najważniejsze odmiany techniki pcr

Najważniejsze odmiany techniki PCRNajważniejsze odmiany techniki PCR

Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)Celem asymetrycznego PCR jest amplifikacja Celem asymetrycznego PCR jest amplifikacja jednoniciowego DNA o określonej długości. jednoniciowego DNA o określonej długości.

Taki zsyntetyzowany przez reakcję PCR produkt Taki zsyntetyzowany przez reakcję PCR produkt momożże być stosowany jako:e być stosowany jako:specyficzna sonda molekularna w hybrydyzacji,specyficzna sonda molekularna w hybrydyzacji,matryca w reakcjach sekwencjonowania DNA. matryca w reakcjach sekwencjonowania DNA.

Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)

Asymetryczny PCR moAsymetryczny PCR możżna wykonać w dwojaki sposób na wykonać w dwojaki sposób stosując:stosując:

jednoetapowa amplifikacja (jednoetapowa amplifikacja (nierówne stęnierówne stężżenie primerów enie primerów od początku reakcji)od początku reakcji)

Produkt amplifikacji otrzymuje się przez zastosowanie Produkt amplifikacji otrzymuje się przez zastosowanie dwóch ródwóch różżnych primerów, z których jeden całkowicie ulega nych primerów, z których jeden całkowicie ulega wyczerpaniu w czasie pierwszych cykli amplifikacji. W wyczerpaniu w czasie pierwszych cykli amplifikacji. W następnych cyklach tylko pozostały w nadmiarze primer monastępnych cyklach tylko pozostały w nadmiarze primer możże e ulegać elongacji, dając właściwy produkt asymetrycznego PCR ulegać elongacji, dając właściwy produkt asymetrycznego PCR - jednoniciowy DNA o określonej długości. Amplifikacja od - jednoniciowy DNA o określonej długości. Amplifikacja od momentu wyczerpania się jednego z primerów nie zachodzi jumomentu wyczerpania się jednego z primerów nie zachodzi jużż w sposób ekspotencjalny, lecz liniowy.w sposób ekspotencjalny, lecz liniowy. Ta metoda wymaga Ta metoda wymaga dużej liczby cykli, a to jest potencjalnym źródłem błędów w dużej liczby cykli, a to jest potencjalnym źródłem błędów w inkorporacji właściwych nukleotydów.inkorporacji właściwych nukleotydów.

Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)Asymetryczny PCR (an. asymmetric PCR)

dwuetapowa amplifikacjadwuetapowa amplifikacja (tylko jeden primer do (tylko jeden primer do reamplifikacji jednej nici DNA na matrycy dwuniciowego reamplifikacji jednej nici DNA na matrycy dwuniciowego produktu PCR występującego w mieszaninie reakcyjnej) produktu PCR występującego w mieszaninie reakcyjnej)

Jest to metoda o wiele bardziej wydajna, Jest to metoda o wiele bardziej wydajna, poniewaponieważż startuje się z wysokokopijnej, sprawdzonej, o startuje się z wysokokopijnej, sprawdzonej, o określonej już pod względem długości matrycy DNA (jest określonej już pod względem długości matrycy DNA (jest to ważne ze względu na liniowy charakter amplifikacji). to ważne ze względu na liniowy charakter amplifikacji). Stosując tą technikę można zamplifikować kilka pmoli Stosując tą technikę można zamplifikować kilka pmoli pojedynczo-niciowego DNA (ssDNA). Taka ilość ssDNA pojedynczo-niciowego DNA (ssDNA). Taka ilość ssDNA może już być analizowana w barwionym bromkiem może już być analizowana w barwionym bromkiem etydyny żelu agarozowym.etydyny żelu agarozowym.

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA, PASA, ASP, ARMS) (ang. allelo-specific amplification)(ang. allelo-specific amplification)

Amplifikacja allelo-specyficzna (ASA), jest równieAmplifikacja allelo-specyficzna (ASA), jest równieżż nazywana PASA (ang. nazywana PASA (ang. PCR Amplification of Specific PCR Amplification of Specific Alleles), ASP (ang. Allele-Specific PCR) lub ARMS (ang. Alleles), ASP (ang. Allele-Specific PCR) lub ARMS (ang. Amplification Refractory Mutation System).Amplification Refractory Mutation System).

Podstawą tej odmiany techniki PCR jest załoPodstawą tej odmiany techniki PCR jest założżenie, enie, żże e niekomplementarność nukleotydów przy końcu 3' niekomplementarność nukleotydów przy końcu 3' jednego lub obu stosowanych primerów zapobiega jednego lub obu stosowanych primerów zapobiega elongacji końca 3' primera przez polimerazę elongacji końca 3' primera przez polimerazę TaqTaq. . Oczywistym jest więc, Oczywistym jest więc, żże moe możżna tutaj stosować tylko na tutaj stosować tylko polimerazy DNA pozbawione aktywności 3'-5' polimerazy DNA pozbawione aktywności 3'-5' egzonukleazy. egzonukleazy.

Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest determinowana Wydajna inicjacja syntezy DNA w takim PCR jest determinowana przez sekwencję ostatniego lub dwóch ostatnich nukleotydów na przez sekwencję ostatniego lub dwóch ostatnich nukleotydów na końcu 3' primerów.końcu 3' primerów.

Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele są Jeśli są one komplementarne do matrycy, to badane allele są wydajnie amplifikowane, a przy braku komplementarności dla wydajnie amplifikowane, a przy braku komplementarności dla innych alleli, amplifikacja ich jest zahamowana. innych alleli, amplifikacja ich jest zahamowana.

Zaleca się stosowanie krótkich primerów (np. 14 nt). Zaleca się stosowanie krótkich primerów (np. 14 nt). KaKażżdy allel dy allel musi być testowany w oddzielnej probówce reakcyjnej. musi być testowany w oddzielnej probówce reakcyjnej. Stąd, ASA Stąd, ASA wymaga bezwzględnie koamplifikacji kontrolnego DNA dla wymaga bezwzględnie koamplifikacji kontrolnego DNA dla sprawdzenia mosprawdzenia możżliwego zahamowania reakcji. Stosowanie takiej liwego zahamowania reakcji. Stosowanie takiej kontroli jest kluczowe w tej metodzie, poniewakontroli jest kluczowe w tej metodzie, ponieważż brak produktu w brak produktu w reakcji ma takie same znaczenie diagnostyczne jak jego obecność. reakcji ma takie same znaczenie diagnostyczne jak jego obecność.


ASA jest metodą wykrywania polimorfizmu alleli, istnienia ASA jest metodą wykrywania polimorfizmu alleli, istnienia punktowych mutacji i jest wykorzystywana do: punktowych mutacji i jest wykorzystywana do: wyjaśniania mechanizmu badanej choroby,wyjaśniania mechanizmu badanej choroby,

wyjaśniania ewolucyjnych powiązań między gatunkami, wyjaśniania ewolucyjnych powiązań między gatunkami,

badania mechanizmu działania substancji mutagennych, badania mechanizmu działania substancji mutagennych,

wykrywania sprzęwykrywania sprzężżonych z chorobą genów w diagnostyce pewnych onych z chorobą genów w diagnostyce pewnych chorób, chorób,

badania zasad powstawania oporności przeciw badania zasad powstawania oporności przeciw chemioterapeutykom u mikroorganizmów, chemioterapeutykom u mikroorganizmów,

badania powiązań genetycznych.badania powiązań genetycznych.



5'3'

5' 3'

allel 1

GC

primer 1

primer 3

5'3'

5' 3'C

primer 1

primer 3

produkt PCR

5'3'

5' 3'

allel 1

G

primer 3

A

B

primer 2

G

brak produktu PCR

5'3'

5' 3'GC

primer 3

5'3'

5' 3'

primer 3

produkt PCR

primer 2

allel 2

5'3'

5' 3'

primer 3

brak produktu PCR

allel 2primer 1

C

C

primer 2

G

Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)

Metoda ta polega na zastosowaniu Metoda ta polega na zastosowaniu wewnętrznej pary primerów w stosunku do wewnętrznej pary primerów w stosunku do preegzystującego produktu amplifikacji preegzystującego produktu amplifikacji ((dwuetapowa amplifikacjadwuetapowa amplifikacja).).

Produkt tej reakcji może być stosowany jako:Produkt tej reakcji może być stosowany jako:

1.1. sonda molekularna w hybrydyzacji,sonda molekularna w hybrydyzacji,

2.2. kontrola specyficzności amplifikacji matrycy. kontrola specyficzności amplifikacji matrycy.

Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)

Dla celów diagnostycznych (aby wyeliminować możliwość Dla celów diagnostycznych (aby wyeliminować możliwość kontaminacji) stosuje się reakcję wewnętrznego PCR w kontaminacji) stosuje się reakcję wewnętrznego PCR w jednej probówce reakcyjnej (jednej probówce reakcyjnej (jednoetapowa amplifikacjajednoetapowa amplifikacja) z ) z użyciem dwóch par primerów charakteryzującymi się użyciem dwóch par primerów charakteryzującymi się różnymi temperaturami topnienia (Tm). różnymi temperaturami topnienia (Tm).

Hybrydyzacja wewnętrznych primerów podczas Hybrydyzacja wewnętrznych primerów podczas pierwszych cykli jest hamowana z powodu ich niskiej pierwszych cykli jest hamowana z powodu ich niskiej temperatury topnienia (np. temperatury topnienia (np. Tm dla pary primerów Tm dla pary primerów zewnętrznych wynosi 80zewnętrznych wynosi 80C, a dla pary primerów C, a dla pary primerów

wewnętrznych - 45wewnętrznych - 45C).C).

Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)Wewnętrzny PCR (ang. nested PCR)W pierwszych cyklach takiej reakcji PCR zachodzi amplifikacja W pierwszych cyklach takiej reakcji PCR zachodzi amplifikacja długiego fragmentu DNA z udziałem primerów zewnętrznych (15-długiego fragmentu DNA z udziałem primerów zewnętrznych (15-20 cykli, dwutemperaturowy profil reakcji: denaturacja 9520 cykli, dwutemperaturowy profil reakcji: denaturacja 95C przez C przez 20 s, dołączanie primerów i elongacja w 7220 s, dołączanie primerów i elongacja w 72C przez 30 s).C przez 30 s).

Następne 16 cykli wykonuje się w następujący sposób: Następne 16 cykli wykonuje się w następujący sposób: denaturacja przy 92denaturacja przy 92C przez 20 s, dołączanie primerów przez 20 C przez 20 s, dołączanie primerów przez 20 s, redukując temperaturę o 2s, redukując temperaturę o 2C co 2 cykle startując od C co 2 cykle startując od temperatury 66temperatury 66C i elongacja przy 72C i elongacja przy 72C przez 20 s. Na tym C przez 20 s. Na tym etapie wytwarzają się produkty różnej wielkości (resztkowa etapie wytwarzają się produkty różnej wielkości (resztkowa amplifikacja z udziałem primerów zewnętrznych, mieszane amplifikacja z udziałem primerów zewnętrznych, mieszane produkty powstałe na bazie primera zewnętrznego i produkty powstałe na bazie primera zewnętrznego i wewnętrznego i produkty amplifikacji z primerami wewnętrznymi.wewnętrznego i produkty amplifikacji z primerami wewnętrznymi.

Trzeci etap reakcji to wytwarzanie tylko krótkich fragmentów z Trzeci etap reakcji to wytwarzanie tylko krótkich fragmentów z wykorzystaniem primerów wewnętrznych (37-45 cykli, wykorzystaniem primerów wewnętrznych (37-45 cykli, denaturacja 88denaturacja 88C przez 20 s, dołączanie primerów 50C przez 20 s, dołączanie primerów 50C przez 20 C przez 20 s, elongacja przy 72s, elongacja przy 72C przez 20 s.C przez 20 s.

Multipleksowy PCR (ang. multiplex PCR)Multipleksowy PCR (ang. multiplex PCR)

Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację kilku Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację kilku regionów genomu w jednej probówce przy zastosowaniu regionów genomu w jednej probówce przy zastosowaniu różnych par primerów. różnych par primerów.

Taka równoczesna amplifikacja więcej niTaka równoczesna amplifikacja więcej niżż jednego regionu jednego regionu DNA w jednej mieszaninie reakcyjnej obniDNA w jednej mieszaninie reakcyjnej obniżża koszty a koszty eksperymentów, oszczędza pracę i czas, a takeksperymentów, oszczędza pracę i czas, a takżże e zmniejsza ryzyko kontaminacji. zmniejsza ryzyko kontaminacji.

Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie zastosowanie, Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie zastosowanie, np. do wykrywania czynników zakaźnych, diagnostyki np. do wykrywania czynników zakaźnych, diagnostyki chorób genetycznie uwarunkowanych, wykrywania chorób genetycznie uwarunkowanych, wykrywania róróżżnego typu mutacji.nego typu mutacji.

Różnicowy PCR (ang. differential PCR)Różnicowy PCR (ang. differential PCR)

Podstawą róPodstawą różżnicowego PCR jest monicowego PCR jest możżliwość liwość amplifikacji genu targetowego i fragmentu amplifikacji genu targetowego i fragmentu odnośnikowego w tej samej probówce reakcyjnej. odnośnikowego w tej samej probówce reakcyjnej.

Taka równoczesna amplifikacja ilościowo Taka równoczesna amplifikacja ilościowo określonego fragmentu odnośnikowego i określonego fragmentu odnośnikowego i fragmentu o nieznanej liczbie kopii w jednej fragmentu o nieznanej liczbie kopii w jednej probówce moprobówce możże posłue posłużżyć do ilościowego yć do ilościowego określenia sekwencji targetowej.określenia sekwencji targetowej.

Amplifikacja nieznanych sekwencjiAmplifikacja nieznanych sekwencji

MoMożżliwość specyficznej amplifikacji DNA zaleliwość specyficznej amplifikacji DNA zależży od tego czy y od tego czy znamy jego sekwencję nukleotydową. Często jednak znamy jego sekwencję nukleotydową. Często jednak dysponujemy matrycowym DNA, którego sekwencja dysponujemy matrycowym DNA, którego sekwencja nukleotydowa jest całkowicie nieznana, a dysponujemy tylko nukleotydowa jest całkowicie nieznana, a dysponujemy tylko znajomością sekwencji nukleotydowej pokrewnych genów znajomością sekwencji nukleotydowej pokrewnych genów pochodzących z innych gatunków. W takich sytuacjach jednak pochodzących z innych gatunków. W takich sytuacjach jednak amplifikacja PCR jest równieamplifikacja PCR jest równieżż mo możżliwa przy zastosowaniu liwa przy zastosowaniu zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych (tzw. zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych (tzw. primery primery uniwersalneuniwersalne).).

Inną strategią jest zaprojektowanie primerów na podstawie Inną strategią jest zaprojektowanie primerów na podstawie znajomości sekwencji aminokwasowej peptydów lub białek. To znajomości sekwencji aminokwasowej peptydów lub białek. To podejście napotyka trudności ze względu na zdegenerowanie podejście napotyka trudności ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego (większość aminokwasów jest kodowana kodu genetycznego (większość aminokwasów jest kodowana przez więcej niprzez więcej niżż jeden kodon). Stąd, primery projektowane na jeden kodon). Stąd, primery projektowane na podstawie sekwencji aminokwasowej powinny być w pełni podstawie sekwencji aminokwasowej powinny być w pełni redundentne. Z tego teredundentne. Z tego teżż względu na ogół stosuje się krótkie względu na ogół stosuje się krótkie primery, np. stosunkowo krótki primer złoprimery, np. stosunkowo krótki primer złożżony z 15 ony z 15 nukleotydów ma junukleotydów ma jużż 512 ró 512 różżnych permutacji. nych permutacji.

Sekwencja nukleotydowa primera ustalona na podstawie Sekwencja nukleotydowa primera ustalona na podstawie sekwencji aminokwasowej peptydusekwencji aminokwasowej peptydu

Sekwencja Sekwencja peptydupeptydu

LL AA TT NN NN

OdpowiadOdpowiadające ające kodonykodony

C T GC T G

C T AC T A

C T TC T T

C T CC T C

T T AT T A

T T GT T G

GC AGC A

GC TGC T

GC CGC C

GC GGC G

AC TAC T

AC AAC A

AC CAC C

AC GAC G

AA TAA T

AA CAA C

AA TAA T

AA CAA C

Sekwencja Sekwencja primeraprimera

[C,T] T [N][C,T] T [N] GC [N]GC [N] AC [N]AC [N] AAAA [T,C] [T,C] AA AA [T,C][T,C]

Amplifikacja nieznanych sekwencjiAmplifikacja nieznanych sekwencji

Pewnym rozwiązaniem w amplifikacji nieznanych sekwencji jest Pewnym rozwiązaniem w amplifikacji nieznanych sekwencji jest zastosowanie uniwersalnej zasady jaką jest inozyna, którą zastosowanie uniwersalnej zasady jaką jest inozyna, którą momożżna podstawić w miejscach okupowanych przez 3 lub 4 na podstawić w miejscach okupowanych przez 3 lub 4 róróżżne zasady. Inozyna jest zasadą purynową, naturalnie ne zasady. Inozyna jest zasadą purynową, naturalnie występującą w rzadko występującym nukleotydzie pewnych występującą w rzadko występującym nukleotydzie pewnych rodzaji tRNA i ma zdolność parowania z wszystkimi czteroma rodzaji tRNA i ma zdolność parowania z wszystkimi czteroma podstawowymi zasadami (A, C, G, T). Nie zaleca się podstawowymi zasadami (A, C, G, T). Nie zaleca się stosowania inozynowych nukleotydów przy końcu 3' primera.stosowania inozynowych nukleotydów przy końcu 3' primera.

Zastosowanie wysoce zdegenerowanych primerów do reakcji Zastosowanie wysoce zdegenerowanych primerów do reakcji PCR nie wymaga PCR nie wymaga żżadnych specyficznych warunków reakcji, adnych specyficznych warunków reakcji, chociachociażż obni obniżżenie temperatury dołączania primerów moenie temperatury dołączania primerów możże być e być konieczne w niektórych przypadkach. konieczne w niektórych przypadkach.

Czynniki wpływające na efektywność PCR

Wiele różnych czynników może wpływać na efektywność Wiele różnych czynników może wpływać na efektywność amplifikacji DNA metodą PCR. Oczywistym jest, że w amplifikacji DNA metodą PCR. Oczywistym jest, że w zoptymalizowanym systemie niewielka zmiana jednego zoptymalizowanym systemie niewielka zmiana jednego lub kilku zasadniczych czynników reakcji będzie miała lub kilku zasadniczych czynników reakcji będzie miała duży wpływ na efektywność procesu. duży wpływ na efektywność procesu.

Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR Najbardziej czułymi na zmiany elementami reakcji PCR są: są:

1.1. stężenie jonów Mg, stężenie jonów Mg, 2.2. dNTP, dNTP, 3.3. aktywność polimerazy Taq, aktywność polimerazy Taq, 4.4. zmiana profilu temperaturowego cyklu, a szczególnie zmiana profilu temperaturowego cyklu, a szczególnie

zmiana temperatury dołączania primerów. zmiana temperatury dołączania primerów.


Stwierdzono na przykład, że:Stwierdzono na przykład, że:10 mM MgCl10 mM MgCl22 hamuje aktywność polimerazy Taq w 40- hamuje aktywność polimerazy Taq w 40-50%,50%,gdy stężenie jonów jednowartościowych przekroczy 75 gdy stężenie jonów jednowartościowych przekroczy 75 mM KCl obserwowany jest wyraźny efekt hamujący. mM KCl obserwowany jest wyraźny efekt hamujący.

Nawet w przypadku zoptymalizowania parametrów reakcji Nawet w przypadku zoptymalizowania parametrów reakcji PCR, wyniki mogą być niesatysfakcjonujące i wtedy PCR, wyniki mogą być niesatysfakcjonujące i wtedy należy rozważyć wpływ innych cznników mogących należy rozważyć wpływ innych cznników mogących obniżać efektywność. obniżać efektywność.

Do nich należą między innymi:Do nich należą między innymi: natura natywnego materiału matrycy, natura natywnego materiału matrycy, stosowana metoda do izolacji matrycowego DNA, stosowana metoda do izolacji matrycowego DNA, związki chemiczne użyte do izolacji DNA i w śladowych związki chemiczne użyte do izolacji DNA i w śladowych ilościach wprowadzone do próbki reakcyjnej PCR. ilościach wprowadzone do próbki reakcyjnej PCR.


Hamowanie przez analizowany materiałHamowanie przez analizowany materiał

Typowymi źródłami matrycowego DNA dla Typowymi źródłami matrycowego DNA dla reakcji PCR w diagnostyce są między innymi: reakcji PCR w diagnostyce są między innymi:

mocz, mocz,

krew obwodowa, krew obwodowa,

wymazy komórkowe, wymazy komórkowe,

ślina, ślina,

płyn mózgowo rdzeniowy, płyn mózgowo rdzeniowy,

materiały biopsji. materiały biopsji.


Mocz zawiera wiele inhibitorów reakcji PCR.Mocz zawiera wiele inhibitorów reakcji PCR.

Izolacja matrycowego DNA z moczu jest prosta. Polega Izolacja matrycowego DNA z moczu jest prosta. Polega na 10 min gotowaniu próbki moczu, co wystarcza do na 10 min gotowaniu próbki moczu, co wystarcza do uwolnienia DNA z materiału komórkowego i cząstek uwolnienia DNA z materiału komórkowego i cząstek zakaźnych (np. wirusów) przez hydrolizę struktur zakaźnych (np. wirusów) przez hydrolizę struktur białkowych. Takie próbki DNA muszą zostać białkowych. Takie próbki DNA muszą zostać rozcieńczone, aby nie hamowały reakcji PCR. Z drugiej rozcieńczone, aby nie hamowały reakcji PCR. Z drugiej jednak strony rozcieńczenie obniża ilość czynników jednak strony rozcieńczenie obniża ilość czynników zakaźnych w jednostce objętości, co oczywiście utrudnia zakaźnych w jednostce objętości, co oczywiście utrudnia nieraz wykrywalność patogenów (trudna interpretacja nieraz wykrywalność patogenów (trudna interpretacja wyników negatywnych). Trudno dokładnie określić naturę wyników negatywnych). Trudno dokładnie określić naturę tych inhibitorów, stąd reakcje PCR z takimi nieznanymi tych inhibitorów, stąd reakcje PCR z takimi nieznanymi substancjami inhibitorowymi wymagają bezwzględnie substancjami inhibitorowymi wymagają bezwzględnie dobrych próbek kontrolnych, które określą aktualną dobrych próbek kontrolnych, które określą aktualną wrażliwość na inhibicję.wrażliwość na inhibicję.

Czynniki wpływające na efektywność PCRStosowanie krwi obwodowej jako źródło matrycowego DNA czasami czyni Stosowanie krwi obwodowej jako źródło matrycowego DNA czasami czyni pewne problemy.pewne problemy.

Próbki krwi powinny być pobierane do probówek zawierających EDTA (1 Próbki krwi powinny być pobierane do probówek zawierających EDTA (1 mg/ml) jako antykoagulenta. mg/ml) jako antykoagulenta.

Próbki pobierane na heparynę (14.3 U/ml krwi) nie nadają się do celów Próbki pobierane na heparynę (14.3 U/ml krwi) nie nadają się do celów PCR. Heparyna całkowicie hamuje amplifikację matrycowego DNA podczas PCR. Heparyna całkowicie hamuje amplifikację matrycowego DNA podczas PCR. Taki efekt działania heparyny nie może być zniesiony przez żadną ze PCR. Taki efekt działania heparyny nie może być zniesiony przez żadną ze znanych metod izolacji i oczyszczania DNA. Jedyną możliwością jest znanych metod izolacji i oczyszczania DNA. Jedyną możliwością jest inkubowanie DNA z heparynazą I lub II. inkubowanie DNA z heparynazą I lub II.

Ekstrakcja DNA z krwi powinna wyeliminować zanieczyszczenia związkami Ekstrakcja DNA z krwi powinna wyeliminować zanieczyszczenia związkami porfirynowymi pochodzącymi z hemu (dobre oddzielenie erytrocytów od porfirynowymi pochodzącymi z hemu (dobre oddzielenie erytrocytów od leukocytów). Są one substancjami najsilniej hamującymi reakcje PCR leukocytów). Są one substancjami najsilniej hamującymi reakcje PCR wykonywanych z matrycowym DNA otrzymywanym z krwi. Pozbawione wykonywanych z matrycowym DNA otrzymywanym z krwi. Pozbawione porfiryn próbki DNA z krwi najwydajniej otrzymuje się poddając najpierw porfiryn próbki DNA z krwi najwydajniej otrzymuje się poddając najpierw wybiórczej lizie erytrocyty, a następnie leukocyty selektywnie osadza się wybiórczej lizie erytrocyty, a następnie leukocyty selektywnie osadza się przez wirowanie i przemywa buforem. Z oczyszczonych od erytrocytów przez wirowanie i przemywa buforem. Z oczyszczonych od erytrocytów komórek leukocytów izoluje się DNA, który jest pozbawiony porfiryn. komórek leukocytów izoluje się DNA, który jest pozbawiony porfiryn.

Hamowanie przez związki chemiczne Hamowanie przez związki chemiczne stosowane do izolacji DNAstosowane do izolacji DNA

Powszechnie do izolacji DNA używa się detergentów Powszechnie do izolacji DNA używa się detergentów potrzebnych do lizy komórek i denaturacji białek związanych z potrzebnych do lizy komórek i denaturacji białek związanych z kwasami nukleinowymi. kwasami nukleinowymi.

Detergenty ogólnie można podzielić na niejonowe i jonowe. Detergenty ogólnie można podzielić na niejonowe i jonowe. Nonidet P-40, Tween 20, Triton X-1000 i N-oktyloglikozyd Nonidet P-40, Tween 20, Triton X-1000 i N-oktyloglikozyd należą do grupy detergentów niejonowych. Natomiast należą do grupy detergentów niejonowych. Natomiast dezoksycholan sodu, sarkozyl i sól sodowa siarczanu dodecylu dezoksycholan sodu, sarkozyl i sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) należą do grupy detergentów jonowych. (SDS) należą do grupy detergentów jonowych.

Zastosowanie detergentów niejonowych zamiast detergentów Zastosowanie detergentów niejonowych zamiast detergentów jonowych w izolacji DNA dla celów PCR jest korzystniejsze. jonowych w izolacji DNA dla celów PCR jest korzystniejsze.


Wykazano, że detergenty niejonowe nie hamują aktywności Wykazano, że detergenty niejonowe nie hamują aktywności polimerazy polimerazy TaqTaq w stężeniach <5%, za wyjątkiem N-oktyloglikozydu, w stężeniach <5%, za wyjątkiem N-oktyloglikozydu, który hamuje reakcję PCR w stężeniach powyżej 0.4%. Stąd, który hamuje reakcję PCR w stężeniach powyżej 0.4%. Stąd, niekonieczna staje się ekstrakcja fenolowa lizatów komórkowych niekonieczna staje się ekstrakcja fenolowa lizatów komórkowych poddanych działaniu proteinazy K z detergentem niejonowym przed poddanych działaniu proteinazy K z detergentem niejonowym przed nastawieniem reakcji PCR (proteinazę K inaktywuje się termicznie). nastawieniem reakcji PCR (proteinazę K inaktywuje się termicznie). Zaoszczędza to znacznie czas przygotowania próbki DNA do PCR i Zaoszczędza to znacznie czas przygotowania próbki DNA do PCR i redukuje możliwość zaistnienia kontaminacji.redukuje możliwość zaistnienia kontaminacji.

Detergenty jonowe hamują aktywność polimerazy Taq już przy Detergenty jonowe hamują aktywność polimerazy Taq już przy bardzo niskich stężeniach. Jonowe detergenty stosowane do lizy bardzo niskich stężeniach. Jonowe detergenty stosowane do lizy komórek i denaturacji białek muszą być usunięte przez ekstrakcję komórek i denaturacji białek muszą być usunięte przez ekstrakcję fenolową i precypitację etanolową przed nastawieniem reakcji PCR. fenolową i precypitację etanolową przed nastawieniem reakcji PCR. Jest to spowodowane tym, że większość detergentów stosuje się w Jest to spowodowane tym, że większość detergentów stosuje się w stężeniach wyższych niż te które są kompatibilne z PCR (np. stężeniach wyższych niż te które są kompatibilne z PCR (np. SDS SDS bardzo często stosuje się w 2% stężeniu końcowym). bardzo często stosuje się w 2% stężeniu końcowym).


Stwierdzono, że 0.001% SDS ma niewielki efekt stymulacyjny Stwierdzono, że 0.001% SDS ma niewielki efekt stymulacyjny na PCR. na PCR. Natomiast, 0.01% SDS obniża aktywność polimerazy Natomiast, 0.01% SDS obniża aktywność polimerazy TaqTaq do do 10%, a 0.1% SDS hamuje prawie całkowicie reakcję PCR 10%, a 0.1% SDS hamuje prawie całkowicie reakcję PCR (aktywność polimerazy (aktywność polimerazy TaqTaq <0.1% w stosunku do pełnej <0.1% w stosunku do pełnej aktywności). aktywności). Hamujący efekt niskich stężeń SDS może być kompensowany Hamujący efekt niskich stężeń SDS może być kompensowany przez pewne niejonowe detergenty (np. 0.5% Tween 20 przez pewne niejonowe detergenty (np. 0.5% Tween 20 przeciwdziała hamowaniu reakcji PCR przez 0.1% SDS). przeciwdziała hamowaniu reakcji PCR przez 0.1% SDS). Jednak bardziej zalecane jest całkowite usuwanie SDS z Jednak bardziej zalecane jest całkowite usuwanie SDS z próbki DNA. próbki DNA. Wydajną eliminację SDS z próbki DNA uzyskuje się przez Wydajną eliminację SDS z próbki DNA uzyskuje się przez ekstrakcję fenolową i następnie precypitację etanolową ekstrakcję fenolową i następnie precypitację etanolową stosując 0.2 M chlorek sodu zamiast octanu amonu przed stosując 0.2 M chlorek sodu zamiast octanu amonu przed dodaniem etanolu, co pozostawia SDS w stanie dodaniem etanolu, co pozostawia SDS w stanie rozpuszczonym, zapobiegając koprecypitacji SDS z kwasami rozpuszczonym, zapobiegając koprecypitacji SDS z kwasami nukleinowymi.nukleinowymi.


Proteinaza K jest proteazą często stosowaną w metodach lizy Proteinaza K jest proteazą często stosowaną w metodach lizy komórek i izolacji DNA. Pozostawienie nawet resztkowej komórek i izolacji DNA. Pozostawienie nawet resztkowej aktywności tego enzymu w mieszaninie reakcyjnej może aktywności tego enzymu w mieszaninie reakcyjnej może bardzo szybko zdegradować proteolitycznie polimerazę bardzo szybko zdegradować proteolitycznie polimerazę TaqTaq. . Stąd, należy bezwzględnie dobrze zinaktywować proteinazę K Stąd, należy bezwzględnie dobrze zinaktywować proteinazę K przez ogrzanie lizatu komórkowego lub oczyszczonych próbek przez ogrzanie lizatu komórkowego lub oczyszczonych próbek DNA w temperaturze 95DNA w temperaturze 95C przez 10 min.C przez 10 min.

Ślady fenolu w próbce DNA do PCR hamują aktywność Ślady fenolu w próbce DNA do PCR hamują aktywność polimerazy DNA. Problem ten można wyeliminować usuwając polimerazy DNA. Problem ten można wyeliminować usuwając ślady fenolu pochodzącego z ekstrakcji fenolowej przez ślady fenolu pochodzącego z ekstrakcji fenolowej przez końcową ekstrakcję DNA mieszaniną chloroform-alkohol końcową ekstrakcję DNA mieszaniną chloroform-alkohol izoamylowy (49:1). Następnie DNA precypituje się z etanolem izoamylowy (49:1). Następnie DNA precypituje się z etanolem i solą, a resztki soli usuwa się przez przemywanie i solą, a resztki soli usuwa się przez przemywanie sprecypitowanego DNA 70-80% etanolem.sprecypitowanego DNA 70-80% etanolem.


Stężenie soli w mieszaninie reakcyjnej w znaczny sposób Stężenie soli w mieszaninie reakcyjnej w znaczny sposób wpływa na aktywność polimerazy wpływa na aktywność polimerazy TaqTaq. . 50 mM chlorek amonu daje niewielką inhibicję, 50 mM chlorek amonu daje niewielką inhibicję, 50 mM octan amonu jest bez wp50 mM octan amonu jest bez wpłływu na efektywność reakcji, ywu na efektywność reakcji, 50 mM chlorek sodu stymuluje reakcję o 25-30%. 50 mM chlorek sodu stymuluje reakcję o 25-30%. Powyższe dane trzeba brać pod uwagę, ponieważ Powyższe dane trzeba brać pod uwagę, ponieważ koprecypitowane z matrycowym DNA sole mogą wpływać na koprecypitowane z matrycowym DNA sole mogą wpływać na aktywność polimerazy aktywność polimerazy TaqTaq. . Inne jony wprowadzane do mieszaniny reakcyjnej PCR, np. Inne jony wprowadzane do mieszaniny reakcyjnej PCR, np. jony potasu, wpływają na Tm primera. Tę zależność wyraża jony potasu, wpływają na Tm primera. Tę zależność wyraża wzór:wzór:

Tm = 81.5 + 16.6(log10 [J+]) + 0.41 (%G+C) - (600/l) - 0.63 Tm = 81.5 + 16.6(log10 [J+]) + 0.41 (%G+C) - (600/l) - 0.63 (%FA).(%FA).


Badano także wpływ sperminy, spermidyny i poliamin na Badano także wpływ sperminy, spermidyny i poliamin na efektywność reakcji PCR. efektywność reakcji PCR. Wykazano, że:Wykazano, że:spermina i spermidyna w stężeniach od 0.5 do 3 mM nie spermina i spermidyna w stężeniach od 0.5 do 3 mM nie ma wpma wpłływu na amplifikację PCR, ywu na amplifikację PCR, według innych autorów obserwuje się wyraźną stymulację według innych autorów obserwuje się wyraźną stymulację amplifikacji PCR przez sperminę lub spermidynę w amplifikacji PCR przez sperminę lub spermidynę w stężeniach od 0.4 do 0.6 mM,stężeniach od 0.4 do 0.6 mM,spermidyna działa skuteczniej od sperminy. spermidyna działa skuteczniej od sperminy. Pokazano również pozytywny wpływ poliamin na Pokazano również pozytywny wpływ poliamin na amplifikację PCR z optimum przy stężeniu 0.6 mM. amplifikację PCR z optimum przy stężeniu 0.6 mM. Formamid (3%) w kombinacji z poliaminą (0.6 mM) Formamid (3%) w kombinacji z poliaminą (0.6 mM) częściowo hamowaczęściowo hamowałł stymulacyjny efekt poliamin. Taki sam stymulacyjny efekt poliamin. Taki sam efekt wykazywaefekt wykazywałł także glicerol. także glicerol.

Dodatkowe składniki wpływające na Dodatkowe składniki wpływające na efektywność PCRefektywność PCR

Dodanie pewnych dodatkowych składników do Dodanie pewnych dodatkowych składników do mieszaniny reakcyjnej PCR może wpływać na:mieszaniny reakcyjnej PCR może wpływać na:

temperaturę topnienia primerów,temperaturę topnienia primerów,

termiczny profil aktywności polimerazy termiczny profil aktywności polimerazy TaqTaq,,

stopień denaturacji,stopień denaturacji,

ułatwienie dołączania primerów (hamowanie ułatwienie dołączania primerów (hamowanie tworzenia struktur drugorzędo-wych primerów).tworzenia struktur drugorzędo-wych primerów).


Każda specyficzna reakcja PCR pozostaje unikalną. Stąd, Każda specyficzna reakcja PCR pozostaje unikalną. Stąd, działanie dodatkowych składników mieszaniny reakcyjnej PCR działanie dodatkowych składników mieszaniny reakcyjnej PCR jest nierównocenne. Pewne próby reakcyjne mogą być jest nierównocenne. Pewne próby reakcyjne mogą być wzmaciane, natomiast na inne ten sam składnik, przy wzmaciane, natomiast na inne ten sam składnik, przy zastosowaniu tych samych stężeń, może nie mieć żadnego zastosowaniu tych samych stężeń, może nie mieć żadnego wpływu. wpływu. Jednym z tych czynników jest DMSO (dwumetylo-sulfotlenek). Jednym z tych czynników jest DMSO (dwumetylo-sulfotlenek). Jest on silnym denaturantem powodującym lepszą denaturację Jest on silnym denaturantem powodującym lepszą denaturację matrycowego DNA. matrycowego DNA. Stwierdzono, że:Stwierdzono, że:

1.1. dodanie DMSO do reakcji PCR może eliminować tworzenie dodanie DMSO do reakcji PCR może eliminować tworzenie struktur drugorzędowych przez primery, struktur drugorzędowych przez primery,

2.2. DMSO obniża Tm o 5-6DMSO obniża Tm o 5-6C,C,3.3. gdy stężenie DMSO przekracza w próbce reakcyjnej 10% gdy stężenie DMSO przekracza w próbce reakcyjnej 10%

obserwuje się 50% zahamowanie aktywności polimerazy obserwuje się 50% zahamowanie aktywności polimerazy TaqTaq. .


Innym czynnikiem jest glicerol, poprawiający efektywność niektórych Innym czynnikiem jest glicerol, poprawiający efektywność niektórych reakcji PCR przy stężeniu 10-15%. reakcji PCR przy stężeniu 10-15%. Najprawdopodobniej jego pozytywne działanie polega na: Najprawdopodobniej jego pozytywne działanie polega na:

1.1. lepszej denaturacji DNA matrycy i lepszej denaturacji DNA matrycy i 2.2. eliminacji tworzenia się struktur drugorzędowych primerów i matrycy. eliminacji tworzenia się struktur drugorzędowych primerów i matrycy.

Glicerol poprzez swoją zdolność stabilizowania struktury białka ma Glicerol poprzez swoją zdolność stabilizowania struktury białka ma również wpływ na stabilność polimerazy również wpływ na stabilność polimerazy TaqTaq. Glicerol w stężeniu powyżej . Glicerol w stężeniu powyżej 20% powoduje zahamowanie reakcji PCR.20% powoduje zahamowanie reakcji PCR.Opublikowano szereg prac wskazujących na dużą użyteczność formamidu Opublikowano szereg prac wskazujących na dużą użyteczność formamidu w polepszaniu efektywności reakcji PCR. w polepszaniu efektywności reakcji PCR. Stwierdzono, że formamid poprawia: Stwierdzono, że formamid poprawia:

1.1. wierność, wierność, 2.2. powtarzalność wyników, powtarzalność wyników, 3.3. czułość i czułość i 4.4. specyficzność amplifikacji, szczególnie gdy targetem jest sekwencja DNA specyficzność amplifikacji, szczególnie gdy targetem jest sekwencja DNA

bogata w pary G+C. bogata w pary G+C. Stężenie formamidu poniżej 10% ma na ogół efekt pozytywny na Stężenie formamidu poniżej 10% ma na ogół efekt pozytywny na aktywność polimerazy aktywność polimerazy TaqTaq..


Glikol poletylenowy (PEG) został także skutecznie Glikol poletylenowy (PEG) został także skutecznie zastosowany dla efektywniejszej amplifikacji DNA. zastosowany dla efektywniejszej amplifikacji DNA. Najbardziej skuteczne stężenie określono w zakresie 5 Najbardziej skuteczne stężenie określono w zakresie 5 do 15%. Efektywność maleje przy wysokich stężeniach do 15%. Efektywność maleje przy wysokich stężeniach przekraczających 20%.przekraczających 20%.

Niejonowy detergent Tween 20 stosuje się często w Niejonowy detergent Tween 20 stosuje się często w przypadku gdy istnieją podejrzenia zanieczyszczenia przypadku gdy istnieją podejrzenia zanieczyszczenia mieszaniny reakcyjnej przez jonowy detergent SDS (np. mieszaniny reakcyjnej przez jonowy detergent SDS (np. pochodzący z izolacji DNA metodą stosującą do lizy pochodzący z izolacji DNA metodą stosującą do lizy SDS). SDS). Tween 20 znosi hamujący efekt pewnych Tween 20 znosi hamujący efekt pewnych jonowych detergentów.jonowych detergentów.


Podsumowując: Podsumowując: składniki dodatkowe dodane racjonalnie do mieszaniny składniki dodatkowe dodane racjonalnie do mieszaniny reakcyjnej mogą znacznie polepszyć efektywność, reakcyjnej mogą znacznie polepszyć efektywność, czułość i specyficzność reakcji PCR, wpływając na różne czułość i specyficzność reakcji PCR, wpływając na różne parametry reakcji;parametry reakcji;

trudno jest jednoznacznie określić jaki jest dokładnie trudno jest jednoznacznie określić jaki jest dokładnie mechanizm polepszania efektywności reakcji PCR przez mechanizm polepszania efektywności reakcji PCR przez te czynniki (przypuszczalnie jest on sumą efektów te czynniki (przypuszczalnie jest on sumą efektów zachodzących w każdym cyklu reakcji poprzez wpływ na zachodzących w każdym cyklu reakcji poprzez wpływ na denaturację matryc, hybrydyzację primerów i aktywność denaturację matryc, hybrydyzację primerów i aktywność polimerazy polimerazy TaqTaq).).

najważniejsze odmiany techniki pcr

Documents