nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy...

8/20/2019 Nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp LC v…

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-xac-dinh-du-luong-mot-so-cephalosporin-trong-nuoc 1/102

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢ NG MỘTSỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚ C THẢI

NHÀ MÁY DƯỢ C PHẨM BẰNG PHƯƠ NGPHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

HÀ NỘI 2014

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

óng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢ C HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨ U XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢ NG MỘTSỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚ C THẢI

NHÀ MÁY DƯỢ C PHẨM BẰNG PHƯƠ NGPHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢ C HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Ngườ i hướ ng dẫn khoa học:

PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2014







LỜ I CẢM Ơ N

Vớ i lòng kính tr ọng và biết ơ n sâu sắc, em xin chân thành cảm ơ n PGS. TS.

Nguyễn Thị Kiều Anh, ngườ i đã cống hiến hết mình vì sự nghiệ p giáo dục,

ngườ i đã tận tình chỉ bảo và hướ ng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn

thành luận văn.Em xin chân thành cảm ơ n ThS. Nguyễn Thị Thanh Phươ ng – Giám Đốc

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội ngườ i đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho

em hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơ n ThS. Nguyễn Thành Đạt – Phó Giám Đốc

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội đã hết lòng hướ ng dẫn em thực hiện khóa luận

này.

Cuối cùng, em xin cảm ơ n toàn thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Kiểm

Nghiệm Hà Nội, gia đình và bạn bè, những ngườ i luôn động viên, khích lệ và tạo

động lực cho em trong suốt quá trình học tậ p và thực hiện luận văn này.

Hà nội, ngày 03 tháng 09 năm 2014

Học Viên

Nguyễn Văn Thuận







LỜ I CẢM Ơ N

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1

CHƯƠ NG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 31.1. TỔ NG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN CỨ U .......................................... 3

1.1.1. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng ...................................... 3

1.1.2. Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin

nghiên cứu ............................................................................................. 4

1.2. TỔ NG QUAN VỀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U .................................... 6

1.2.1. Các phươ ng pháp chiết tách .................................................................. 6

1.2.2. Tổ

ng quan về ph

ươ ng pháp s

ăc ký l

ỏng- kh

ối ph

ổ ............................. 11

1.2.2.1. Thiết bị khối phổ ............................................................... 11

1.2.2.2. Một số k ỹ thuật ghi phổ ..................................................... 14

1.2.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng- khối phổ ........................ 15

1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U VỀ DƯ LƯỢ NG THUỐC KHÁNG SINH CÓ

TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI ................................ 15

1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U VỀ ĐỊ NH LƯỢ NG ĐỒ NG THỜI CÁC

CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI ......................................................... 17

CHƯƠ NG 2: ĐỐI TƯỢ NG VÀ CÁC PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U ......... 20

2.1. ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG TIỆ N NGHIÊN CỨ U .................................... 20

2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn ......................................................................... 20

2.1.2. Máy móc- thiết bị ................................................................................ 20

2.1.3. Đối tượ ng nghiên cứu .......................................................................... 21

2.2. PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U.................................................................. 21







2.2.1. Phươ ng pháp thu thậ p và xử lý mẫu ..................................................... 21

2.2.2.

Khảo sát điều kiện xử lý mẫu ................................................................ 212.2.3. Xây dựng phươ ng pháp xác định hàm lượ ng một số Cephalosporin bằng

k ỹ thuật LC/MS/MS ............................................................................... 22

2.2.4. Đánh giá phươ ng pháp phân tích .......................................................... 22

2.3.

PHƯƠ NG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................ 25

CHƯƠ NG 3: K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U ................................................................ 26

3.1.

XÂY DỰ NG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ....................................................... 26

3.1.1.

Khảo sát điều kiện đo phổ khối ............................................................. 263.1.2.

Khảo sát điều k iện LC............................................................................ 28

3.1.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ................................................................ 36

3.1.4. Quy trình phân tích ................................................................................ 39

3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠ NG PHÁP ......................................................................... 41

3.2.1. Độ thích hợ p của hệ thống ..................................................................... 41

3.2.2. Tính chọn lọc của phươ ng pháp ............................................................ 41

3.2.3.

Độ tuyến tính .......................................................................................... 463.2.4.

Độ đúng và chính xác của phươ ng pháp ............................................... 46

3.2.5.

Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng ........................................... 49

3.3.

Ứ NG DỤ NG QUY TRÌNH XÂY DỰ NG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊ NH DƯ LƯỢ NG

KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC .......... 51

CHƯƠ NG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................... 54

4.1. LỰ A CHỌ N QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ...................................................... 54

4.2.

LỰ A CHỌ N ĐIỀU KIỆ N PHÂN TÍCH.......................................................... 544.3. Ý NGHĨA THỰ C TIỄ N CỦA ĐỀ TÀI ........................................................... 56

4.3.1.

Tình hình kháng kháng sinh .................................................................. 56

4.3.2.

Nghiên cứu dư lượ ng kháng sinh trong môi tr ườ ng tại Việt Nam ...... 58

K ẾT LUẬN .................................................................................................................. 60

KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 61







DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

BP 2010 Dượ c điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)

IS Internal standard (chuẩn nội)

C18 Octadecyl carbon chain

DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)

LC-

MS/MS

Sắc kí lỏng khối phổ 2 lần (High perform liquid chromatography – Tandem

Mass Spectrometry)

tR Thờ i gian lưu

S píc Diện tích pic

SIS Diện tích pic của chuẩn nội

TB Trung bình

MeOH Methanol

mg Milligram

ml Mililit

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

UV - VIS Quang phổ hấ p thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible absorption

Spectrophotometry)

LOD Giớ i hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giớ i hạn định lượ ng (Limit of Quantitation)

SPE Chiết pha r ắn (solid phase extraction)

IAC Chiết ái lực miễn dịch







DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin............................................................4

Bảng 1.2.Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu...............................5

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu cần có.......................................................................... 20

Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hóa ESI ...................................................................... 26

Bảng 3.2: K ết quả lựa chọn ion mẹ ............................................................................. 27

Bảng 3.3: Năng lượ ng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS ..................... 28

Bảng 3.4. Chươ ng trình Gradient pha động ................................................................ 29

Bảng 3.5. K ết quả khảo sát cột sắc ký ......................................................................... 31

Bảng 3.6. Khảo sát qui trình chiết pha r ắn .................................................................. 37

Bảng 3.7. K ết quả khảo sát qui trình chiết pha r ắn ..................................................... 38

Bảng 3.8. Điều kiện LC và MS .................................................................................... 40

Bảng 3.9. Độ thích hợ p của hệ thống về thờ i gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so

vớ i chuẩn nội ................................................................................................................. 42

Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ của diện tích kháng sinh và chuẩn nội

theo nồng độ .................................................................................................................. 47

Bảng 3.11. Đánh giá độ chính xác và độ đúng của phươ ng pháp ............................. 48

Bảng 3.12: Giá tr ị LOD và LOQ của phươ ng pháp .................................................... 49

Bảng 3.13. K ết quả phân tích mẫu nướ c thải thứ nhất ............................................... 51

Bảng 3.13. K ết quả phân tích mẫu nướ c thải thứ hai ................................................. 52







DANH MỤ

C CÁC HÌNH

Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin...........................................................3

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ ............................................... ..............................12

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chươ ng trình pha dộng ................................................. 29

Hình 3.2. K ết quả khảo sát cột sắc ký ......................................................................... 32

Hình 3.3: K ết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu ............................................................ 34

Hình 3.4: K ết quả khảo sát tốc độ dòng pha động ...................................................... 36

Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết của 2 qui trình chiết pha r ắn.................... 38

Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu ................................................................. 45

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu LOD ..................................................................................... 50

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử thứ nhất ......................................................................... 52

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử thứ hai ........................................................................... 53







1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc sử dụng kháng sinh một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát đang tr ở thành vấn đề

thờ i sự của ngành y tế, trong đó việc gia tăng tình tr ạng kháng kháng sinh đang

là hậu quả nghiêm tr ọng. Bên cạnh nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không

hợ p lý thì một lý do khác đang đượ c quan tâm là sự tồn tại dư lượ ng kháng sinh

và những chất chuyển hoá của chúng trong môi tr ườ ng vì chỉ cần một dư lượ ng

nhỏ kháng sinh thải ra môi tr ườ ng nhưng sẽ đượ c tích lũy dần dần vào các vi

khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc. Hướ ng nghiên

cứu về dư lượ ng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động

của chúng trong môi tr ườ ng đượ c bắt đầu từ những năm cuối thậ p k ỉ 90 của thế

k ỷ 20 và r ất đượ c quan tâm tại các nướ c phát triển. Nhiều nghiên cứu đã cho

thấy r ằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi

tr ườ ng nướ c đã tr ở nên phổ biến [17], [36].

Song song vớ i việc nâng cao chất lượ ng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân

dân, l ĩ nh vực sản xuất thuốc đượ c đặc biệt chú tr ọng. Hiện cả nướ c có khoảng

gần 200 doanh nghiệ p có sản xuất dượ c phẩm vớ i nhiều sản phẩm thuốc vớ i đủ

chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và

vitamin…Kháng sinh nhóm Cephalosporin có phổ kháng khuẩn r ộng trên tr ực

khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang đượ c chỉ định r ộng rãi trong việc điều tr ị các

bệnh nhiễm khuẩn tại nướ c ta. Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệ p dượ c đang sản

xuất nhóm kháng sinh này vớ i các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên

nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh

nhóm Cephalosporin trong nướ c thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa đượ c

quan tâm đúng mức. Tớ i thờ i điểm hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên







2

cứu xác định dư lượ ng một số kháng sinh trong nướ c thải bệnh viện [2], nướ c

sông [34],nhưng đối vớ i đối tượ ng nướ c thải từ cơ sở sản xuất dượ c thì mớ i bướ cđầu nghiên cứu và có một nghiên cứu về dư lượ ng cefixim đượ c công bố [20].

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứ u

xác định dư lượ ng một số cephalosporin trong nướ c thải nhà máy dượ c

phẩm bằng phươ ng pháp LC/MS-MS” vớ i các mục tiêu như sau:

1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác

định đồng thờ i dư lượ ng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong

nướ c thải từ cơ sở sản xuất Dượ c bằng k ỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb.

2. Thẩm định phươ ng pháp phân tích dư lượ ng các kháng sinh trên và

bướ c đầu ứng dụng phươ ng pháp để đánh giá dư lượ ng kháng sinh trong nướ c

thải của nhà máy sản xuất dượ c phẩm.







3

CHƯƠ NG 1: TỔNG QUAN1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢ NG NGHIÊN CỨ U

1.1.1. Công thứ c cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

* Công thứ c chung của cephalosporin

S

N

NHR1

O

R2 H

O

OOH

H

H

R3

Hình 1.1. Công thứ c chung của cephalosporin

Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic

(A7AC), mang cấu trúc 3-cephem, 3 mớ i đủ liên hợ p điện tử vớ i vòng β –

lactam để hợ p chất có tác dụng sinh học.

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu

như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7]

* Phân loại và phổ tác d ụng

Hiện nay, cephalosporin đượ c phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác

dụng. Các cephalosporin thế hệ tr ướ c tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh

hơ n, nhưng trên Gram (-) yếu hơ n thế hệ sau và ngượ c lại [12]. Phổ chung của

các thế hệ cephalosporin đượ c giớ i thiệu tại Bảng 1.1







4

Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin [4], [12]

NhómTên đại

diệnPhổ tác dụng

Thế hệ

I

Cephalexin

Cephalothin

Cephazolin

…

- Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn

Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (tr ừ liên cầu

kháng methicillin).

Thế hệ II

CefaclorCefuroxim

Cefotetan…

- Phổ tác dụng tươ ng tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tácdụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơ n còn tác dụng

trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơ n.

Thế hệ

III

Cefixim

Cefoperazon

Cefotaxim

Cefdinir…

- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững vớ i β-

lactamase, tác dụng trên cả P. aeruginosa.

- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1.

Thế hệ

IV

Cefepim… - Phổ tác dụng tươ ng tự nhưng mạnh hơ n thế hệ 3.

Thuốc tác dụng tốt vớ i các vi khuẩn

Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas,

Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu.

- Bền vững vớ i β-lactamase.

1.1.2. Công thứ c phân tử , công thứ c cấu tạo, đặc tính của các cephalosporinnghiên cứ u







5

Bảng 1.2. Công thứ c, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứ u [3],[7],[14]

Tên chấtThế

hệ

Công thứ c phân tử ,

công thứ c cấu tạoTính chất vật lí

1. Cefuroxim II

C20H22 N4O10S

- Bột tr ắng hoặc hơ i vàng.

- Ít tan trong nướ c, tan trong

aceton, ethyl acetat và methanol,

ít tan trong ethanol.

- Độ tan trong nướ c: 0,284 g/l.

- pK a1 = 3,15; pK a2 = 1,1

2.Cephalexin I

C16H17 N3O4S

- Dạng bột k ết tinh màu tr ắng, hơ icó mùi lưu huỳnh.

- Tan ít trong nướ c; tan trong cácdung dịch kiềm loãng, thực tế không tan trong ethanol 96%,ether.

- Độ tan trong nướ c: 2,97.10-1 g/l

- pK a1= 3,45; pK a2 = 7,44

3.Cefixim IIIC16H15 N5O7S2

-Bột tr ắng hoặc gần như tr ắng. Ít

tan trong nướ c, aceton, glycerin,

tan trong methanol, propylen

glycol, hơ i tan trong ethanol, thực

tế không tan trong ether, ethyl

acetat và hexan, hầu như khôngtan trong dung dịch sorbitol 70%

-Độ tan trong nướ c: 0,104 g/l.

-Hằng số pK a1 = 3,45; pK a2 = 2,92







6

5.Terbutaline C12H19 NO3

- pK a1 = 8,86; pK a2 = 9,76

- Dạng bột k ết tinh màu tr ắng

hoặc tr ắng xám, không mùi hoặc

có mùi của acid acetic.

- Dễ tan trong nướ c, ít tan trong

methanol

- pK a1 = 8,86; pK a2 = 9,76

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

1.2.1. Các phươ ng pháp chiết tách

a. Chiế t l ỏng- l ỏng

Chiết lỏng- lỏng là phươ ng pháp chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung

môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất. Các

dạng chiết xuất bao gồm:+ Chiết các chất dạng acid, base hoặc chất lưỡ ng tính.

+ Chiết các chất dạng nội phức.

+ Chiết cặ p ion.

Chiết lỏng- lỏng là k ỹ thuật đơ n giản, dễ thực hiện và đượ c sử dụng phổ biến

nhất trong các phươ ng pháp xử lý mẫu huyết tươ ng và mẫu có nền mẫu tươ ng

đối phức tạ p. Tuy nhiên k ỹ thuật này có nhượ c điểm: dùng nhiều dung môi, khó

khăn k ết nối vớ i các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch

k ết quả.

b. Chiế t pha r ắ n

Chiết pha r ắn (solid phase extraction, SPE) là một phươ ng pháp chiết dựa vào

sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và r ắn, trong đó các chất đượ c







7

chiết từ pha lỏng vào pha r ắn. Pha r ắn thườ ng là các hạt nhỏ, xố p đượ c nhồi vào

các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tươ ng tác vớ i pha r ắn sẽ đượ c giữ lại trên ống. Các chất này đượ c r ửa giải khỏi pha r ắn bằng một dung

môi khác phù hợ p. Thông thườ ng thể tích dung môi r ửa giải nhỏ hơ n nhiều so

vớ i thể tích dịch ban đầu. Vì thế qua chiết pha r ắn, ngoài tác dụng làm sạch có

thể thực hiện thêm bướ c làm giàu mẫu. Ngoài ra, ngườ i ta có thể sử dụng luồng

khí nóng để r ửa giải các chất từ pha r ắn, đây là cách thuận tiện để chuyển các

chất vào phân tích trên sắc ký khí [6], [10], [29]. Quá trình chiết pha r ắn tr ải qua 4 giai đoạn: hoạt hóa cột, nạ p mẫu, r ửa tạ p

chất và r ửa giải [10].

- Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợ p đi qua pha r ắn để làm ướ t các

nhóm hoạt động, đồng thờ i loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung

môi.

- Nạ p mẫu: Tr ướ c khi nạ p mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ để

đưa mẫu vào môi tr ườ ng phù hợ p sao cho giai đoạn này phải lưu giữ đượ c toàn

bộ chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác đượ c giữ lại trên

cột, các tạ p chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh tranh và ảnh

hưở ng đến quá trình tươ ng tác của chất phân tích vớ i pha t ĩ nh.

- R ửa tạ p chất: Sau khi nạ p mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạ p chất khác có

liên k ết vớ i pha t ĩ nh. Phải chọn đượ c dung môi r ửa tạ p sao cho có thể hòa tan và

kéo đượ c các tạ p chất mà không kéo theo chất phân tích.

- R ửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột đượ c hòa tan và kéo ra khỏi cột

bằng một dung môi phù hợ p. Cần phải tối ưu loại dung môi r ửa giải, thể tích







8

dung môi r ửa giải, pH dung môi r ửa giải, tốc độ r ửa giải…để có thể r ửa giải

đượ c tối đa chất phân tích nhưng r ửa giải tối thiểu các tạ p chất còn trên cột.

Các loại pha r ắ n cơ bản và ứ ng d ụng trong phân tích

Chiết pha r ắn có bản chất tươ ng tự như sắc ký lỏng, vì thế các loại pha r ắn đượ c

sử dụng trong SPE hầu hết tươ ng tự pha r ắn của cột sắc ký lỏng. Tuy nhiên có sự

khác nhau nhất định về dạng hoặc tính chất của pha r ắn. Hầu hết các chất hấ p

phụ sử dụng trong SPE đều có bản chất nền Silica có gắn vớ i các nhóm hữu cơ

khác.

* N ề n silica (SiO2 ).

Silica là một polymer vô cơ có cấu trúc chung là (SiO2)x, có thể đượ c tạo

thành nhờ quá trình polymer hóa acid silicic. Bề mặt silica có chứa các nhóm

hydroxyl (-OH) và thườ ng đượ c gọi là nhóm silanol (SiOH).

Tùy theo đặc tính của pha liên k ết mà có thể chia thành một số loại cột có

bản chất khác nhau, có thể k ể ra bao gồm pha đảo, pha thuận và trao đổi ion.

- Pha đảo: Nền silica gắn thêm các nhóm không phân cực như C8, C18…

- Pha thuận: Nền silica gắn thêm các nhóm phân cực như –NH2, -CN,

diol…

- Trao đổi ion: Nền silica gắn thêm các nhóm trao đổi cation (dẫn chất

phenylsulfonic) hoặc anoin (dẫn chất amoni bậc 4).

* Florisil (Magnesi silicat)







9

Magnesi silicat (MgSiO3) là các loại hạt có đườ ng kính từ 25-200 µm kích

thướ c thông thườ ng từ 60-100 µm. Đây là loại chất hấ p phụ ít phân cực và tínhacid yếu hơ n so vớ i Silica. Vì có bản chất phân cực yếu nên Florisil thườ ng đượ c

dùng cho các HCBVTV r ất phân cực, những chất mà không thể sử dụng cột

silica do liên k ết quá mạnh vớ i các nhóm silanol.

* Graphite cacbon (than chì)

Nền than chì cũng đã đượ c một số tác giả nghiên cứu làm pha r ắn trong

SPE. Than chì là chất k ỵ nướ c bở i vì cấu trúc bao gồm các lớ p carbon phẳng

dạng lục giác. Bề mặt có dạng xố p, cũng có các nhóm hoạt động như nhóm

hyroxyl, nhóm carbonyl và các nhóm acid vì thế có thể hấ p phụ các chất khác.

Bề mặt này cũng có thể gắn các nhóm tươ ng tự như đối vớ i nền silica.

* N ề n polymer hữ u cơ t ổ ng hợ p

Các loại nền có bản chất tự nhiên đã chứng minh đượ c vai trò quan tr ọngcủa nó trong SPE, tuy nhiên những nền này dễ bị ảnh hưở ng bở i môi tr ườ ng, có

thể bị bất hoạt bở i các yếu tố bên ngoài như không khí, nướ c, môi tr ườ ng pH. Để

thay thế, ngày nay ngườ i ta sử dụng các loại nền polymer hữu cơ trên cơ sở trùng

hợ p một số chất hữu cơ . Những chất này có diện tích bề mặt lớ n, dung lượ ng hấ p

thu lớ n hơ n bở i vì tỷ lệ carbon cao hơ n và bề mặt k ỵ nướ c hơ n. Hơ n nữa khoảng

pH làm việc của nền polymer r ộng hơ n so vớ i nền silica.

- Styren-divinylbenzen (PS-DVB)

Nền PS-DVB thu đượ c khi đồng trùng hợ p styren và divinylbenzen, có

diện tích bề mặt lớ n nên dung lượ ng của cột r ất cao, hoạt động ở bất k ỳ khoảng







10

pH nào vì không có nhóm silanol. Đây là pha r ắn thích hợ p cho các chất kém

phân cực, không phân cực có khối lượ ng phân tử lớ n.

- Các nền polymer chứa nhóm hoạt động

Gần đây, nhiều tác giả đã nghiên cứa phát triển để gắn các nhóm ưa nướ c

trên nền PS-DVB nhằm tăng tính chọn lọc và khả năng ứng dụng của loại cột

này. Điển hình nhất có thể k ể đến là cột Oasis HLB.của Waters. HLB

(Hydrophilic Lipophilic Balance) có ngh ĩ a là cân bằng thân nướ c, thân dầu. Loại

cột này đượ c chế tạo bằng cách đồng trùng hợ p N-vinylpyrrolydon và

divinylbenzen, trên bề mặt có hai vùng, một vùng thân nướ c và một vùng thân

dầu.

* Mixed mode.

Cột Mixed mode (tính năng tr ộn lẫn) là cột có nhiều cơ chế lưu gữ khác

nhau, nhằm đạt hiệu quả cao hơ n trong quá trình làm sạch mẫu. Thông thườ ng,cột mixed-mode có hai cơ chế lưu giữ khác nhau.

* Ái l ự c miễ n d ịch.

Chiết bằng ái lực miễn dịch (IAC) dựa trên liên k ết kháng nguyên – kháng

thể trong đó một loại imunoglobulin đượ c dùng để gứn vớ i chất phân tích. Bở i vì

imunoglobulin liên k ết chọn lọc vớ i chất kháng nguyên dùng để sản xuất ra nó

nên đây là k ỹ thuật lý tưở ng để phân tích chọn lọc một một chất hoặc một nhóm

chất nào đó. Ứ ng dụng của IAC còn khá hạn chế do k ỹ thuật này có ứng dụng

hạn chế và khá tốn kém.







11

1.2.2 Tổng quan về phươ ng pháp sắc ký lỏng - khối phổ [1],[13]

Phươ ng pháp phổ khối lượ ng (Mass Spectrometry) là một phươ ng pháp phân

tích dụng cụ quan tr ọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phươ ng

pháp này nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượ ng phân

tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử

trong một điện tr ườ ng hoặc từ tr ườ ng nhất định.

Tr ong nghiên cứu khối phổ của bất k ỳ chất nào, tr ướ c tiên nó phải đượ c

chuyển sang tr ạng thái bay hơ i, sau đó đượ c ion hoá bằng các phươ ng pháp thích

hợ p. Các ion tạo thành đượ c đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối

phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngườ i ta chọn kiểu quét ion

dươ ng (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dươ ng thườ ng cho nhiều thông tin hơ n về

ion nghiên cứu nên đượ c dùng phổ biến hơ n.

1.2.2.1.Thiế t bị khố i phổ [13],[31]

Một khối phổ k ế bao gồm các bộ phận chính như sau:

Bộ nạ p mẫ u (Inlet):

Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối phổ. Có hai

phươ ng pháp nạ p mẫu chính, tuỳ thuộc vào tr ạng thái vật lý của chất cần phân

tích:

Nạ p mẫu dạng khí: Áp dụng đối vớ i các chất khí, chất lỏng (dễ bay hơ i) bằng

syringe

tiêm mẫu hoặc k ết nối vớ i hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS).

Nạ p mẫu tr ực tiế p: Áp dụng vớ i các r ắn, tinh thể, sơ n hoặc keo

Bộ nguồn ion hóa (Ion source): Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành

các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà







12

thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượ ng

cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơ m chânkhông của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ đượ c tăng tốc độ và thu gọn

(hội tụ). Mỗi ion có khối lượ ng m và điện tích z nhất định. Tỷ số m/z (hay còn

gọi là số khối) có ảnh hưở ng r ất lớ n đối vớ i chuyển động này của ion. Đây là

một thông số r ất quan tr ọng trong định tính cũng như định lượ ng.

− Bộ phận phân tích khố i (mass analyzer): Sau khi đượ c tạo thành thì các ion sẽ

đượ c gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện tr ườ ng và từ tr ườ ng để đi đến bộ phận phát hiện.

− Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch

đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.

− Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ

Trong đ ó:

1: Bộ nạ p mẫu (Inlet)

2: Bộ nguồn ion hóa (Ion source)

3: Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)

4: Bộ phận phát hiện (Detector)

5: Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

543

2

1







13

Trong r ất nhiều năm, các nhà nghiên cứu k ỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ

phải đối mặt vớ i r ất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết đượ c sự tươ ngthích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình

phân tích vớ i đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất

khảo sát phải ở tr ạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại

hoạt động ở áp suất cao vớ i một lượ ng dung môi tươ ng đối lớ n, nhiệt độ tươ ng

đối thấ p, các chất phân tích ở thể lỏng. Để khắc phục những khó khăn trên, cần

phải có một k ỹ thuật trung gian gọi là giao diện. R ất nhiều k ỹ thuật giao diện(interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục

… đã đượ c nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thậ p nhiên 80 nhờ

k ỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API)

mớ i tạo ra bướ c đột phá thật sự cho phươ ng pháp LC-MS/MS.

Ư u điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển

ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt vớ i các kiểu ion hóa sử dụng tr ướ c

đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh vớ i dòng liên tục (Continuous

Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS)

đều đòi hỏi áp suất thấ p. Một thuận lợ i nữa của API là sự ion hóa mềm (soft

ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợ p chất cần phân tích nhờ đó thu đượ c

khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, vớ i k ỹ thuật này, ngườ i ta có thể điều khiển

đượ c quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân

tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS:• Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI).

• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical

Ionization – APCI).

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photon

Ionization – APPI).







14

Trong đó, hai k ỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI đượ c sử dụng nhiều hơ n cả.

1.2.2.2. M ột số k ỹ thuật ghi phổ [13],[31]

Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion r ất quan tr ọng cho

việc xác định đượ c hợ p chất cần phân tích. Một hợ p chất xác định trong những

điều kiện nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ. Tuy nhiên, một

ion có số khối xác định trên phổ đồ lại có thể xuất phát từ nhiều hợ p chất khác

nhau vì vậy trong phân tích một hỗn hợ p hoặc lẫn nhiều tạ p chất nếu điều kiện

sắc kí chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số khối

trên phổ đồ có thể bị ảnh hưở ng. Đối vớ i tr ườ ng hợ p này khối phổ 1 lần (MS) có

thể cho k ết quả không chính xác so vớ i k ỹ thuật khối phổ nhiều lần (2 lần

MS/MS).

+ Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác vớ i chế độ scan, đầu dò sẽ nhận đượ c tất cả các mảnh ion để cho

khối phổ toàn ion đối vớ i tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thườ ngdùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớ n. Đối vớ i

đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thườ ng đượ c lựa chọn để khảo

sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thườ ng

đượ c sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.

+ Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc tr ưng

cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã đượ c lựa

chọn tr ướ c đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh vớ i các thư viện

có sẵn. Đối vớ i đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thườ ng đượ c lựa chọn để

khảo sát năng lượ ng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.







15

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction

Monitoring)Đối vớ i khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiế p (MS-MS), 2 k ỹ

thuật ghi phổ có độ nhạy cao thườ ng đượ c sử dụng là SRM và MRM.

− SRM: cô lậ p ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lậ p đó, trong các

mảnh ion sinh ra, cô lậ p 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò

để phát hiện.

− MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt k ỹ thuật đối vớ i phân tích vi lượ ngnên các ion con cần quan tâm thườ ng từ 2 tr ở lên, do vậy k ỹ thuật ghi phổ

MRM thông dụng hơ n SRM. Đầu tiên, cô lậ p ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ

cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lậ p đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng

va chạm) thu đượ c các ion con, cô lậ p 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan

tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

1.2.2.3.M ột số ư u đ iể m của sắ c ký l ỏng khố i phổ Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà

khối phổ thườ ng đượ c sử dụng để xác định lượ ng siêu vết trong mẫu có thành

phần phức tạ p như định tính, định lượ ng thuốc và các dạng chuyển hóa trong

dịch sinh học, độc chất học, định lượ ng dư lượ ng thuốc tr ừ sâu, chất bảo quản,

chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dượ c liệu, thủy hải sản và môi

tr ườ ng. Ngoài ra phươ ng pháp khối phổ còn có thể đượ c sử dụng để xác địnhmức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích.

1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U VỀ DƯ LƯỢ NG THUỐC KHÁNG SINH CÓ

TRONG NƯỚ C Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚ I

Hướ ng nghiên cứu về dư lượ ng kháng sinh và các loại dượ c phẩm nói chung

có trong môi tr ườ ng ngày nay r ất đượ c quan tâm ở các nướ c phát triển. Ví dụ







16

như một nghiên cứu tại New Mexico (Hoa K ỳ) đã phát hiện ra ngoài kháng sinh

còn có một số dượ c phẩm như: thuốc chống tr ầm cảm, chống dị ứng, viêm, vàhoóc môn... trong nướ c bề mặt và nướ c ngầm ở các nồng độ khác nhau. Nhóm

nghiên cứu đã sử dụng phươ ng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao k ết hợ p khối phổ

(HPLC-MS/MS) để xác định các kháng sinh nhóm Tetracyclin có trong các

nguồn nướ c tự nhiên. Cụ thể oxytetracyclin 1890 – 4600 ng/L; tetracyclin 660

ng/L [28].

Nghiên cứu của Dươ ng Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng đượ c phươ ng pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nướ c

thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng k ỹ thuật chiết pha r ắn dùng cột

silicagel tự chế tạo và định lượ ng đượ c các kháng sinh ciprofloxacin,

norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt trong nướ c thải

bệnh viện bằng HPLC vớ i detector huỳnh quang. Điều kiện sắc ký: cột C18,

nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bướ c sóng kích thích 278 nm và

bướ c sóng phát xạ 445 nm. Hiệu suất thu hồi trong nền nướ c thải đạt từ 80 đến

106% và giớ i hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [2].

Trong đề tài nghiên cứu về dư lượ ng kháng sinh Macrolides, Sulfonamides

và Trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kong, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử

dụng phươ ng pháp LC/MS/MS vớ i cột sắc ký YMC pro C18 (3 µm, 150 mm ×

2 mm), pha động là hệ: Dung dịch acid formic 1% - MeOH (1 % acid formic)

chạy gradient, vớ i tốc độ dòng là 0,15 ml/phút. Mẫu nướ c sông đượ c xử lý bằng

k ỹ thuật chiết pha r ắn vớ i cột Oasis HLB (200mg, Water). Giớ i hạn định lượ ng

của phươ ng pháp là từ 0,1 – 1,2 ng/ml [34].

Vishal et al cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dư lượ ng của các kháng

sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và







17

levofloxacin trong nướ c thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ tại các thờ i điểm

khác nhau. Dư lượ ng ciprofloxacin đượ c phát hiện là 2,20 – 236,6 µg/l vànorfloxacin là 6,4 – 29,6 µg/l. Một nghiên cứu khác cũng đã xây dựng phươ ng

pháp để xác định các nhóm thuốc kháng sinh fluoroquinolon, sulfonamid,

trimethoprim, beta-lactam (penicillin và cephalosporin), nitroimidazol và

tetracyclin trong nướ c thải bệnh viện. K ết quả cho thấy nồng độ chất phân tích

khác nhau dao động trong phạm vi sau đây (đơ n vị µg/l): ciprofloxacin 3,6-

101,0; metronidazol 0,1-90,2; sulfamethoxazol 0,4-12,8; ofloxacin 0,2-7,6;trimethoprim 0,6-7,6; và doxycyclin 0,6-6,7 [35],[36].

1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨ U VỀ ĐỊNH LƯỢ NG ĐỒNG THỜ I CÁC

CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚ I

Nghiên cứu của Xiao-Lin Hou và cộng sự (2013) đã xây dựng và đánh giá

dư lượ ng của 10 cephalosporins (cefalexin, cefquinome, ceftiofur, cefacetrile,

cefalonium, cefapirin, cefazelin, cefoperazone, cefradine, cefotaxim) vàdesacetylcefapirin trong sữa bò bằng k ĩ thuật UHPLC-ESI-MS/MS. Các mẫu

đượ c chiết pha r ắn qua cột HLB sau khi pha loãng vớ i dung dịch đệm phosphate

(pH 8,5). Mẫu đượ c phân tích bằng LC-MS/MS trên cột UPLC BEH RP18

(2,1mm × 100 mm, 1,7µm) vớ i gradient r ửa giải (acid formic 0,1% và MeOH).

Nghiên cứu đã sử dụng chuẩn nội là Ceftiofur-D3. Các giá tr ị LOD từ 0,004

µg/kg đến 0,60 µg/kg; LOQ từ 0,014 µg/kg đến 2,0 µg/kg. Phươ ng pháp đượ c

ứng dụng để phân tích 40 mẫu sữa thu thậ p trên thị tr ườ ng và 9 mẫu sữa bò sau

khi tiêm dướ i da Cephalexin [37].

Một nghiên cứu của Tr ần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phươ ng pháp

xác định dư lượ ng Cefixim có trong nướ c thải từ cơ sở sản xuất Dượ c. Đề tài sử







18

dụng k ỹ thuật HPLC, loại tạ p bằng cloroform và acid hóa bằng HCl đến pH 3.

Điều kiện sắc ký: Cột Luna C18, detector DAD: λ = 285 nm, thể tích tiêm mẫu:200 µl, nhiệt độ cột: 32ºC, pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH =

3,2 (dung dịch NaH2PO4 40 mM, điều chỉnh pH bằng H3PO4). Giớ i hạn phát hiện

của cefixim là 6,68 ng/ml [20].

Năm 1982, Fasching CE và Peterson LR đã tiến hành nghiên cứu so sánh hai

phươ ng pháp tách ba kháng sinh cephapirin, cefotaxim và cefoxitin từ protein

huyết thanh bằng cột trao đổi anion Sephadex DEAE – A-25 và k ết tủa protein

vớ i dung dịch acid tricloacetic 6% hoặc ethanol. Khi dùng Sephadex để xử lý

mẫu, protein và chất cản tr ở bị loại đi, hoạt chất đượ c cố định trên cột và đượ c

r ửa giải bằng dung dịch natri clorid 1 M. Nghiên cứu đượ c tiến hành phân tích

mẫu của 12 bệnh nhân. K ết quả cho thấy xử lý mẫu bằng chiết pha r ắn vớ i cột

trao đổi ion cho thấy phươ ng pháp định lượ ng nhanh, chính xác, cải thiện độ thu

hồi thuốc và loại đượ c hầu hết chất cản tr ở trong nền mẫu khi phân tích bằngHPLC [19].

Một nghiên cứu của Cha JM và cộng sự tại Đại học bang Colorado, Fort

Collins Mỹ (2005), phươ ng pháp đã xây dựng và đánh giá dư lượ ng của các

kháng sinh ß-Lactam gồm: Amoxixillin, ampicillin, oxacillin, cloxacillin, và

cephapirin trong nướ c bề mặt và nướ c thải nhà máy. Nghiên cứu sử dụng k ĩ thuật

chiết pha r ắn vớ i cột Oasis HLB ở pH 7,5 và phươ ng pháp LC-MS/MS vớ i cộtsắc ký Xterra MS C18 (2,1 mm × 4 mm, 2,5 µm) cùng cột bảo vệ. Pha động

gồm: Acid formic 0,1% - Methanol và acetonitrile chạy gradient, nhiệt độ cột

45°C và thể tích tiêm 40 µL). Giớ i hạn phát hiện của phươ ng pháp đượ c ướ c tính

trong khoảng từ 8 đến 10 ng/L trong nướ c bề mặt, 13 đến 18 ng/L trong nướ c hạ

lưu sông và 8 đến 15 ng/L trong nướ c từ một nhà máy xử lý nướ c thải. Phươ ng







19

pháp đã đượ c ứng dụng để đánh giá sự có mặt của các ß-Lactam trong nướ c một

dòng sông và một nhà máy xử lý nướ c thải ở phía bắc bang Colorado, Mỹ [15].

Một nghiên cứu của Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN thuộc

Phòng thí nghiệm phân tích Hóa học, khoa Hóa, Đại học Aristotle của

Thessaloniki, Hy Lạ p năm 2003 đã xây dựng phươ ng pháp xác định đồng thờ i

bốn Cephalosporin Cephalexin, cefadroxil, cefaclor, cefotaxim trong dượ c phẩm

cũng như trong huyết thanh và nướ c tiểu ngườ i bằng HPLC, sử dụng cột

Spherisorb ODS -2 250 x 4 mm, phát hiện tại bướ c sóng 265 nm, giớ i hạn phát

hiện là 0,2 ng cho cefadroxil và cephalexin; 0,1 ng cho cefotaxim và cefaclor

trong thể tích tiêm mẫu là 20 µl. Phươ ng pháp này đượ c áp dụng cho việc xác

định các cephalosporin trong dượ c phẩm và trong dịch sinh học (huyết thanh,

máu ngườ i) sau khi chiết pha r ắn và nướ c tiểu sau khi lọc và pha loãng. Độ thu

hồi của chất phân tích trong khoảng 76,3-112,0 % [32].

H.-J.Brauch và F. Sacher, (2008) đã sử dụng k ỹ thuật LC/MS/MS để định

lượ ng các kháng sinh cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefixime, ceftiofur,

ceftriaxon, cefuroxime có trong nướ c bề mặt và nướ c uống. Vớ i Hệ thông

HPLC: HP 1100 Agilent, cột Luna Phenomenex ( 250 × 2 mm, 5 µm), pha

động là hệ: Acid formic 0,1 % và ACN : MeOH (2:1) : Acid formic 0,1 % đượ c

chạy gradient. Nghiên cứu sử dụng k ỹ thuật chiết pha r ắn để xử lý mẫu vớ t cột

ENV+. Giớ i hạn định lượ ng của các kháng sinh trong nghiên cứu này là khoảng20 ng/l [21].







20

CHƯƠ NG 2: ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1. ĐỐI TƯỢ NG VÀ PHƯƠ NG TIỆN NGHIÊN CỨ U

2.1.1. Hoá chất- chất chuẩn

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu cần có

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn cần

1 Cefixim (HL 98,88), SKS 0105192

Chuẩn Quốc Gia Nguồn gốc: Viện kiểmnghiệm thuốc TrungƯơ ng

2 Cefuroxim natri (HL 95,15%) SKS 01051753 Cephalexin (HL 93,16%) SKS 0509016

4 Cefdinir (HL 94,56%), SKS 0409034

5 Cefaclor (HL 98,2%), SKS 0309042

6 Ceftriaxone (HL 95,5%), SKS 0104132

7 Cefadroxil (HL 94,3%), SKS 0104190

8 Cefepim (HL 95,7%)SKS 0111283.01

9Terbutaline sulphat (HL 99,95%), SKSWS.0109227

10 Methanol

HPLC, Merck (Đức)11 Acetonitril

12 Acid phosphoric đậm đặc

13 Triethylamin

PA,Merck (Đức)14 Acid formic

15 Na2EDTA

2.1.2. Máy móc- trang thiết bị

- Máy HPLC Shimadzu – LCMS 8030/SPD 20 (Nhật)

- Cột Zorbax 5µm, 4,6 × 150mm (Mỹ)







21

- Cột Oasis HLB 30 µm (Mỹ)

- Bộ chiết pha r ắn Restek (Mỹ)

- Thiết bị đuổi bằng khí N2: Gast-col Zipvap 12 (Mỹ)

- Tủ lạnh Hitachi – E25 (Nhật)

- Máy lắc siêu âm: ELMA -100H (Đức)

- Cân phân tích Shimadzu – Auw 220D

- Máy chuẩn độ đo điện thế Metrohm – 702 (Thụy S ĩ )

- Máy lọc chân không New Askir 20 (Ytalia)

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích

2.1.3. Đối tượ ng nghiên cứ u

- Mẫu tr ắng: Nướ c thải ở các cơ sở sản xuất dượ c có sản xuất kháng sinh nhóm

Cephalosporin không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày.

- Mẫu thử: Nướ c thải ở các cơ sở sản xuất dượ c có sản xuất kháng sinh nhóm

Cephalosporin trong ngày sản xuất các kháng sinh.

2.2. PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.2.1.

Phươ ng pháp thu thập và xử lý mẫu+ Phươ ng pháp thu thậ p mẫ u

Lấy nướ c thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không

sản xuất và trong ngày giai đoạn sản xuất kháng sinh, lọc, điều chỉnh đến pH

thích hợ p r ồi đem đi xử lý mẫu.

2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu







22

Để tìm đượ c qui trình chiết pha r ắn cho độ thu hồi cao chúng tôi tiến hành khảo

sát:

- Qui trình hoạt hóa cột

- Qui trình r ửa giải chất phân tích

2.2.3. Xây dự ng phươ ng pháp xác định hàm lượ ng cefixim, cefuroxim,

cephalexin bằng k ỹ thuật LC/MS/MS.

Xây dựng quy trình phân tích:

Điề u kiện về khố i phổ :

+ Khảo sát điều kiện MS/MS: Khảo sát, lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều

kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định lượ ng.

Điề u kiện về sắ c ký l ỏng:

+ Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thờ i gian phân tíchkhông quá dài, đáp ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội

để khảo sát là Terbutaline sulfat – là chất ít có trong các nhà máy sản xuất dượ c

phẩm.

+ Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng để có

thể tách và phát hiện các chất kháng sinh Cefixim, Cephalexin, Cefuroxim ở

nồng độ ppb, sắc đồ đẹ p, thờ i gian phân tích không quá dài.

2.2.4. Đánh giá phươ ng pháp phân tích[22]

Xử lý các mẫu nghiên cứu theo các phươ ng pháp đã xây dựng, tiến hành sắc

ký theo các điều kiện đã khảo sát sau đó đánh giá phươ ng pháp phân tích dựa

trên các chỉ tiêu:







23

Tính thích hợ p của hệ thố ng [22]

Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiế p trong cùng điều kiện một dung dịch chứachất chuẩn kháng sinh và chất chuẩn nội. Đánh giá độ phù hợ p của hệ thống

thông qua các chỉ số sau đây:

- Giá tr ị RSD của thờ i gian lưu và diện tích píc của chất chuẩn nội và kháng

sinh (nhỏ hơ n 2%).

- Giá tr ị RSD của tỉ số diện tích píc của kháng sinh/chuẩn nội (nhỏ hơ n

2%). Tính chọn l ọc [22]

Độ đặc hiệu của đượ c đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn,

mẫu tr ắng và mẫu tự tạo (mẫu tr ắng có thêm kháng sinh nghiên cứu). Tiến hành

như sau:

- Pha một dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng

độ đã biết.

- Mẫu tr ắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo qui trình đã xây dựng.

- Mẫu tự tạo là mẫu tr ắng có thêm một lượ ng chính xác các kháng sinh có

nồng độ đã biết.

- Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu tr ắng và mẫu tự tạo

theo các điều kiện đã chọn. Trên sắc kí đồ của mẫu tr ắng tại các thờ i điểm trùng

vớ i thờ i gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các píc có các mảnh khối

phổ tươ ng ứng vớ i số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và chuẩn nội. Nếu có đáp ứng phải nhỏ hơ n 1% so vớ i nồng độ giữa của khoảng tuyến tính.

Độ đ úng và độ chính xác [22]

Độ đúng của phươ ng pháp đượ c tiến hành trên mẫu tự tạo (mẫu tr ắng có

thêm một lượ ng chính xác kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết). Lựa

chọn 3 nồng độ chất chuẩn thêm vào để khảo sát là nồng độ thấ p (LQC), nồng độ







24

trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC). Tiến hành xử lý mẫu và sắc kí theo

các điều kiện đã chọn. Độ lặ p lại của phươ ng pháp đượ c đánh giá thông qua giátr ị RSD thu đượ c khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau của một nồng độ. Tính

lượ ng chuẩn thu hồi đượ c theo phươ ng trình hồi qui đã xây dựng và so sánh vớ i

lượ ng chuẩn thêm vào để đánh giá độ đúng của phươ ng pháp.

Độ tuyế n tính [22]

Từ dung dịch chuẩn gốc của các chất kháng sinh nghiên cứu tiến hành pha

một dãy ít nhất 5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảngtuyến tính cần khảo sát. Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn làm việc

đượ c giữ hằng định. Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn. Xây dựng đồ

thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích píc kháng sinh/chuẩn nội (SKS/Si) và

nồng độ kháng sinh. Thiết lậ p phươ ng trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b

và hệ số tươ ng quan r từ đó k ết luận về độ tuyến tính của phươ ng pháp.

Giớ i hạn phát hiện (LOD) [22]

Đượ c tính dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đườ ng tuyến tính.

LOD đượ c tính theo công thức:

3,3×SLOD=

a

Trong đó: S là độ lệch chuẩn của đáp ứng và a là hệ số góc của đườ ng chuẩn.

− Từ k ết quả đườ ng chuẩn xác định độ tuyến tính, tính toán đượ c giá tr ị LOD.

Giớ i hạn định l ượ ng (LOQ) [22] LOQ là một thông số quan tr ọng của phép định lượ ng các chất có nồng độ

thấ p trong mẫu. LOQ đượ c định ngh ĩ a là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích

trong mẫu thử để có thể định lượ ng đượ c vớ i độ đúng và độ chính xác thích hợ p.

LOQ đượ c tính theo giá tr ị LOD theo công thức:

LOQ = 3,3 × LOD







25

2.3. PHƯƠ NG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Số liệu đượ c xử lý trên Microsoft Office Excel 2010.Một số công thức tính các giá tr ị thống kê:

Giá tr ị trung bình = × ∑

Độ lệch chuẩn (SD) SD = ∑

Độ lệch chuẩn tươ ng đối RSD = × 100

Trong đó: xi là k ết quả ở lần xác định thứ i.n là số lần xác định.

- Nồng độ dư lượ ng kháng sinh đượ c tính dựa vào phươ ng trình hồi quy tuyến

tính bậc nhất biểu diễn mối tươ ng quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân

tích vớ i hệ số tươ ng quan không nhỏ hơ n 0,995.







26

Khảo sát đ iề u kiện nguồn ESI

Để khảo sát các điều kiện về khối phổ chúng tôi tiến hành cân chính xác khoảng

25 mg mỗi kháng sinh cefixim, cephalexin, cefuroxim và IS (Terbutaline sulfat),

hòa tan trong hệ dung môi MeOH : H2O (1:1) để đượ c nồng độ khoảng 1 mg/ml,

pha loãng bằng MeOH : H2O (1:1) thu đượ c nồng độ chính xác khoảng 100ng/ml.

Qua tham khảo một số tài liệu [23],[26],[27], và điều kiện thực nghiệm chúng tôi

quyết định chọn điều kiện nguồn ion hóa đượ c trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1. Điều kiện nguồn ion hóa ESI

Thông số Giá trị

DL temperature (nhiệt độ mao quản) 2500C

Nebulizing Gas flow (tốc độ khí phun) 25 l/min

Heat block temperature (nhiệt độ nguồn) 4000C

Drying Gas flow (tốc độ khí làm khô) 15 l/min

Interface vonltage (thế nguồn ion hóa) 5000 v

Trong k ỹ thuật ion hóa phun điện tử vớ i chế độ bắn phá ion dươ ng, các ion mẹ

có dạng (MH)+ vớ i số khối m = (M+1) theo phản ứng:

CHƯƠ NG 3. K ẾT QUẢ NGHIÊN CỨ U

3.1. XÂY DỰ NG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH3.1.1 Khảo sát điều kiện đo phổ khối







27

Mo + H+ → (MH)+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, k ết quả đượ c trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: K ết quả lự a chọn ion mẹ

Khảo sát đ iề u kiện ion hóa l ự a chọn ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê khối phổ 2 lần, do đó để phát

hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đượ c ion con là r ất quan tr ọng. Ion

con phải có tín hiệu gấ p ít nhất 10 lần so vớ i ion mẹ. Để thu đượ c mảnh ion con

có tín hiệu cao cần phải chọn đượ c mức năng lượ ng bắn phá thích hợ p. Sử dụng

chế độ bơ m tự động để bơ m từng chất phân tích vào detector khối phổ và lựa

chọn ion con đặc tr ưng có cườ ng độ tín hiệu cao nhất để định tính và địnhlượ ng. Mảnh ion con m/z có cườ ng độ lớ n nhất dùng để định lượ ng, mảnh ion

con thứ 2 có cườ ng độ thấ p hơ n dùng để xác nhận chất phân tích. Đối vớ i các

chất chuẩn nội, lựa chọn 1 ion con đặc tr ưng có cườ ng độ cao nhất. K ết quả thu

đượ c ở bảng 3.3.

Chất phân tích Khối lượ ng phân tử Ion mẹ (m/z)

IS 225,2 226,2

Cephalexin 347 348

Cefuroxim 441 442

Cefixim 453,1 454,1







28

Bảng 3.3: Năng lượ ng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS

Chất phântích

Ion mẹ (m/z)

Ion con(m/z)

Q1prebias(V)

CE(eV)

Q3prebias(V)

IS 226,2 152,1 -10 -15 -19

Cephalexin 348 158,05 -17 -10 -20

Cefuroxim 442 336 -21 -10 -30

Cefixim 454,1 126,1 -21 -10 -26

Nhân xét: Theo qui đin h của Châu Âu 2002/657/EC [18], số điểm nhân dan g

(IP) đươ c tính đối vớ i k ỹ thuât LC/MS/M, tươ ng ứng vớ i 1 ion me và 2 ion con

(Phụ lục 5), số điểm nhân dan g (IP) là 4.

Như vậy phươ ng pháp đã đáp ứng đươ c yêu cầu của Châu Âu 2002/657/EC [18],

và phù hợ p vớ i các nghiên cứu [23][26][27].

3.1.2. Khảo sát điều kiện LC

Để khảo sát điều kiện LC từ dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml pha hỗn hợ p chứa

đồng thờ i 3 kháng sinh và chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 20 ng/ml.

Khảo sát chươ ng trình pha động.

Qua tham khảo tài liệu [15][21] [23], chúng tôi tiến hành khảo sát 2 chươ ng

trình pha động và tốc độ dòng vớ i các điều kiện sắc ký khác như: cột Zorbax

C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), thể tích tiêm mẫu 50 µl (nhiệt độ cột: 250C), tốc độ

dòng 0,5 ml/phút; Chươ ng trình pha động và tốc độ dòng khảo sát như sau:







29

Bảng 3.4. Chươ ng trình Gradient pha động

Kênh A: H2O (0,1% acid Formic)

Kênh B: ACN (0,1% acid Formic)

(a) sắc ký đồ khi chạy gradient 1

Thờ i gian

(phút)

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

Kênh A Kênh B Kênh A Kênh B Kênh A Kênh B

0- 0,5 98 2 95 5 85 15

0,5-7,5 0 100 0 100 0 100

7,5-10 0 100 0 100 0 100

10-14 98 2 95 5 85 15







30

(b) sắc ký đồ khi chạy gradient 2

(c) sắc ký đồ khi chạy gradient 3

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chươ ng trình pha dộng







31

Nhận xét:

- Vớ i chươ ng trình gradient 1 thì pic IS bị doãng không cân xứng

- Vớ i chươ ng trình gradient 2 và 3 thì IS và các kháng sinh đều cho đáp ứng

tươ ng đươ ng nhau tuy nhiên chươ ng trình gradient 2 thì các pic cân xứng hơ n

(hệ số Tailing factor gần giá tr ị 1 hơ n)

Vì vậy chúng tôi quyết định chọn chươ ng trình gradient 1 cho các khảo sát tiế p

theo

Khảo sát cột sắ c ký

Tiến hành khảo sát trên 2 cột Zorbax C18 (4,6 x 150mm, 5µm) và cột Supelco

C18 (12,5 cm × 4,6 mm, 5µm) vớ i chươ ng trình gradient pha động đã chọn như

trên, k ết quả thu đượ c như sau:

Bảng 3.5. K ết quả khảo sát cột sắc ký

‘

Chất phân

tích

Cột Zorbax C18 Cột Supelco C18

Diện tíchpic

Hệ số kéođuôi

Diện tíchpic

Hệ số kéođuôi

IS 207801 1,233 325119 2,182

Cefuroxim 10500 1,327 13743 0,795

Cephalexin 57974 1,715 39432 1,087

Cefixim 17921 1.470 24372 1,315







32

(a) Sắc ký đồ cột Zorbax C18

(b) Sắc ký đồ cột Supleco

Hình 3.2. K ết quả sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký







33

Nhận xét: Khi phân tích, sử dụng cột Zorbax C18 và cột Supleco C18 đều cho

đáp ứng tốt, tuy nhiên k ết quả phân tích dùng cột Supelco có hệ số kéo đuôi của pic IS lớ n, vì vậy chúng tôi chọn cột Zorbax C18 cho các khảo sát tiế p theo.

Khảo sát thể tích tiêm mẫ u

Tiến hành khảo sát các thể tích tiêm mẫu khác nhau để có thể lựa chọn đượ c

thể tích tiêm mẫu phù hợ p (píc cân xứng, không bị doãng, nâng cao đượ c đáp

ứng diện tích pic). Tiến hành lựa chọn 3 thể tích tiêm mẫu để khảo sát là: 20 µl,

50 µl, 80 µl. Các điều kiện sắc ký khác như đã chọn ở trên. K ết quả thu đượ c

như sau:

(a) Thể tích tiêm 20 µl







34

(b) Thể tích tiêm 50 µl

(c) Thể tích tiêm 80 µl

Hình 3.3: K ết quả sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu







35

K ết quả thu đượ c cho thấy:

- Vớ i thể tích 20 µl thì chất phân tích có đáp ứng thấ p và nhiễu đườ ng nền

lớ n.

- Vớ i thể tích tiêm 50 µl và 80 µl pic của các chất phân tích đều cân xứng

không bị doãng, đáp ứng về diện tích pic tốt cũng như tỷ lệ S/N cao.

Như vậy vớ i thể tích tiêm 50 µl, 80 µl thì các pic đều có đáp ứng diện tích

tốt. Tuy nhiên thể tích tiêm quá lớ n có thể ảnh hưở ng đến hiệu lực của cột nhất là

khi phân tích trong thờ i gian dài chính vì vậy chúng tôi quyết định chọn thể tích

tiêm mẫu 50 µl để tiến hành nghiên cứu tiế p theo.

Khảo sát t ố c độ dòng

Trong k ỹ thuật LC/MS tốc độ dòng pha động để ở mức tối ưu nhỏ nhất nếu

có thể. Tốc độ dòng pha động càng cao, thì tốc độ khí cung cấ p cho nguồn ion

hoá để bay hơ i dung môi càng phải lớ n sẽ ảnh hưở ng đến khả năng chuyển mẫu

vào MS (quá trình chuyển mẫu vào MS đối vớ i nguồn ion hoá phun sươ ng chủ

yếu thực hiện theo nguyên tắc chênh lệch áp suất). Chính vì vậy chúng tôi tiến

hành khảo sát 2 mức tốc độ dòng là: 0,5 ml/phút và 0,2 ml/phút, k ết quả thu

đượ c cho thấy:

- Tại tốc độ dòng là 0,5 ml/phút thì thờ i gian phân tích ngắn, các pic đều

đẹ p và cân xứng

- Tại tốc độ dòng là 0,2 ml/phút thì thờ i gian phân tích lâu hơ n nhiều, các

pic bị kéo chân.







36

Hình 3.4: Sắc ký đồ tại tốc độ 0,5 ml/phút

Vì vậy, chúng tôi chọn tốc độ dòng là 0,5 ml/phút để tiến hành các khảo sát tiế p

theo.

3.1.3. Khảo sát qui trình xử lý mẫu

Qua tham khảo tài liệu [21], [27],[34] và để phù hợ p vớ i điều kiện ghiên cứu

chúng tôi tiến hành khảo sát chiết pha r ắn theo 2 qui trình như bảng 3.6 vớ i

dung dịch thử đượ c chuẩn bị như sau: Hút chính xác 1ml dung dịch chứa hỗn

hợ p cephalexin, cefuroxim, cefixim có nồng độ mỗi kháng sinh chính xác

khoảng 40 ng/ml cho vào bình định mức 100 ml, thêm vừa đủ bằng nướ c cất (đã

đượ c thêm khoảng 0,13g Na2EDTA và acid hóa bằng acid H2SO4 10% đến pH =

4).







37

K ết quả thu đượ c trình bày ở bảng 3.7 và mô tả bở i hình 3.5

Bảng 3.6. Khảo sát qui trình chiết pha rắn

Qui trình 1 Qui trình 2

Cột Oasis HLB, 30 µm Oasis HLB, 30 µm

Hoạt hóa cột

- 5 ml MeOH- 5 ml dung dịch Acid

formic 0,1 %

- 1,5 ml MeOH :Ethylacetat = 1:1 × 2 lần

- 1,5 ml MeOH (NH3 1%)× 2 lần

- 1,5 ml dung dịch H2SO4 (pH = 4) × 2 lần

Nạp mẫu

Cho 100 ml dung dịch thử vào cột vớ i tốc độ < 5ml/phút

Cho 100 ml dung dịch thử vàocột vớ i tốc độ < 5 ml/phút

Làm khô cột Làm khô bằng khí N2/ 30 phút

Làm khô bằng khí N2/ 30 phút

R ử a giải - 5 ml MeOH – 5 mlACN : H2O :Triethylamin(90:10:0,5)

- Tốc độ: < 5 ml/phút

- 1,5 ml MeOH :Ethylacetat = 1:1 × 2 lần

- 1,5 ml MeOH (NH3 1%)× 2 lần

- Tốc độ: < 5 ml/phút

Làm khô Làm khô bằng khí N2 Làm khô bằng khí N2

Hòa tan mẫu

Hòa tan bằng 1 ml IS có

nồng độ chính xác khoảng5ng/ml

Hòa tan bằng 1 ml IS có nồng

độ chính xác khoảng 5ng/ml







ình 3.5:

Bảng

ui Trình

B

SD(%)

ui Trình

B

SD(%)

iểu đồ s

0

0.3

0.6

0.9 0.

.7. K ết q

1

2

sánh hi

R1

808

0.45

uả khảo

SIS

1 7608

2 7978

3 7653

4 7883

5 7796

6 8090

7835

1 8552

2 8037

3 7874

4 7854

5 6988

6 6723

7671

u suất c

R2

0.361

0.

8

át qui tr

R1

0 0,85

6 0,75

7 0,88

6 0,81

9 0,82

2 0,71

,7 0,80

7,64 0,55

2 0,34

7 0,41

2 0,5

7 0,38

2 0,45

,3 0,4

18,3

iết của 2

0

32

nh chiết

R2

0,39

0,35

0,37

1 0,37

8 0,3

0,31

8 0,36

7,4 0,21

0,21

0,27

0,21

0,20

0,26

0,23

4 12,9

qui trìn

R3

.492

0.167

pha rắn

R3

0,50

0,45

6 0,5

0,5

0,49

0,4

1 0,49

7,4 0,14

0,16

0,20

0,17

0,14

0,16

0,16

4 13,3

chiết ph

9

8

5

2

3

6

1

9

8

7

9

a rắn

T1

T2







39

Trong đó : - R1, R2, R3: tỷ lệ diện tích kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim,

Cefixim vớ i IS- QT1, QT2: Là qui trình chiết 1 và 2

Nhận xét: Qui trình 1 cho k ết quả tỷ lệ diện tích giữa pic các kháng sinh và

chuẩn nội đều lớ n hơ n qui trình 2 hay qui trình 1 cho độ thu hồi cao hơ n vớ i

RSD < 8%. Vì vậy chúng tôi lựa chọn qui trình 1 để tiến hành các nghiên cứu

tiế p theo.

3.1.4. Quy trình phân tích

Từ những k ết quả khảo sát ở trên, chúng tôi đưa ra quy trình định lượ ng kháng

sinh trong nướ c thải vớ i IS là Terbutaline sulfat (cho đáp ứng khá tốt – vớ i nồng

độ thấ p hơ n kháng sinh nhưng cho diện tích Pic lớ n hơ n). Cụ thể như sau:

Chuẩn bị dung dịch thử và dãy chuẩn:

- Dung dịch chuẩn nội (Terbutaline sulfat 5 ng/ml): Cân chính xác khoảng

25 mg IS cho vào bình định mức 100 ml, hòa tan vừa đủ bằng MeOH: H2O (1:1)

đượ c dung dịch chuẩn nội có nồng độ 0,25 mg/ml, pha loãng bằng MeOH: H2O

(1:1) để đượ c nồng độ chính xác khoảng 5 ng/ml.

- Dung dịch chuẩn gốc kháng sinh (1000 ng/ml): Cân chính xác khoảng 25

mg mỗi 3 kháng sinh cephalexin, cefuroxim, cefixim vào bình định mức 100 ml

hòa tan vừa đủ bằng MeOH : H2O (1:1) đượ c dung dịch chuẩn có nồng độ 0,25

mg/ml, pha loãng bằng MeOH : H2O (1:1) để đượ c nồng độ chính xác khoảng1000 ng/ml.

- Dãy dung dịch chuẩn: Tiến hành pha dãy hỗn hợ p chứa 3 kháng sinh có

nồng độ trong khoảng từ 1 – 70 ng/ml và nồng độ chất chuẩn nội là 5 ng/ml. Sau

đó lọc các dung dịch trên qua màng lọc 0,45 µm.







40

- Dung dịch thử: Hút chính xác 1ml dung dịch chứa hỗn hợ p 3 kháng sinh

có nồng độ mỗi kháng sinh chính xác khoảng 40 ng/ml cho vào bình định mức100 ml, thêm nướ c cất vừa đủ (đã đượ c thêm khoảng 0,13g Na2EDTA và acid

hóa bằng acid H2SO4 đến pH = 4).

- Dung dịch sau khi pha, xử lý đượ c phân tích theo các điều kiện đã chọn

Điều kiện về LC và MS

Bảng 3.8: Điều kiện LC và MS

Điều kiện LC

- Cột Zorbax C18 (4,6 × 150 mm, 5 µm)

- Nhiệt độ cột 25°C

- Thể tích tiêm: 50 µl

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

Gradient

Thờ i gian(phút)

H2O (0,1%acid

formic)

ACN(0,1% acid

formic)

1 - 0,5 95 5

0,5-7,5 0 100

7,5-10 0 100

10-14 95 5

Điều kiện MS

- Drying Gas flow: 15 l/min - DL temperature: 250oC- Interface vonltage : 5000 v - Nebulizing Gas flow: 25 l/min

- Heat block temperature : 400oCIS Cephalexin Cefuroxim Cefixim

Q1 prebias(V) -10 -17 -21 -21

CE (V) -15 -10 -10 -10

Q3 prebias(V) -19 -20 -30 -26







41

3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠ NG PHÁP

3.2.1. Độ thích hợ p của hệ thống

Từ dung dịch chuẩn gốc và dung dịch chuẩn nội chuẩn bị như mục 3.1.4,

tiến hành pha để có dung dịch chuẩn hỗn hợ p chứa đồng thờ i 3 kháng sinh có

nồng độ chính xác khoảng 20 ng/ml và chuẩn nội vớ i nồng độ là 5 ng/ml. Tiến

hành sắc ký mẫu này 6 lần liên tiế p theo điều kiện sắc ký đã chọn như bảng 3.8.

K ết quả đượ c trình bày ở bảng 3.9

Nhận xét:

K ết quả cho thấy RSD của thờ i gian lưu của chuẩn nội và kháng sinh đều

r ất thấ p (< 1%) và RSD của tỷ số diện tích píc của mỗi kháng sinh và chuẩn nội

< 5%. Như vậy, hệ thống đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượ ng các kháng

sinh trong nướ c thải.

3.2.2. Tính chọn lọc của phươ ng phápTính đặc hiệu đượ c đánh giá qua phân tích các dung dịch chuẩn, dung dịch

mẫu tr ắng, dung dịch mẫu tự tạo chứa 3 kháng sinh cephalexin, cefixim,

cefuroxim.

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn, dung dịch mẫu tr ắng (placebo) và dung dịch

mẫu tự tạo như sau:

- Dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha như mục 3.1.4, tiến hành

pha dung dịch hỗn hợ p gồm 3 kháng sinh có nồng độ chính xác khoảng

40 ng/ml và chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 5 ng/ml

- Dung dịch mẫu tự tạo: Hút chính xác 1ml hỗn hợ p 3 kháng sinh có nồngđộ chính xác khoảng 40 ng/ml và chuẩn nội có nồng độ khoảng 5 ng/ml







42

Bảng 3.9. Độ thích hợ p của hệ thống về thờ i gian và tỷ số diện tích của kháng sin

STT

IS Cefixim Cefuroxim Cepha

S ic tR S ic N tR R S ic N tR R S ic 1 63027 5,672 28725 31076 6.464 0,456 15531 35897 7.024 0,246 619322 63270 5,668 28114 33275 6.461 0,444 14802 32074 7.023 0,234 607613 63749 5,666 27701 31131 6.462 0,435 15634 34194 7.024 0,245 590014 63031 5,663 28289 32269 6.455 0,449 14137 33316 7.020 0,224 605035 63721 5,667 28465 30336 6.457 0,447 14502 36327 7.023 0,228 610946 64502 5,663 28056 30840 6.457 0,435 14453 31508 7.017 0,224 60772

TB 63550 5,667 6.459 0,444 15026 7.022 0,234 60549SD 565,06 0,0034 3,502 0,008 15531 2,787 0,01 RSD(%) 0,89 0,0598 0,054 1,86 14802 0,04 4,34

Trong đó: tR : là thờ i gian lưu (phút)

R: tỷ số S pic/SIS

N: số đĩ a lý thuyết

WWW





43

cho vào bình định mức 100 ml r ồi tiến hành xử lý mẫu theo qui trình chiết phar ắn như mục 3.1.3 cho vào cắn của mẫu nướ c thải đã xử lý.

- Dung dịch mẫu tr ắng: Hòa tan cắn sau khi chiết bằng k ỹ thuật SPE của

mẫu nướ c thải nhà máy dượ c phẩm trong ngày không sản xuất kháng

sinh cephalosporin trong 1ml H2O : MeOH (1:1)

Tiến hành phân tích các dung dịch trên theo điều kiện đã chọn như bảng

3.8.

Ngoài ra chúng tôi còn khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích đồng thờ i 3kháng sinh đang cần phân tích và 5 kháng sinh cephalosporin khác: cefaclor,

cefdinir, cetriazone, cefepim, cefadroxil. Tiến hành pha một hỗn hợ p gồm 8

cephalosporin này có nồng độ chính xác khoảng 20 ng/ml và IS 5 ng/ml tiến

hành sắc ký theo điều kiện đã chọn như bảng 3.6. K ết quả đượ c ghi lại trong

Hình 3.6.

(a)Mẫu tự tạo







44

(b) Mẫu tr ắng

(c) Chuẩn hỗn hợ p 8 kháng sinh và IS







45

(d) Chuẩn 3 kháng sinh và IS

Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu

Nhận xét:- Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu tr ắng không xuất hiện pic nào tại

thờ i gian lưu tươ ng ứng của 3 kháng sinh phân tích và IS.

- Trên sắc ký đồ của dung dịch tự tạo xuất hiện 4 pic tươ ng ứng vớ i thờ i

gian lưu tươ ng ứng vớ i pic của IS và các kháng sinh trong sắc ký đồ dung dịch

chuẩn.

Khi phân tích hỗn hợ p gồm 5 cephalosporin khác và IS:

- Trên sắc ký đồ phân tích 8 cephalosporin và IS: Vẫn xuất hiện các pic

kháng sinh đang cần nghiên cứu như khi chạy hỗn hợ p 3 kháng sinh này vớ i

IS

Như vậy, phươ ng pháp này chọn lọc ngay cả khi phân tích 3 kháng sinh

cephalexin, cefixim, cefuroxim trong dung dịch thử có chứa nhiều kháng sinh

cephalosporin khác.







46

3.2.3. Độ tuyến tính

Chúng tôi đã khảo sát độ tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic của chất phân

tích và chuẩn nội và nồng độ chất phân tích, cụ thể tiến hành như sau:

Từ dung dịch chuẩn gốc chuẩn chứa hỗn hợ p 4 kháng sinh và dung dịch

chuẩn nội gốc đượ c chuẩn bị như phần 3.1.4 tiến hành chuẩn bị các dãy chuẩn

làm việc: pha loãng mẫu chuẩn gốc vớ i MeOH: H2O (1:1) để đượ c các dung

dịch kháng sinh có kho

ảng n

ồng

độ từ

khoảng 1 ng/ml

đến 70 ng/ml và

chuẩn nội 5 ng/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích theo điều

kiện đã chọn, k ết quả đượ c trình bày như bảng 3.10.

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát của cả 3 kháng sinh có sự

tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích vớ i tỷ lệ diện tích pic của chất

phân tích (kháng sinh) và chuẩn nội (r > 0,995). Do đó, đườ ng hồi quy có thể

tính toán k ết quả định lượ ng vớ i độ tin cậy cao.

3.2.4. Độ đúng và độ chính xác của phươ ng pháp

Độ đúng của phươ ng pháp đượ c tiến hành theo quy trình phân tích trên

mẫu thử chứa lượ ng hoạt chất đã biết. Độ lặ p lại của phươ ng pháp đượ c xác

định thông qua giá tr ị độ lệch chuẩn tươ ng đối (RSD) thu đượ c khi phân tích 6

mẫu tự tạo khác nhau. Chúng tôi lựa chọn nồng độ để khảo sát là nồng độ

khoảng 40 ng/ml.

Tiến hành pha dung dịch chuẩn chứa hỗn hợ p 3 kháng sinh có nồng độ

chính xác khoảng 40 ng/ml, đem đi xử lý mẫu như mục 3.1.3, sau đó đượ c

đem đi phân tích bở i các điều kiện đã chọn. Thực hiện đồng thờ i 6 mẫu song

song, k ết quả đượ c trình bày như bảng 3.11.







47

Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính giữ a tỷ lệ của diện tích kháng sinh và chuẩn nộ

Trong đó: R là tỷ lệ diện tích kháng sinh và chuẩn nội

STT

Cefixim Cefuroxim

SIS

Nồng độ thự c

(ng/ml) Spíc R

% tínhlại theođườ ngchuẩn


(ng/ml) Spíc R

% tínhlại theođườ ngchuẩn


(ng/ml)

1 65348 2,52 2639 0,04 120,48 2,36 2136 0,033 92,84 1,19

2 63278 12,61 14545 0,23 67,88 11,78 7659 0,121 101,9 11,88

3 66026 25,21 28742 0,435 107,51 23,56 14693 0,223 98,81 23,76

4 67505 37,82 43661 0,647 104,68 35,34 25345 0,375 113,95 35,63

5 64269 50,43 56182 0,874 104,73 47,12 30077 0,468 107,28 47,51

6 64095 63,04 69792 1,089 106,73 58,9 36935 0,576 106,25 59,39

7 68793 75,64 85873 1,248 106,67 70,68 45965 0,668 102,99 71,27

Phươ ng trình hồi quy: y = 0,016x + 0,013Hệ số tươ ng quan : r = 0,999

Phươ ng trình hồi quy: y = 0,005x + 0,001Hệ số tươ ng quan : r = 0,998

Phươ ng Hệ số tư

WWW





48

Bảng 3.11. Đánh giá độ chính xác và độ đúng của phươ ng pháp

Trong đó: R: là tỷ số diện tích của kháng sinh và chuẩn nội,

H(%): là hiệu suất thu hồi

Cephalexin Cefuroxim Cefixim

STT

Lượ ngchuẩnthêmvào(ng/ml)

R

Lượ ngchuẩntìm lạiđượ c H(%)


R

Lượ ngchuẩntìm lạiđượ c H(%)


Phươ ng trình hồi quy: y = 0,041x + 0,024 Phươ ng trình hồi quy: y = 0,009x + 0,007 Phươ ng

1 48,32 0,808 20,15 41,71 51,38 42,72 42,72 83,15 53,38

2 47,96 0,756 17,86 37,23 51,25 38,55 38,55 75,22 52,19

3 46,34 0,884 20,97 45,26 53,24 40,97 40,97 76,96 54,35

4 47,23 0,811 19,2 40,65 53,78 40,66 40,66 75,61 52,78

5 47,25 0,828 19,6 41,48 52,23 39,27 39,27 75,19 51,98

6 46,18 0,716 16,88 36,56 52,65 34,09 34,09 64,75 52,21

Trung bình 39,20 75,15

RSD (%) 7,50 7,89

WWW





49

Nhận xét:

- Tại nồng độ khảo sát: Độ thu hồi trung bình của Cephalexin là 40,48%

(RSD% = 7,91), của cefuroxim là 75,15% (RSD% = 7,89) của Cefixim là

55,95% (RSD % = 6,53). Như vậy sử dụng qui trình chiết pha r ắn như mục

3.1.3 cho độ thu hồi tươ ng đối tốt từ khoảng 40 – 80% vớ i độ chính xác cao

(RSD < 8%).

3.2.5. Giớ i hạn phát hiện và giớ i hạn định lượ ng

Giớ i hạn phát hiện

Tiến hành: Tại nồng độ thấ p nhất của các đườ ng chuẩn (các chất đều cho giá

tr ị S/N > 10) chúng tôi tiêm lặ p lại 6 lần hỗn hợ p này, giớ i hạn phát hiện đượ c

tính từ giá tr ị độ lệch chuẩn đáp ứng và hệ số góc của đườ ng chuẩn theo công

thức sau:

3,3×SLOD=a

Trong đó: S là độ lệch chuẩn của đáp ứng và a là hệ số góc của đườ ng chuẩn.

Giớ i hạn định l ượ ng:

Đượ c tính dựa vào giá tr ị LOD:

LOQ = 3,3 x LOD

K ết quả giá tr ị LOD và LOQ đượ c trình bày như bảng 3.12

Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của phươ ng pháp

LOD(ng/ml)

LOQ(ng/ml) PT Hồi qui S (Độ lệch chuẩn)

Cephalexin 0,69 2,08 y = 0,036x + 0,0230,00237

Cefuroxim 0,58 1,75 y = 0,009x + 0,0130,00172

Cefixim 0,77 2,30 y = 0,016x + 0,013 0,00160







50

Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu LOD







51

3.3. Ứ NG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰ NG ĐƯỢ C ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ

LƯỢ NG KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚ C THẢI CÔNG NGHIỆP

DƯỢ C

Trong giai đoạn nghiên cứu này, chúng tôi đã lấy đượ c 2 mẫu nướ c thải của

2 nhà máy dượ c phẩm trên địa bàn Hà Nội.

Mẫu thứ nhất (M1): Đượ c lấy vào giai đoạn đang có sản xuất cephalexin

(8/8/2014)

Mẫu thứ hai (M2): Đượ c lấy vào giai đoạn nhà máy đang sản xuất cefuroxim

và đã ngừng sản xuất cefixim đượ c 3 ngày (ngày 17/8/2014)

Tiến hành phân tích mẫu khi chưa chiết pha r ắn và sau khi chiết pha r ắn k ết

quả thu đượ c như sau:

Bảng 3.13. K ết quả phân tích mẫu nướ c thải M1

Trướ cchiết

Sauchiết

STB (n=2)

Tỷ lệ SKS/SIS


(ng/ml)

Cephalexin- - -

Cefuroxim - - -

Cefixim- - -

IS 63124







52

Trong đó ký hiệu: (-) : Âm tính

SKS/SIS : Tỷ lệ diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội

Như vậy phươ ng pháp đã nghiên cứu không xác định thấy dư lượ ng kháng

sinh nào trong 3 kháng sinh nghiên cứu ở mẫu thứ nhất.

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử M1

Bảng 3.14. K ết quả phân tích mẫu nướ c thải M2

(Cefuroxim: Đườ ng chuẩ n: y = 0,009x+0,007, Độ thu hồi 75,15%)

Trướ c

chiết

Sau

chiết

STB

(n=2)

Tỷ lệ

SKS/SIS

Nồng

độ sauchiết(ng/ml)

Nồng

độ thự c(ng/ml)

Cephalexin- - -

Cefuroxim - + 16444 0,265 28,667 0,381

Cefixim - - -

IS 62104







54

CHƯƠ NG 4. BÀN LUẬN

4.1. LỰ A CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU

Qui trình xử lý mẫu bao gồm các giai đoạn lọc loại tạ p, thêm Na2EDTA

để loại các tạ p ion kim loại, sau đó mẫu đượ c acid hóa đến pH = 4. Chúng tôi

đã tiến hành khảo sát và lựa chọn qui trình chiết nhằm thu đượ c hiệu suất thu

hồi

cao. Việc này là r ất có ý ngh ĩ a khi xác định dư lượ ng các chất trong môitr ườ ng do chúng có thể chỉ có hàm lượ ng ppb. Qui trình chiết pha r ắn đã sử

dụng cho hiệu suất thu hồi tốt ở hầu hết các kháng sinh (từ 40 – 80 %) và ổn

định (RSD < 8%).

Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng cũng không thể phủ nhận nhượ c điểm

của quy trình xử lý mẫu này là r ất tốn kém và phải kiểm soát đượ c tốc độ chiết

trong quá trình. Một số nghiên cứu khác đã áp dụng k ỹ thuật chiết lỏng – lỏngđể loại tạ p mẫu tr ướ c quá trình phân tích [20]... Tuy nhiên, phươ ng pháp này

cũng có nhượ c điểm là không làm giàu đượ c mẫu phân tích so vớ i k ỹ thuật

chiết pha r ắn, tốn dung môi. Không những vậy, việc khảo sát lựa chọn dung

môi phù hợ p vớ i việc chiết nhiều kháng sinh cùng lúc cũng là r ất khó khăn.

4.2. LỰ A CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH

Chúng tôi lựa chọn phươ ng pháp phân tích bằng hệ thống LC/MS/MS vìhệ thống này cho độ nhạy cao phù hợ p vớ i các nghiên cứu về xác định dư

lượ ng trong môi tr ườ ng, thờ i gian phân tích tươ ng đối ngắn và k ỹ thuật

LC/MS/MS có thể dễ dàng xác định cùng lúc đượ c nhiều chất cụ thể như

chúng tôi đã thử nghiệm có thể xác định đồng thờ i 8 kháng sinh họ

cephalosporins.







55

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát và tối ưu các điều kiện khác như điều

kiện nguồn ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ, thể tích tiêm mẫu, chươ ng trình

gradient pha động... để thu đượ c giớ i hạn phát hiện của mẫu tiêm của các

kháng sinh ở nồng độ ppb (0,58 ng/ml- 1,22 ng/ml), giá tr ị LOD này sẽ là thấ p

hơ n nhiều khi mẫu đượ c làm giàu bở i quá trình chiết pha r ắn. So sánh vớ i

nghiên cứu của Tr ần Thị Thanh Huế sử dụng k ỹ thuật chiết lỏng – lỏng và

HPLC - UV để định lượ ng cefixim trong nướ c thải nhà máy dượ c phẩm có k ết

quả giớ i hạn phát hiện là 6,68 ng/ml [20]. So sánh vớ i nghiên cứu của Vishal

Diwan và cộng sự (2010) sử dụng chiết pha r ắn và HPLC-MS/MS để định

lượ ng một số chất trong đó có các kháng sinh nhóm cephalosporin trong nướ c

thải bệnh viện thu đượ c giớ i hạn phát hiện ở ppb (từ 0,01 đến 2,5 ng/ml tùy

thuộc kháng sinh) [36]. Một nghiên cứu khác của Dươ ng Hồng Anh và cộng

sự (2006) sử dụng quy trình chiết pha r ắn và HPLC vớ i detector huỳnh quang

để xác định dư lượ ng của một số kháng sinh họ floquinolon trong nướ c thải bệnh viện cũng thu đượ c giớ i hạn phát hiện ở ppb (từ 0,5 đến 1,0 ng/ml). Như

vậy có thể thấy phươ ng pháp chúng tôi xây dựng đượ c đã đưa gia đượ c k ết

quả phát hiện r ất tốt, tươ ng đươ ng hoặc hơ n vớ i các đề tài nghiên cứu trong và

ngoài nướ c. Song cũng có thể nhận thấy việc sử dụng đồng thờ i k ỹ thuật chiết

pha r ắn và LC/MS/MS cũng có nhượ c điểm về chi phí dung môi, chi phí cột

chiết pha r ắn là nhiều hơ n so vớ i các phươ ng pháp khác.

Qui trình phân tích chúng tôi đã xây dựng có khả năng định lượ ng đượ c

đồng thờ i 3 kháng sinh cephalosporin. Điều này là phù hợ p vớ i thực tế mỗi

dây chuyền sản xuất cephalosporin không chỉ sản xuất đơ n lẻ một loại

cephalosporin mà sản xuất đồng thờ i nhiều cephalosporin cùng lúc. Những

cephalosporin này cũng là những loại kháng sinh đang đượ c sử dụng và sản

xuất r ất phổ biến tại Việt Nam, do vậy phươ ng pháp có thể áp dụng cho mẫu







57

sát quốc gia về nhiễm khuẩn bệnh viện ở giai đoạn 1992-2004 cho thấy tỷ lệ

kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) tăng 9% vớ i

quinolon, 20% vớ i cephalosporin thế hệ 3 và tăng 15% vớ i imipenem; tỷ lệ

kháng cephalosporin thế hệ 3 của Klebsiella pneumonia (K. pneumonia) cũng

tăng 47% [16] [30].

Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007 ở các bệnh viện Hàn

Quốc cho thấy S. aureus kháng Methicillin (MRSA) 64%; K.

pneumoniaekháng cephalosporin thế hệ 3 là 29%; E.coli kháng

fluoroquinolone 27%, P. aeruginosa kháng 33%, Acinetobacter spp. kháng

48%; P. aeruginosa kháng amikacin 19%, Acinetobacter spp. kháng 37%. E.

faecium kháng vancomycin và Acinetobacter spp. kháng imipenem tăng lên

dần. Tỷ lệ kháng phát hiện tại các phòng xét nghiệm của E.coli và K.

pneumoniae đối vớ i cephalosporin thế hệ 3 và P. aeruginosa đối vớ i

imipenem cao hơ n trong bệnh viện [25]. T ại Việt Nam

Tình tr ạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao. Trong

những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy:

• Các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên nhân

thườ ng gặ p nhất gây nhiễm khuẩn hô hấ p- kháng penicillin (71.4%) và

kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nướ ctrong mạng lướ i giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP)

năm 2000-2001.

• 75% các chủng pneumococci kháng vớ i ba hoặc trên ba loại kháng sinh.

• 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn phổ biến khác)

kháng vớ i ampicillin.







58

•

Xu hướ ng gia tăng của tình tr ạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ r ệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng

pneumococcus kháng vớ i penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng

lên 56%. Xu hướ ng tươ ng tự cũng đượ c báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt

Nam.

Theo báo cáo k ết quả nghiên cứu ở 15 bệnh viện ở Hà Nội, TPHCM và Hải

Phòng trong 2 năm (2008-2009) về tình tr ạng kháng thuốc kháng sinh, có 4

chủng vi khuẩn thườ ng gặ p kháng kháng sinh là Acinetobacter spp,

Pseudomonas spp, E.coli, Klebsiella. Hầu hết các kháng sinh thông thườ ng

như: penicillin, tetracyclin, streptomycin… hay như kháng sinh cephalosporin

thế hệ thứ 3 đều đã xuất hiện các khuẩn kháng thuốc. Sự kháng thuốc cao đặc

biệt ở nhóm thuốc Cephalosporin thế hệ 3, 4 vớ i tỷ lệ kháng từ 66 - 83%, tiế p

theo là nhóm kháng sinh aminosid và floquinolon tỷ lệ kháng xấ p xỉ trên 60%.

Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%, tăng gần gấ p đôi so vớ i tỷ lệ nàynăm 2006 (18,4%) [5],[9].

Do tỉ lệ kháng kháng sinh cao, nhiều liệu pháp kháng sinh đượ c khuyến cáo

trong các tài liệu hướ ng dẫn điều tr ị đã không còn hiệu lực. Do các bệnh

nhiễm khuẩn vẫn là các bệnh phổ biến ở Việt Nam, việc tiế p cận vớ i các

kháng sinh có hiệu lực giữ vai trò r ất quan tr ọng. Tỉ lệ kháng kháng sinh gia

tăng như hiện nay là mối hiểm họa đối vớ i hiệu quả của các liệu pháp điều tr ị bằng kháng sinh

4.3.2 .Nghiên cứ u dư lượ ng kháng sinh trong môi trườ ng tại Việt nam

Tại Việt Nam, mớ i chỉ có một số ít nghiên cứu về vấn đề dư lượ ng

kháng sinh trong môi tr ườ ng. Như nghiên cứu về xác định các kháng sinh

nhóm Quinolon trong nướ c thải bệnh viện [2], một số nghiên cứu sử dụng k ỹ

thuật chiết pha r ắn và phân tích bằng LC/MS/MS nhằm xác định nhóm kháng







59

sinh nitrofuran, nhóm sulfonamides trong các loại thực phẩm tươ i hay dư

lượ ng của Cloramphenicol trong thủy sản. [8],[11].

Một số nghiên cứu quốc tế có sự tham gia của Việt Nam cũng cho thấy

mức độ ô nhiễm dư lượ ng kháng sinh tại Việt Nam cao hơ n so vớ i các nướ c

khác trên thế giớ i [33],[34]. Các nghiên cứu này đều có chung khuyến nghị là

cần tiế p tục có các nghiên cứu khác một cách có hệ thống để đánh giá toàn

diện tình hình ô nhiễm dư lượ ng kháng sinh ở Việt Nam.

Tuy nhiên, nghiên cứu về dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải nhà máy

công nghiệ p dượ c tại Việt Nam chưa đượ c quan tâm một cách đúng mức trong

khi số lượ ng nhà máy dượ c phẩm sản xuất kháng sinh là r ất lớ n. Gần đây nhất

chỉ có nghiên cứu xác định dư lượ ng Cefixim trong nhà máy nướ c thải dượ c

phẩm bằng phươ ng pháp HPLC, nồng độ kháng sinh xác định đượ c là từ

19,24 - 43,33 ppb [20].

Như vậy tình hình kháng kháng sinh trên thế giớ i nói chung và ở Việt Nam nói riêng đã và đang để lại những hậu quả nghiêm tr ọng về sức khỏe,

tính mạng con ngườ i cũng như chi phí điều tr ị. Ngoài nguyên nhân do việc sử

dụng thuốc không hợ p lý thì một nguyên nhân khác đang r ất đượ c quan tâm

đấy là do dư lượ ng của kháng sinh có trong môi tr ườ ng như trong thực phẩm

tươ i sống hay từ các nguồn nướ c. Bở i lẽ chỉ cần một lượ ng nhỏ các loại kháng

sinh khác nhau tồn dư trong thực phẩm cũng như nướ c thải thì vi khuẩn có thể

hình thành nên các gen kháng thuốc gây ra những hậu quả nghiêm tr ọng cho

cộng đồng. Hơ n thế nữa khi mà những dư lượ ng kháng sinh trong môi tr ườ ng

đượ c tích lũy trong cơ thể chúng ta thì chúng có thể gây ra những hậu quả mà

chúng ta cũng chưa thể đoán tr ướ c.

Chính vì vậy cần phải khẩn tr ươ ng mở r ộng các nghiên cứu liên quan

đến dư lượ ng kháng sinh có trong nướ c thải công nghiệ p dượ c và các tác động







53

Trong đó ký hiệu: (-): Âm tính

(+): Dươ ng tính

SKS/SIS : Tỷ lệ diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử M2

Nhận xét: Như vậy qua phân tích mẫu nướ c thải của nhà máy sản xuất

dượ c phẩm thứ nhất thì không phát hiện đượ c có kháng sinh trong nướ c thải

Đối vớ i mẫu thử thứ 2 thì thu đượ c nồng độ Cefuroxim r ất thấ p (<1 ng/ml) nó

thấ p hơ n LOD và LOQ của phươ ng pháp điều đó chứng tỏ đượ c vai trò của

k ỹ thuật chiết pha r ắn là r ất quan tr ọng trong việc làm giàu mẫu tr ướ c khi phân

tích.







60

của chúng đến tình tr ạng kháng kháng sinh của vi sinh vật nhằm hỗ tr ợ các

nhà hoạch định chính sách trong việc đưa ra các giải pháp, các qui định cho

vấn đề môi tr ườ ng này.

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

K ẾT LUẬN

Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi thu đượ c các k ết luận như sau:

Xây dự ng quy trình định lượ ng đồng thờ i 4 kháng sinh: cefuroxim,cephalexin, cefixim, cefaclor trong nướ c thải ở các cở sở sản xuất

dượ c:

- Đã khảo sát đượ c qui trình xử lý mẫu cụ thể như sau: Hoạt hóa cột bằng 5

ml MeOH và 5 ml dung dịch acid formic 0,1%, r ửa giải cột bằng 5 ml MeOH

và 5 ml ACN : H2O : Triethylamin (90 :10 : 0,5). Qui trình xử lý này có hiệu

suất cao (độ thu hồi từ 40 – 80%) và ổn định (RSD < 8%).- Đã khảo sát các điều kiện về khối phổ: Lựa chọn ion mẹ, năng lượ ng bắn

phá ion mẹ để thu đượ c ion con, lựa chọn đượ c các ion con phù hợ p cho quá

trình phân tích định lượ ng phù hợ p vớ i tiêu chuẩn Châu Âu 2002/657/EC.

- Đã khảo sát lựa chọn các điều kiện về sắc ký lỏng khác như: lựa chọn cột

Zorbax C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), thể tích tiêm mẫu 50 µl, tốc độ dòng 0,5

ml/phút, chươ ng trình gradient pha động để có thể định lượ ng đượ c đồng thờ i

3 kháng sinh trong nướ c thải công nghiệ p dượ c ở nồng độ ppb.

Thẩm định quy trình trình định lượ ng các kháng sinh trong nướ c thải

ở các cở sở sản xuất dượ c:

- Đã thẩm định đượ c phươ ng pháp có tính chọn lọc cao: có thể phân tích

đồng thờ i cefuroxim, cephalexin, cefixim trong hỗn hợ p nhiều cephalosporin

khác.







61

- Đã xây dựng đượ c khoảng tuyến tính r ộng từ khoảng 1 ng/ml – 70 ng/ml

vớ i hệ số tươ ng quan r ất chặt chẽ r > 0,99.

- Phươ ng pháp có độ lặ p lại cao RSD < 8% vớ i n = 6 (Theo AOAC nồng

độ từ 10 – 100 ng/ml: RSD ≤ 21%) .

- Độ nhạy cao vớ i giá tr ị LOD và LOQ thấ p (LOD từ 0,58 ng/ml- 1,22

ng/ml), giá tr ị này sẽ thấ p hơ n nhiều khi mẫu đượ c làm giàu bở i k ỹ thuật chiết

pha r ắn, chứng tỏ phươ ng pháp này r ất khả thi để ứng dụng phát hiện dư

lượ ng kháng sinh trong môi tr ườ ng.

- Độ thu hồi của các kháng sinh nằm trong khoảng 40 – 80% (RSD < 8%)

đạt qui định > 30%.

Áp dụng trên mẫu thự c:

Đã áp dụng quy trình xây dựng đượ c vào phân tích mẫu nướ c thải của

Công ty dượ c phẩm vào ngày có sản xuất kháng sinh. K ết quả cho thấy quy

trình xây dựng đượ c đã xác định đượ c dư lượ ng cefuroxim trong nướ c thải

nhà máy công nghiệ p dượ c.

Đối vớ i mẫu nướ c thải nghi là có cephalexin và cefixim thì qui trình phân

tích cho k ết quả âm tính. Điều này có thể là do qui trình xử lý nướ c thải của

nhà máy là tốt hoặc có thể là do ngày lẫy mẫu không phù hợ p.

KIẾN NGHỊ - Tiế p tục nghiên cứu triển khai quy trình trên để xác định đồng thờ i

nhiều kháng sinh ở nhà máy công nghiệ p dượ c cũng như các nguồn nướ c có

nguy cơ chứa kháng sinh cao như nướ c thải bệnh viện, nướ c trong nuôi tr ồng

thủy sản.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ti ế ng Vi ệt

1. Tr ần Tử An (2011), Kiể m nghiệm d ượ c phẩ m, Nhà xuất bản y học, Tr 84-

110.

2. Dươ ng Hồng Anh (2006), Phân tích đ ánh giá sự có mặt của các kháng

sinh họ floquinilon trong nướ c thải bệnh viện, Đề tài nghiên cứu khoa học

của Tr ườ ng Đại Học Quốc Gia Hà Nội.3. Bộ y tế (2009), Dượ c đ iể n Việt Nam IV , nhà xuất bản Y học.

4. Bộ y tế (2009), Dượ c thư quố c gia Việt Nam, nhà xuất bản Y học.

5. Bộ Y t ế - GARP -Việt Nam - Oxford University Clinical Research Unit , Báo

cáo sử d ụng kháng sinh và kháng kháng sinh t ại 15 bệnh viện Việt Nam

năm 2008-2009, tr. 12-17

6. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Xuân Đà (2013), Xử lý mẫu trong phân tích thực

phẩm, nhà xuất bản khoa học và k ỹ thuật.

7. Tr ần Đức Hậu (2007), Hóa d ượ c t ậ p 2, nhà xuất bản Y học, tr 118-133.

8. Tr ần Thị Hồng,(2012) “Xác định đồng thờ i dư lượ ng kháng sinh nhóm

nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươ i sống trên địa bàn Hà Nội bằng

phươ ng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”,Tr ườ ng Đại học Khoa học

Tự nhiên Luận văn ThS. ngành Hóa phân tích

9. Nguyễ n V ăn Kính và nhóm nghiên cứ u quố c gia GARP -Việt Nam (2010), Phân tích thự c tr ạng : S ử d ụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt

Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership, tr. 17-33

10. Phạm Luận (2004), Một số vấn đề cơ sở của sự chiết trong phân tích,

tr ườ ng đại học Quốc gia Hà Nội







11. Vũ thị Trang (2012), “Phươ ng pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định dư

lượ ng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm”,

Tr ườ ng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành Hóa phân tích

12. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dượ c lí học t ậ p 2, NXB Y học, tr 149-

153.

13. Nguyễn Đình Triệu (2005), các phươ ng pháp phân tích vật lý và hóa lý,

nhà xuất bản khoa học và k ỹ thuật, tr.41-60.

Ti ế ng Anh

14. British pharmacopoeia 2010

15. Cha J.M Yang S, Carlson K.H (2005), "Trace determination of-lactam

antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid

chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry",

Journal of Chromatography A, (1115), pp. 46-57

16. Chuanwu Xi1,Yongli Zhang1,Carl F. Marrs, Wen Ye, Carl Simon, Betsy

Foxman, Jerome Nriagu (2009), Prevalence of Antibiotic Resistance in

Drinking Water Treatment and Distribution Systems, Applied and

Environmental Microbiology, p 5714-5718.

17.European Centre for Disease Prevention and Control director’s

presentation (2012), EU action on Antimicrobial Resistance – European

Antibiotic Awareness Day, EU Health Prize for Journalists 2011, 31

January 2012, Brussels

18. European Union (2002) Commission Decision 2002/657/EC, Official

Journal of the European Communities, L 221/14

19. Fasching CE, Peterson LR (1982). Anion-exchange extraction of

cephapirin, cefotaxime, and cefoxitin from serum for liquid







chromatography. Antimicrob Agents Chemother. Volume 21(4), p 628-

633.

20. Hue, T.T.T., Son, D.C, Anh, N.T.L, Anh, N. T. K., Phong, T. K., and

Hiramatsu K. (2014), A Simple and Rapid Method to Measure Residue Of

Cefixime - a Cephalosporin Antibiotic in the Wastewater of

Pharmaceutical Production Plant . Journal of the Faculty of Agriculture,

Кyushu University, 59(1),169-175

21. H.-J. Brauch and F. Sacher, (2008) “Determination of CephalosporinAntibiotics by Solid-phase Extraction followed by Liquid

Chromatography and Tandem Mass Spectrometry “, Volume I, pp.151 –

167

22. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for

Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005),Validation of

anatical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), ICH Harmonised

Tripartite Guideline

23. Karageorgou E Myridakis A, Stephanou EG, Samanidou V (2013),

"Multiresidue LC–MS/MS analysis of cephalosporins and quinolones in

milk following ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersive

extraction combined with the quick, easy, cheap, effective, rugged, and

safe methodology", Journal of Separation Science, (36), pp. 2020-2027.

24. Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR et al, (2010), Emergence of anew antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a

molecular, biological, and epidemiological study. Lancet. Infect.

Dis , 10 (9), pp. 597–602

25. Kyungwon Lee, (2010), “Increase of ceftazidime- and fluoroquinolone-

resistant Klebsiella pneumoniae and imipenem-resistant Acinetobacter







spp. in Korea: analysis of KONSAR study data from 2005 and 2007”,

Yonsei Med J, 51(6), pp 901 – 911

26. Lei Tong a, Ping Li a, Yanxin Wang , Kuanzheng Zhu b, (2009),“Analysis

of veterinary antibiotic residues in swine wastewater and environmental

water samples using optimized SPE-LC/MS/MS”, Chemosphere 74, pp.

1090–1097

27. Lindberga, R., Jarnheimer, P., Olsen, B., Johansson, M., and Tysklind M.

(2004), Determination of antibiotic substances in hospital sewage waterusing solid phase extraction and liquid chromatography/mass

spectrometry and group analogue internal standards, Chemosphere 57

1479–1488

28. McQuillan D., et al (2002), Drug Residue in Ambient Water: Initial

Surveillance in New Mexico, USA, 7th Annual New Mexico Environmental

Health Conference

29. Mitra S. (2003), Sample Preparation Techniques in Analytical chemistry,

John Wiley & Sons, USA

30. NNIS report (2004), National Nosocomial Infections Surveillance System

Report, data summary from January 1992 through June 2004. Am. J.

Infect. Control, 32, 470-485

31. Robert E.ardray (2003), Liquid Chromatography – mass spectrometry An

introduction, University of fluddersfield.32. Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN (2003) , Rapid and sensitive

high-performance liquid chromatographic determination of four

cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals and body fluids, J

Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. Volume 788(1), p 58-147







33. Satoru Suzuki , Phan Thi Phuong Hoa,(2012),“Distribution of quinolones,

sulfonamides, tetracyclines in aquatic environment and antibiotic

resistance in indochina”, Front. Microbiol , 3(67), pp.1-8

34. Satoshimanagaki, Ayakomurata, Hideshigetakada, Bui cach tuyen,

Nguyen H.Chiem, (2007),”Distribution of Macrolides, Sulfonamides, and

Trimethoprim in Tropical Waters: Ubiquitous Occurrence of Veterinary

Antibiotics in the Mekong Delta”, Environ. Sci. Technol , 41,pp. 8004–

801035. Vishal et al (2010), Antibiotics and antibiotic- resistant bacteria in water

associated with a hospital in Ujjain India, BMC Public Heath, 10: 414,

36. Vishal et al. (2012), Identification of extended- spectrum β - lactamase and

quinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from hospital

wastewater from central India, J Antimicrob Chemother; 67: 857 – 859

37. Xiao-Lin Houa, Yin-Liang Wub, Yan Lvb, Xiu-Qin Xub, Jian Zhaob,

Ting Yangb, (2013) , “Development and validation of an ultra high

performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for

determination of 10 cephalosporins and desacetylcefapirin in milk”,

Journal of Chromatography B, 931 6– 11

38. WHO (2014), Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014

(http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/)







BỘ Y TẾ

TR ƯỜ NG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN

Họ và tên học viên: Nguyễn Văn Thuận Khóa 17

Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất Mã số: 60720410

Tên đề tài: Nghiên cứu xác định dư lượ ng một số cephalosporin trong nướ c

thải nhà máy dượ c phẩm bằng phươ ng pháp LC/MS-MS

Tên cơ sở đào tạo: Tr ườ ng Đại học Dượ c Hà Nội

1. Mục đích và đối tượ ng nghiên cứ u

1.1 M ục đ ích:

1.Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác định

dư lượ ng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong nướ c thải từ

cơ sở sản xuất Dượ c bằng k ỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb.

2. Thẩm định phươ ng pháp phân tích dư lượ ng các kháng sinh trên và bướ c

đầu ứng dụng phươ ng pháp để đánh giá dư lượ ng kháng sinh trong nướ c thải

của nhà máy sản xuất dượ c phẩm

1.2 Đố i t ượ ng nghiên cứ u:

Mẫu nướ c thải của nhà máy công nghiệ p trong giai đoạn không sản xuất

kháng sinh và mẫu trong giai đoạn sản xuất kháng sinh đang cần phân tích







2.Phươ ng pháp nghiên cứ u đã sử dụng:

Phươ ng pháp LC/MS-MS k ết hợ p vớ i k ỹ thuật chiết pha r ắn để làm giàu mẫu

3.K ết quả chính và k ết luận

3.1 K ế t quả chính

- Đã xây dựng đượ c qui trình xử lý mẫu bằng k ỹ thuật chiết pha r ắn vớ i cột

Oasis cho hiệu suất tốt từ 40 – 80% vớ i độ lă p lại cao (RSD < 8%).

- Đã khảo sát ,lựa chọn các ion mẹ, năng lượ ng bắn phá ion con và các ion con

đạt tiêu chuẩn về IP 4 điểm của Châu Âu 2002/657/EC

- Khảo sát đượ c các điều kiện về LC như: Cột Zobrax C18(150 mm x 4,6

mm; 5 µm)

- Chươ ng trình gradient pha động, thể tích tiêm mẫu 50 µl, tốc độ dòng là 0,5ml/phút

- Đã thẩm định đượ c phươ ng pháp LC/MS-MS vớ i độ chính xác cao:

+ Độ thích hợ p của hệ thống: độ thích hợ p về hệ thống giữa tỷ lệ về diện tích

pic kháng sinh và chuẩn nội cho độ lặ p lại cao vớ i RSD < 5%

+ Độ tuyến tính: phươ ng pháp có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa tỷ lệ diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội trong khoảng nồng độ khảo sát từ 1 – 70

ng/ml vớ i r > 0,99.

+Độ đặc hiệu: k ết quả thẩm định độ đặc hiệu cho thấy trên sắc ký đồ mẫu

tr ắng không thấy sự xuất hiện pic của kháng sinh và chuẩn nội, ngoài ra

phươ ng pháp còn cho thấy có thể phân tích đượ c đồng thờ i 3 kháng sinh trên

vớ i nhiều kháng sinh cephalosporin khác vớ i cùng đáp ứng.







+ Độ đúng và độ chính xác: Phươ ng pháp cho độ đúng tốt vớ i hiệu suất chiết

40 – 80% và độ chính xác cao RSD < 8%

+ Giá tr ị LOD và LOQ của mẫu tiêm thấ p: LOD từ 0,58 – 0,77 ng/ml, LOQ

từ 1,75 – 2,30 ng/ml, giá tr ị này còn thấ p hơ n nhiều khi đượ c k ết hợ p vớ i qui

trình làm giàu mẫu bằng chiết pha r ắn

- Đã ứng dụng thành công phươ ng pháp nghiên cứu để kiểm tra dư lượ ng

kháng sinh tại nhà máy công nghiệ p dượ c

3.2 K ết luận:

K ỹ thuật xử lý mẫu bằng chiết pha r ắn k ết hợ p vớ i sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

cho phép đánh giá dư lượ ng kháng sinh ở nồng độ ppb phù hợ p vớ i mục tiêu

của đề tài và có ý ngh ĩ a quan tr ọng trong việc đánh giá sự ô nhiễm môi tr ườ ng

tại các nguồn nướ c của nhà máy công nghiệ p dượ c.

Hà Nội 5/10/2014

Học Viên

Nguyễn Văn Thuận







PHỤ LỤC 1

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ THÍCH HỢ P CỦA HỆ THỐNG







PHỤ LỤC 2

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH







PHỤ LỤC 3

SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG ĐỘ CHÍNH XÁC CỦAPHƯƠ NG PHÁP







PHỤ LỤC 4

SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ CƠ SỞ SẢN XUẤT DƯỢ C M2







PHỤ LỤC 5

PHỔ ĐỒ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨ U







WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHONWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy...

Documents