nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------ ------

PHẠM NHO

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH

β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 1.04.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Ri

Hà nội-2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG I – TỔNG QUAN ................................................................................ 2

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam .............................................................. 2

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay .............. 6

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam .............................................. 8

1.3.1 Phương pháp quang học.............................................................................. 8

1.3.2 Phương pháp điện hóa ................................................................................ 9

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................................................ 9

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) .............. 12

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 13

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu ..................................................................... 13

2.1.1 Đối tượng ................................................................................................... 13

2.1.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 13

2.2 Giơi thiêu chung vê phương phap Điên di mao quan ........................................ 13

2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản ......................................... 13

2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản ..................................... 14

2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu ................... 14

2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất ...................................... 15

2.2.3 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) ........ 17

2.2.4 Mao quản và ử lý mao quản trước khi tách ................................................ 24

2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu ..................................................................... 26

2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản .............................................. 27

2.2.7 Phân loại các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản ................. 28

2..2.8Phân tích định lượng bằng phương pháp điện di mao quản ....................... 28

2.3.1 Kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong

mẫu sinh học ............................................................................................................ 29

2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extration-SPE) Thực nghiệm .......... 29

2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu

sinh học .................................................................................................................... 32

2.4. Thực nghiêm ................................................................................................. 31

2.4.1 Máy móc dụng cụ ....................................................................................... 34

2.4. Hóa chất ........................................................................................................ 35

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 36

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam......................................... 36

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất ................................................................... 36

3.1.2 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di ................................................ 37

3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm ................................................ 40

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm ........................................................ 41

3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS .............................. 43

3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu .................................................... 47

3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di ............................................................... 49

3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ mao quản ............................................. 52

3.1.12 Tổng kết điều kiện tối ưu .......................................................................... 54

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích ....................................................................... 55

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ........................................ 55

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn

.................................................................................................................................. 58

3.2.3 Độ chính xác của phép đo ........................................................................... 59

3.2.4 Độ lặp lại của phép đo ................................................................................ 62

3.3 Phân tích mẫu thực ............................................................................................. 64

3.3.1 Khảo sát điều kiện SPE mẫu nước tiểu thêm chuẩn ................................... 64

3.3.1.1 Chọn cột chiết pha rắn các β-lactam trong mẫu nước tiểu ................ 64

3.3.1.2 Khảo sát lực rửa giải của hệ các dung môi ....................................... 64

3.3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải .................................................. 66

3.3.1.4 Khảo sát pH rửa giải.......................................................................... 67

3.3.2 Phân tích mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện ..................................... 70

3.4 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen

(MECC) .................................................................................................................... 71

3.5 Hướng phát triển của đề tài ................................................................................ 72

CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN .................................................................................... 73

1. Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy điện di ..................... 73

2. Đánh giá phương pháp phân tích ......................................................................... 73

3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu .................. 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 75

Phụ lục ..................................................................................................................... 79

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người

ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe.

β-lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y

từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh

được dùng nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên sử dụng loại kháng sinh này không đúng

liều lượng và cách dùng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa

trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do

virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn

cho việc chẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng

lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy

kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết

để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.

Hai phương pháp dùng thường dùng để phân tích các β-lactam là HPLCvà

phương pháp Điện đi mao quản (CE). Phương pháp HPLC làphương pháp tách có

độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tuy

nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung

môi trong quá trình phân tích, vì vậy làm cho giá thành phân tích cao. Ngược lại,

phương pháp CE lại sử dụng lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3-4

lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.Ở

Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các

kháng sinh β-lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường

bằng kỹ thuật HPLC nhưng với kỹ thuật điện di mao quản thì chưa nhiều.

Với những lý do nêu trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu luận văn là: “Nghiên cứu

điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản”

2

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,35]

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm:

penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ

biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và

Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic

(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.

Cấu trúc và phân loại:

* Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-

Lactam

N

SCH

3

CH3

NH

O

COR

COOM

2

3

4

1

56

7

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R

là:(2S,5R,6R3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic

acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,

5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác

nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác

nhau.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

3

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

Tên kháng sinh R Hoạt tính N

hó

m p

en

icil

lin

tựn

hiê

n

Penicillin G

(PENG)

Benzathin

CH2-

Benzyl

Gồm các Penicillin

tự nhiên và dẫn

xuất.Phổ hẹp: vi

khuẩn gram(+).

Không kháng β-

lactamase

Nh

óm

pen

icil

lin

kh

án

g p

enic

illi

iase

Oxacillin

(OXA) N

C-

O

CH3

6-[(5-

methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-

carbonyl)amino]

Là các Penicillin bán

tổng hợp. Phổ hẹp

như nhóm I. Kháng

penicilliiase, không

tác động vào vòng β-

lactam được. Cloxacillin

(CLO)

Cl NO

C-

CH3

6-{[3-(2-

chloropheny )-5-methyl-

oxazole-4-carbonyl]amino}

Nh

óm

p

en

icil

lin

ph

ổ r

ộn

g Ampicillin

(AMP)

CH-

NH2NH2

6-([(2R)-2-

amino-2-phenylacetyl]amino)

Phổ rộng, tác dụng cả

khuẩn gram (+) và

(-). Không kháng β-

lactamase và

penicilliiase

Amoxicillin

(AMO)

CH-

NH2NH2

HO 6-{[(2R)-2-

amino-2-(4-hydroxyphenyl)-

acetyl]amino}

4

* Các cephalosporin

Các cephalosporin có cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-lactam 4 cạnh gắn

với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các

gốc R.

NH

O

COR1

N

S

R3

R2

COOM

12

3

4

5

67

8

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là:(6R,7R) 8-oxo-5-

thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các

cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng

trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày

thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF).

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosprin

Thế hệ Kháng sinh R1

R2 R3

I: Phổ tác dụng trung

bình, tác dụng mạnh

nhất trên vi khuẩn

gram (+), yếu nhất trên

gram (-). Không bền và

dễ bị β-lactamase phá

hủy

Cephalexin

(CEP)

CH-

NH2

-H -CH3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

5

III: Tác dụng tốt trên vi

khuẩn gram (-), trên vi

khuẩn gram (+) thì tác

dụng kém penicillin và

cephalosporin thế hệ I.

Bền với β-lactamase

Cefixim

(CEF) S

N

N

NH2

HOOCCH2O

-H -CH=CH2

Tính chất:Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan

trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung

môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần

chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2.

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ

thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp

thụ).

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5–2,8 tùy vào cấu trúc

phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên

kháng sinh pka1

Tên

kháng sinh pka1

Tên

kháng sinh pka1

PEN 2,74 AMO 2,8 CLO 2,7

AMP 2,7 CEP 2,6 OXA 2,72

Tác dụng:

Cơ chế

Các penicillin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị

6

ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa

enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi

khuẩn bị tiêu diệt.

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm

hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ

rộng.

Kháng thuốc

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là các enzim có tác dụng mở vòng β-lactam,

theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các

cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin).

Độc tính

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị

ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc

phản vệ.

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định

dị ứng với thành phần của thuốc.

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ

chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các

bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để

điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích

hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở

các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần

thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách.

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu

người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales

[4,29], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong

khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không

7

điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở

nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin.

Theo báo cáo của A.W. McCormick [14] năm 2003, tỷ lệ pneumococus kháng

penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus

sẽ đề kháng penicillin. Tỷ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4

thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương

tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong

vòng 24 giờ. D.P. Raymond [18] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng

vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử

vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô la Mỹ.

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [6], năm

2005 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh

nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).

Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít

trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử

vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết

tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi

Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60%

tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện.Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng

hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng

huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi

khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của

Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%.

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng

kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các

nhà chuyên môn đã thành lập “Liên hiệp vì sự Sử dụng Kháng sinh Hợp lý”

(Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm

8

chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát

triển.

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch Toàn cầu để Kiểm

soát Sự Đề kháng Kháng sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng

cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và

chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu.

Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các

thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo,

không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất……

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ

bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế

được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

1.3 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng β-lactam

1.3.1 Phƣơng pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học

của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp

này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-

lactam, đặc biệt trong dược phẩm.

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng độ hấp thụ không cao, chúng cũng tạo phức

với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường

hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.

Các phương pháp huỳnh quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy

khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các

β-lactam.

Fernández-González và cộng sự [13] dùng Cu2+

thủy phân và tạo phức với

AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu

được 4.10-7

M (0,16mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho

9

hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống,

huyết thanh.

Theo [23], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng

phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng

sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu

vàng được đo tại bước sóng 335nm. Khoảng tuyến tính từ 8-40mg/l và giới hạn phát

hiện của AMP là 0,73mg/l, AMP 0,76mg/l.

Wei Liu và cộng sự [35], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn nối trực tiếp đãphân tíchmột

số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN

là 0,5mg/l, cefradine 0,04mg/l, cefadroxil là 0,08mg/l, 0,1mg/l CEP. Kết quả được

kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong

mẫu là 0,1mg/l.

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn nối tiếp, các

phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và

trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích,

việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần

thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.

1.3.2 Phƣơng pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam

nhưng không phổ biến nhiều. Theo [19], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng

sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92μM (0,39mg/l) trong

môi trường đệm axetat 0,1M, pH=5,2.

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng

quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách

pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các

10

loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính

xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau

khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã

mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối

với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể

phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.

Theo [36], WJBlanchflower và cộng sự dùng HPLC-MS phân tích penicillin

V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký:

cột Inertsil ODS2(4,6mm×150mm, 5μm); pha động: ACN-(C2H5)3N 0,5% (45/55),

dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10μg/kg, trong thịt

25-100μg/kg.

J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC-MS để phân tích β-lactam

trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18

(2,1mm×50mm, 2,5μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C

=Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút

A/B/C=50:40:10, 20phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25ml/phút; nhiệt độ cột

450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8-10 ng/l với nước bề mặt, 13-18ng/l với

nước thải trước xử lý, 8-15ng/l với nước thải sau xử lý.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang,

với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [33] C.Y.W Ang và cộng sự

dùng cột Spherisorb ODS2 (250mmx4,6mm, 5μm) phân tích AMO trong sữa

bò(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6-24/76; detector huỳnh quang: 346-

422nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5μg/kg và 0,3μg/kg. Tuy vậy, do các β-

lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang

hóa [18, 28] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không

áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.

11

Tác giả Ngô Quang Trung [11] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6

kháng sinh β-lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải

bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250mm x

4,6mm, 5µm, pha động gồm đệm axetat 12mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%.

Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh

trong khoảng 0,1-1mg/l, hệ số tương quan R >0,99. Giới hạn phát hiện LOD và

LOQ là 0,4 và 9,1mg/l .

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…

để phân tích các β-lactam.

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như

thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp

đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ.

1.3.4 Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillaryelectrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu

quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng

dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác

nhau.

L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [23] sử dụng phương pháp điện di

mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịchđệmđiện di

gồm 40mM đệm Borat, 100mM SDS, pH 8,5. Tiến hành phân tích tại thếđiện di 10

kV, nhiệtđộ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh

gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong

mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0,14mg/l-0,27mg/l, độ

lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 - 0,86%, diện tích pic 1,3 - 4,15%. Độ

thu hồi trên 96%.

Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector

điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp

12

0,31μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l-8mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch

chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/mẫu.

Attila Gaspar và cộng sự [15] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ

cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone

electrophoresis - CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25mM có pH = 6,8,

trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin,

cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten,

cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 - 1,62mg/l.

Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89mg/l; khoảng

tuyến tính 5-200mg/l. Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ

bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4

và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại

nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.

Phương pháp MECC cũng được M.I. Bailón Pérez, L. Cuadros Rodr´ ıguez,

C. Cruces-Blanco [24] xác định 9 loại kháng sinh β-lactam gồm CLO, dicloxacillin,

OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược

phẩm. Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8,5

làm chất nền điện di và thế điện di 25kV. Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến

1,42mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian

lưu từ 1,5 đến 1,7%. Độ thu hồi từ 91 - 95,6%.

Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến

hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc

phân tích các mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ

chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy

phương pháp CE sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của

phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này,

chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M.

Valcárcel [23], M.I. Bail ón Pérez, L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [24]

trong mẫu dược phẩm và sinh học.

13

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tƣợng

Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu là một mảng đề

tài rất thực tế và quan trọng. Như chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn

đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh

hưởng xấu đến sức khỏe con người.

Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là

penicillin(PENG), cloxacillin(CLO), oxacilin(OXA) ampicillin(AMP),

amoxicillin(AMO) và cephalexin(CEP)là các kháng sinh β-lactam được sử dụng

phổ biến hiện nay.

2.1.2Nội dung nghiên cứu

Nội dung đề tài cần giải quyết là:

- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản mixen

(MECC) với detector Diod Array (DAD) có độ nhạy cao.

- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách một số kháng sinh -lactam như: pH,

nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…

- Nghiên cứu điều kiện chiết pha rắn; tách và làm giàu-lactam từ nước tiểu

- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu

- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp

2.2Giơi thiêu chung vê phƣơng phap Điên di mao quan [5,8,22]

Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương

pháp điện di mao quản điện động học mixen (MECC).

2.2.1Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản

- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -

mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản

(đường kính 25-100m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH

thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một

14

nguồn thế cao một chiều (V: 10-30 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CE là

kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự

tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các

hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất

xẩy ra nhanh và hiệu quả cao

- Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force:

EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan

sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vìđiện tích, kích thước và độ

linh động của chúng khác nhau.

2.2.2 Các đặc trƣng của phƣơng pháp điện di mao quản

2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu

Độ linh động tuyệt đối của cấu tử trong dung dịch điện ly chuyển động trong

điện trường được biểu diễn bằng công thức:

μef = q

6πɳr cm2V−1s−1 (1)

Trong đó: q - điện tích của hạt tích điện (culong)

ɳ - độ nhớt của dung dịch

r - bán kính ion

Trong dung dịch, độ linh động của một cấu tử còn liên quan đến thế zeta nên:

μef = Dζef

4πɳ (cm2V−1s−1) (2)

Trong đó: D - hằng số điện môi

ζef - thế zeta

Độ linh động điện di thẩm thấu, biểu diễn tương tự phương trình

μeof = Dζeo

4πɳ (3)

ζeo là thế zeta thẩm thấu

Độ linh động điện di hiệu quả:

15

Trong dung dịch chất điện ly, mỗi ion luôn chịu ảnh hưởng bởi lực tác động

của nhiều ion khác nhau xung quanh, đặt biệt là các ion đối làm cho tác động của

điện trường tới ion sẽ giảm đi. Mặt khác, điện trường chỉ tác động tới các cấu tử

mang điện tích, mà điều này còn phụ thuôc nhiều yếu tố, đó là hằng số phân ly của

chất điên ly, pH của dung dịch và nồng độ của nó. Như vậy, độ linh động điện di

của một ion khi bị tác động của các yếu tố kể trên nên khác với độ linh động điện di

tuyệt đối.Độ linh động điện di của ion tương ứng với phần ion bị ảnh hưởng của

điện trường đó gọi là độ linh động điện di hiệu quả, kí hiệu là µ’

[ 𝜇 , = 𝜇𝑖 .𝑛𝑖𝑖 4 ; trong đó µi là độ linh động ion, ni là phần mol

2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất

Nguyên nhân xuất hiện dòng điện di thẩm thấu

Dòng điện di thẩm thấu (EOF) trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên

thành mao quản và chất điện ly chứa trong nó. Sự phân li của các nhóm chức trên

bề mặt mao quản tạo nên lớp điện tích trái dấu từ đó hình thành lớp điện kép, phía

trong là các ion cửa và phía ngoài của nó là lớp khuếch tán. Nếu lớp ion cửa mang

điện tích âm, thì lớp phía ngoài sẽ mang điện tích dương và ngượclại.

Hình 2.1 Cấu trúc các lớp điện trong thành mao quản

16

Trong bề mặt mao quản silica, các nhóm silanol (–SiOH) bị deproton thành –

SiO- khi tiếp xúc với dung dịch chất điện li và hình thành một lớp điện tích âm. Để

trung hòa các điện tích âm trên, cần có các điện tích dương, và do đó hình thành

một lớp điện kép, tiếp theo là các lớp khuếch tán. Ở pH=9 thì các nhóm silanol hầu

như ion hóa hoàn toàn, lớp điện kép hình thành một cách tốt nhất. Lớp điện kép này

lại liên quan mật thiết với dòng điện di thẩm thấu EOF. Bản chất của dong EOF là

sự di chuyển có hướng của các điện tích trong môi trường. Trong dung dịch đệm,

các ion tích điện dương sẽ di chuyển về phía cực âm còn các ion tích điện âm sẽ di

chuyển theo chiều ngược lại về phía cực dương.

Trong dung dịch nước và các hệ đệm khác nhau, các ion không tồn tại độc lập

mà bị hyđrat hóa, đặt biệt là các ion dương từ đó khi các ion di chuyển trong điện

trường kéo theo sự di chuyển của cả nước. Khi ta đặt một thế vào hai đầu mao

quản(cỡ 25-100µm) thì dòng dung dịch trong mao quản đã xảy ra. Ví dụ, vận tốc

dòng đạt 4nl/s với mao quản có đường kính 50µm. Đây chính là dòng điện di thẩm

thấu, EOF. Chiều của dòng điện di thẩm thấu đi từ cực dương sang cực âm.

Sự di chuyển của ion dương về cực âm mang theo nước hydrat tạo thành dòng

dung dịch mang theo cả phân tử trung hòa và cả ion âm (bị cuốn theo dòng dung

dịch vì không vượt qua dòng EOF). Trong dòng chảy về phía cực âm đi đầu là các

ion mang điện tích dương tiếp theo là các phân tử trung hòa, đi sau cùng là các ion

mang điện tích âm.

Hình 2.2 Lớp điện kép trong mao quản silic

17

Tính chất của dòng EOF

Dòng EOF di chuyển trong mao quản được điều khiển bằng điện trường cho

nên tính chất khác so với dòng EOF được điều khiển bằng áp suất. Lực tác động lên

các chất điện li trong dung dịch nền rất đồng đều, hơn nữa mao quản không có chất

nhồi nên mặt cắt tiết diện trong mao quản rất phẳng, chỉ có một phần nhỏ nơi tiếp

giáp với bề mặt của thành mao quản có sự kéo dài của chân. Điều này có thể giải

thích do sự ma sát, tuy nhiên so sánh với mặt cắt khi điều khiển bằng áp suất thì

trong trường hợp điều khiển bằng điện trường tốt hơn rất nhiều.

a) b)

Đường kính của mao quản cũng ảnh hưởng nhiều tời dòng EOF, người ta thấy

rằng đối với mao quản nhỏ trong vùng 25-50µm, sự thay đổi đường kính mao quản

không ảnh hưởng tới dòng EOF. Tuy nhiên khi đường kính mao quản lớn hơn

50µm thì khi tăng đường kính mao quản sẽ làm giảm dòng EOF, thậm chí d >

200µm dòng EOF có thể mất hẳn.

2.2.3 Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC)

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) là kỹ thuật

tách điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản

(Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các

Hình 2.3:a) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng điện áp và píc tương ứng

b) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng áp suất và píc tương ứng

18

kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong

sinh học, y học và dược. MECC là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức

mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các

chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion).

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử

Mixen (tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này

sẽ dẫn dắt và đóng góp vào khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất

trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách sắc

kí của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MECC được điều chỉnh bởi các

chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở

nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC -

Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium

Dodecyl Sulfat), có CMC= 9mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất

hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành trong ống mao quản các tổ

hợp của các tiểu phân SDS tạo thành các Mixen (pha tĩnh giả). Các Mixen này có

đầu kị nước hướng vào trung tâm của Mixen và đầu ưa nước hướng ra ngoài dung

dịch và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Cấu trúc tiêu biểu của

Mixen được mô tả trong hình 2.6. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh.

Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở

ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố ki

xácđịnh, trong những điều kiện nhất định đãđược chọn để chạy điện di và mỗi chất

tan xisẽ có một hằng số phân bố kinhất định trong điều kiện đó. Nếu các ki của các

chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt.

Phương pháp MECC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có

điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là

cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF tùy thuộc vào điện tích của chất hoạt

động bề mặt và cấu trúc của Mixen. Các chất hoạt động bề mặt Anionic, ví dụ như

SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng

EOF. Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di

19

chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen

là theo hướng của dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương

tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng

rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để

tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình

điện di.

Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào

trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có

hằng số phân bố ki nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu

cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau giữa các chất tan, và tạo ra sự

tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao

quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với

Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi

các Mixen mang nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng

EOF.

Đối với các chất tan không tương tác với các Mixen, chúng được dòng EOF

mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất

Hình 2.4 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MECC

20

mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong Mixen, nên làm tăng thời gian

lưu giữ của chất tan.

Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MECC về cơ bản vẫn là kiểu

tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp

phụ, nhưng lại được điều khiển bởi lực điện trường E của điện thế cao V giữa hai

đầu mao quản tạo, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC.

Trong kỹ thuật phân tích MECC, các tính toán về hệ số dung tích ki’, số đĩa N của

cột mao quản, độ phân giải R,... cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của

hệ sắc kí cột LC, và có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn

cho hệ pha MECC.

Hệ số lƣu giữ:

Tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha

tĩnh giả) và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di) cũng

được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công

thức sau.

ki′ =

ti − t0

𝑡0 1 −ti

tmc

= ki ∗ Vmc

Vmp

(5)

Trong đó:

ti - thời gian lưu của chất tan

t0 - thời gian không lưu giữ của chất

tmc - thời gian lưu của Mixen

ki - hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha

Vmc - thể tích của pha Mixen

Vmp - thể tích của pha động.

Và tỷ số q = Vmc

Vmp cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MECC.

Từ biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan tRnhư

sau:

Nếu (tmc << t0*k’) thì chúng ta có:

21

ti = tmc 1 + ki

′

ki′

(6)

Nghĩa là thời gian lưu tRcó quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki’. Khi hệ số ki’

lớn, thì thời gian lưu ti cũng lớn. Mặt khác, trong MECC, tỷ số pha q phụ thuộc vào

nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn

bởi công thức sau đây.

q = V ∗ Csp − Cmc

1 − Vmc ∗ Csp − Cmc (7)

Trong đó:

V - điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di

Csp - nồng độ của Mixen (mol/l)

Cmc - nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l)

Vmc - Tốc độ trung bình của Mixen

ki - hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen

Khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki’, và tốc độ của dòng EOF,

được tính như sau:

ki′ = Ki ∗ Vmc Csp − Cmc (8)

VEOF = µe + µmc ∗ E (9)

Cùng với các tham số tR, ki’, Rijđã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động ki của chất

tan trong hệ MECC cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình

xảy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau:

lnki = ∆H0

RT +

∆S0

R (10)

Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí,

và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số

phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động.

Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bốkiđều giảm dần ở

tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số ki này cũng thay đổi rất khác nhau,

22

đócũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di. Đồng thời với các chất

hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ số ki khác nhau.

Để có được hệ số dung tích ki’ tốt, trong MECC, có thể đạt được bằng cách

thay đổi pH, thay đổi nồng độ của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ

vào pha động (dung dịch đệm điện di). Nói chung, hệ số dung tích ki’ của chất tan

tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng

nhất định. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất

hiện ở đây là gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt

Jun xuất hiện, rõ rệt nhất là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic. Công

suất điện trong vùng từ 5 - 7W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình

cũng làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC), lúc này hiệu suất sắc

ký bị giảm. Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100m),

việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao sẽ càng làm nóng mao quản. Vì thế cần

tránh dùng thế quá cao và cần phải điều nhiệt cho mao quản.

Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MECC có thể tương tác với thành ống

mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự

tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất

tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen

và tốc độ của dòng EOF. Nói chung các hệ đệm điện di có pH tương đối cao,

thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di

chuyển ổn định của các Mixen.

Độ điện di và độ điện di hiệu dụng

Trong kỹ thuật MECC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định

đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện

di đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại

Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS.

Theo lý thuyết, độ điện di tổng (toàn phần) của chất tan [5, 8]

μtot (i) = μef − μeof =L ∗ L1

ti ∗ V (11)

23

Thời gian lưu của chất tan i là:

ti =L ∗ L1

μtot (i) ∗ V (12)

Trong đó:

V - điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản (kV)

L1 - chiều dài hiệu dụng (68cm)

L - chiều dài tổng cộng của mao quản (73cm).

E - điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V

(kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di

của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản.

Độ điện di hiệu dụng riêng µefcủa chất tan được tính theo công thức sau:

μef = μtot − μeof 13

Trong đó:

μtot =L ∗ L1

ti ∗ V=

73 ∗ 68

ti ∗ V (14)

μeof =L ∗ L1

t0 ∗ V=

73 ∗ 68

t0 ∗ V (15)

Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất

tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di

chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di methanol tinh

khiết. Thực tế trong mỗi thí nghiệm chúng tôi quan sát thấy t0 trùng với tín hiệu

nhiễu trên đường nền gây ra bởi dung địch đệm điện di. Vì thế trong các thí nghiệm

chúng tôi đã sử dụng thời gian xuất hiện của tín hiệu này như thời gian t0.

24

Bảng 2.1 Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MECC

Loại chất Ví dụ CMC (mM) Số phần tử kết tụ

(mixen)

Anionic SDS 14 62

Cationic DTAB 14 50

Non-ionic Octylglucoside - -

Non-ionic

n-Dodecyl-β-D-

maltoside 0.16 -

Triton-X 0.24 140

Ionic kép CHAPS 8 10

CHAPSO 8 11

Bile Salts Axit Chlolic 14 2 - 4

2.2.4 Mao quản và xử lý mao quản trƣớc khi tách

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột mao quản silic nung chảy không

phủđể tách các cấu tử chất kháng sinh β-lactam.

Cột mao quản silic trần có các nhóm chức silanol đóng vai trò như axit yếu, có

pH = 6,8 ± 0,5, vì vậy nó có khả năng trao đổi ion. Do khả năng trao đổi thấp, k’

nhỏ, tương tác của chất tan và thành mao quản yếu nên tương tác này không ảnh

hưởng nhiều đến phép phân tích điện di, đặc biệt là khi dung dịch đệm có nồng độ

ion trung bình. Tuy nhiên, khi chất phân tích là các chất hữu cơ có nhiều nhóm chức

có khả năng trao đổi đáng kể (thí dụ các protein), thì tương tác giữa chúng với thành

mao quản trở nên đáng kể, thậm chí thuận nghịch.

Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn

100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy

mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 - 30kV. Hơn nữa kích

thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như

mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu

25

nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường

kính trong của mao quản thường là 25 - 150µm. Tốt nhất nên dùng mao quản

cóđường kính trong từ 25 - 75µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75µm thường cho

hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp

với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên

cứu này có đường kính trong là 50µm.

Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu

mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao

quản thông thường đảm bảo từ 200 - 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài

mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến

detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách.

Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 73cm,

chiều dài hiệu lực là 68cm, high sense cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell

thông thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 68cm tính

từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài

2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di.

Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước

deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại

cột, rửa với NaOH 0,1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút.

2.2.4.1 Số đĩa lý thuyết của cột mao quản

Chúng ta biết rằng tốc độ của hạt có điện tích tỷ lệ với độ linh động điện di và

điện trường ngoài, E.

u = μ ∗ E (16)

Như vậy, để di chuyển hết chiều dài (hiệu dụng) mao quản L1, từ đầu mao

quản tới detector, hạt tích điện phải mất thời gian t như sau:

ti =L1

μi + μeof ∗ E (17)

26

Sự khuếch tán (σ) của các chất trong mao quản là hiện tượng cố định (theo

chiều dọc) quyết định số đĩa lý thuyết N

σ2 = 2D ∗ ti = 2D ∗L1

μi + μeof ∗ E (18)

Số đĩa lý thuyết được đĩnh nghĩa:

N =L1

2

σ2 (19)

hay

𝐍 = 𝛍𝐢 + 𝛍𝐞𝐨𝐟

𝟐𝐃𝐋∗ 𝐕 ∗ 𝐋𝟏 (𝟐𝟎)

Trong đó: L là chiều dài của toàn bộ mao quản, L1 là chiều dài hiệu quả của mao

quản từ đầu đến detector; E =V

Llà điện trường trong mao quản, trong đó V là điện áp

cấp cho mao quản; µi là độ linh động của cấu tử i trong dung dịch vô cùng loãng.

2.2.5 Chọn phƣơng pháp bơm mẫu

Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa mẫu vào mao quản bằng ba

phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy

động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương

pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương

pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai

điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm.

Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói

trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu

mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản

nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích

khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do

vậy nồng độ chấtphân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu

thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này

không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn

và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm

27

mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ

dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể

biết trước được như những mẫu nước tiểu.

Trong phươngpháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học

bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc

của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản

được đặt cao thấp khác nhau một khoảng H, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và

đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời

gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp

này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp

dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng.

Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào

lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất

định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản.

Áp suất hay được dùng từ 50 - 300mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và

giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng

tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50mbar và

cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm.

2.2.6Thiết bị của phƣơng pháp điện di mao quản

Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy

phải có các bộ phận chính như sau:

1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt),

2. Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),

3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15- 40kV), tạo lực điện trường E, để điều

khiển quá trình điện di (sắc ký) của các chất,

4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách),

5. Bô phân phat hiên cac chât sau khi tach (detector),

6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản (thường làm mát bằng không khí),

7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu.

28

2.2.7 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phƣơng pháp điện di mao quản

Sắc kýđiện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từđơn giản đến hoàn chỉnh và

phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy

ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu

(mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và

sử dụng chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là:

1. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE)

2. Điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF)

3. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP)

4. Điện di mao quản Gel (Capillary Gel Electrophoresis - GCE)

5. Sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (Micellar

electrophoresis capillary chromatography - MECC).

2.2.8 Phân tích định lƣợng trong phƣơng pháp điện di mao quản

Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời

gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều

cao H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ

Cxcủa chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có

biểu thức xác định mối quan hệ đó là:

Hi = ki ∗ Ci (21)

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

29

và Si = k2 ∗ Ci (22)

Trong đó: Hi, Si - chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i.

Ci - nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi.

k1, k2 - hằng số điều kiện thực nghiệm.

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương

trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương

pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất

phân tích trong mẫu.

2.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng cho các đối tƣợng mẫu sinh học

2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extraction-SPE)[8]

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm

sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột pha rắn, sau đó chất

phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích hợp. Cơ chế của quá

trình lưu giữ gồm pha đảo, pha thường và trao đổi ion. Ưu điểm của phương pháp

SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa,

lượng dung môi sử dụng ít và có thể kết hợp tốt với phương pháp điện di mao quản

(CE). SPE ra đời từ những năm 1970 và dần dần thay thế phương pháp chiết lỏng-

lỏng.

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước chính như sau:

B1.Hoạt hóa cột B2. Nạp mẫu B3. Rửa giải B4. Rửa chiết

30

Hình 2.6 Sơ đồ các bước trong quá trình chiết pha rắn

Bước 1: Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn. Cho dung môi chảy qua chất hấp phụ

để làm ướt vật liệu nhồi và solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời

đẩy không khí ra khỏi cột. Dung môi điển hình cho quá trình hoạt hóa là methanol,

sau đó được thay bằng nước hoặc dung dịch đệm. Nước và dung dịch đệm được sử

dụng để hoạt hóa cột với mục đích làm cho cơ chế hấp phụ hoạt động có hiệu quả

đối với các mẫu là dung dịch nước.

Bước 2: Nạp mẫu vào cột chiết, cho một thể tích mẫu nhất định vào cột. Tùy

theo kích thước cũng như loại mẫu, có thể áp dụng phương pháp chảy bình thường

hay sử dụng áp suất. Trong quá trình nạp mẫu, chất phân tích có thể cùng với một

vài chất khác được giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt.

Cơ chế lưu giữ chất ở đây là theo lực Van de walls, liên kết hydrô, tương tác lưỡng

cực-lưỡng cực, trao đổi cation, trao đổi anion.

Bước 3: Loại bỏ tạp chất gây ảnh hưởng đồng thời giữ lại chất phân tích. Nếu

nền mẫu là dung dịch nước, cần phải sử dụng dung dịch đệm hoặc hổn hợp nước-

dung môi hữu cơ. Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa giải có thể

sử dụng chính dung môi hữu cơ đó.

Bước 4: Là bước giải hấp chất phân tích khỏi cột bằng dung môi thích hợp,

dung môi được chọn phải đặc trưng để phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất

.Rửa giải các tạp chất

Chất phân tích

31

hấp phụ với mục đích rửa giải được chất phân tích. Dung môi sử dụng rửa giải càng

ít chất (các chất này cũng bị hấp phụ trên cột) càng tốt. Về nguyên tắc không nên sử

dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những

chất không mong muốn trong quá trình giải hấp. Ngược lại nếu khả năng chiết tách

của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử dụng một lượng dung môi lớn mới có thể giải

hấp hết các chất phân tích trên cột.

Chọn cơ chế chiết SPE theo mẫu phân tích [12]

Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu trong dung môi nước:

Với các mẫu nước, việc quyết định sử dụng hợp chất hấp phụ nào là dựa vào

đặc tính phân cực và đặc tính ion của chất phân tích quan tâm. Nếu chất phân tích là

ion và phân cực thì nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion. Trong trường hợp

chất phân tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ

theo nguyên tắc pha đảo (ví dụ C18). Còn nếu chất phân tích không phân cực, thì

việc chọn pha đảo với chất hấp phụ C8 hoặc C18 là phương án tối ưu.

- Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu không phải mẫu nước:

Hình 2.7 Cơ chế SPE phân tích các mẫu nước

32

Với các mẫu này, việc quyết định sử dụng chất hấp phụ nào hơi ngược lại cho

với trường hợp trên. Nếu chất phân tích là phân cực và là ion thì hiệu suất thu hồi

tốt nhất là sử dụng chất hấp phụ trao đổi ion (tương tự trường hợp trên). Nếu chất

phân tích mang tính phân cực nhưng không phải là ion thì chất hấp phụ sử dụng trên

cơ sở pha đảo hoặc pha thường. Sự lựa chọn này tùy thuộc vào dung môi hữu cơ

phân cực hay không phân cực tương ứng và cuối cùng, nếu chất phân tích không

phân cực thì chất hấp phụ lựa chọn theo nguyên tắc pha đảo.

2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) sử dụng chochấtphân tích trong các đối

tƣợng mẫu sinh học[34]

Chiết pha rắn (SPE) với pha tĩnh kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương

tác ưa nước (hydrophilic-lypophilic water-wettable revered phase)đã được áp dụng

rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu

nói riêng.

Hình 2.8 Cơ chế SPE phân tích các mẫu không phải mẫu nước

33

Hình 2.9Cấu trúc của pha tĩnh cột SPE dùng cho các mẫu sinh học

Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ

chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước. Pha tĩnh này được trùng hợp từ hai

monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ưa nước và divinylbenzen

có tính kỵ nước. Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lổ rổng là

1,3 cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao(810 m

2/g).

Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân

cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực cao hơn

3 lần so với cột C18 truyền thốngđồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH

rộng.

Hình 2.10 So sánh yếu tố lưu giữ (K’) giữa cột C18 và cột Oasis

® HLB

34

Pha tĩnh Oasis có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực, các hợp chất

acid, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm giàu các đối tượng thuốc

trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh β-lactam, các sulfonamids, các

quinolones...

2.4 Thực nghiệm

2.4.1 Máy móc và dụng cụ

- Máy điện di model 1602A của hãng HP3D

(Agilent) với detector DAD, kết

nối với phần mềm HP chemstation

- Mao quản silica trần-Capillary kit-high sens.cell, đường kính 75µm, chiều

dài 78cm, chiều dài hiệu dụng 72cm của hãng HP (Đức)

- Máy trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu

- Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức

- Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc

0,45μm; 0,2μm của hãng Millipore (USA)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích

Hình 2.11 Sơ đồ tổng quát chiết SPE với cột Oasis® HLB với các mẫu sinh học

35

2.4.2 Hóa chất

- Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H2O, AMO.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O,

OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế (48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp

- Sodiumdodecylsulfat (SDS), axít Boric H3BO3, muối amonium format

(HCOONH4), muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, natridihydrophosphat dihydrat

(NaH2PO4.2H2O), natrihydrophosphat (Na2HPO4)… của hãng Merk (Đức).

- Nước deion được lọc qua giấy lọc 0,45µm của hãng Millipore (USA)

- Đệm Borat được pha từ axit boric H3BO3, muối natri tetraborat

Na2B4O7.10H2O với nước deion. Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc

kích thước lỗ 0,2μm và định mức tới thể tích mong muốn. Điều chỉnh pH bằng dung

dịch NaOH và H3BO3, giá trị pH thay đổi cho phép ± 0,05. Dung dịch được bảo

quản ở nhiệt độ thường

- Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem

siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000mg/l. Dung dịch 1000mg/l được pha

loãng 10 lần thành 100mg/l(1000mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100mg/l bảo quản

1 tháng). Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100mg/l và sử dụng

trong ngày. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng trực tiếp.

36

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách β-Lactam

3.1.1 Chọn bƣớc sóng phát hiện chất

Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-VIS. Do các β-Lactam

đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên

chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV - 601PC với khoảng quét phổ là 190 - 400nm

dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này.

Các chất được pha với nồng độ 10mg/l trong 15mM đệm Borat, 75mM SDS, pH=

6,8. Phổ thu được thể hiện hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10mg/l )

Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng

UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm,

xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng.

37

Kết quả quét phổ cho ta thấy: Các β-lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở

198nm. Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198nm cho giá trị mật độ quang lớn

nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector Diod Array (DAD) của hãng HP.

3.1.2 Ảnh hƣởng pH của dung dịch đệm điện di

Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện

di chứa:

- 6 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 2mg/l, 15mM đệm Borat + 75mM SDS

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s, nhiệt độ mao

quản 250C

Giá trị pH thay đổi tại pH = 6,5; 6,8; 7,0 và 7,5

pH = 6,5

pH = 6,8

pH = 7,0

38

Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactamở pH 6,5; 6,8; 7,0 và 7,5

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-lactam

pH Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút)

t0 AMO PENG OXA CLO CEP AMP

6,5 7,58 9,5 12,34 13,41 14,68 16,16 17,28

6,8 7,47 9,45 12,27 13,02 14,39 15,98 16,82

7,0 7,27 9,41 12,15 12,71 14,24 14,63 15,28

7,5 9,71 12,62 16,43 17,04 17,04 17,85 18,40

Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH dung dịch đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

pH = 7,5

39

Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic

không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 6,5 đến 7,5 (>4), bề mặt mao quản

tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly

proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic) thì dòng EOF thường

hướng theo phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất

hoạt động bề mặt SDS - dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di

chuyển về phía anốt (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF.

Do từng tính chất riêng của các β-lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với

hệ số phân bố khác nhau. Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng

tốc độ Mixen, khi không bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di

thẩm thấu. Kết quả là trong dòng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và

các ion mang điện tích âm. Mixen và dòng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số

phân bố vào Mixen của các kháng sinh β-lactam khác nhau dẫn tới chúngdi chuyển

tới cực âm với tốc độ khác nhau, từ đó tách ra khỏi nhau.

Khi điện di ở pH 6,5 đến 7,5 làm cho dòng EOF và độ điện di µefcủa chất tan

bị thay đổi theo. Trong dung dịch với giá trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI(độ

ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm

chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại. Kết quả sẽ làm cho

dòng EOF và độ điện di µefcủa chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao hơn

giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di

chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dòng EOF. Như vậy cùng với tác

dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di

cũng làm thay đổi cả tốc độ của dòng EOF.

Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao

quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro,

tách ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đối lớp điện kép

và thế zeta. Qua đó mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất.

40

Từ hình 3.3, ở pH =6,5 đến pH = 7,0 độ điện di của AMO, PENG và CLO hầu

như không bị ảnh hưởng. Đối với CEPvà AMP độ điện di ít thay đổi từ pH 6,5 đến

6,8, sau đó thay đổi nhiều đến pH 7,5.

Ở pH = 7,0độ điện li của OXA tăng trong khi độ điện di của PENG ít thay đổi

dẫn đến pic của PENG và OXA dínhchân nhau, CLO và CEP dính chân nhau.

Ở pH = 7,5 độ điện li của AMO và PENG giảm đáng kể, tuy nhiên độ điện di

của các chất còn lài tăng đột biến vì vậy dẫn đến các pic OXA và CLO chập vào

nhau; CEP và AMP dính chân vào nhau.

Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn

hơn và pic nhọn hơn. Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở OXA và PENG; CEP và

AMP. Từ nghiên cứu, chúng tôi chọn pH =6,8 là tốt nhất để tách các β-lactam trong

những nghiên cứu tiếp theo.

3.1.3 Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò

rất quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế người ta chọn chất

đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải

thể hiện qua việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao

quản. Qua đó sẽlàm ổn định độ điện di hiệu dụng µefcủa chất phân tích.

Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường có hiệu lực tốt hơn

các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có

khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ

cao mà không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản.

Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 15mM đệm Photphat

- 6 chất kháng sinh β-lactam cùng nồng độ 2mg/l, 75mM SDS, pH =6,8

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 10s, nhiệt độ

mao quản 250C

Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa

xuất hiện pic trước thời gian 15 phút. Vì vậy chũng tôi quyết định chọn đệm Borat

cho các khảo sát tiếp theo.

41

3.1.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động

cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta

cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di.

Như vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả

tách sắc ký. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải

Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại ba giá trị là 10mM; 15mM; và

20mM với điều kiện khảo sát như sau:

- 6 chất kháng sinh β-lactam cùng nồng độ 2mg/l, 75mM SDS, pH = 6,8

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 10s, nhiệt độ

mao quản 250C

Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-lactam tại nồng độ đệm 10mM, 15mM, 20mM

Borat 10 mM

Borat 15 mM

Borat 20 mM

42

Bảng 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút)

Nồng độ đệm

(mM)

Thời gian di chuyển của β-lactam (phút)


10 6,95 8,90 11,47 11,52 12,68 13,36 13,91

15 7,71 9,55 12,58 13,68 15,15 16,11 16,88

20 8,18 10,98 13,92 13,92 14,58 15,31 15,31

Khảo sát nồng độ đệm tại 3 giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu

dụng của đa số kháng sinh β-lactam càng giảm, gian lưu của chất tan tăng lên.

Nồng độ đệm 10mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dòng điện I, tăng

sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh

hơn vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của PENG và OXA gần như chập vào nhau.

Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng,

thường làm giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện

Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra rất

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ Borat đến độ điện di hiệu dụng của β-lac tam

43

tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển

không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách,

cụ thể nhất ở nồng độ 20mM.

Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dòng EOF và quá trình

sắc ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị

thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion

lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ

nét của pic cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 20mM

nồng độ đệm cao nên pic đã bị dãn, hiệu quả vì thế đã giảm đi nhiều, các pic PENG,

OXA và các píc CEP, AMP chập vào nhau..

Tại nồng độ đệm borate 15mM, lưc ion và tốc độ dòng EOF là tốt nhất cho

quá trình tách điện di, vì vậy chúng tôi chọn nồng độ 15mM đệm Borat là điều kiện

tối ưu.

3.1.5Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất tạo mixen SDS

Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực

chất nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm

điện di có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nó liên

quan đến sự hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm

điện di. Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị

thay đổi tại ba giá trị là 50mM; 75mM và 100mM. Các điều kiện khảo sát:

- 6 chất kháng sinh β-lactam cùng nồng độ2mg/l, 15mM đệm Borat, pH = 6,8

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s, nhiệt độ mao

quản 250C

SDS 50mM

44

Hình 3.6 Sắc đồ điện di của β-lactam tại nồng độ SDS 50mM; 75mM và 100mM

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-lactam

Nồng độ SDS

(mM)

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút)


50 7,51 9,53 11,79 11,79 12,52 12,52 13,24

75 7,83 9,64 12,72 13,61 15,23 16,14 16,91

100 8,14 12,10 15,48 19,21 23,26 24,18 26,12

SDS 75mM

SDS 100mM

45

Nồng độ

SDS

(mM)


t0 AM

O PENG OXA CLO CEP AMP

50 7,51 9,53 11,79 11,79 12,52 12,52 13,24

75 7,83 9,64 12,72 13,61 15,23 16,14 16,91

100 8,14 12,10 15,48 19,21 23,26 24,18 26,12

Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên

thành mao quản qua tương tác ionic hay hiệu ứng kị nước. Các chất hoạt động bề

mặt được dùng trong MECC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng

có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa

chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen

cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng

EOF. SDS là chất hoạt động bề mặt dạng anionic làm tăng dòng EOF, sẽ di chuyển

về anot (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF.

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ SDS đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ SDS đến lưu gian lưu của β-lactam

46

Theo lý thuyết [5,8], độ phân giải R là một thông số quan trọng của kỹ thuật

MECC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như i và j trong hệ MECC cũng được

biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.

Rij = A ∗ z ∗ ti (23)

Trong đó:

Hiệu lực tách -A = N4 (24)

Độ chọn lọc-𝑧 =𝛼−1

𝛼với𝛼 =

𝑘2′

𝑘1′ (25)

Thời gian lưu tR :

𝑡𝑅𝑖 =

𝑘2′

𝑘2′ +1

1 −𝑡𝑜

𝑡𝑚𝑐

1 + kit0

tmc

(26)

Trong đó: k’i - hệ số dung tích

tRi - thời gian lưu của chất tan.

t0 - thời gian không lưu giữ của chất

Theo công thức, độ phân giải Rij có thể được nâng cao (làm tốt) khi tối ưu hóa

được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc α và hệ số dung

tích k’i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k

’i nói chung là tăng tuyến tính cùng

với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng

tăng nồng độ SDS thì thời gian lưu các β-lactam càng tăng do ảnh hưởng của nồng

độ các ion trong dung dịch càng lớn, tương tác với Mixen bền, dẫn đến tốc độ di

chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lưu tăng, cường độ dòng cũng

tăng, chiều cao pic cũng bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo dãn

và tù hơn.

Hình sắc đồ trên ta thấy, ở nồng độ SDS thấp 50mM, cường độ dòng trong

mao quản tăng cao làm tăng tốc độ điện di, các chất tan ra nhanh chưa kịp tách ra

khỏi nhau (píc PENG chập với píc OXA, píc CLO chập với píc CEP) vì vậy ở nồng

độ này độ phân giải thấp.

47

Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại

ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và

hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nóng lên. Tại nồng độ 100mM

nhận thấy tín hiệu nền xấu hơn nhiều so với ở nồng độ 75mM, thời gian điện di kéo

dài, chân pic dãn rộng.

Tại nồng độ SDS bằng 75mM, cường độ dòng phù hợp, tốc độ điện di vừa

phải từ đó các chất có thời gian tách ra khỏi nhau, hiệu quả tách là tốt nhất. Vì vậy

chúng tôi chọn nồng độ SDS 75mM để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.6 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 8s, 10s và

12s với điều kiện khảo sát như sau:

- 6 chất kháng sinh β-lactam cùng nồng độ 2mg/l, 15mM đệm Borat, 75mM SDS,

pH = 6,8

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, nhiệt độ mao quản 250C

Bơm mẫu 8s

Bơm mẫu 10s

48

Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu (phút)

Thời gian

bơm mẫu (s)



8 7,47 9,51 12,26 12,83 14,24 15,26 16,32

10 7,49 9,54 12,28 13,02 14,29 15,30 16,36

12 7,54 9,58 12,31 13,19 14,38 15,37 16,41

Bơm mẫu 12s

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ SDS đến độ điện di hiệu dụng của β-lac tam

Hình 3.8 Sắc đồ điện di tại thời gian bơm mẫu 8s, 10s và 12s

49

Khi nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải nhỏ hơn giới

hạn cho phép (2% ≤ chiều dài L). Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán

mở rộng của vùng mẫu sẽ xuất hiện mạnh (do hiện tượng khuếch tán). Vùng mẫu

càng lớn thì sự phân tán càng lớn. Lúc này độ phân giải và hiệu suất tách (Nef ) sẽ bị

khử (bị giảm mạnh) theo sự phân tán mở rộng của vùng mẫu của chất phân tích

trong mao quản.

Ta có công thức [8]:

σ2 =Winj

2

12 (27)

Trong đó:σ- độ biến động hay độ lệch chuẩn (sự phân tán) của sự tách trong CE

Winj - độ rộng củamẫu được nạp vào đầu ống mao quản

Từ công thức trên cho thấy, khi vùng mẫu Winj lớn, thì độ lệch chuẩn σ cũng

lớn theo. Nghĩa là số đĩa lý thuyết của cột tách sẽ giảm.

Hình 3.8thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi

tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên nhưng không đáng kể. Trong cùng

một điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu các chất hầu như không

thay đổi chỉ có chiều cao các pic thay đổi. Bơm mẫu càng lâu thì chiều cao pic

không thay đổi nhiều và có xu hướng giảm vì chân pic bị doãng, thể hiện rõ ràng

nhất là ở pic của AMP. Vì vậy chũng tôi chọn thời gian bơm mẫu 10s là điều kiện

tối ưu.

3.1.7 Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều

nhất định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và

dòng điện I trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V

được dùng sao cho không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng này chỉ

nên nằm trong khoảng vùng từ 10-80μA.

Khảo sát thế điện di tại ba giá trị 20kV, 22kV và 25kV với điều kiện khảo sát

như sau:

- 6 chất kháng sinh cùng nồng độ2mg/l, 15mM đệm Borat, 75mM SDS, pH = 6,8

50

- Bơm mẫu 10s áp suất 50mbar, nhiệt độ mao quản 250C

Hình 3.10 Sắc đồ điện di thế điện di 20kV, 22kV, 24kV và 25kV

Thế 20kV

Thế 22kV

Thế 25kV

Thế 24kV

51

Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thế điện đi tới thời gian lưu (phút)

Thế điện di

(kV)



20 9,48 12,05 15,84 16,68 18,18 19,59 20,87

22 7,49 9,52 12,81 13,62 15,02 16,16 16,91

24 7,04 9,15 12,06 12,67 13,81 14,52 15,12

25 6,30 7,98 10,36 10,78 11,74 12,34 12,83

Kết quả khảo sát cho thấy:

Khi tăng thế điện từ 20kV đến 25kV, thời gian di chuyển của các β-Lactam

càng giảm. Tại thế 20kV và 22kV đạt hiệu quả tách tốt, nhưng thời gian di chuyển

của β-Lactam ở 20kV khá lớn tại 18,27 phút mới xuất hiện pic của AMP.

Với thế 25kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so

với 20kV, 22kV nhưng hiệu quả tách kém, pic CLO và CEP dính chân vào nhau. Vì

khi tăng thế V, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản

Hình 3.11 Ảnh hưởng thế điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-lac tam

52

gây ra sự doãng pic, tức là làm giảm hiệu quả tách. Vì vậy chúng tôi chọn thế tại

22kV là phù hợp.

3.1.8 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ mao quản

Tiến hành khảo sát nhiệt độ của mao quản ba giá trị là 230C, 25

0C và 28

0C,

với điều kiện khảo sát như sau:

- 6 chất kháng sinh β-lactam cùng nồng độ 2mg/l, 15mM đệm Borat, 75mM SDS,

pH = 6,8

- Thế điện di 22kV, bơm mẫu 10s, áp suất 50mbar.

Hình 3.12 Sắc đồ điện di ở nhiệt độ 220C, 25

0C và 28

0C

Nhiệt độ 28oC

Nhiệt độ 23oC

Nhiệt độ 25oC

53

Bảng 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian di chuyển β-lactam

Nhiệt độ

(0C)



23 7,52 10,09 13,11 13,82 15,22 16,19 17,02

25 7,31 9,58 12,24 12,96 14,25 15,02 15,94

28 6,98 9,12 11,68 12,28 13,57 13,98 14,69

Cũng giống như khi tăng điện thế V làm ảnh hưởng tới hiệu ứng nhiệt Jun

làm nóng thành mao quản. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng. Sự tăng nhiệt độ ít ảnh

hưởng đến số đĩa hiệu dụng Nef, song có trường hợp khi tăng nhiệt độ lại làm hỏng

chất mẫu hay chất đệm nhất là làm thay đổi độ nhớt dung dịch, tạo ra gradient nhiệt

độ và nồng độ chất, qua đó làm ảnh hưởng đến sự điện di.

Song trong phương pháp điện di mao quản, sự gradient nhiệt độ luôn xảy ra,

nó chỉ khác nhau ở mức độ. Tiêu hao công suất điện từ trường sinh ra nhiệt càng

nhiều, thì càng không có lợi. Đồng thời sự phân tán nhiệt độ qua thành mao quản ra

Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

54

ngoài, lại làm cho vùng tâm của cột mao quản có nhiệt độ cao hơn vùng sát thành.

Sự khác nhau về nhiệt độ sẽ tạo ra sự khác nhau về độ nhớt dung dịch, chỗ nào có

nhiệt độ cao hơn thì sẽ có độ nhớt thấp hơn và như thế cũng dẫn đến làm tăng tính

không đồng nhất của dung dịch trong các vùng của cột mao quản.

Khi nhiệt độ thay đổi 1 độ, thì dẫn đến sự thay đổi độ nhớt từ 2- 3%, qua đó

ảnh hưởng đến giá trị độ điện di μefcủa chất tan (chất phân tích), điều này sẽ gây ra

sự mở rộng pic. Kết quả là giảm hiệu quả tách, vì khi độ nhớt giảm sẽ làm giảm số

đĩa hiệu dụng Nef của cột tách.

Hình 3.12, tại nhiệt độ 230C pic các pic tách rời nhau nhưng thời gian điện di

kéo dài, 17,3 phút. Tại nhiệt độ 280C, các của PENG và OXA dính đuôi nhau, píc

CLO và CEP cũng dính đuôi nhau. Tại nhiệt độ 250C, píc của 6 chất kháng sinh

tách nhau hoàn toàn, hình pic cân đối, như thếchúng tôi chọn nhiệt độ tại 250C là

điều kiện tối ưu.

3.1.9Tổng kết điều kiện tối ƣu

Sau khi khảo sát các điều kiện chạy điện di phân tách đồng thời 6 β-lactam,

chúng tôi tổng kết được điều kiện tối ưu để nghiên cứu tiếp theo như sau:

Bảng 3.8 Tổng kết các điều kiện tối ưu

Các yếu tố Điều kiện

Detetor DAD, loại high sense cell

Chiều dài bước sóng 198nm

Kích thước mao quản

Mao quản silica trần, tổng chiều dài L = 73cm,

chiều dài hiệu dụng L1 = 68cm, đường kính

trong mao quản 50µm

Chất tạo mixen SDS

Phương pháp bơm mẫu Thủy động học: 10s, 50mbar

Thế điện di 22kV

55

Dung dịch điện di 15mM đệm Borat + 75mM SDS, pH = 6,8

Nhiệt độ mao quản 250C

Hình 3.14 Sắc đồ điện di của β-lactam tại điều kiện tối ưu

3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn

Từ phương trình Si = k1*Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì diện tích pic

cũng tăng lên, song thực tế cho thấy tỷ lệ đó chỉ đúng trong một khoảng nồng độ

nhất định. Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích.

Chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ưu mục

3.1.12 của 6 β-lactam trong khoảng nồng độ từ 0,5 - 20mg/l, mỗi nồng độ được đo

lặp lại 3 lần. Chúng tôi thu được kết quả như sau.

Bảng 3.9 Diện tích pic của 6 β-lactam tại các nồng độ khảo sát

Nồng độ

(mg/l)

Diện tích pic (mAU) của các β-lactam nghiên cứu

AMO PENG OXA CLO CEP AMP

0,5 62,51 33,49 63,24 58,23 53,35 52,42

1 115,8 58,12 143,1 132,9 120,9 133,1

2 214,4 114,4 270,1 236,2 219,3 202,1

5 495,6 276,1 596,3 609,7 536,6 528,2

7 699,8 415,6 769,8 761,9 742,3 829,1

10 956,4 567,5 1201,0 1296,3 1143,4 1057,7

12 1238,5 726,4 1380,5 1436,9 1429,3 1305,8

56

15 1487,2 802,3 1841,2 1882,9 1665,9 1557,8

17 1652,4 921,8 2132,5 1978,5* 1892,7* 1714,9

20 2216,8 1031,1* 2576,5* * * 2092,6

Hình 3.15 Sắc đồ điện di của β-lactam tại nồng độ 20ppm

Khi tăng dần nồng độ lên, chúng tôi nhận thấy từ nồng độ 17mg/l và 20mg/l

có hiện tượng pic của PENG vàOXA; CLO và CEPdính vào nhau, chân pic bị

doãng rộng, pic không tách hết chân. Hiện tượng này được giải thích tương tự như

mục 3.1.7.

Kết quả chạy mẫu chuẩn tại các nồng độ từ 0,5mg/l đến 15mg/l, sắc đồ điện di

của 6 β-lactam nghiên cứu đẹp, các pic tách nhau hoàn toàn, hình pic cân đối. Với

kết quả thực tế trên, chúng tôi chọn khoảng nồng độ tuyến tính cho phép phân tích

điện di nghiên cứu là 0,5mg/l – 15mg/l.

Dựa vào số liệu bảng 3.8 chúng tôi sử dụng phần mềm Origin version 8.0 để

xây dựng đường chuẩn gồm 5 điểm (0,5, 2, 5, 10 và 15mg/l) kết quả thu được như

sau:

58

3.2.2Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng(LOQ) của đƣờng chuẩn

Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất

mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được.

- Giới hạn phát hiện là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân

tích. Để xác định LOD của các β-lactam chúng tôi tiến hành xác định LOD dựa vào

đường chuẩn theo công thức sau:

LOD = 3 ∗Sy

b (28)

Trong đó: Sy - độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn

b - là hệ số góc của phương trình hồi qui

- Giới hạn phát hiện cũng được tính dựa trên tỷ số tín hiệu/nhiễu (S/N)

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu

đường nền, thông thường lấy S/N=3

Hình 3.16 Đường chuẩn làm việc của 6 β-lactam nghiên cứu

59

Hình 3.17 Xác định LOD theo tín hiệu nhiễu/đường nền

- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) được định nghĩa là nồng độ

chất phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin

cậy 95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lượng là nồng độ chất phân tích

có tín hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền.

LOQ = 10 ∗Sy

b (29)

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện của phương pháp

Chất

phân tích

Phƣơng trình

y = a + bx

Hệ số

góc

(b)

Độ lệch

chuẩn

(Sy)

LOD

(mg/l)

LOQ

(mg/l)

AMO y = 11,18 + 97,23x 97,23 19,23 0,59 1,97

PENG y = 9,86 + 53,67x 53,67 14,39 0,81 2,68

OXA y = 5,07 + 121,43x 121,43 20,86 0,51 1,72

CLO y = -11,28 + 127,02x 127,02 24,15 0,57 1,92

CEP y = -6,22 + 112,02x 112,02 16,28 0,43 1,42

AMP y = 3,28 + 103,21x 103,29 25,44 0,73 2,41

60

So sánh giới hạn phát hiện LOD và LOQ với các phƣơng pháp khác

Bảng 3.11 So sánh LOD và LOQ với các phương pháp khác

So sánh với kết quả MECC của học viên cao học Trần Thị Thu Hằng (2007-

2009) thì các giá trị LOD và LOQ cao hơn, nhưng so với phương pháp HPLC và

phương pháp Điện hóa thì các giá trị LOD và LOQ nhỏ hơn.Như vậy LOD và LOQ

ở phương pháp chúng tôi sử dụng cột dài hơn (73cm) và detector high sense tỏ ra có

hiệu quả trong việc tăng LOD và LOQ

3.2.3 Độ chính xác của phép đo

Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành chọn ba

mẫu tương ứng với khu vực: điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến

tính đã được chọn ở trên. Các mẫu được chọn có nồng độ lần lượt là 0,5mg/l; 5mg/l

và 15mg/l. Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tương tự như các điều kiện khi

khảo sát khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành đo 7lần. Sai số được tính theo công

thức:

X = St − Si

Si

∗ 100 (30)

61

Trong đó: Si - diện tích pic tính từ phương trình hồi qui

St - diện tích pic đo được trên sắc đồ

Bảng 3.12 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (0,5mg/l)

STT 1 2 3 4 5 6 7 TB

AMO

Si 59,79

St 57,84 62,31 59,45 65,14 66,95 61,12 64,78 62,51

X(%) 3,37 4,04 5,71 8,21 10,69 2,17 7,71 4,51

PENG

Si 36,69

St 32,18 32,09 32,15 34,14 37,95 33,74 32,18 33,49

X% 14,01 14,33 14,12 7,46 3,32 8,74 14,01 9,55

OXA

Si 65,78

St 66,04 68,98 64,24 58,79 61.22 62,17 61,24 63,24

X(%) 0,39 4,64 2,39 11,89 7,44 5,81 7,41 3,86

CLO

Si 52,23

St 59,94 60,05 58,25 55,97 58,19 53,92 61,28 58,23

X(%) 12,86 13,02 10,33 6,68 10,24 3,13 14,76 11,47

CEP

Si 49,79

St 54,94 54,12 50,01 54,17 57,19 53,02 50,03 53,35

X(%) 9,95 8,59 1,08 8,67 13,49 6,69 10,99 7,84

AMP

Si 55,43

St 50,94 54,12 50,14 56,11 51,29 53,12 61,22 52,42

X(%) 8,81 2,42 10,55 1,21 8,07 4,34 8,21 5,43

Bảng 3.13 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (5mg/l)

STT 1 2 3 4 5 6 7 TB

AMO

Si 487.3

St 519,2 482,0 470,2 506,4 464,4 522,7 511,5 496,6

X(%) 6,1 1,1 3,6 3,7 4,9 6,8 4,7 1,9

62

PENG

Si 281,2

St 271,5 270,1 285,2 280,2 279,6 284,0 261,5 276,1

X(%) 3,6 4,1 1,4 0,1 0,6 1,0 7,5 1,8

OXA

Si 619,2

St 591,2 603,2 600,2 582,4 598,3 586,3 612,4 596,3

X% 4,7 2,6 3,2 6,3 3,5 5,6 1,1 3,7

CLO

Si 623,8

St 608,1 592,2 630,3 627,2 591,1 605,2 611,1 609,7

X(%) 2,6 5,3 1,0 0,5 5,0 3,1 2,1 2,2

CEP

Si 553,88

St 534,3 512,2 563,4 526,4 552,9 509,6 557,3 536,6

X(%) 3,7 8,1 1,7 5,2 0,2 8,7 0,6 3,1

AMP

Si 520,69

St 535,2 521,5 536,8 537,3 514,2 516,8 535,5 528,2

X(%) 2,7 0,2 3,0 3,1 1,3 0,8 2,8 1,4

Bảng 3.14 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (15mg/l)

STT 1 2 3 4 5 6 7 TB

AMO

Si 1469,6

St 1481,5 1502,5 1498,3 1441,7 1480,1 1521,6 1484,3 1487,2

X(%) 0,8 2,2 1,9 1,9 0,7 3,4 1,0 1,2

PENG

Si 814,9

St 806,3 803,3 809,4 786,6 795,6 804,2 810,5 802,3

X(%) 1,1 1,4 0,7 3,6 2,4 1,3 0,5 1,5

OXA

Si 1810,5

St 1853,3 1840,2 1833,6 1830,3 1871,0 1825,3 1834,6 1841,2

X(%) 2,3 1,6 1,2 1,1 3,2 0,8 1,3 1,7

CLO Si 1922,0

63

St 1880,4 1926,5 1893,5 1922,2 1788,3 1905,2 1864,4 1882,9

X(%) 2,2 6,0 4,4 5,8 1,2 4,9 2,9 2,1

CEP

Si 1684,0

St 1662,3 1644,8 1655,5 1682,8 1651,5 1675,8 1688,9 1665,9

X(%) 1,3 2,4 1,7 0,1 2,0 0,5 0,3 1,1

AMP

Si 1578,5

St 1560,3 1534.2 1601,5 1541,3 1551,2 1548,2 1567,6 1557,7

X(%) 1,2 2,9 1,4 2,4 1,8 1,9 0,7 1,3

Nhận xét: Từ kết quả tính toán ở trên, chúng tôi nhận thấy độ sai sốcao nhất

của đường chuẩn ở nồng độ thấp 0,5mg/llà 11,47%, ở nồng độ 5mg/l là 3,01% và

15mg/l là 1,53%. Vậy độ chính xác của phương pháp trong khoảng nồng độ khảo

sát là tốt, đều nằm trong giới hạn cho phép (<15%).

3.2.4 Độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ lặp

lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp

lại ở 3 nồng độ trên (0,5mg/l; 5mg/l và 15mg/l). Dựa vào kết quả thực nghiệm của

phần trước, tiến hành tính độ lặp lại theo công thức sau.

Độ lệch chuẩn:

S = Si − Stb

2

N − 1 (31)

Hệ số biến động:

V% =S ∗ 100

Stb

(32)

Trong đó:Si - giá trị diện tích pic của tín hiệu phân tích đo ở lần thứ i

Stb - là giá trị trung bình diện tích pic của N lần đo (N = 7)

S - là độ lệch chuẩn của phép đo

V - là hệ số biến động của phép đo

64

Giá trị độ lệch chuẩn S được tính toán trong phần mềm Origin version 8.0.

Các kết quả tính toán được biểu diễn ở bảng sau:

Bảng 3.15 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích

Nồng độ

AMO PENG

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

0,5 mg/l 3,28 62,51 5,24 2,14 33,49 6,39

5 mg/l 24,00 487,33 4,83 8,61 276,12 3,12

15 mg/l 24,85 1487,16 1,67 8,44 802,28 1,05

Nồng độ

OXA CLO

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

0,5 mg/l 3,43 63,24 5,42 2,56 58,23 4,39

5 mg/l 10,37 596,27 1,73 14,75 609,74 2,25

15 mg/l 15,88 1841,18 0,86 46,16 1882,92 2,15

Nồng độ

CEP AMP

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

Độ

lệch chuẩn

(S)

Giá trị TB

(STB)

Hệ số

biến động

(V%)

0,5 mg/l 2,61 53,35 4,89 2,12 52,42 4,05

5 mg/l 21,78 536,58 4,06 10,26 528,18 1,94

15 mg/l 16,75 1665,95 1,01 22,28 1557,75 1,43

Qua bảng 3.13 đánh giá độ lặp lại của phép đo chúng tôi nhận thấy độ lệch

chuẩn và hệ số biến động của chất phân tích tương đối nhỏ, mặc dù với nồng độ 0,5

mg/l thì hệ số biến động lớn hơn so với nồng độ 5mg/l và 15mg/l , tuy nhiên các giá

trị này vẫn nằm trong giới hạn cho phép. Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt.

65

3.3Phân tích mẫu thực

3.3.1Khảo sát điều kiện SPEmẫu nƣớc tiểu thêm chuẩn

3.3.1.1Chọn cột chiết pha rắn các β-lactam trong mẫu nƣớc tiểu

Kháng sinh β-lactam là những hợp chất vừa có tính axit, vừa có tính ba zơ, là những

hợp chất có độ phân cực tương đối mạnh và tan tốt trong môi trường nước và các

dung môi hữu cơ phân cực mạnh như methanol, acetonitril…

Sau khi khảo sát, so sánh từ thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy sự dụng cột

SPE Oasis HLBđể chiết và làm giàu các kháng sinh họ β-lactam trong mẫu nước

tiểu có hiệu quả hơn cột C18. Kết luận trên hoàn toàn phù hợp với lý thuyết [34];

pha tĩnh Oasis là sự kết hợp giữa tính tương tác không phân cực của monomer

divinylbenzen và tính tương tác phân cực N-vinylpyrolydone,đồng thời có cấu trúc

không gian lớn, tạo ra nhiều lổ xốp nên có khả năng lưu giữ tốt các cấu tử phân cực

β-lactam. Nhờ có khả năng lưu giữ β-lactam lớn mà làm tăng khả năng làm sạch và

làm giàu các β-lactam trong mẫu nước tiểu. Vì những ưu việt trên, chúng tôi chọn

cột SPE Oasis® HLB trong nghiên cứu này.

3.3.1.2 Khảo sát lực rửa giải của hệ các dung môi

Chúng tôi sử dụng 3 hệ dung dịch khác nhau để khảo sát lực rửa giải gồm:

1) Dung dịch đệm phosphat 10-1M, pH 6,5 + 5%CH3OH



Sau khi thực hiện chiết mẫu nước tiểu Spike chuẩn (5 mg/l) của AMO, PENG

và CEP, tính giá trị hiệu suất thu hồi sau khi chiết SPE theo công thức:

𝐇 =𝐒𝐬𝐩𝐢𝐤𝐞

𝐒𝐬 (𝟑𝟑)

Trong đó: Sspike - Diện tích pic(mAU)của mẫuthêm chuẩn (5mg/l) sau khi chiết

Ss - Diện tích pic(mAU) của mẫu chuẩn 5mg/l

66

Bảng 3.16Hiệu suất thu hồi ở các nồng độ CH3OH khác nhau

Hàm lƣợng

CH3OH

Hiệu suất thu

hồi

AMO (%)

Hiệu suất thu

hồi

PENG (%)

Hiệu suất thu

hồi

CEP (%)

5% 94 97 96

10% 81 84 82

15% 58 67 64

Ở hàm lượng CH3OH 5%, hiệu suất thu hồi các β-lactam khá cao nhưng khả

năng làm sạch nền mẫu thấp, vẫn còn nhiều pic bẩn xen lẫn vào pic chất phân tích

làm cho khả phát hiện phương pháp kém.

Ở hàm lượng CH3OH cao (15%), khả năng làm sạch nền mẫu rất tốt nhưng vì

lực rửa giải quá lớn nên đã kéo chất phân tích ra khỏi cột SPE làm chosuất thu hồi

các β-lactam thấp, lần lượt của AMO, PENG và CEP là 58%, 67% và 54%, thấp

hơn cho phép 70%.

Ở hàm lượng CH3OH 10%, khả năng làm sạch nền mẫu tốt; các chất bẩn được

rửa sạch gần như hoàn toàng đồng thời các chất phân tích vẫn còn lưu giữ nhiều

Hình 3.18 Ảnh hưởng nồng độ CH3OH đến hiệu quả chiết SPE

67

trên cộtnên hiệu suất thu cao, lần lượt của AMO, PENG và CEP là 81%, 84% và

82% (sắc độ điện di hình 3.23 phụ lục).

Vì vậy chúng tôi chọn hàm lượng CH3OH 10% trong hệ dụng dịchrửa giải là

đệm phosphat 10-1M pH 6,8 để tiến hành chiết pha rắn.

3.3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải

Chúng tôi chọn khảo sát các thể tích rửa giải như sau: 4ml, 8ml và 12ml

Chiết pha rắn theo quy trình ở các thể tích rửa giải như trên, chúng tôi thu

được kết quả như sau:

Bảng 3.17 Hiệu suất thu hồi ở các thể tích rửa giải khác nhau

Thể tích rửa

giải (ml)

Hiệu suất thu

hồi

AMO (%)

Hiệu suất thu

hồi

PENG (%)

Hiệu suất thu

hồi

CEP (%)

4 96 98 97

8 81 84 82

12 65 71 70

Hình 3.19 Ảnh hưởng thể tích rửa giải đến hiệu quả chiết SPE

68

Ở thể tích 4ml, hiệu quả làm sạch thấp, nền mẫu cao, vẫn còn nhiều pic tạp

nên ảnh hưởng đến khả năng phát hiện chất phân tích.

Ở thể tích 12ml,tuy các β-lactam còn lưu giữ tương đối nhiều trên cột nhưng

khả năng làm sạch nền mẫu không cải thiện nhiều và khi rửa giải ở thể tích 12ml sẽ

cần nhiều thời gian.

Ở thể tích 8ml, khả năng làm sạch nền mẫu tốt và hiệu suất thu hồi chất phân

tích cao, hiệu suất thu hồi lần lượt của AMO, PENG và CEP là 81%, 84% và 82%.

Như vậy chúng tôi chọn thể tích rửa giải là 8ml cho quá trình làm sạch và làm giàu

β-lactam trong mẫunước tiểu phân tích (sắc đồ điện di hình 3.24 phụ lục)

Tuy thể tích rửa giải sử dụng khá lớn nhưng qua thực nghiệm chúng tôi nhận

thấy tăng thể tích rửa giảiở lực rửa giải thấp (nồng độ CH3OH 10%) có hiệu quả

chiết mẫu tốt hơnsử dụng thể tích rửa giải ít ở lực rửa giải cao ((nồng độ CH3OH

15%).

3.3.1.4 Khảo sát pH rửa giải

Chúng tôi khảo sát tại các pH 4,5, 6,5, 7,0 và 8,5 và có kết quả như sau

Ở pH thấp 4,5 và pH cao (8,5), quá trình rửa giải gần như hoàn toàn các β-

lactam, vì các β-lactam là các amino axit nên ở pH môi trường thấp làm cho ion hóa

ở nhóm chức –NH2) nên giảm khả năng lưu giữ trên cột và bị rửa ra khỏi cột trong

quá trình làm sạch).

Ở pH 7,0, quá trình rửa giải trên cột tương đối tốt, các tạp chất được loại khỏi

cột và các β-lactam còn lưu trên cột nhưng với hiệu suất không cao, lần lượt của

AMO, PENG và CEP là 51%, 62% và 60%.

Ở pH 6,5, nền mẫu sau khi rửa giải sạch và hiệu suất thu hồicác β-lactam

nghiên cứu cao, lần lượt của AMO, PENG và CEP là 81%, 84% và 82%. Như vậy

chúng tôi chọn pH rửa giải là 6,5 để thực hiện chiết SPE các β-lactam bằng cột

Oasis® HLB.

Kết hợp chiết pha rắn và phương pháp điện di mao quản động học Mixen,

chug tôi sử dụng cột SPE Oasis®

HLB để chiết các kháng sinh β-lactam trong mẫu

nước tiểu người.

69

Sơ đồ phân tíchcác beta lactam trong mẫu nước tiểu Spike chuẩn sử dụng CE

kết hợp làm sạch mẫu bằng cột SPE Oasis®

HLB như sau:

Mẫu nước tiểu trắng (lấy từ người không uống kháng sinh β-lactam) bảo quản

trong tủ đông (-150C)[16]trước khi phân tích (để tránh phân hủy sinh học) trước khi

mang đi phân tích. Đầu tiên mẫu được thêm chuẩn ở nồng độ 5ppm của 3 thuốc

kháng sinh β-lactam AMO, PENG và CEP, tiếp theo được axit hóa bằng axit

sulfosalixylic (để kết tủa protein). Mẫu sau khi axit hòa được lắc trong 5 phút và

cho vào ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút. Sau đó hút 1,5ml mẫu (dịch trong) cho

vào cột SPE Oasis®

HLB (được hoạt hóa bằng methanol và nước). Quá trình rửa

(rửa các tạp chất trong nước tiểu như protein, ure, acid uric, creatinine, các muối vô

cơ…) sẽ được thực hiện bằng 8ml dung dịchđệm phosphat 10-1

M, pH 6,8 + 10%

methanol.Tiếp theo rửa với1ml nước deion rồi hút khô cột bằng hút chân không.

Hình 3.20 Sơ đồ phân tích β-lactam trong mẫu nước tiểu kết hợp cột chiết pha

rắn Oasis® HLB và MECC

70

Các beta lactam sau đó được rửa chiết bằng 2ml methanol. Dịch rửa chiết được làm

khô dưới dòng khí ni tơ trong bể điều nhiệt 500C, sau đó cặn được hòa tan bằng

1,5ml dung dịch đệm điện di, lọc qua màng lọc 0,45µm và bơm vào máy điện

di.Mỗi mẫu đo được bơm lặp lại 3 lần. Lấy kết quả diện tích pic trung bình 3 lần

bơm.

Kết quả nồng độ β-lactam trong nước tiểu thêm chuẩn được tính bằng công

thức sau:

𝐱𝟎 = 𝐲𝟎 − 𝐚

𝐛 (𝐦𝐠/𝐥) (𝟑𝟒)

Trong đó: y0 - giá trị diện tích pic (mAU) đo được từ thực nghiệm phân tích mẫu

spike chuẩn (10ppm), đo lặp lại 3 lần.

a - giá trị hệ số của phương trình hồi qui (intercept)

b - là giá trị hệ số góc của phương trình hồi qui (slope)

Kết quả phân tích mẫu thêm chuẩn

Kết quả chiết ở điều kiện đã chọn là tốt, sắc đồ điện di rất đẹp, nền mẫu sau

khi chiết thấp và phẳng, điều đó chứng tỏ khả năng làm sạch và làm giàu mẫu của

phương pháp chiết SPE lựa chọn lớn, hiệu suất thu hồi các β-lactam nghiên cứu

gồm AMO, PENG và CEP lần lượt là 81%, 84% và 82%. Các hiệu suất thu hồi như

vậy là khá cao, điều lớn hơn giới hạn cho phép 70%. Vì vậy chúng tôi chọn hệ chiết

này để phân tích mẫu thực.

3.3.2Phân tích mẫu nƣớc tiểu lấy từ ngƣời tình nguyện

Mẫu nước tiểu được lấy từ 2 người tình nguyện khỏe mạnh, cách 2 tuần trước

khi uống thuốc không dùng bất kỳ loại thuốc nào khác[21]. Mỗi người tình nguyện

uống 3 viên/ngày vào các buổi sáng, trưa và tối. Ở ngày thứ hai, sau khi uống 5giờ

thì lấy nước tiểu (đối với người uống Amoxicllin) và 6 giờ (đối với người uống

Cephalexin). Sau đó mẫu nước tiểu được bảo quản và xử lý như mẫu thêm chuẩn.

Công thức tính hàm lượng thuốc trong mẫu nước tiểu như sau:

xt = x0

H∗ 100 (35)

71

Trong đó: H - hiệu suất thu hồi (%) của β-lactam nghiên cứu chiết qua cột SPE

Oasis® HLB

x0- giá trị nồng độ tính từ phương trình đường chuẩn theo diện tích pic (mAU)

đo được từ phép phân tích CE

Kết quả phân tích mẫu nước tiểu như sau:

Theo [9], tính nồng độ x0 khi có giá trị thực nghiệm y0 theo công thức và sử dụng

qui luật lan truyền sai số để tính giá trị ∆x0(phụ lục)

Với mẫu nước tiểu của người uống AMO:(y0 = 458,3 mAU)

- Nồng độ Amox phân tích trên CE (x0): 4,6mg/l± 0,5mg/l

- Nồng độ thực (xt): 5,7mg/l ± 0,6 mg/l

- Nồng độ Amox trong nước tiểu ban đầu:28,5 mg/l ± 3,1 mg/l (pha loãng cặn

sau khi thổi khô 5 lần so với thể tích mẫu đưa vào cột SPE)

Với mẫu nước tiểu của người uống CEP:(y0=934,7 mAU)

- Nồng độ Cep phân tích trên CE (x0): 8,4 mg/l ± 0,9mg/l

- Nồng độ thực (xt): 10,2 mg/l ± 1,1 mg/l

- Nồng độ Ceptrong nước tiểu ban đầu: 102 mg/l ± 11,4 mg/l (pha loãng cặn

sau khi thổi khô 10 lần so với thể tích mẫu đưa vào cột SPE)

Nhận xét:

Phân tích AMO sau 5h uống có nồng độ 28,5mg/l. Kết quả phù hợp với thông

số dược động học của thuốc:Liều 250mg, khoảng 60% thải trừ nguyên dạng theo

đường tiểu sau 6-8h [2].

Phân tích CEP sau 6h uống có nồng độ 102mg/l. Kết quả trên phù hợp với

thông số dược động học của thuốc:Liều 500mg, 80% liều dùng thải trừ ra đường

tiểu ở dạng không đổi trong 6 giờ đầu lọc qua cầu thận và bài tiết ở ống thận[2].

3.4 Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu

mixen (MECC)

Phương pháp MECC là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và

hiệu quả tách cao. Phương pháp có thể xác định được trên nhiều đối tượng khác

72

nhau bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính. Phương pháp có một số đặc

điểm cơ bản sau:

- Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn

nhiều so với kỹ thuật phân tích HPLC. Trong thí nghiệm của chúng tôi, phân tích 6

chất chỉ trong vòng 16 phút.

- Dung dịch pha động cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước

deion và sử dụng rất ít.

- Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ sản xuất hơn

nhiều so với cột HPLC.

Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm sau:

- Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn

so với phương pháp khác. Giới hạn của nó cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD.

Trong khi đó các phương pháp khác như: HPLC có giới hạn nhỏ hơn.

- Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc.

- Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng là

nhược điểm của nó. Khi lượng mẫu nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng

lớn do hệ số pha loãng cao. Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian bơm

mẫu thì gây ra hiện tượng doãng pic, hiệu suất tách không cao.

- Thời gian lưu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm,

dung dịch điện ly vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ.

3.5 Hƣớng phát triển của đề tài

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

được hàm lượng của β-lactam bằng phương pháp MECC trong mẫu nước tiểu bằng

kết hợp. Phương pháp còn có thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền

mẫu khác nhau ví dụ như:mẫu máu, mẫu cá, mẫu sữa… hay các mẫu môi trường

như: nước thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuôi gia súc...Vì vậy rất cần có những

nghiên cứu tiếp theo để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn hơn.

73

CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN

Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích kết hợp ứng

dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC)với

phương pháp SPE Oasis® HLB để tách và xác định các kháng sinh AMO, PENG,

OXA, CLO, CEP, AMP trong mẫu dược phẩm và mẫu nước tiểu, chúng tôi thu

được kết quả như sau:

1. Khảo sát và chọn đƣợc thông số tối ƣu cho quá trình chạy điện di và

chiết pha rắn

Điều kiện chạy CE

- Detector DAD – 198nm, loại high sense

- Chất tạo mixen: SDS

- Dung dịchđiện ly: 15mM đệm Borat + 75mM SDS, pH = 6,8

- Thế điện di 22kV

- Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 73cm, chiều dài hiệu dụng

68cm, đường kính trong 50µm

- Nhiệt độ mao quản 250C

Điều kiện tối ưu chiết pha rắn mẫu nước tiểu như sau:

- Cột Oasis®HLB, đường kính hạt nhồi 60µm

- Hệ dung môi rửa giải: Dung dịch đệm phosphat 10-1

M + 10% methanol

- Thể tích rửa giải: 8 ml (tốc độ 1 - 2 giọt/phút)

- pH rửa giải: 6,5

2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích

- Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0,5 - 15 mg/l, hệ số

tương quan các đường chuẩn R> 0,99 cho thấy phương pháp MECC nghiên cứu có

độ tuyến tính rất cao.

- Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh thấp, từ 0,43 - 0,81 mg/l

- Giới hạn định lượng LOQ cũng rất thấp, chỉ từ 1,42 - 2,68 mg/l

- Độ chính xác ở các nồng độ 0,5mg/l; 5mg/l và 15mg/l nằm trong khoảng 1,1

- 11,47 % đều nằm trong giới hạn cho phép 15%

74

- Hệ số biến động ở các nồng độ 0,5mg/l; 5mg/l; 15mg/l thấp, khoảng 1,05 -

6,39%.

- Chiết pha rắn các β-lactam trong nước tiểu có hiệu suất thu hồi đạt 81 - 84%

và thu được đường nền mẫu rất sạch

- Trong phương pháp CE nói chúng và phương pháp MECC nói riêng, mẫu

chạy cần phải được làm sạch nên sự kết hợp SPE và MECC trong nghiên cứu chúng

tôi là cần thiết và cho kết quả phân tích tốt và đáng tin cậy.

3. Phân tích hàm lƣợng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nƣớc tiểu

-Chiết SPE mẫu nước tiểu: Hiệu suất thu hồi các mẫu spike chuẩn AMO,

PENG và CEPchiết bằng cột chiết SPE Oasis HLB từ 81 -84%. Như vậy cột chiết

pha rắn Oasis®

HLB sử dụng rất hiệu quả để chiết và làm giàu các kháng sinh β-

lactam trong mẫu nước tiểu vì thế có thể mở rộng cho cácnền mẫu sinh học khác.

- Với 2 mẫu nước tiểu của người tình nguyện: Nồng độ AMO phân tíchđược là

28,5 mg/l (lấy mẫu sau 5 giờ uống), và nồng độ CEP là 102mg/l (lấy mẫu sau 6 giờ

uống). Các nồng độ AMO và CEP phân tích được như trên phù hợp với các thông

số dược động học của chúng [2]. Đây là một kết quả rất có ý nghĩa trong nghiên cứu

dược động học của thuốc; đánh giá hàm lượng β-lactam trong nước tiểu và trong

mẫu máu để đưa ra nhưng đánh giá về việc sử dụng β-lactam có đúng cách và liều

dùng hay không.

75

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội

2. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản Y

học, Hà Nội

3. Lê Thị Huyền Dương (2000), Tách và phân tích đồng thời một số chất quan

trọng trong nhóm vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

và điện di mao quản, Luận án tiến sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội

4. Nguyễn Văn Đích (2005), “Không nên lạm dụng kháng sinh”, Báo y học và

đời sống, số 27

5. Phạm Luận (2004), “Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao”, ĐH

Quốc Gia Hà Nội

6. Nguyễn Kim Phượng và J.Chalker (1997), “Chuyên đề kháng sinh” ,

Medicine and Modern Life Magazine, Số 14, 1997

7. Ngọc Phương (2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo

laodong.com.vn, 10-10-2006.

8. Nguyễn Văn Ri (2007), “Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao

học”, trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội

9. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH

Quốc gia Hà Nội

10. Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội bộ cho

sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội

11. Ngô Quang Trung (2008), “Xây dựng qui trình phân tích đồng thời một số

kháng sinh học b_lactam và nghiên cứu sự tồn dư tại một số khu vực bệnh

viện Hà Nội”, Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐHQGHN

12. Nguyền Hùng Việt, “Sắc ký khí, cơ sở lý thuyết và ứng dụng”, trang 102-

108, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

76

13. Amber R. Solangi (2007), ”Development of new analytical methods for 4-

quniolone antibacterials and cephalosporin antibiotics”, National Centre of

Excellence in Analytical Chemistry/ University of Sindh

14. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends

of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United

States", Journal Nature medicine, 9: 424 - 430

15. Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), "Application of

capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of

cephalosporins", Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239–246

16. Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008),

"Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled

capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence

detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4),

1249-1253

17. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam

antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid

chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry",

Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57

18. Dr. Ramon Companyo’(2010) “ Optimazation of SPE Clean-up Approach

for the Analysis of Sulfonamides in Aninal Feed”, Official Jourrnal of the

European Union L268, 18.10.2003

19. Daniela P. Santos and co-wokers (2007), “Voltammetric sensor for

amoxicillin determination in human urine using polyglutamic

acid/glutaraldehyde film”, Science Direct, 133 (2), pp 398-403

20. A. Fernández-González, R. Badía and M. E. Díaz-Gar (2003), "Micelle-

mediated spectrofluorimetric determination of ampicillin based on metal

ion-catalysed hydrolysis", Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 223-231

21. F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef (2000),

"Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in

77

dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686

22. James W.Jorgenson (1992), “High performance capillary electrophoresis”,

Agilent Technoligies

23. L.Nozal, L.Arce1, A.R´ıos2, M.Valcárcel(2004), "Development of

ascreening method for analytical control of antibiotic

Residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of

AnalyticaChimicaActa, 523(2004)21–28

24. M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo

Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental

aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary

electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280

25. M.I Bailon-Perez, L.CuadrosRodr´ ıguez,C.Cruces-Blanco (2006), "

Analysis of different -lactams antibiotics in pharmaceutical preparations

Using micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752

26. Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003),“Chromatographic

determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means off luorescence,

chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass

Spectrometry,39(3), 329 – 340

27. Merk (1996), The Merck Index, 12th edition

28. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on

infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care

Medicin, 29(6):1101-1108

29.

R. Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago.

Press, 23:757-762

30. Richard P. Wenzel, M.D Michael B. Edmond, M.D., M.P.H (2000), "

Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine,

343:1961-1963

78

31. Todd Barsby (2002), “New antibiotics from a marine isolate of Bacillus

laterosporus”, Journal of Critical Care Medicin, 1802-1348

32. Tomofumi Ohmori and fellow-woker (2011), “ Simultaneous determination

of eight β-lactam antibiotics in human serum by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 1038-1042

33. C. Y. W Ang, W.H. Luo, E.B. Hansen, j.p. Freeman, H,C. Thompson

(1996), "Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid

chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC

International, 80(1),. 107-190

34. Water corporation (2003), “Cartuchos Oasis”, pp 3-7

35. Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam

antibiotics in milk using micro-flow chemiluminescence system with on-line

solid phase extraction", Analytica Chimica Acta,592(2), 187–192

36. WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for

the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk

using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst,

119(12), 2595-2601

Phụ lục

Bảng 3.18Ảnh hưởng của pH đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

pH Độ điện di hiệu dụngµef(10

-4cm

2V

-1s

-1)


6,5 3,93 3,06 2,82 2,57 2,31 2,19

6,8 4,05 3,10 2,84 2,61 2,37 2,24

7,0 4,16 3,17 2,98 2,64 2,52 2,42

7,5 3,04 2,39 2,21 2,22 2,01 1,57

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ Borat đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

Nồng độ

Borat

(mM)

Độ điện di hiệu dụngµef(10-4

cm2V

-1s

-1)


10 4,23 3,32 3,31 3,02 2,84 2,75

15 4,15 3,18 2,91 2,61 2,31 1,82

20 3,43 2,74 2,66 2,60 2,30 2,30

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ SDS đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

Nồng

độ SDS

(mM)


cm2V

-1s

-1)


50 3,97 3,22 3,20 3,16 3,14 2,78

75 3,81 2,93 2,76 2,51 2,50 2,22

10 3,21 2,52 2,06 1,72 1,57 1,47

Bảng 3.21 Ảnh hưởng của tốc độ bơm mẫu đến chiều cao pic của β-lactam

Tốc độ

bơm

mẫu (s)

Chiều cao pic (mAU)


8 28,81 27,51 26,52 24,78 23,21 22,73

10 28,78 27,50 26,49 24,75 23,18 22,70

12 28,76 27,48 26,48 24,73 23,16 22,68

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của thế điện di đến độ điện di hiệu dụng của βlactam

Thế

điện di

(kV)


cm2V

-1s

-1)


20 3,43 2,62 2,48 2,27 2,11 1,98

22 3,95 2,93 2,76 2,51 2,32 2,22

24 3,99 2,97 2,86 2,59 2,52 2,37

25 4,14 3,19 3,07 2,82 2,71 2,57

Bảng 3.23 Ảnh hưởng nhiệt độ mao quản đến độ điện di hiệu dụng của β-lactam

Nhiệt

độ (0C)


cm2V

-1s

-1)


23 3,74 2,92 2,72 2,48 2,32 2,23

25 3,95 3,14 2,91 2,64 2,54 2,38

28 4,16 3,27 3,06 2,79 2,68 2,57

Hình 3.21 Sắc đồ điện di mẫu chuẩn của 6 β-lactam ở nồng độ 0,5mg/l, 2mg/l, và

5mg/l

Nồng độ 2mg/l

Nồng độ 0,5mg/l

Nồng độ 5mg/l

Hình 3.22Sắc đồ điện di mẫu chuẩn của 6 β-lactam ở nồng độ 10mg/l và 15mg/l

Nồng độ 15mg/l

Nồng độ 10mg/l

Hình 3.23Sắc đồ điện di của mẫu spike chuẩn (5ppm) ở các lực rửa giải khác nhau

(% CH3OH trong dung dịch rửa giải)

Rửa giải 10% CH3OH



Hình 3.24Sắc đồ điện di của mẫu spike chuẩn (5ppm) ở thể tíchrửa giải khác nhau

(10% CH3OH trong dung dịch đệm phosphat 10-1

M )

Hình 3.25Diện tích picmẫu chuẩn (5ppm) của AMO, PENG, và CEP.

Rửa giải thể tích 12ml



[[[[[[

Hình 3.26Sắc đồ điện di của mẫu spike chuẩn (5ppm) rửa giải ở các pH khác nhau

(10% CH3OH trong dung dịch đệm phosphat 10-1

M )

Rửa giải ở pH 4,5


Rửa giải ở pH 7,0 Rửa giải ở pH 8,5


Hình 3.27Sắc đồ điện di của mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện uống AMO

(lấy mẫu 5 giờ sau khi uồng) và CEP(lấy mẫu 6 giờ sau khi uống)

Mẫu nước tiểu chứa AMO Mẫu nước tiểu chứa CEP

Mẫu nước tiểu chứa AMO

Bảng3.24Diện tích pic của các β-lactam sau khi qua cột chiết SPE theo hàm lượng

methanol và diện tích chuẩn 5mg/l

Hàm lƣợng

CH3OH

Diện tích pic

AMO (mAU)

Diện tích pic

PENG (mAU)

Diện tích pic

CEP (mAU)

5% 465,9 267,8 515,1

10% 401 231,9 439,6

15% 287,5 184,9 343,1

Chuẩn 5mg/l 495,6 276,1 536,5

Bảng 3.25 Diện tích pic của các β-lactam sau khi qua cột chiết SPE theo hàm thể

tích rửa giải và diện tích chuẩn 5mg/l

Thể tích rửa

giải (ml)

Diện tích pic

AMO (mAU)

Diện tích pic

PENG (mAU)

Diện tích pic

CEP (mAU)

4 475,8 270,5 520,4

8 81 231,9 439,6

12 65 196 375,2

Chuẩn 5mg/l 495,6 276,1 536,5

Theo [9]

- Kiểm tra hệ số b (intercept) của phương trình hồi qui với giá trị 0 bằng chuẩn

thống kê Fisher

𝐹𝑡 =𝑆𝑦′2

𝑆𝑦2

(36)

Nếu Ft< F(0,95, n-2, n-3) thì kết luận hệ số b xem như =0 và phương pháp

không mắc sai số hệ thống

- Độ lệch chuẩn giá trị y của phương trình hồi qui:

- Độ lệch chuẩn giá trị x0tính từ phương trình hồi qui

- Khoảng biến động của giá trị x0

∆x0 = t ∗ Sx0

Trong đó: t(0,95, n-2); n-số điểm xây dựng đường chuẩn

- Lan truyền sai số về độ lệch chuẩn của hiệu và tổng

- Lan truyền sai số về độ lệch chuẩn của nhân và chia

- Kết quả mẫu phân tích viết dưới dạng: x0 ±∆x0

(37)

(38)

(39)

(40)

(41)

Hình 3.31 Hệ thống CE Model 1602A - Agilent

Hình 3.32 Hệ thống chiết pha rắn và bơm hút chân không

Hình 3.33 Kết quả chiết pha rắn mẫu nước tiểuvới cột Oasis HLB

Hình 3.34 Thổi khô dịch chiết cuối bằng khí N2 trong bể điều nhiệt (500C)

nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản

Documents