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NOMBRE: NANCY LUCERO MARTINEZ RODR~GUEZ
MATRICULA: 993 18555
LICENCIATURA: BIOLOGIA EXPERIMENTAL
TITULO DEL TRABAJO: Determinacidn del Polimorfismo de 10s genes HLA- DR en pacientes maicanos con Cardiomiopatia Dilatada usando la Tkcnica de PCR (Reaccidn en cadena de la polimerasa) y Dot Blot Reverso.
LUGAR DE REALIZACION: Instituto Nacional de Cardiologia Ignacio Chavez, Departamento de Fisiologia, Laboratorio de Biologia Molecular.
ASESOR WTERNO:
Dr. Jose Luis Gomez Olivares h e a de Biologia Celular Departamento de Ciencias de la Salud Division de Ciencias Biologicas y de la Salud Unidad Iztapalapa
INDICE Páginas. 1. INTRODUCCIÓN 1
2. GENERALIDADES
2.1. EL SISTEMA PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD 3
2.1.1. Genes clase I 6
2.1.2. Genes clase II 8
2.1.3. Genes clase III 11
2.2 PAPEL FISIOLÓGICO DEL SPH 11
2.3 PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTIGENOS
POR EL SPH CLASE I Y II. 12
2.4. APLICACIONES CLINICAS DEL SPH 15
2.5 ASOCIACION DE HLA CON ENFERMEDADES 15
2.6. Antigenos DE linfocito Humano (HLA) Y Cardiomiopatia
Dilatada 17
2.7. CARDIOMIOPATIA DILATADA 17
2.7.1. Etiología de la Cardiomiopatía Dilatada 20
2.7.1.1. Factores Genéticos. 21
2.7.1.2. Factores virales. 23
2.7.1.3. Inmunidad humoral. 25
3. JUSTIFICACIÓN. 26
4. HIPÓTESIS 27
5. OBJETIVO 27
6. METODOLOGÍA 28
6.1. SUJETOS DE ESTUDIO 28
6.2.EXTRACCIÓN DE DNA (técnica de triton) 29
6.3. DETERMINACIÓN DE ALELOS HLA-DR 30
6.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 31
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32
8. CONCLUSIÓN 33
9. BIBLIOGRAFÍA 34
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1. INTRODUCCIÓN
La Cardiomiopatía Dilatada (CD) es una enfermedad del músculo
cardiaco que produce dilatación y daño principalmente en el ventrículo
izquierdo, aunque en algunos casos puede llegar a afectar a ambos
ventrículos. La destrucción difusa de las fibras miocárdicas ocasiona que las
miofibrillas restantes no logren desarrollar eficientemente la función de bombeo
(función propia del corazón). Es decir, a mayor destrucción miocárdica mayor
deterioro de la función contráctil. La disminución en la función cardíaca afecta a
pulmones, hígado y otros sistemas del organismo; se puede llegar a presentar
en ambos sexos y a cualquier edad, pero suele a menudo presentarse en
hombres de mediana edad 1.
Estudios anatomopatológicos e histológicos muestran extensas zonas de
fibrosis que han sustituido al tejido miocárdico. Las fibras del miocardio se
encuentran hipertrofiadas e incluso hay presencia de miocitos en procesos de
degeneración. Debido a que la miocardiopatía dilatada forma parte de un
estado final de lesión miocárdica se puede llegar a encontrar inflamación,
necrosis por isquemia u ocasionando lisis por efecto tóxico o sobrecarga
hemodinámica crónica2,3.
A pesar de que la etiología de la CD es desconocida, se han reportado
varias anormalidades a nivel del sistema inmune. En la inmunidad mediada por
células se ha observado déficit en la función de los linfocitos T citotóxicos y
reducida o ausente actividad de las células NK (asesinas naturales). También,
se ha sugerido que la baja actividad de las células T citotóxicas conlleva a una
producción alterada de algunos autoanticuerpos. Con respecto a la inmunidad
humoral, se ha reportado la presencia de autoanticuerpos específicos del
órgano cardiaco tales como anti-miosina y anti-actina. Dichos autoanticuerpos
se han encontrado de forma más frecuente en familiares afectados y no
afectados de pacientes con CD, sugiriendo que la carga genética puede estar
jugando un papel relevante en la patogénesis de la enfermedad 4,5,6.
Aunque en las últimas décadas la CD se ha investigando, en la
actualidad su etiología sigue siendo desconocida y se le considera por varios
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autores como una enfermedad autoinmune. A partir de una infección
principalmente de origen viral (adenovirus, enterovirus) se ocasiona un daño a
nivel celular exponiendo antígenos intracelulares como la miosina y disparando
la autoinmunidad en individuos genéticamente susceptibles7.
Otro mecanismo implica una reactividad cruzada entre los antígenos
presentes en los virus y las estructuras del miocardio, las cuales por éste
fenómeno son reconocidas como extrañas y son blanco del ataque
autoinmune. Recientemente, se ha reportado que anticuerpos monoclonales
dirigidos contra el virus Coxsackie B4 reaccionan con el músculo cardiaco y
otros anticuerpos dirigidos contra la cápside del mismo virus, produciéndose
una reacción de forma cruzada con la miosina cardiaca8.9.
Debido a la importante participación de la respuesta inmune en el
desarrollo de la enfermedad, los factores genéticos implicados en su
desencadenamiento podrían incluir a los genes del Sistema Principal de
Histocompatibilidad (SPH)10.
El sistema HLA está constituido por un conjunto de genes localizados en
el brazo corto del cromosoma 6. Debido a su participación crucial en la
fisiología sus aplicaciones son muy diversas, entre las más importantes esta: a)
trasplante de órganos y tejidos, b) asociación con etiología de enfermedades
con un fondo autoinmune y crónico-degenerativas, así como algunas
infecciones, c) medicina forense y d) estudios de migración y evolución en
población humana.
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2. GENERALIDADES
2.1 EL SISTEMA PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El Sistema Principal de Histocompatibilidad (SPH) comprende una serie
de genes estrechamente relacionados cuyos productos están comprometidos
con la regulación de la respuesta inmune. Cada uno de estos genes es
extraordinariamente polimórfico y son heredados de manera mendeliana
codominante; lo cual ha permitido que sean usados como marcadores
genéticos en el estudio de las enfermedades y también se han empleado en la
caracterización de la estructura genética de algunas poblaciones, en la
selección de individuos candidatos como donadores para transplante11.
El SPH se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 6
humano (6p), en la porción distal de la banda p21.3. Este sistema ha sido
dividido en tres grupos en base a las características estructurales y funcionales
de los productos de los genes.
La región clase I del SPH (Figura 1), se localiza hacia el telómero y tiene
por lo menos 17 genes relacionados entre sí y que incluye los loci HLA-A, HLA-
B, HLA-C, HLA-E, HLA-F , HLA-G . Hacia el centrómero está la región clase II,
que se divide en cuatro subregiones (DP, DO/DZ, DQ y DR), cada una por lo
menos con un par de genes α y β ; además encontramos a los genes TAP
(Transportador Asociado al Procesamiento de antígenos) y LMP (Proteínas de
bajo peso molecular). Entre las regiones clase I y clase II, se encuentra la
región clase III, cuyos genes codifican para los componentes del complemento
C2, factor B (fb), C4A y C4B, como los genes estructurales de la 21-hidroxilasa
A y B (21-OHA y 21-OHB).
Dentro del SPH se incluyen el gen de la glicoxilasa I, el más
centromérico de todos, así como los genes del factor de necrosis tumoral (TNF)
α y β. Que están entre el HLA-B y la región de clase III. Recientemente se han
encontrado otros cinco genes asociados con el locus HLA-B, llamados
“transcritos asociados” a B, que se designan como BAT-1,-2, -3, -4 y –5. En
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1989 se detectaron dos loci de la proteína de choque térmico HSP70 HSP70-1
y HSP70-2 situados entre los genes de clase III y el TNF α.
Las moléculas clase I se expresan en la membrana de todas las células
nucleadas del cuerpo, excepto en neuronas y trofoblastos maduros y son
difíciles de detectar en eritrocitos. De los tres loci de clase I (HLA-A, -B y –C),
el locus de C es el que menos adecuadamente se expresa. Las moléculas
clase II se expresan sólo en células como macrófagos, linfocitos B, células
endoteliales, células dendríticas y células de Langerhans. No se expresan en
eritocitos maduros, granulocitos ni en linfocitos T no activados, pero su
expresión puede inducirse con mitógenos o estímulos antígeno específico.
Tanto los eritrocitos maduros como los granulocitos no expresan moléculas
de clase II.
La frecuencia de recombinación génica dentro del SPH es muy baja
(menos del 2%) debido a que este conjunto de genes ocupa solamente unas
3,800 kb. El entrecruzamiento entre cromosomas homólogos que incluya a los
genes HLA-A y –B o a HLA-B y –DR ocurre con una frecuencia un poco menor
de 1% del total de meiosis. Por esta razón el complejo génico puede
considerarse como una sola unidad genética.
Los alelos de los loci del SPH de un cromosoma en particular
constituyen un haplotipo (el genotipo de un individuo está dado por dos
haplotipos, uno de origen materno y otro de origen paterno). Una combinación
dada de alelos de los loci B, C2, C4A y C4B conforman el complotipo o
haplotipo de genes del complemento12,13,14.
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Figura.1 Localización cromosómica de los genes del Sistema Principal de Histocompatibilidad en humano.
CROMOSOMA 6
q
p (21.3)
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2.1.1. Genes Clase I
Las moléculas del SPH clase I se encuentran en todas las células
nucleadas y plaquetas del organismo, razón por la cual su presencia es nula
en los glóbulos rojos, su expresión es intensa en las células linfoides, menos
intensa en el hígado, riñón y pulmón y escasa en el cerebro, músculo
esquelético y trofoblasto velloso. Esta distribución en los tejidos implica que
actúan como marcadores de reconocimiento de las células propias, condición
necesaria para que el organismo distinga los agentes extraños de los internos,
y se defienda contra ellos. Su expresión es coordinada: A, B y C, se expresan
al mismo tiempo en la superficie celular15.
Koller y colaboradores en 1989 construyeron un mapa de los genes clase-I
que incluye 6 loci: HLA-A, HLA-B, HLA-C; HLA-E, HLA-F, HLA-G , que ocupan
11 centimorgans (cM).
Los principales locus son: HLA-A, B y C llamados clásicos y comprenden
una extensión de 2000 Kb, separados entre sí por largas fibras de ADN, y su
función es la presentación a linfocitos T de péptidos de 8 a 10 aminoácidos de
largo. Los linfocitos T participan en el reconocimiento, rechazo y destrucción de
virus e injertos de tejido extraño. La identificación serológica de las moléculas
tipo C ha sido difícil e imprecisa, sin embargo ellas parecen ser muy
importantes en la interacción con las células asesinas NK 16.
Existen otros locus menos polimórficos que se expresan poco, los cuales
son HLA-E, F, G, H, y J, cuyas funciones aún no están bien establecidas,
aunque algunas evidencias y la restricción tisular del HLA-G, sugieren la
participación de éstas moléculas en la tolerancia materno-fetal.
Los antígenos de clase I son mediadores de la eliminación alogénica y de
la restricción de linfocitos T efectores. Se constituyen en par de cadenas
polipeptídicas unidas no covalentemente: una cadena pesada α, que es
glicoproteíca, transmembranal de 45 kd y una cadena ligera α, también
glicoproteíca, de 12 kd. La cadena α es polimórfica y es codificada por el HLA-
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A, -B ó –C y la cadena β, monomórfica, es la β2-microglobulina, codificada por
un gen en el cromosoma.
La estructura de los antígenos de clase I del SPH, se dedujo inicialmente
a partir de la determinación de la secuencia de aminoácidos del material
purificado de una línea celular humana linfoblastoide. Estas moléculas tienen
dominios extracelulares, una región transmembranal y una cola citoplásmica
corta. Se ha podido encontrar además la estructura tridimensional del antígeno
HLA-A2 por medio de cristalografía de rayos X. La cadena pesada α consta de
tres dominios externos (α1, α2 y α3). Los dominios α1 y α2 son los más distales
a la membrana celular y son los que contienen los residuos polimórficos que
conforman el sitio de unión a un antígeno, y así son presentados por la
molécula del HLA al receptor del linfocito T17.
FIGURA 2. Estructura de una molécula Clase I del SPH.
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2.1.2. Genes Clase II
El sistema clase II está subdividido en varios grupos: Los HLA-DR, DQ,
DZ, DO, DP, DM, y DN. En el humano se han definido bioquímicamente tres
isotipos de las moléculas clase II, DR, DQ y DP, que son coexpresados en la
superficie de las células presentadoras de antígeno, cada una de ellas
constituida por un dímero: DRα/DRβ, DQα/DQβ y DPα/DPβ. Algunos individuos
expresan además un cuarto producto denominado DRw52, DRw53 o DRB51;
además de los genes TAP1 y TAP2 y los genes LMP2 y LMP718.
Los antígenos de clase II son determinantes primarios en la generación
de respuestas proliferativas de linfocitos T y pueden presentar antígenos al
receptor de linfocito T. Se constituyen de cadenas glicoproteícas, unidas no
covalentemente, una pesada α monomórfica de 33 kd y una cadena ligera β
polimórfica de 28 kd, ambas codificadas por loci del HLA. DR/DR
La molécula de clase II tiene cuatro dominios externos: α 1, α2, b1 y
b2, análogos a los dominios a1, a2, a3 y a la β2-microglobulina, de la
molécula de clase I, respectivamente. Los dominios α 2 y β2 son del tipo de las
inmunoglobulinas, muy conservados y los dominios β1 y α 1 son polimórficos.
La molécula de clase II tiene asociada a las cadenas α y β una
glucoproteína transmembranal de 31 Kd, conocida como cadena gamma o
cadena invariante. Esta cadena no se detecta con anticuerpos en la superficie
celular, por lo que se piensa que se asocia al complejo entre el paso por el
aparato de Golgi y el arribo a la membrana celular.
De las cuatro subregiones de los genes de las moléculas de clase II, la
subregión DP consta de dos pares de loci α y dos β , de los cuales DP α 2 y DP
β 2 parecen ser pseudogenes (genes que no codifican para proteínas). La
subregión DZ/DO se constituye de los genes DZ α y DO β, pero como estos
dos loci están separados por varios cientos de kilobases, quizá no forman un
dímero α / β.
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La subregión DQ tiene dos genes α y dos β: incluye dos genes DX (α y
β) y un gen DVα entre los genes DQ y DX. La subregión DR tiene cuatro genes
β: el β 1 codifica para las variantes de DR de DR1 a DR18, el β2 es
pseudogen, el β3 codifica para el determinante DRW 52 y el β4 para el
determinante DRW 53, hay un gen DR α no polimórfico . Se expresan tres
tipos de productos de clase II: DP, DQ y DR. No hay evidencias de que DZβ y
DOβ se expresen como proteínas, aunque se ha encontrado RNA mensajero
normalmente poliadenilado, de ambos genes en células B. Pueden formarse
pares de cadenas de DQβ y DQ α en “trans”, es decir, la cadena α 1 y β1
codificadas cada una por uno de dos los cromosomas homólogos de un
individuo.
Los genes de la región β son los llamados "genes IR" (de respuesta
inmune). El HLA DM participa en el proceso de liberación, transporte y
ensamblaje del péptido exógeno al complejo. El HLA DZ al parecer, tiene
genes incompletos que no se expresan, y que solo lo hacen en células muy
especializadas aún no identificadas. El HLA DP se encuentra en las células
presentadoras de antígeno, y estimulan a los linfocitos T; participan en la
presentación de antígenos de influenza y Herpes simplex y se ha encontrado
asociada a artritis reumatoidea juvenil y a infecciones por Onchocerca valvulus.
El HLA DO frena la presentación de antígenos a los LT-CD4+ actuando
sobre las moléculas HLA DM a las cuales inhibe, impidiendo la liberación de la
molécula CLIP con lo cual interviene en el acoplamiento de los antígenos a los
HLA Clase I.
El polimorfismo de las moléculas clase II se encuentra en las cadenas α
de los antígenos HLA-DP, -DQ y –DR. Los residuos polimórficos están en
cuatro cúmulos en los dominios β1 de DQ y DR, así como en un cúmulo de �1
de DQ. El polimorfismo de la cadena DPβ es limitado.
Otros genes que se encuentran dentro de la clase II del SPH, son los
TAP y los LMP, cuya importancia radica en su participación durante el
procesamiento y presentación antígenica mediados por clase I. Los genes del
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LMP son polimórficos y sus productos constituyen dos subunidades del
complejo proteosomal, las cuales se les ha atribuido que participan en la
degradación de proteínas citosólicas y en la generación de peptidos
antigénicos; mientras que las TAP (TAP1 y TAP2) forman un heterodímero y
participan en el transporte de péptidos generados por las proteasas, desde el
citosol hacia el retículo endoplásmico.
El polimorfismo alélico de los antígenos de clase I y II se reconoce
fenotípicamente por serología y por técnicas moleculares.
FIGURA3. Estructura de una molécula Clase II del SPH
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2.1.3. Genes Clase III
La región clase III contiene por lo menos 70 genes, con una densidad de
aproximadamente un gen cada 10 kb en promedio. Los genes de clase III del
SPH, después del HLA, forman el conjunto de marcadores genéticos más
polimórficos del humano19.
Los cuatro loci de esta región (C2, Factor B, C4A y C4B), se heredan en
bloque. Las moléculas del factor B y C2 son glicoproteínas de una sola cadena
de 90 kDa y 102 kDa, respectivamente. Estos circulan en el plasma en forma
de pro-enzimas20.
La molécula de C4, pesa 200 Kd y tiene tres subunidades acopladas por
puentes disulfuro: α (95 Kd), β (75 Kd) y τ (30 Kd). Se sintetiza como una sola
cadena en el orden α-β-τ que luego se glicosila y se procesa intracelularmente;
secretándose como una estructura de tres cadenas. En los últimos años se ha
estudiado el hecho de que muchos de los genes en la región clase III, codifican
proteínas con funciones relacionadas con el sistema inmune como los genes
del complemento, el factor B, las proteínas de choque térmico (hsp70) y el
factor de necrosis tumoral (TNF)21,22,23,24,25.
2.2. PAPEL FISIOLÓGICO DEL SPH.
Los antígenos de histocompatibilidad se descubrieron por su
participación en el rechazo de injertos. La capacidad de distinguir lo propio de
lo extraño, es una característica de todos los organismos pluricelulares,
apareciendo ya en los tunicados y los celenterados (Pepinos de mar y estrellas
de mar), como un mecanismo para mantener la identidad de la especie; Estos
han evolucionado hasta aparecer en los anfibios y probablemente ya en los
peces y permiten la alta variabilidad interindividual dentro de una misma
especie, asegurando un sistema adecuado de unidades de reconocimiento
sobre las células propias.
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En la etapa de diferenciación intratímica, los linfocitos T (LT) aprenden a
reconocer los antígenos extraños en el contexto de lo propio, según si van a
ser célula CD4+ (Clase II), o célula T CD8+ (Clase I). Ahí se produce la
selección positiva, y el linfocito que no tiene la capacidad de reconocer I o II va
a la apoptosis26,27.
Los antígenos del SPH son indispensables para la inducción de la
respuesta ya que el LT reconoce muy pobremente al antígeno que llega en
forma soluble, y requiere del contexto de SPH en la membrana de la célula
presentadora; por eso la expresión de sus antígenos, regula en cierta forma la
respuesta, ya que determina qué va a ser reconocido y cómo. A nivel
intracelular, los antígenos del SPH en la célula presentadora participan en el
procesamiento del antígeno y son críticos en la presentación antigénica28,29.
2.3. PROCESAMIENTO Y PRESENTACION DE ANTIGENOS POR EL
SPH CLASE I Y II.
Las células T sólo reconocen antígenos sobre la superficie de células
accesorias en asociación a los productos de los genes del SPH propio. Los
linfocitos T colaboradores CD4+ reconocen antígenos asociados a los productos
de los genes del SPH clase II (reconocimiento restringido por SPH clase II) y
los linfocitos T citotóxicos (CD8+) reconocen antígenos asociados a los
productos de los genes del SPH clase I (reconocimiento restringido por SPH
clase I)30.
El procesamiento del antígeno consiste en la introducción de los
antígenos proteicos en las células presentadoras de antígenos (APC), la
degradación proteolítica de estas proteínas en péptidos, la unión de los
péptidos a las moléculas de SPH recién ensambladas y la exposición de los
complejos péptido-SPH sobre la superficie de una APC para el reconocimiento
potencial de células T.
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Las vías del procesamiento del antígeno en las APC utilizan los
mecanismos celulares básicos de proteólisis, que también operan
independientemente del sistema inmunitario. Tanto las proteínas extra como
intracelulares son mostradas a través de estas vías de procesamiento del
antígeno y los péptidos derivados de las proteínas normales propias y de las
proteínas extrañas son a su vez expuestos por las moléculas del SPH para la
vigilancia a través de los linfocitos T.
Las APC especializadas entre ellas macrófagos, linfocitos B y células
dendríticas internalizan las proteínas extracelulares en los endosomas para su
procesamiento a través de la vía del SPH clase II. Estas proteínas sufren
proteólisis por enzimas que actúan a pH ácido en las vesículas de la vía
endosómica. Los heterodímeros del SPH clase II recién sintetizados se asocian
a la cadena invariable y son dirigidos desde el retículo endoplásmico rugoso
(RER) hacia las vesículas endosómicas, donde la cadena invariable sufre
proteólisis, eliminándose a partir de la hendidura de unión del péptido en la
molécula del SPH por la acción de moléculas DM, un pequeño péptido residual
de la cadena invariable. Los péptidos generados a partir de proteínas
extracelulares se unen después a la molécula del SPH clase II, y el complejo
trimérico (cadenas αy β del SPH clase II y el péptido) se traslada hacia la
superficie de la célula.
Las proteínas citosólicas en célula infectadas por virus siguen la vía del
SPH clase I para la presentación del antígeno. El proteosoma es un complejo
citoplasmático multiproteico que degrada mediante proteólisis las proteínas
citoplasmáticas marcadas con ubiquitina y genera probablemente, una gran
cantidad de péptidos cuyo destino es la exposición por las moléculas del SPH
clase I.
Los péptidos son distribuidos desde el citoplasma al RER a través de las
moléculas proteínas transportadoras de antígenos (TAP). Los dímeros del SPH
clase I recién formados en el RE se asocian y se unen a los péptidos
distribuidos por TAP. La unión del péptido estabiliza las moléculas del SPH
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clase I y permite su movimiento desde el RER a través del aparato de Golgi,
hacia la superficie. Estas vías de presentación de antígeno restringidas por el
SPH garantizan que sean escrutadas la mayor parte de las proteínas del
organismo buscando la presencia de posibles antígenos extraños.
Las vías aseguran igualmente que las proteínas de los microorganismos
extracelulares probablemente generen péptidos unidos a moléculas del SPH
clase II para su reconocimiento con células T colaboradoras CD4+, mientras
que las proteínas codificadas por microorganismos intracelulares generan
péptidos unidas a moléculas del SPH clase I para su reconocimiento por CTL
CD8+. La inmunogenicidad de las proteínas microbianas depende de la
capacidad de las vías de procesamiento del antígeno para generar péptidos
derivados de estas proteínas que se unen a moléculas del SPH propias.
FIGURA 4. Vías de procesamiento y presentación de antígenos.
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2.4. APLICACIONES CLINICAS DEL SPH
La capacidad de resistencia de un individuo a determinado
microorganismo está programada por SPH y es altamente probable que en un
futuro próximo pueda establecerse contra cuáles microorganismos es
resistente cada persona. Por lo pronto, la importancia de la determinación de
éstos antígenos tiene aplicación práctica en la asociación con enfermedades,
definición de paternidad, estudios antropológicos y trasplantes31 .
2.5. ASOCIACION DE HLA CON ENFERMEDADES
Se puede inferir que cualquier trastorno manifestado, ya sea como
aumento o defecto de la respuesta inmunitaria que involucre a cualquiera de
los anfígenos del SPH, puede traer consecuencias relevantes en el tipo de
respuesta inmunitaria que desarrolle un individuo en particular.
Desde el descubrimiento de que las moléculas HLA sirven como
elementos de restricción para el reconocimiento de muchos agentes
patógenos, se pensó que este sistema podría estar relacionado con la
predisposición para desarrollar algunas enfermedades. Los avances en el
conocimiento de la genética y la biología de las moléculas clase I, II y III han
estimulado la investigación en el área de la asociación de enfermedades con
alelos de estos genes, especialmente por el papel que tienen en la regulación
de la respuesta inmune.
En 1973 se reportó la asociación entre la espondilitis anquilosante y el
antígeno HLA-B27, desde entonces más de 700 enfermedades han sido
asociadas con uno o más antígenos del SPH. Estas enfermedades se pueden
incluir básicamente en tres grupos:
1.-Enfermedades asociadas a los antígenos clase I (principalmente las
espondiloartropatías asociadas a B27).
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2.-Enfermedades asociadas a los antígenos clase II principalmente con
el locus HLA-DR (cardiomiopatías).
3.-Enfermedades asociadas a los antígenos clase III (Lupus sistemico
eritematoso ).
La mayoría de las enfermedades incluidas en el segundo grupo son de
origen autoinmune. Las enfermedades asociadas al SPH son multifactoriales,
es decir, involucran tanto el terreno genético del individuo como también ciertos
factores ambientales, actuando conjuntamente para influir en la susceptibilidad
o resistencia al desarrollo de enfermedades especificas.
Las correlaciones con una enfermedad pueden ser positivas o negativas;
la positiva implica que un alelo predispone a la enfermedad, mientras que una
negativa sugiere que el alelo HLA puede ser protector, especialmente si tiene
un efecto dominante y no se encuentra en individuos afectados en estado
heterocigoto con un alelo putativo promotor de enfermedad. Se han reportado
varias asociaciones entre alelos del SPH y enfermedades cardiológicas, entre
éstas tenemos a la Cardiomiopatia Dilatada e hipertrófica, infarto al miocardio,
fiebre reumática y aterosclerosis. (Cuadro 1)33.
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2.6. Antígeno del linfocito Humano (HLA) y Cardiomiopatía dilatada
A pesar de la gran cantidad de estudios que se han realizado en cuanto
a los alelos asociados han mostrado resultados heterogéneos, lo cual puede
deberse a las diferencias étnicas de los grupos de estudio.
El estudio realizado por Carlquist y colaboradores en 1990 confirmaron
el incremento de la frecuencia del antígeno HLA-DR4 en un grupo de
pacientes con cardiomiopatía dilatada; a su vez encontraron una disminución
en la expresión de DRw6 en el mismo grupo de pacientes. También,
reportaron un incremento significativo del HLA-DQw4 en los pacientes cuando
se compararon con los controles.
En un estudio con pacientes del las costas del mediterráneo, los alelos
que se asociaron con la susceptibilidad al desarrollo de la enfermedad fueron
el HLA-B15 y del HLA-DQ3.
Maharaj y colaboradores demostraron un incremento en la frecuencia de los
antígenos HLA-DR1 Y DRw10 en pacientes negros con cardiomiopatía
dilatada.
En pacientes de origen caucásico se ha asociado de forma importante con el
antígeno HLA-DR4, HLA-DR1 Y HLA-DR5. Los subtipos de DR4 encontrados
en caucásicos el DR*0401, *0404 y *0407 Y en japoneses el DR *040134.
2.7. CARDIOMIOPATÍA DILATADA
La Cardiomiopatía Dilatada (CD), también denominada cardiomiopatía
congestiva provoca daños en el tejido muscular cardiaco que conforma las
cavidades de bombeo del corazón. Este daño se caracteriza por un
adelgazamiento de las paredes de las cavidades debilitándose demasiado, el
corazón no puede bombear normalmente, ya que las contracciones se vuelven
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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deficientes y hay dilatación en el ventrículo izquierdo reduciéndose así la
función sistólica.
Inicialmente, las funciones del organismo seguirán siendo casi normales,
otras partes del organismo tratarán de compensar la disminución de la
capacidad de bombeo del corazón con un aumento en la cantidad de líquido
que retienen y produciendo más sangre de lo normal. Entonces, las cavidades
del corazón se agrandan (dilatan) para poder recibir este mayor volumen de
sangre1.
Pero los efectos a largo plazo del agrandamiento del corazón no son
buenos; el corazón tratará de aumentar su frecuencia para bombear más
sangre al organismo. El corazón no puede contraerse bien, afectando a la
circulación lo cual provoca una acumulación de líquido en los pulmones, en la
región superior del abdomen y las piernas. Esta acumulación de líquido dificulta
la respiración y produce hinchazón (edema); éstos son dos síntomas comunes
del síndrome de insuficiencia cardiaca congestiva.
El agrandamiento del corazón (cardiomegalia) a veces puede dar lugar a
una alteración del ritmo cardíaco (arritmia). Además, la sangre circula más
lentamente por un corazón agrandado, y por lo tanto, pueden formarse
coágulos sanguíneos fácilmente. Estos coágulos se pueden desprender y
desplazarse por la corriente sanguínea hasta llegar a los pulmones (embolia
pulmonar) u obstruir un vaso sanguíneo en el cerebro o el corazón.
Actualmente es complicado conocer la etiología de esta patología, ya
que es una enfermedad poligénica en la cual están comprometidos factores
genéticos, virales, inmunológicos y ambientales, por lo que en la mayoría de los
casos de cardiomiopatía dilatada, lo cual significa que no puede determinarse
exactamente su causa.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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Figura 5.
Figura. 6 Figura. 5 Cardiomiopatía Dilatada: LA, atrio izq., LV ventrículo izq., RA. Atrio derecho, RV, ventrículo derecho 6, fotografias de un corazón con Cardiomiopatíz Dilatada.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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2.7.1. Etiología de la cardiomiopatía dilatada
Su incidencia es mayor en el sexo masculino y en la raza negra. La
etiopatogenía se desconoce. Aproximadamente un tercio de los casos son de
origen genético hereditario y en el resto se reconocen causas especificas de
origen isquémico, hipertensivo, tóxico, metabólico, inflamatorio, viral, de
inmunidad celular y humoral, apoptosis celular o de otra etiología (cuadro 2)2.
CUADRO 2. CAUSAS ESPECIFICAS DE CARDIOMIOPATIA DILATADA
Isquemia
Tóxicos: alcohol, cocaína, anfetaminas, cobalto, plomo, mercurio,
monóxido de carbono, berilio.
Deficiencias nutricionales: tiamina, selenio, carnitina.
Enfermedades infecciosas:
Virus: Coxsackie, citomegalovirus, VIH, varicela, hepatitis, Epstein-Barr,
virus ECHO.
Bacterianas: fiebre reumática, fiebre tifoidea, difteria, brucelosis,
psitacosis, enfermedades por Rickettsia, enfermedad de Lyme.
Micoplasma, hongos, histoplasmosis, criptococosis.
Parasitos: enfermedad de Chagas, toxoplasmosis, esquistosomiasis,
triquinosis.
Alteraciones electrolíticas: hipocalcemia, hipofosfatemía, uremia, otros.
Alteraciones endocrinas: tiroides, diabetes mellitus, feocromocitoma,
Cushing, hormona de crecimiento.
Medicamentos (quimioterapia, antirretrovirales)
Enfermedades neuromusculares (distrofia muscular de Duchene),
reumatologicas (lupus)
Misceláneas: miocardiopatía periparto y autoinmunitarias, taquicardia,
miocardiopatias autoinmunes, cardiopatias familiares,apnea de sueño,
sobrecarga de calcio, radicales libres.
Enfermedades de deposito: amiloidosis.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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2.7.1.1. Factores genéticos
La forma familiar de cardiomiopatía dilatada es heterogénea y es
responsable de un 20 a un 30% de los casos. Existen por lo menos cinco o
más loci asociados con cardiomiopatía dilatada autosómica dominante en
adultos. Cuatro se asocian con otras manifestaciones clínicas con defectos de
las proteínas del citoesqueleto productoras de disfunción miocárdica y de
músculo esquelético.
Dentro de las mutaciones genéticas en cardiomiopatía dilatada se
encuentran las siguientes:
• Proteínas del citoesqueleto: distrofina (Xp21), desamina, taffazzin.
• Actina (cromosomas 1q32, 9q13-22 y 10q21-23).
• Cadena pesada betamiosina cardiaca y troponina T (cromosoma
14q11.2-13).
• Otros cromosomas: 2q11-22, 2q31 mitocondrial.
CUADRO 3: Alelos del SPH asociados con cardiomiopatía dilatada en otras poblaciones
POBLACION GRUPO ALELOS
ASOCIADOS
CAUCASICOS
NORTE-AMERICANOS NORTE-EUROPEOS ESPAÑOLES ISRAELITAS
HLA-DR4 *0401, *0404 *0401, *0404 *0405, *1001 *0102, *0405
ASIATICOS JAPONESES COREANOS CHINOS
HLA-DR1, DR5 *0405 *0401, *0405 *0405, *1001
NEGROIDE Oman HLA-DR4
INDÍGENAS AMERICANOS
TINGLIT YAKIMA PIMA
HLA-DRB1 *1402 *1402 *1402
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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El cuadro anterior nos da las bases sobre el reporte que se tiene sobre
la inmunogenetica de la población mexicana (mestiza e indígena). Los mestizos
mexicanos, contamos con un 56% de genes amerindios (genes indígenas), un
40% de genes caucásicos y un 4% de genes negroides.
Históricamente los primeros pobladores del continente americano fueron
los amerindios hace 30,000 a 40,000 años y ubicándose en norte América (sur
de estados unidos), centro América y Sudamérica, otra de las poblaciones
fueron los na-dene hace 10,000 a 15,000 años estando estos ubicados al norte
america (norte de estados unidos y sur de Canadá) los por ultimo la población
eskimo-aleut hace 5,000 a 8,000 años ubicados al norte de Canadá y Alaska.
La población indígena antes de que fuera descubierta América contaba
con 90-112 millones de indígenas de los cuales 14 a 30 millones eran incas y
una cantidad superior a los incas de mesoamericanos. Cuando se da el
descubrimiento de América en particular la conquista de México aparecen
muchas enfermedades, la población se incrementa de una manera
considerable, dándonos como resultado una mezcla de razas y una gran
variabilidad genética en ese entonces se contaba con 8-15 millones de
indígenas, 56 grupos étnicos 5 troncos lingüísticos (- macro-nahua, macro-
mixteco, macro-maya, macro-yuma, tarasco).
Esta combinación genética nos dio como resultado la variabilidad de
nuestros genes encontrando que los alelos más frecuentes en los mestizos
mexicanos son HLA-A: A2 (28.2%), A24 (14.5%), A28 (12.1%), A1 (7.7%),
HLA-B: B35 (27.0%), B39 (10.5%), B61 (7.5%), B18 (6.5%) , HLA-DR: DR4
(23.7%), DR8 (11.6%), DR7 (11.1%), DR14 (10.9%).
Ahora bien por que la importancia de estos datos de la población, en
primer lugar nos ayudaran a 1.- entender la evolución de los pueblos
americanos, nos servirá para 2.- establecer la relación entre ellos y 3.- detectar
nuevas variantes así como su 4.- asociación con enfermedades.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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2.7.1.2. Factores virales: Más de 200 cepas virales son patógenas para el hombre, las más
conocidamente cardiotropas son las provenientes de los enterovirus (mucosa
digestiva), que son subgrupos de los picornavirus. De ellos el Coxsackie B y el
poliovirus son marcadamente cardiotropicos
Picornavirus
Rinovirus
Enterovirus
Coxsackie Coxsackie B Poliovirus virus ECHO
Figura 6: Familia de los Virus Cardiotropos.
Actualmente se reconoce con mayor frecuencia que el virus Coxsackie B
es el agente que provoca con mayor incidencia la cardiomiopatía dilatada, este
Coxsackie B mide 30 milésimas de micra. La vía de ingreso más común es la
oral, al adquirirse por saliva, secreciones faringeas o por heces de infectado.
Puede ser neonatal por transmisión placentaria, y puede llegar a aparecer
como epidemia.
Presenta un periodo de incubación de días que desemboca en cuadro
clínico de meningitis, encefalitis y/o miocarditis, con principio febril brusco.
Se han identificado genomas de ARN viral en material patológico
proveniente de biopsias endomiocárdicas y autopsias de pacientes con
cardiomiopatía dilatada con títulos elevados de anticuerpos contra el virus
Coxsackie B.
Existen datos que revelan que en modelos murinos, el daño en el
miocardio por el virus Coxsackie B ocurre en 2 fases; la fase aguda en la cual
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existe una replicación viral e infiltración celular. La fase crónica que consiste
en niveles bajos persistentes del genoma viral y progresa a cardiomiopatía.
El posible mecanismo es: 1. predominantemente de daño directo: el
virus produce directamente la lesión inflamatoria; 2. pero cabe también la
posibilidad de daño indirecto: el virus desencadena una alteración inmunológica
que indirectamente daña al corazón (¿elemento genético?; se da una
respuesta autoinmune en donde el virus puede provocar autosensibilización en
las proteínas intracelulares (miosina, actina) y si existe similitud entre los
antígenos exógenos (virus) y endógenos (proteínas intracelulares), dando por
resultado una respuesta inmune cruzada, la cual provoca un daño a los
antígenos propios). Ambos mecanismos son aplicables a la fase aguda de
infección pero también a la posible crónica: 1. el episodio inicial rápidamente
degenera el corazón en escasas fibras; 2. el episodio inicial deja el daño que a
la larga, a través de respuesta inmunológica por anticuerpos anticorazón lleva a
la cardiofibrosis dilatada.
Figura 7. Fotografía de un Virus Coxsackie B
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2.7.1.3. Inmunidad humoral
Existe evidencia de que en pacientes con cardiomiopatía dilatada se han
encontrado una gran variedad de autoanticuerpos los cuales hablan acerca de
que tal vez su origen sea un padecimiento de tipo autoinmune. La patogénesis
de los autoanticuerpos depende de la actividad, la accesibilidad y los blancos
antigénicos, así como de las acciones de los mecanismos efectores de la
respuesta inmune.
Los diferentes autoantígenos y sus correspondientes autoanticuerpos
que se han encontrado en cardiomiopatía dilatada pueden ser clasificados
dependiendo su localización en la célula de la siguiente manera:
A) Autoantígenos de la membrana plasmática: autoanticuerpos contra el
receptor β1 adrenérgico. También se ha encontrado evidencia de
autoanticuerpos contra el receptor muscarínico (M2).
B) Autoantígenos del citoesqueleto: autoanticuerpos contra proteínas
intracelulares, tales como la miosina y actina. En algunas circunstancias en
donde existe necrosis de tejido (secundaria a una infección viral u otras
causas), se podría facilitar la exposición de estas proteínas intracelulares,
favoreciendo así una respuesta autoinmune. La exposición de las proteínas
intracelulares dentro de la inmunología podría estar relacionada entre el
autoanticuerpo y el daño al miocardio.
En pacientes con cardiomiopatía dilatada, hay autoanticuerpos contra
las cadena pesada alfa de la miosina (específicamente en el tejido atrial) y en
la beta (en el ventrículo y en el tejido músculo esquelético).
Otro autoaanticuerpo del citoesqueleto encontrado en pacientes con
cardiomiopatía dilatada son autoanticuerpos contra tropomiosina I. La
antitropomiosina también se ha encontrado en pacientes con enfermedad
valvular e isquémicos.
C) Autoantígenos de estructuras internas: Dentro de los componentes
intracelulares que tienen capacidades antígénicas. Se encuentra el
autoanticuerpo anti-mitocondrial (anti-M7), el cual es dirigido contra
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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flavoproteína de la membrana de la mitocondria. Este autoanticuerpo anti-
flavoenzima se ha observado en un 36% de pacientes con cardiomiopatía
dilatada y en 25% de pacientes con miocarditis, pero no se ha encontrado en
personas sanas.
También se han encontrado autoanticuerpos contra el nucleótido
translocador de adenina (ANT), inhibiendo el transporte de nucleótidos a nivel
transmembranal; y que participan en una respuesta dañina en la función del
miocardio. Estos anticuerpos se han encontrado en pacientes con
cardiomiopatía dilatada idiopática, pero no en pacientes con cardiomiopatía
dilatada con otras etiologías.
Es conocido que el transporte de calcio mediado por la ATP-asa
del miocito en el retículo sarcoplásmico es disminuido en pacientes con
cardiomiopatía dilatada. Hay diferencias entre pacientes con cardiomiopatía
dilatada isquémica y con cardiomiopatía dilatada idiomática, se ha observado
en los mecanismos que causan disfunción del miocito en el retículo
endoplásmico.
Los antecedentes sugieren que los genes HLA-DR tienen gran
importancia como marcadores tanto de susceptibilidad como de las
manifestaciones clínicas de la cardiomiopatía dilatada . Su alto polimorfismo y
el hecho de que su frecuencia varía de un grupo étnico a otro implica que los
datos reportados a la fecha en otras poblaciones no son extrapolables a
nuestra población8.
3. JUSTIFICACION
La Cardiomiopatía Dilatada (CD) es una de las principales causas de
falla cardiaca que conlleva a una elevada tasa de morbilidad y mortalidad en la
población mundial. Cabe añadir que es el principal indicador de trasplante
cardíaco implicando altas repercusiones sociales, productivas y económicas en
los pacientes que la padecen; además de que un alto índice de éstos pacientes
no recibe el manejo apropiado y fallecen sin mayor esperanza de vida.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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La prevalencia e incidencia de la CD se ha incrementado de manera
notable en los últimos años, de tal forma que en 1998 la Organización Mundial
de la Salud (OMS), reveló que alrededor de 2 de cada 10,000 individuos a nivel
mundial sufría de Cardiomiopatía Dilatada 1.
En México la incidencia de Cardiomiopatía dilatada es de 1 en 10,000
individuos, mientras que en Latinoamérica y en otros países en desarrollo es de
2 de cada 10,000 individuos hasta 1999.
En particular en el Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez” en
los últimos 3 años han ingresado un promedio de 150 casos por año de
pacientes con diagnóstico de CDI Estudios en otras poblaciones han
encontrado asociación con alelos HLA-DR. La población mestiza mexicana es
un grupo étnico muy bien caracterizado desde el punto de vista genético,
presenta una proporción del 56% de genes amerindios, 40% genes caucásicos
y 4% de genes de origen negro, dado que los estudios de asociación con HLA-
DR varían de acuerdo al grupo étnico estudiado, es importante saber cual es la
frecuencia de estos alelos en nuestra población y particularmente, saber si
alguno de estos participa en la susceptibilidad al desarrollo de esta enfermedad
en nuestro país.
4. HIPOTESIS
Si existe una relación inmunológica entre el tejido cardíaco y el antígeno
HLA clase II particularmente el HLA-DR que participa en la presentación
antigénica, entonces es posible esperar una diferencia en la frecuencia y
distribución de los alelos entre pacientes e individuos control.
5. OBJETIVO Determinar con técnicas moleculares los polimorfismos del gen HLA-DR,
en un grupo de pacientes mestizos mexicanos con cardiomiopatía dilatada
idiopática, con el fin de definir si existe alguna relación entre el polimorfismo de
HLA-DR y la susceptibilidad genética al desarrollo de esta enfermedad.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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6. METODOLOGÍA
6.1. SUJETOS DE ESTUDIO
El estudio contemplo a 44 pacientes mestizos mexicanos con
diagnóstico de CD y como grupo control se utilizaron a 99 individuos del mismo
origen étnico y sin antecedentes de enfermedades asociadas a los genes HLA
de acuerdo con los siguientes criterios.
Criterios de inclusión:
Que tanto pacientes como controles, así como sus dos últimas generaciones
hayan nacido en México (Mestizo Mexicano).
Los pacientes y controles estuvieron entre los 18 y 70 años de edad.
Los pacientes deberán tener diagnóstico de Cardiomiopatía Dilatada por el
cuerpo médico de la consulta externa en el Instituto Nacional de Cardiología
“Ignacio Chávez”.
Los controles no deberán presentar antecedentes de enfermedades cardiacas.
Tanto pacientes como controles deberán de estar de acuerdo en participar en
el protocolo de investigación.
Criterios de exclusión: 1. Ser Extranjeros.
2. Presentar enfermedades cardíacas o tener antecedentes familiares.
3. No estar de acuerdo en participar en el protocolo de investigación.
99 CONTROLES
44 PACIENTES con Dx. CD.
MESTIZOS MEXICANOS
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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6.2. EXTRACCIÓN DEL DNA (Técnica de Triton) A partir de 5 a 10 ml de sangre periférica, se separó el plasma por medio
de centrifugación eliminándose por completo, ya que se tiene el paquete rojo
se le adiciona la solución de TKM-1 con tritón, esto con el fin de lisar los
eritrocitos, se centrífuga para obtener los leucocitos, (si el botón continua muy
rojo, se hacen varios lavados solo con TKM-1) se adiciona la solución de TKM-
2 y SDS al 20%, en este paso se lisan los leucocitos, se incuba a una
temperatura de 55°C después se le adiciona NaCl (6M ó 5M), esto es para
precipitar las proteínas, se centrífuga, el sobrenadante se pasa a un tubo
nuevo y se le agrega etanol al 100% se mezcla por inmersión hasta que
precipite el DNA, se centrífuga, se lava el botón con etanol frío al 70% se
centrífuga, se seca para después resuspender con agua estéril y por ultimo se
ajusta .
El DNA se cuantifica en un espectrofotómetro y se lleva a una
concentración de 200 ng/µl para ser utilizado.
6.3. DETERMINACIÓN DE ALELOS HLA-DR
Lisis Eritrocitos
TKM-1 +
Lisis Leucocit
os
TKM-2 + SDS al
Incubar Etanol 100%
Precipitación DNA
Etanol frío 70%
Sangre Periferica 10 ml.
H2O d. Incubar
NaCl (6M óDeseca
Cuantificación 200 ng/ul.
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6.3. DETERMINACIÓN DE ALELOS HLA-DR
La determinación de estos alelos se realizó por la técnica de Dot Blot
reverso usando kits comerciales .(Dynal RELI SSO HLA-DRB test). Cada DNA
se amplificó empleando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR-SSO) con iniciadores genéricos para la región HLA-DR previamente
marcados con biotina la mezcla anterior se coloca en un termociclador 9700
(Applied Byosistems) con el siguiente programa 35 ciclos de 950 C 15’’, 600C
45’’, 720C 15’’ y una extensión de 72°C 5’.
Después de la amplificación cada muestra se visualiza en un gel de
agarosa al 1.5 % con la finalidad de corroborar la amplificación (240 pb). Los
productos amplificados se desnaturalizaron con una solución de NAOH y
acetato de amonio y se hibridaron con sondas específicas de alelos ancladas
en membranas de nitrocelulosa. El proceso de revelado incluyó un conjugado
de estreptavidina-peroxidasa y el sustrato colorido correspondiente. Para su
interpretación se usó un sofware (Dynal RELI SSO pattern Matching Program).
HLA- DR (Amplificado) GEL DE AGAROSA 1.5%
Hae III
13531078872603
310271, 281
23419411872
240 pb.
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DOTBLOT REVERSO (Sondas)
6.4 . ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
El diseño del estudio es transversal, prospectivo y analítico/descriptivo.
Para determinar la posible relación entre los alelos de HLA-DR y la
cardiomipatía dilatada se usaron pruebas estadísticas no paramétricas como
Chi-cuadrada (X2) y exacta de Fisher. La comparación entre dos grupos de
estudio se efectúo mediante tablas de contingencia de 2x2.El valor de p fue
corregido utilizando la corrección de Bonferroni, multiplicando por el número de
DR4 DR5 DR4 DR4 DR1
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comparaciones realizadas, en este caso el numero alélico fue de 12 (numero
de tipos de DR).
En nuestro trabajo se tipificaron 44 pacientes mestizos mexicanos con
Cardiomiopatia Dilatada y 99 controles sanos.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
TABLA 1. Frecuencias génicas (fg) de HLA-DR en controles y pacientes con Cardiomiopatía Dilatada.
_____________________________________________________________________ HLA-DR Pacientes Controles
(n= 44) (n=99)
n fg n fg p
_____________________________________________________________________
DR1 4 0.045 10 0.050
DR2 11 0.125 18 0.090
DR3 6 0.068 11 0.055
DR4 26 0.295 47 0.237
DR7 5 0.056 22 0.11
DR8 13 0.147 33 0.166
DR9 0 0.0 3 0.015
DR10 0 0.0 1 0.005
DR11 3 0.034 20 0.101
DR12 1 0.011 2 0.010
DR13 11 0.125 10 0.050 0.04
DR14 9 0.102 21 0.106
______________________________________________________________________________________________
En este estudio los datos preliminares muestran que la frecuencia de los
alelos HLA-DR es similar entre pacientes y controles. Se observa un
incremento moderado de HLA-DR 13 en pacientes y controles dándonos
una p=0.04, este valor no es significativo al ajustar la p, Es interesante
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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observar que el alelo asociado más frecuentemente en otras poblaciones es
el DR4, sin embargo esto no se observa en nuestro estudio.
8. CONCLUSIONES
En nuestros datos no se corrobora la asociación a la Cardiomiopatía
Dilatada Idiopática de alguno de los alelos HLA-DR previamente reportados.
El HLA-DR 13 esta incrementado de manera moderada en los pacientes, por
lo que es necesario incrementar el número de muestras para poder concluir
una posible asociación.
Determinación del Polimorfismo de los genes HLA-DR en pacientes mexicanos con Cardiomiopatía Dilatada, usando la Técnica de PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa) y Dot Blot Reverso
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