chưa có tác dụng giảm đau trung ương.

KIẾN NGHỊ

- Tổng hợp hoạt chất nano từ các chất có hoạt tính chống đông máu đã tách ra từ nọc bò cạp H.

laoticus nhằm nâng cao khả năng ứng dụng chống đông máu của các chất này.

- Tổng hợp hoạt chất nano-toxin từ các toxin có hoạt tính đã tách ra từ rắn cạp nong B. fasciatus và

khảo sát so sánh hoạt tính: giảm đau, kháng viêm, kháng tăng sinh tế bào ung thư,…của các hoạt chất nano-

toxin này với các toxin nguyên bản nhằm tìm kiếm hoạt chất mới ứng dụng trong y – dược.

34

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Hai hợp chất lần đầu tiên được phát hiện trong nọc bò cạp H. laoticus và được xác định là có hoạt

tính chống đông máu đó là:

- 5.5.1 có KLPT là 267,867 Da và được xác định là adenosine.

- 5.22.3 có KLPT là 317,133 Da và được xác định là dipeptide Ile - Trp.

2. Lần đầu tiên phân lập được protein 3.3 từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus có hoạt tính kháng tăng

sinh cả tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (A549) ở nồng độ 10 µg/mL sau 72 h, thể hiện rõ rệt ở

nồng độ 50 µg/mL và 100 µg/mL. Protein 3.3 có KLPT là 13093 Da, là phospholipase A2.

Trình tự amino acid của protein 3.3:

NLLQFKNMIQ CAGSRLWVAY VKYGCYCGPG GTGTPLDQLD RCCQTHDHCY

DNAKKFGNCI PYFKTYEYTC NKPDLTCTDA KGSCARNVCD CDRAAAICFA AAPYNLANFG

INKETHCQ

3. Cũng từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus đã phân lập được hai protein có hoạt tính giảm đau ngoại

biên là BF4.11 và BF4.12 có KLPT lần lượt là 13038 Da và 13036 Da.

35

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN

1. Thien V Tran, Andrei E Siniavin, Anh N Hoang, My T T Le, Chuong D Pham, Trung V Phung, Khoa C

Nguyen, Rustam H Ziganshin, Victor I Tsetlin, Ching-Feng Weng, Yuri N Utkin, Phospholipase A2 from

krait Bungarus fasciatus venom induces human cancer cell death in vitro, PeerJ, 2019, 7:e8055 DOI

10.7717/peerj.8055.

2. Trần Vũ Thiên, Phạm Đình Chương, Phùng Văn Trung, Nguyễn Cửu Khoa, Utkin Yuri Nicolaevich,

Hoàng Ngọc Anh, Tách protein có hoạt tính kháng tế bào ung thư từ nọc rắn cạp nong Bungarus

fasciatus phân bố ở Vĩnh Phúc, Tạp chí Hóa học, 57(2E1,2), 2019, 95-99.

3. Trần Vũ Thiên, Trần Thụy TrúcVy, Nguyễn Thị Thùy Trang, Phùng Văn Trung, Nguyễn Cửu Khoa,

Utkin Yuri, Hoàng Ngọc Anh, Tách và khảo sát hoạt tính giảm đau của một số polypeptid từ nọc rắn cạp

nong Bungarus fasciatus phân bố ở Vĩnh Phúc, Tạp chí Hóa học, 55(5E34), 2017, 186-190.

4. Thien Vu Tran, Anh Ngoc Hoang, Trang Thuy Thi Nguyen, Trung Van Phung, Khoa Cuu Nguyen,

Alexey V. Osipov, Igor A. Ivanov, Victor I. Tsetlin and Yuri N. Utkin, Anticoagulant Activity of Low-

Molecular Weight Compounds from Heterometrus laoticus Scorpion Venom, Toxins, 2017, 9(11), 343.

5. Tran Vu Thien, Hoang Ngoc Anh, Nguyen Thi Thuy Trang, Phung Van Trung, Nguyen Cuu Khoa, A. V.

Osipov, P. V. Dubovskii, I. A. Ivanov, A. S. Arseniev, Corresponding Member of the RAS V. I. Tsetlin,

and Yu. N. Utkin, Low-Molecular- Weight Compounds with Anticoagulant Activity from the Scorpion

Heterometrus laoticus Venom, Doklady Biochemistry and Biophysics, 2017, Vol. 476, pp. 316–319.

6. Trần Vũ Thiên, Hoàng Ngọc Anh, Nguyễn Văn Minh Khôi, Lê Ngọc Hùng, Phùng Văn Trung, Lê Minh

Hà, Xác định khối lượng phân tử của một số thành phần trong nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus bằng

phương pháp khối phổ phân giải cao, Tạp chí KH&CN ĐH Đà Nẵng, 2017, Số 9(118), 109-111.

7. Trần Vũ Thiên, Lê Thị Thùy Liên, Nguyễn Thị Thùy Trang, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Đức Tuấn,

Nguyễn Cửu Khoa, Utkin Yuri, Hoàng Ngọc Anh, Nghiên cứu tác động giảm đau, kháng viêm của các

phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus phân bố tại Vĩnh Phúc, Tạp chí Y học TP.Hồ

Chí Minh, Phụ bản tập 21, số 1, 2017, 523-530.

8. Trần Vũ Thiên, Nguyễn Thị Thùy Trâm, Nguyễn Thị Thùy Trang, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Đức Tuấn,

Nguyễn Trung Kiên, Phạm Nguyên Đông Yên, Hoàng Ngọc Anh, Khảo sát tác động kháng viêm và giảm

đau của chế phẩm kem bôi da chứa nọc bò cạp Heterometrus laoticus, Tạp chí Y học TP.Hồ Chí Minh,

Phụ bản tập 21, số 1, 2017, 531-537.

n khoa h c vÀ cÔng ngh

Documents