ISSN 373 - 580 X

Bol. Soc. Argent. Bot. 30 (1-2): 71-76. 1994

DESARROLLO DE SACCOBOLUS LONGEVISPORUS {FUNGI, ASCOMYCETES)

CON DISTINTAS FUENTES DE NITROGENO

Por ARACELI MARCELA RAMOS*

Summary Development of Saccobolus longevisporus (Fungi Ascomycetes) using nitrogen sources. Theeffect of various nitrogen sources on growth and apothecial production of Saccobolus longevisporus wasinvestigated. Asparagine, urea, ammonium inorganic salts and sodium nitrate were used as nitrogensources. The results showed that this fungus was able to grow in all the sources except ammonium nitrate.The best nitrogen source was urea, producing maximal growth in Ipw concentrations. Saccoboluslongevisporus produced aphotecia only with asparagine and sodium nitrate.

INTRODUCCION Evans y Garraway, 1984; Abuzinadah, 1978;Rappior et al, 1988; Elliot, 1989).

En este trabajo se analiza la influencia de distin-para su crecimiento y desarrollo. El nitrógeno es tas fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico en elutilizado para la síntesisde una variedad deconstitu- crecimiento y la fructificación de- Saccobolusyentes celulares esenciales tales como aminoácidos, longevisporus, sp. nov (Ranalli y Gonzalez Castelain,proteínas, purinas y pirimidinas, ácidos nucleicos, en prensa), Ascomycete coprófilo, (orden Pezizales,glucosamina, quitina y varias vitaminas. De acuerdo familia Ascobolaceae) que cumple un papel funda-a su capacidad para metabolizar distintos compues¬tos nitrogenados, tales como: N2, NO.,', N03',.NH4* ycompuestosorgánicos loshongos pueden clasificarsesegún el esquema clásicode Robbins (Robbins,1937).No existe evidencia inequívoca de utilización denitrógeno molecular por partede los hongos. El N02‘ Organismo y condiciones de cultivoes generalmente tóxico para la mayoría pero puedeser utilizado por algunas especies.

La mayoría de los hongos son capaces de utilizar longevisporus (BAFC), de la cual se hicieron aisla-tanto nitrógeno orgánico como inorgánico y, apa- mientos monospóricos a partir de ascosporas obte-rentemente muy pocas especies utilizan sólo fuen- nidas de cultivos en estiércol de vaca tindalizado.tes de nitrógeno orgánicas. Una de esas especies, Las ascosporas obtenidas en agar-agua 2%, fueronTeighemiomyces parasiticum, tiene un requerimiento tratadas con una solución de OHNa 0,3%.Se utilizóabsoluto por L-cisteína y casi total por L-valina y L- un medio de cultivo basal constituído por: glucosaleucina (Binder y Barnett, 1974). Otras especies, ta- 15 g; MgS04.7H20 0,5 g; HK2P04 0,6 g; H2KP04 0,5les como Blastocladiella emersonii, Catenaria g; CuS04. 5HzO 4 mg; MnCl2.4H20 0,09 mg; H3B04anguillulae y Leptomitus lacteus son capaces de usar 0,07 mg; NaMo04.2H20 0,02 mg; ZnCl210 mg; Feuno o más aminoácidos (Whitaker, 1976).

En numerosos trabajos se ha analizado la capaci- litro de H20 bidestilada. Las fuentes de nitrógenodad de los hongos para incorporar distintas fuentes ádicionadas al medio basal en las distintas expe¬de nitrógeno: (Nicholas, 1965; Roepper y French, riendas fueron: L-Asparagina (monohidrato), urea,1981; Peeler y Mullins, 1982; Lima y Mercuri; 1984; H(NH4)2P04, (NH4) N03 y NaNÓ3, siendo las mis¬

mas autoclavadas separadamente para evitar su al¬teración. Los cultivosen medio líquido fueron reali¬zados en erlenmeyers de 125 mi conteniendo 50 mide medio de cultivo, autoclavado a 121°C (15PSI)/20 min.

Los hongos requieren una fuente de nitrógeno

mental en la degradación de estiércol de herbívo¬ros.

MATERIALES V METODOS

Se trabajó con la cepa C-2665 de Saccobolus

Cl3 1 mg; HCl-Tiamina 0,1 mg; Biotina 0,5 pg por

* Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de CienciasExactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.Ciudad Univer¬sitaria, pabellón II, 4° piso, 1428. Buenos Aires, Argentina.

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Se inoculó con un disco de aproximadamente 5 ron en cajas de Petri por triplicado, se incubaron enmm de diámetro tomado de una colonia de 5-10 cámara termostatizada a 23° C por un período de15días de crecimiento sobre Bacto Agar 2%.

La incubación fue realizada en cámara apotecios en tres transectas por caja.termostatizada a 23° C, bajo iluminación continua yagitación constante a 125 rpm.

El micelio fue filtrado por embudo Buchner, a RESULTADOSpresión reducida, a través de papel de filtro y seca¬do en estufa a 90° C hasta peso seco constante. Losresultados se expresan como mg de peso seco/50 miento. Los mayores se observaron con asparaginami de medio. Las determinaciones de pH final fue- (349 mg) y urea (368 mg) siendo mínimo conron realizadas en el sobrenadante de cultivo con NH4N03 (18 mg), (Fig. 1, A,B y C); mientras que

H(NH4)2P04 y NaNQj presentaron crecimientosconsiderables, 152 mg y 250 mg, respectivamente,

días al cabo de los cuales se contó el número de

Todas las fuentes de nitrógeno registraron creci-

pH-metro Photovolt.

Curva de crecimiento y variaciones de pH del medio (Fig. 1, D y E).de cultivo. Se estudió el crecimiento vegetativo de S. La curva <ie crecimiento con NaNCX, mostró unalongevisporus en función del tiempo de incubación, y prolongada fase logarítmica, registrándoseel máxi-su relación con la variación del pH del medio de mo crecimiento el día 26°.cultivo,durante un períodode tiempo variable para Con respecto a las concentraciones óptimas decada fuente de nitrógeno. Dichas fuentes fueron cada fuente de nitrógeno (Fig. 2), la mínima concen-adicionadas al medio basal en cantidades equiva- tración ensayada de urea (0,4 g/1) ya registra unlentes a 0,75 g de nitrógeno/1. Se colectaron las elevadocrecimiento, ocurriendoel máximo a 0,6g/muestras hasta observar disminución del pesó seco 1, lo que equivale a 0,27 g/1 de nitrógeno. Con(inicio de la fase de autólisis). Las determinaciones asparagina, el aumento de crecimiento en funciónde peso seco y de pH se realizaron en el momento de la concéntración es más gradual, registrándosede la cosecha. el máximo a una concentración de 6 g/1, equivalen¬

te a 1,12g/1de nitrógeno. Cuandose utilizó NaNO,Determinación de la concentración óptima para cada y.H(NH4)2P04 el máximo crecimiento ocurrió a una

fuente de Nitrógeno. Se realizaron experiencias a fin concentración de 4,5 g/1 y 3,48 g/1 respectivamen-de determinar las concentraciones óptimas para te, equivalente en ambos casos a 0,75 g/1 decada fuente de nitrógeno, utilizándose el medio nitrógeno. Con NH4N03 el crecimiento registrado

. basal al cual se le adicionaron las fuentes en las fue muy bajo con todas las concentraciones ensaya-siguientes concentraciones: L-Asparagina, 2 g/1, 3 das. En los ensayos para determinar el pH óptimog/1, 4 g/1, 5 g/1; H(NH4)2P04, 3 g/1, 3,48 g/1, 4 g/1, de crecimiento el máximo se registró a pH 6,5. Por5 g/1; Urea, 0,4 g/1, 0,8 g/1, 1,2 g/1, 1,4 g/1, 1,6 g/1, debajo de pH 4 los valores de peso seco registrados2 g/1, 2,4 g/1, 2,8 g/1; (NH4)N03,1g/1, 2 g/1, 2,4 g/ son muy bajos (Fig. 3).1, 3 g/1, 4 g/1; N03Na, 2 g/1, 4 g/1, 4,5 g/1, 5 g/1, 6g/1, 8 g/1.

Con asparagina, NaN03 y urea se observó undescenso de pH en los primeros estadios de creci¬miento y un posterior aumento de éste hacia el día

PH óptimo de crecimiento. Se determinó el pH óp- de máximo crecimiento. En el caso de la asparaginatimo decrecimientoen medio basal másasparagina, (Fig. 1, A), dicho aumento fue de una unidad conutilizándose buffer Citrato-fosfato-borato 20 mM, respecto al inicial, aumentando una unidad máspH2-12. El rango de pH estudiado fue entre 2,5 y 8. hacia la fase de autólisis. Mientras que para urea yEl micelio fue cosechado el día de máximo creci- NaNO, dicho aumento fue de más dedos unidades,'miento determinándose el peso seco y el pH final manteniéndose luegoconstantedurante toda la cur-del sobrenadante. Las determinaciones de pH fue- va de crecimiento (Figs. 1, B y E). Con H(NH4)2P04

disminución del pH luego del día deron realizadas con pH-metro Photovolt. ocurrió unamáximo crecimiento llegando a un valor tres veces

Producción defructificaciones con distintasfuentes menor que el inicial manteniéndose luegoconstantede nitrógeno. Se estudió la cantidad de fructifica- (Fig.1, D). Cuandose utilizó NH4N03como fuente,ciones producidas en función de la concentración el pH del medio de cultivo descendió dos unidadesde nitrógeno, para cada fuente. Se agregó al medio con respecto al inicial manteniéndose luego cons-basal 20 g de Bacto agar por 1000 mi y las distintas tante a lo largó de toda la curva decrecimiento (Fig.fuentes de nitrógeno, en cantidades equivalentes a 1, C).0,071 - 0,146 - 0,215 - 0,286 - 0,35 - 0,42 - 0,49 - 0,57gramos de nitrógeno/litro. Los cultivos se realiza- máximocon 0,215g/1de nitrógeno para asparagina

El número de fructificaciones producidas fue

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A. M. RAMOS, Saccobolus longevisporus

peso seco (mg) PH1 10400

A350

8300

.t250

0 peso seco (mg) pH160 8

D200

1404

150

120 0100

2100

50 -f-K80

0 00 5 10 15 2°10 60400 3

B 40

______—h 2

8300 20 1

/4 0

0300(- 5 10 15 20 25

10200

E4

250 ---+, 8

A1002 200

.;

0

15000

5 .10 15 20 250 420100c

62

5015

5\0 0—-4

4 0 5 10 15 20-h -f- 25 30

días10

3

25

1

00255 10 15 200

días

Fig. 1.— Saccobolus longevisporus. Crecimiento (mg de peso seco) y variación del pH en mçdios con distintas fuentes de

nitrógeno: asparagina (A), urea (B), NH4N03(C), H(NH4)2P04(D) o NaN03(E) en función del tiempo. El contenido de .nitrógeno en cada una equivale a 0,75 g/1.

Peso seco pH

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peso seco (mg) N° de fructific.500 160

Jk,140

400

120

100300 '+ +_±_80

*20060

,

40

A+100

20

-t-4--± ± 0 TS-0'6 a 10o 2 4 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

g/1 Nitrógeno (g/1)

Fig. 2.— Saccobolus longevisporus. Crecimiento (mg de peso Fig. 4.— Saccobolus longevisporus. Producción deseco) con distintas concentraciones (g/1) de cada fuente de fructificaciones (N° de fructif.) en función de la concentra-nitrógeno. El peso seco se determinó el día de máximo ción de Nitrógeno (g/1), para cada una de las fuentes.

Asparagina —*—crecimiento para cada fuente.

NaNo3NaN03

NH4NO3 Asparagina

NH4NO3 UreaH(NH4)JP04 —x—Urea

peso seco (mg) y 0,286 g/1de nitrógeno para NaNOr Con NH4N03y urea sólo se produjeron escasas fructificacionescon la menor concentración, 0,071 g/1de nitrógeno,mientras que con H(NH4),P04 no hubo fructificaciónen ninguna de las concentraciones ensayadas (Fig.

500

too

4).

DISCUSION Y CONCLUSIONES300

Los resultados obtenidos indican que Saccoboluslongevisporus puede utilizar tanto nitrógeno orgáni¬co como inorgánico para el crecimiento vegetativopudiéndolo, entonces, incluir dentro del grupo II dela clasificación de Robbins (Robbins, op cit).

El mayor crecimiento ocurrió en los medios su¬plementados con urea y asparagina. El NaN03 y elH(NH4)2P04 resultaron buenas fuentes nitrogena¬das, no así el NH4N03 debido probablemente albrusco descenso de pH ocurrido durante los prime¬ros estadios de crecimiento.

200

100

o20 4 6 6 10 La urea pudo ser utilizada muy eficientemente

como fuente de nitrógeno, ya que con una bajaconcentración se registró un elevado crecimientocomparado con el resto de las fuentes. Una posible

PH

Fig. 3.— Saccobolus longevisporus. Crecimiento (mg de pesoseco) en función del pH en medio basal más Asparagina. El explicación es que la urea debe ser hidrolizada en elpeso seco se determinó el día de máximo crecimiento con medio extracelular previo a su incorporación y, por

lo tanto, convertida a HC03'.y NFL*. Simultánea-unente se podría utilizar el HCQ, como fuente de

Asparagina.pH

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A. M. RAMOS, Saccobolus longevisporus

carbono alternativa lo que justificaría el alto valoralcanzado. La utilización de HC03‘ ha sido citadapara varios hongos (Foster, 1949; Robinson, 1978;Lima y Mercuri, op cit.). Roon y Levenberg (1970)postularon, un patrón de hidrólisis extracelular deurea, asociado con la fijación heterotrófica de HC03"para Candida utilis.

El marcado retraso observado en la curva decrecimiento con N03Na puede deberse al hecho quela enzima Nitrato reductasa, responsable tanto delingreso como de la catálisis del primer paso en lareducción del N03‘ a NH4+ es, en la mayoría de losorganismos que la poseen, una enzima sustrato-inducible (Pateman y Kinghorn, 1976; Essgaouri yBotton, 1990). Por otro lado, en muchos hongos,como Neurospora crassa (Nason y Evans, 1953),Aspergillus niger, (Thiery,1977) y Sphaerostilbe repens,(Essgaouri y Botton op cit.), dicha enzima tiene unpH óptimo de actividad cercano a 7. Este pH esalcanzado en la curva de crecimiento con NaNo3después del día 15°, momento en el cual la utiliza¬ción de NO,' por parte del hongo aumenta el pHhasta ese nivel, induciendo un aumento en la activi¬dad de la nitrato reductasa.

Analizando los valores de pH a lo largo de lascurvas de crecimiento con distintos medios se ob¬serva que, cuando se utilizó NH4N03 la brusca dis¬minución ocurrida durante los primeros estadiosresultó inhibitoria para el crecimiento, mientras quecon H(NH4)2P04 el descenso ocurrió posteriormen¬te permitiendo un crecimiento moderado. El pHinicial y de los primeros estadios fue determinanteen el'crecimiento. La rápida disminución del pH enel medio de cultivo cuando se utilizó NH4N03 sedebe a que ésta es una sal de ácido fuerte y, supo¬niendo una más rápida incorporación del NH4+ queel N03‘, esto significa un aumento en la concentra¬ción de [H+] de intercambio y una disminuciónmuy rápida del pH a niveles inhibitorios, (Lilly yBamett, 1951; Lilly, 1965; Byrde, 1965; Nicholas, opcit.; Cochrane, 1965; Bull y Bushel, 1976; Lima yMercuri, op cit.; Garraway y Evans, 1984).

Con H (NH4)2P04 el pH baja más lentamente,por tratarse de una sal de ácido débil. Un casoinverso ocurrió cuando se utilizó NaNOn comofuente ya que la incorporación de N03‘, produce unaumento en los OH‘ de intercambio y, por lo tantoun aumento del pH del medio de cultivo (Lima yMercuri, op cit.). Con urea, el pH del médio de

• cultivo aumentó también considerablemente debi¬do a una posible incorporación más rápida delHCQ,' respecto del NH4*, considerando la hidrólisisenzimática (Lima y Mercuri, op cíf.).La leve dismi¬nución de pH ocurrida en los primeros estadios decrecimiento con todas las fuentes de nitrógeno, sedebe a la producción por parte del hongo de ácidos

orgánicos y C02 productos del metabolismo (Lillyy Bamett, 1951); paralelamente, de acuerdo a lafuente de nitrógeno ocurrirán los distintos procesosantes mencionados alcanzándose un determinadovalor de pH.

Los resultados obtenidos en los ensayos de de¬terminación de concentración óptima, muestran quela urea es utilizada más eficientemente que el restode las fuentes, mientras que para NaNOa,H(NH4)2P04 y asparagina la eficiencia es menor re¬gistrándose el máximo con una mayor concentra¬ción de nitrógeno. Los valores de pesoseco registra¬dos con distintos pH concuerdan con lo observadoen las curvas de crecimiento, donde los pH bajosresultaron inhibitorios, mientras que los pH entre5,5 y 8 presentaron crecimientos considerables.

Sólo la asparagina y el NaN03 resultaron bue¬nas fuentes para la producción de fructificaciones.La urea, que resultó una buena fuente para el creci¬miento vegetativo no lo fue para la producción defructificaciones en la relación de concentracionesglucosa-urea empleadas. Pardo, (1991) observó enAscobolus biguttulatus, que en el medio glucosa —urea se requieren bajas concentraciones denitrógeno y carbono para el desarrollo del procesosexual normal, sugiriendo- que la reproducciónsexual en este medio se produce como respuesta aun déficit nutricional. En Neurospora crassa, Sommeret al. (1987) observaron quealtas concentraciones denitrógeno inhiben la formación de protoperiteciosrequiriéndose una concentración mucho menorpara el desarrollodel proceso reproductivo que parael crecimiento Vegetativo. El H(NH4)2P04, que per¬mitió un buen crecimiento vegetativo, no resultóuna buena fuente para la fructificación, esto con¬cuerda con lo observado por Galvagno (1976) enAscobolus crenulalus.

Varios autores han encontrado que la formacióndeestructuras reproductivas en Ascomycetessupe¬riores se ve afectada por los compuestosinorgánicos de NH4+, debido probablemente al des¬censo marcado del.pH (Ross y Hamlin,1965; Ross yBremmer, 1971; Qureshi y Page, 1972).

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la Dra. Flavia Forchiassin por la lecturacrítica del manuscrito. AL CONICET por la financiaciónparcial de este irabajo.

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