NEKODIRAJOČE RNA

PRESENEČENJE V (RNA) SVETU

ORGANIZACIJA GENOMAŠe pred desetletjem nam je genom

izgledal

kot linearna ureditev ločenih posameznih genov

GEN

DNA, ki kodira proteine DNA, ki kodira ne-kodirajoče„house-keeping“

RNA

(tRNA, rRNA)

CENTRALNA DOGMA (Crick, 1958)

(GEN)

ŽE V STRUKTURI GENA SO KODIRAJOČA IN NEKODIRAJOČA ZAPOREDJA

Vrste ponavljajoče DNA,

ki se pojavlja v človeškem genomu

Tandemske

ponovitve: satelitna

DNA

• Razpršena

ponovljena

zaporedjaSINEs

(Short

INterspersed

repeated

Elements), npr.

Alu

elementi

Retrovirusom

podobna zaporedja. npr. LINEs

(Long INterspersed repeated Elements)

• Podvojeni

geni

tudi

psevdogeni

IZVENGENSKA NE-KODIRAJOČA DNA

Kratka

ponavljajoča

razpršena zaporedja

(SINEs): Alu zaporedja

Značilnosti• Konsenzno: 281 bp• Sestavljena iz dveh sorodnih enot• Precejšnja variacija v dolžini zaradi delecij, substitucij

ali

insercij

• ~1,000,000 elementov/haploidni

genom

(~12%)

Porazdeljenost• Povprečni razmik je

4-kb

• Razpršene

vendar ne naključno?• Škodljive, če se vrinejo

v gen

•

Primeri insercij,

ki pomagajo pri regulaciji izražanja,

ko se vrinejo v regulatorne

elemente genov

•

Sebična

“Selfish”

DNA ne vpliva

na

fenotip, “zanima”

jo

le

lastno pomnoževanje

1 GGCCGGGCGC GGTGGCTCAC GCCTGTAATC CCAGCACTTT 41 GGGAGGCCGA GGCGGGCGGA TCACGAGGTC AGGAGATCGA 81 GACCATCCCG GCTAAAACGG TGAAACCCCG TCTCTACTAA 121 AAATACAAAA AATTAGCCGG GCGTAGTGGC GGGCGCCTGT 161 AGTCCCAGCT ACTTGGGAGG CTGAGGCAGG AGAATGGCGT 201 GAACCCGGGA GGCGGAGCTT GCAGTGAGCC GAGATCCCGC 241 CACTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCGA GACTCCGTCT 281

Dolga

razpršena jedrna zaporedja

(LINEs)

Značilnosti• 60 bp

-

7 kb

•

Precejšnja variacija v dolžini zaradi

5’

skrajševanj, delecij

in preurejanj

• ~500,000 elementov/haploidni

genom

(15-20%)• 3000-4000 jih

je celotne

dolžine

•

1-2% sposobne prepisovanja, najverjetneje preko

RNA

intermediata (kot pri

retrovirusih)

Porazdeljenost• Najdene v regijah bogatih z A-T bp

A-Trich

5’ 3’ORF1ORF2

Psevdogeni

• Psevdogeni:

•

Nefunkcionalne

kopije

genov ali genskih fragmentov

so nastale med razširitvijo genske družine•

Vsebujejo

insercije, delecije, nepomenske

mutacije• Običajno

se ne prepisujejo

• Lahko so povezane

s

prepisi funkcionalnih genov

Struktura evkariontskega

genoma

Repetitive

DNA

“DARK MATTER”

“Kakor zgoraj, tako spodaj”?

KAKO MALOPROTEIN

-

KODIRAJOČIH GENOV

VSEBUJE

NAJVEČJE PRESENEČENJE PRI DEKODIRANJU ČLOVEŠKEGA GENOMA

GENI, KI KODIRAJO PROTEINE

•

~ 20 tisoč*•

< 2% celotnega nukleotidnega

zaporedja

genoma•

Podobno število kot npr. nematod Caenorhabditis

elegans

(C. elegans)

*Inernational

Human Genome Sequencing

Consortium, 2004

Primerjalna genomikaČLOVEK DELI GENE Z DRUGIMI VRSTAMI

96% s šimpanzom80% z mišjo75% s psom50% z vinsko mušico (Drosophila)40% z nematodo

(C. elegans)

30% s kvasovko

POMEMBNI GENI

Od 289 pri človeških boleznih mutiranih genov,jih 211 tudi pri vinski mušici povzroča bolezni

To so geni vključeni v rak prostate, rak pankreasa,bolezni srca, cistično fibrozo, levkemijo…

Večina proteinov je ortolognihin imajo enako delovanje od nematod do človeka

KJE JE INFORMACIJA, KI PROGRAMIRA NAŠO KOMPLEKSNOST?

(C. elegans)

(H. sapiens)

RAZMERJE MED KODIRAJOČO IN NEKODIRAJOČO DNA

POVEČANA KOMPLEKSNOST

•

Prepisovanje ni omejeno na predele, ki kodirajo proteine

•

Prepisi niso sami sebi namen -

“selfish gene”

•

Funkcijska vloga preostalega deleža (98%) genoma, ki ne kodira proteinov?

RNA polimeraza iz T. aquaticus

sintetizira RNA

VEČ

KOT 90% GENOMA SE PREPIŠE DO RNA

tRNA

(prenašalna

RNA, adaptor v procesu translacije)rRNA

(ribosomalna

RNA, komponenta ribosoma, katalizira

peptidil

transferazno

reakcijo za povezovanje aminokislin v tvorbi proteinov)snRNA

(majhna jedrna

RNA, komponenta

spajalnega telesca)

snoRNA

(majhna nukleolarna

RNA, sodeluje pri procesiranju rRNA)RNase

P (ribocim,

pretvarja prekurzorske

tRNA

v aktivne tRNA)

SRP RNA (RNA komponenta „signal recognition particle“)

translacija

ProteinmRNADNAtranskripcija

KRITIČNE KOMONENTE ŠTEVILNIH CELIČNIH PROCESOV

ŽE POZNANA FUNCIJSKA VLOGA RNA, KI SE NE PREVEDE DO PROTEINOV

DVA RAZREDA RNA MOLEKUL

•

INFORMACIJSKA –

mRNA•

NEKODIRAJOČA -

ncRNA

VKLJUČITEV ncRNA

V CENTRALNO DOGMO

PREPISOVANJE NI OMEJENO NA PREDELE, KI KODIRAJO PROTEINE

•

Kompleksna mreža prekrivajočih se prepisov

•

Več

deset tisoč

dolgih RNA molekul, brez ali z malo translacijske sposobnosti

Pregled v Kapranov

et

al. 2007 Nat Rev Genet

“ENCODE“

IN “FANTOM” PROJEKT

Enciklopedia

of

DNA Elements

Consortium

-

(ENCODE) Projekt transkriptom

(“deep

sequencing”

tehnologija)

Število dolgih in kratkih ncRNA

prepisov presega število protein-kodirajočih genov

Functional

Annotation

of

Mammalian

cDNA

–

(FANTOM)Projekt transkriptom

Sekveniranje

cDNA

sesalcev (pa tudi vseh višjih evkarjontov)

Transkriptom

je že na posameznem lokusu

kompleksenmozaik prekrivajočih se

obojesmernih

prepisov, kodirajočih in ne-kodirajočih in tako predstavlja kompleksno hierarhijo

prekrivajočih se izoform…

V

človeškem genomu

je10000-100000 nekodirajočih

prepisov

Transkriptom

je kompleksen mozaik prekrivajočih se prepisovv obeh smereh

Ista genomska

zaporedja si delijo številni kodirajoči in nekodirajoči

prepisi v smiselni in proti-smiselni smeri

RAZLIČNE RNA POLIMERAZE

•

Pol I prepiše ribosomalne

RNA gene•

Pol II prepiše gene, ki kodirajo proteine in snRNA, miRNA, lncRNA,…

•

Pol III prepiše tRNA, miRNA, lncRNA,…Vsaka vsebuje specifično promotorsko

področje

ne katerega se veže, da začne prepis

Isti genomski

predel lahko prepišeta Pol II in Pol III, kar še dodatno poveča kompleksnost transkriptoma

ŠTEVILNI PREPISI NA ENI MATRIČNI DNA

NEKODIRAJOČE RNA

•

Dolge ncRNAs

(lncRNAs) prepisane iz kromatinskih lokusov

•

Majhne RNA prepisane s promotorskih predelov

•

RNA različnih velikosti, ki nastanejo iz dvosmernih (bidirectional) promotorjev

•

Razširjeno prepisovanje iz ponavljajočih zaporedij

(transpozonov, Alu

ponovitev)

•

ncRNA

iz mitohondrijske

DNA

NASTANEK RAZNOLIKIH VRST RNA

PASRs, promoter-associated

RNAs

lncRNAs, long

non-coding

RNAs

miRNAs, microRNAs

snoRNAs, small

nucleolar

RNAs;

sdRNAs, sno-derived

RNAs

endo-siRNAs, endogenous

siRNAs

piRNAs, PIWI-interacting

RNAs tiRNAs, transcription

initiation

RNAs

RASTOČE ŠTEVILO OBJAV O ncRNA

*do avgusta 2009

Novo-prepoznani razredi ncRNAs

v evkariontih

Wery

et

al. 2011 System

Biol Med

cryptic

unstable

transcripts

-

CUT,

stable

unannotated

transcripts

-

SUT

PROMoter

uPstream

Transcripts

-

PROMPT

large

intergenic

ncRNAs

-

lincRNA

promoter-associated

long

ncRNAs

-

PALR

terminator-associated

small

RNAs

-

TASR

promoter-associated

small

RNAs

-

PASRs

transcription

initiation

RNAs

-

tiRNA

transcription

start site-associated

RNAsTSSa-RNA

VRSTE NE-KODIRAJOČIH RNA

•

Dolge ncRNA–

200 nt

-

> 100000 nt

•

Majhne ncRNA–

18 nt

-

200 nt

VRSTE NE-KODIRAJOČIH RNA PRI ČLOVEKU

RELATIVNA ORIENTACIJA ncRNA

in mRNA

PREPISOV

5'NDR -

5' nucleosome-depleted

region

ORF –

open reading

frame

70% prepisov je protismernih

SELEKTIVNI IN DINAMIČNI PROFILI ncRNA

V CELIČNIH IN SUBCELIČNIH PREDELIH

PRECIZNO ČASOVNO IN PROSTORSKO IZRAŽANJE ncRNAJE IZREDNO POMEMBNO

Diferenčno izraženi ne-kodirajoči prepisi med diferenciacijo zarodnih izvornih celic

0 1 2 3 4 5 6 8 10 12 16 dan

Dinger

et

al. Long noncoding

RNAs

in mouse

embryonic

stem

cell pluripotency

and

differentiation. Genome Research

18: 1433–1445 (2008)

Značilnosti nekodirajočih RNA•

Lahko tvorijo veliko število funkcionalnih sekundarnih struktur

•

Nivoji izražanja lncRNA

so nižji kot protein kodirajočih genov

•

Nekatere ncRNA

so preferenčno izražene v določenih tkivih

•

Zavzemajo večino RNA mase celice (če odštejemo ribosomalno

in mitohondrijsko

RNA)

Spcifično

časovno-prostorsko izražanje ncRNA

Pregladanih

1,328 ncRNAs849 izraženih v možganih

60 povsod623 celično in regionalno specifičnih

2009

EVOLUCIJSKA OHRANJENOST ncRNA

•

Dolge ncRNA

na splošno niso ohranjene•

Veliko jih vsebuje le močno ohranjene elemente

•

Manjša ohranjenost zaradi novejše in hitrjše prilagoditvene selekcije

–

V ncRNA

HAR1F, ki se izraža v neokorteksu

potekajo pri človeku (napram

šimpanzu) hitre evolucijske spremembe

•

Majhne RNA (npr. miRNA) so visoko evolucijsko ohranjene

•

Večja ohranjenost v RNA sekundarnih strukturah kot v primarnih zaporedjih

IZRAŽANJE RNA HAR1F

V RAZVIJAJOČIH MOŽGANIH

Pollard

et

al. Nature

Epigenetski

procesi so ključni za:

•

Diferenciacijo in razvoj•

Dogotrajne

odgovore na spremembe

okolja (dedovanje, evolucija)•

Delovanje možganov

•

Nastanek bolezni

Epigenetski

regulatorni

mehanizem

•

Epigenetski

spomin se vgradi:–

v metilacijo

in hidroksi-metilacijo

citozina

v DNA–

Z modifikacijo kromatina (preko histonskih

oznak)

To se dogaja s pomočjo izredne mreže

ENCIMOV/ KOMPLEKSOV/ MOLEKULSKIH GRADNIKOV ~ 60

ki vključujejo skupine proteinov

Polycomb

in Trithorax, ki so ključna za večino (če ne vse) razvojne procese in programe v

organizmu

Podvojevanje

DNA-metilacijskega

vzorca

Np95 odkrije mesto metilacije

v matrični verigi, sledi vezanje encima Dnmt1 (DNA-metil-transferaza) na Np95 in metilacija

podvojene verige

PCNA-”proliferating

cell

nuclear

antigen”

ki objame DNA

Histonske oznake

Mehanizem za vzpodbujanje/zaviranje izražanja DNA s skupino proteinov Polycomb

in trithorax

•

KAJ DOLOČA MESTNO-SELEKTIVNOST TEH ENCIMOV?

•

KAJ DOLOČA V KAKŠNEM STANJU JE KROMATIN?

•

KAKŠNE SO MOLEKULARNE OSNOVE INTERAKCIJ MED EPIGENOMOM IN OKOLJEM?

DNA ncRNA OKOLJE

NEKODIRAJOČE RNA IN DEDOVANJE

•

Predstavlja nov nivo v “zakonih” Mendlovega dedovanja, ki ga imenujemo

mehki-”Lamarck-izem”–

Pogoji okolja v zgodnjem življenjskem obdobju lahko povzročijo epigenetske

spremembe pri ljudeh, ki ostanejo celo življenje in so lahko posledica preko ncRNA

posredovane modifikacije metilacije

DNA ali modifikacije histonskih

oznak

–

Epigenetska

sprememba v času nosečnosti se lahko prenese v naslednjo generacijo.

Heijmans

et

al. 2008

VKLJUČENOST ncRNA

V ŠTEVILNE BIOLOŠKE PROCESE

•

Epigenetiko•

Alternativno izražanje

•

Strukturne komponente•

Importu

v jedro

•

Prekurzorji

za majne

RNA•

Regulatorji upadanja mRNA

Nekodirajoče RNA

•

Celotno področje transkripcijske

in post- transkripcijske

regulacije doživlja

renesanso

•

Vpliv na vsa področja biokemije, biologije in medicine

"dark matter" ali "junk" DNA

•

Glavna biološka vloga

–

Regulaciji genov–

Celičnem razvoju

–

Metabolizmu–

Kompleksnosti organizmov

–

Evoluciji–

Razvoju bolezni