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Nextera DNA サンプル調製キットと

Dual Indexシーケンス渡辺真子 (Masako Watanabe, PhD) テクニカルアプリケーションサイエンティスト

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Outline of Presentation

1. Nextera DNA サンプル調製キット 2. サンプル調製とシーケンスワークフロー 3. 製品番号とソフトウェア情報 4. シナリオ（例） 5. FAQs 6. ワークフローのまとめ

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Nextera -- 簡単で迅速なサンプル調製キット

迅速で簡素化されたワークフロー

– プロトコールは 90分で終了

– DNA断片とアダプター付加をシングルチューブの酵素反応で実施

– DNA断片化装置は不要

– 簡単な4ステップのプロトコール

微量スタート： 50ng DNA

ハイスループットとインデックス

– バッチあたり96サンプルを処理

– マスターミックスの試薬と自動化対応可能な試薬キット

– 96インデックスのサポート

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PCRの最適化

– 必要な試薬類

– 少ないサイクル数

– ポリメラーゼの改良

– GCバイアスとエラーレートを減少

96インデックスで全シーケンサーに対応 (MiSeq/HiSeq/HiScanSQ/GAIIX)

プレートベースのプロトコール

マスターミックスへの変更

– 簡単なプロトコールを少ないチューブで

最適化されたタグメンテーション反応

– MiSeq 2x150bp をサポート

イルミナのNextera DNAサンプル調製キットの改良点

Improved GC performance (High ~67% GC content of Rhodobacter genome)

Illumina

Nextera

Epicentre

Nextera

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サンプル調製とシーケンスワークフロー

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Nextera で “タグメント”

• 断片化とアダプター付加をシングルチューブで同時反応

• 精製

PCRでアダプターとインデックスを付加

• PCR共通のアダプターを使用

• 最大 96 インデックス対応

• 精製

精製とサイズ選定

• MiSeq ロングリードに対応できるようにインサートサイズの分布を制限

シーケンス

• イルミナ機種に対応

• illumina Experiment Manager (IEM)を使ってサンプルシートの作成

Nextera サンプル調製キットのワークフロー

25分 30分 30分

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ステップ1: テンプレートDNAの”タグメント”

8

ステップ 2: アダプターとインデックスをPCRで付加

9

ステップ 3: 精製とシーケンス

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96サンプルまでのマルチプレックス

– ２つのインデックスによるサンプルの同定

– 20 チューブで96インデックスが可能

12種類 x 8 種類= 96インデックス

– 1レーンにつき最大96サンプル処理可能

– デマルチプレックスに対応したソフトウェア

シンプルなセットアップ

– Illumina Experiment Manager (IEM) でサンプルシートを作成

– プレートフィクサーを使った反応準備

Dual Indexシーケンス (96サンプルのマルチプレックス対応)

P5 Index 2 P7 Index 1

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Cluster

amplification

FLOWCELL

Linearize DNA

FLOWCELL

Sequence 1st strand

FLOWCELL

Sequence 2nd strand

FLOWCELL

Linearize DNA

FLOWCELL

Strand re-synthesis

1st

cut

2nd

cut

Dual Indexペアエンドシーケンス Extends the Power of the Technology

Read 1 25-150 bp

Read 2 25-150 bp

Index 1 8bp

7bp dark + Index 2 8bp

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TruSeq Dual Index シーケンスプライマーの使用

– マルチプレックスでなくても全てのリードのシーケンスプライマーが必要

– Single Read (SR) フローセル FC-121-1003

– Paired End (PE) フローセル PE-121-1003

HP10 read 1 シーケンスプライマー: クラスター形成

(cBot の strip tube hyb recipe を使用)

Read 1 産物を除去

HP12 index read1プライマー: 8サイクルのindex read 1

SR または PE でのIndex Read 2:

– SRフローセル: HP9 プライマーによる8サイクルのindex read 2

– PEフローセル:フローセル表面のP5 配列を使用

7 サイクルのダークサイクルに続いて

8 サイクルのIndex read 2 (SBS 試薬15サイクル分)

HP11 read 2 プライマー: PEシーケンス

Nextera Dual Index シーケンスのワークフロー

P5 Index 2 P7 Index 1

Single Read

Run

Paired End

Run

Index Read 1

(HP12)

Index Read 2

(HP9)

Index Read 1

(HP12)

Index Read 2

(Grafted P5)

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インデックス情報が入ったサンプルシートの作成

(CASAVA またはMiSeq Reporterに必要)

サンプルシートの作成はサンプル調製の前

ソフトウェア – Illumina Experiment Manager (IEM) Paired End

Index Read 1

(HP12)

Index Read 2

(Grafted P5)

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Nextera サンプル調製キットとシーケンスワークフローの注意点

NEXTERA サンプル調製キット

サンプル調製キットとインデックスキットの両キットが必要。

Illumina Experiment Manger でサンプルシートの作成。

シーケンス (SBS)

反応の変更なし。デュアルインデックス対応のソフトウェアが必要。

HiSeq/HiScanSQ と GAでは別途プライマーミックスが必要。 (要発注)

デュアルインデックスではSBS試薬23サイクル分を使用。

MiSeqカートリッジには必要な全ての試薬が含まれる。

クラスター形成

反応の変更なし。別途シーケンスプライマーが必要。 (要発注)

解析

デマルチプレックスにはCASAVA 1.8.2 または MiSeq Reporterが必要。

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製品番号とキットソフトウェア情報

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製品番号とキット情報

Nextera DNA サンプル調製キット

– 24 samples FC-121-1030

– 96 samples FC-121-1031

Nextera インデックスキット

– 24 Indices, 96 samples FC-121-1011

– 96 Indices, 384 samples FC-121-1012

*インデックスを使用しない場合も必要*

TruSeq Dual Index シーケンスプライマー

– Single Read Flow Cell FC-121-1003

– Paired End Flow Cell PE-121-1003

完全なライブラリーに必要なインデックスオリゴを含む。サンプルのプールをしない場合でも必要。

必要な試薬を含む。

クラスター形成、全てのリードのシーケンスに必要なシーケンスプライマーを含む。フローセルのタイプ別 HiSeq/HiScanSQ 、GAIIx で必要。 MiSeq は試薬カートリッジに新しいプライマーが入っている。

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ソフトウェアのバージョン情報

ソフトウェアのアップデート

– Illumina Experiment Manager (IEM) : サンプルシートの作成

– cBot 1.4 : * strip tube hyb recipeを使用*

– HCS 1.5 / SCS 2.10 / MCS

– SAV 1.8.4

– CASAVA 1.8.2 / MSR

サンプルプールのガイドライン

– low-plexity のプール: Nextera Sample Prep ユーザーガイド (15027987)

SBS 試薬の使用

– デュアルインデックスには、別途23 サイクル必要

– HiSeqでの2x100 dual index runには 4 x 50 cycle kits を４つ使用

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シナリオ

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サンプル調製

FC-121-1024 Nextera DNA Sample Prep kit (24 samples)

加えて…

FC-121-1011 Nextera Index kit (24 Indices, 96 samples)

クラスター形成とシーケンス

MS-102-1001 MiSeq Reagent Kit (300-cycles-PE)

シナリオ 1: MiSeqで 2x150 PE ランをしたい。

1 レーンに流すのは1サンプルだけ。

発注ワークフロー

キットの発注

サンプルシートの作成 Illumina Experiment Manager

サンプル調製 Nextera Sample Prep kit と Index kit :

クラスター形成とシーケンス MiSeq

データ解析 MiSeq Reporter

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シナリオ2: HiSeq 2000 で2x100 PE ランをしたい。

1レーン75サンプルのマルチプレックス。

サンプル調製


加えて. . .

FC-121-1012 Nextera Index kit (96 Indices, 384 samples )


PE-401-3001 TruSeq PE Cluster kit v3- cBot- HS

シーケンスプライマー

PE-121-1003 TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit, Paired End

SBS

４箱 FC-401-3002 TruSeq SBS kit v3- HS (50 cycle)


キットの発注

インデックスの組み合わせとサンプルシートの作成: Illumina Experiment Manager

サンプル調製: Nextera Sample Prep kit と Index kit

クラスター形成: cBot 1.4, HP10を使用した tube strip hyb recipe (HP10 in TruSeq Dual Index Sequencing Primer kit)

シーケンス: HiSeq with HCS 1.5, 50 cycle kits 4箱, TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit のプライマー

データ解析: CASAVA 1.8.2

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シナリオ3: GAIIx で72 cycle single read のランを行いたい。

1レーン24 サンプルのマルチプレックス。

サンプル調製


加えて…

FC-121-1011 Nextera Index kit (24 Indices, 96 samples)


GD-300-2001 TruSeq SR Cluster Kit v2- cBot- GA

シーケンスプライマー

FC-121-1003 TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit, Single Read

SBS

3箱 FC-104-5001 Truseq SBS kit v5- GA (36 cycle)

キットの発注

インデックスの組み合わせとサンプルシートの作成: Illumina Experiment Manager

サンプル調製: Nextera Sample Prep kit と Index kit

クラスター形成: cBot 1.4, HP10を使用した tube strip hyb recipe (HP10 in TruSeq Dual Index Sequencing Primer kit)

シーケンス: GA with SCS 2.10, 36 cycle kits 3箱 TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit のプライマー

データ解析: CASAVA 1.8.2


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FAQs

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イルミナ Nextera ライブラリーは、同じレーンに他のライブラリー (例えばTruSeq DNA) と合わせて解析できますか？

いいえ。イルミナでは、全ての可能なインデックスの組み合わせをテストしておりませんので、同じレーンで異なる種類のライブラリーをシーケンスすることは推奨しておりません。

イルミナ Nextera ライブラリーは、同じフローセルで異なる種類のライブラリーを合わせて解析できますか？

はい。異なるレーンであれば、同じフローセルに違う種類のライブラリーをシーケンスしていただけます。TruSeq Dual Index シーケンスプライマーカクテルは、互換性があり、全てのpre-TruSeq イルミナライブラリーでご使用いただけます。すべてのリードでDual index シーケンスプライマーご使用いただけます。

注意: CASAVA1.8.2 でのデマルチプレックスは、別のサンプルシートが必要です。

Nextera FAQs

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Nextera FAQs

POOLING GUIDELINES:

Illumina Experiment Manager (IEM) を使用する。

– サイクルあたり各レーザーに対応するいずれかの塩基が必要 (green = G/T; red = A/C)。

サンプルを混合する際にすべてのインデックスを使用しない場合は Illumina Nextera DNA

Sample Preparation Guide 内のチャートを参照:

– ≤ 6 サンプル: 24 index キットを使用してシングルインデックスで行う。

– > 6 サンプル: 使用・混合の方法が User Guide で推奨されている。

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Nexteraライブラリーの調製

•2 種類のキット

•Nextera DNA Sample Preparation Kit

•Nextera Index kit

• IEMでサンプルシートを作成


•シーケンスプライマー

•TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit, SR

•TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit, PE

• cBot 1.4 software

•HP10 プライマー •strip tube hyb recipe を使用

•MiSeq 変更なし

シーケンス

•HiSeq

•HCS 1.5, SAV 1.8.4

•GA

• SCS 2.10, SAV 1.8.4

•インデックスとread2 プライマーは TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit から使用。

• SBS試薬 23 cycles 分が別途必要

•MiSeq 変更なし

デマルチプレックス

•CASAVA 1.8.2

•MiSeq Reporter

• Illumina Experiment Manager

ワークフローのまとめ

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Nextera トレーニングコース

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Nextera トレーニングコース http://support.illumina.com/training.ilmn

Sequencing: Illumina’s Dual Indexing Strategy

Nextera Sample Preparation: Best Practices

Nextera: Sample Preparation

http://support.illumina.com/training.ilmn

http://support.illumina.com/icomLogin.ilmn?iframe&ReturnUrl=https://mycourses.illumina.com/courses/Sequencing_Illuminas_Dual_Indexing_Strategy/Dual Indexing.htm




http://support.illumina.com/icomLogin.ilmn?iframe&ReturnUrl=https://mycourses.illumina.com/courses/Nextera_Sample_Prep_Best_Practices/index.html





http://support.illumina.com/icomLogin.ilmn?iframe&ReturnUrl=https://mycourses.illumina.com/courses/Illumina_Nextera_DNA_Sample_Preparation_Kit/index.html



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ご清聴ありがとうございました。

ご質問は[email protected]で承ります。

mailto:ご質問は[email protected]

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