nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và...

8/20/2019 Nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe

http://slidepdf.com/reader/full/nghien-cuu-xac-dinh-ham-luong-mot-so-chat-huu-co-trong 1/176

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Quang Hải

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNGMỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ TRONG DƯỢC PHẨM

VÀ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON - AMPE

Chuyên ngành: Hóa phân tíchMã số: 62 44 29 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:1.

GS.TS Từ Vọng Nghi2.

PGS.TS Dương Quang Phùng

HÀ NỘI - 2014

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong

bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

TRẦN QUANG HẢI





ii

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn

GS.TS Từ Vọng Nghi, cố PGS.TS Dương Quang Phùng đã tận tình hướng

dẫn, khích lệ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, PGS.TS Tạ Thị Thảo

và các quý thầy cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học trường Đại

học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG HN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá

trình thực hiện luận án.Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS ĐàoThị Phương Diệp, TS. Trần Công

Việt và các quý thầy cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học trường

Đại học Sư Phạm Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực

hiện luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Tổ chức – Hành chính,

Khoa Công nghệ Hóa học - Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội và các đồng

nghiệp đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện

luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc với bố, mẹ, gia đình và

các bạn gần xa đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này.

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2014

TRẦN QUANG HẢI





iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ii

MỤC LỤC ............................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................... vi

DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................. viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................xii

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 4

1.1.

ĐẠI CƯƠNG VỀ OFLOXACIN, METRONIDAZOL,

CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL ......................................... 4

1.1.1. Ofloxacin ............................................................................................ 4

1.1.2. Metronidazol ....................................................................................... 5

1.1.3. Clorpheniramin maleat ....................................................................... 7

1.1.4. Cefadroxil ........................................................................................... 9

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH OFLOXACIN,

METRONIDAZOL VÀ CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ

CEFADROXIL. ................................................................................................ 11

1.2.1. Các phương pháp xác định ofloxacin ............................................... 11

1.2.2. Các phương pháp xác định metronidazol ......................................... 13

1.2.3. Các phương pháp xác định clorpheniramin maleat .......................... 14

1.2.4. Các phương pháp xác định cefadroxil .............................................. 15

1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CỰC PHỔ VÀ VON-AMPE ............... 16

1.3.1. Cực phổ xung vi phân (Diffrerential Pulse Polarography – DPP) ... 17

1.3.2. Phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV) ........................... 18

1.4. XỬ LÝ MẪU .......................................................................................... 21

1.4.1. Mẫu thuốc ......................................................................................... 21

1.4.2. Mẫu nước tiểu ................................................................................... 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 24

2.1. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT ................................................... 24





iv

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 24

2.1.2. Hóa chất .............................................................................................. 25

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 27

2.2.1. Phân tích hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc ........................ 27

2.2.2. Phân tích hàm lượng các thuốc trong nước tiểu bệnh nhân ................ 28

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 28

2.3.1. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe vòng (CV) ......... 28

2.3.2. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân (DP) . 29

2.3.3. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xung vi phân hòa tan –hấp phụ (DP – AdSV) ................................................................................... 30

2.3.4. Tiến hành thí nghiệm theo kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) .................... 30

2.3.5. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc ........................... 30

2.3.6. Các bước khảo sát ............................................................................... 31

2.3.7. Xử lý mẫu ............................................................................................ 34

2.3.8. Xử lý số liệu ........................................................................................ 35

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 38

3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG

OFLOXACIN ................................................................................................... 38

3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin .............................. 38

3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp ....................... 45

3.1.3. Xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc. ............... 48

3.1.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu thuốc ..... 50

3.1.5. Nghiên cứu qui trình định lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu . 51

3.1.6. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu

nước tiểu ....................................................................................................... 63

3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL .......... 65

3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp ........................................................ 65






v

3.2.3. Xây dựng qui trình định lượng metronidazol trong các mẫu thuốc .... 75

3.2.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng metronidazol trong các

mẫu thuốc ..................................................................................................... 75

3.2.5. Nghiên cứu định lượng metronidazol trong mẫu nước tiểu ................ 77

3.3. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLORPHENIRAMIN

MALEAT .......................................................................................................... 79

3.3.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp ........................................................ 79


3.3.3. Xây dựng qui trình định lượng clorpheniramin maleat trongmẫu thuốc. .................................................................................................... 88

3.3.4. Áp dụng thực tế phân tích trong các mẫu thuốc ................................. 89

3.4. NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CEFADROXIL ..................................... 92

3.4.1. Nghiên cứu định lượng cefadroxil bằng phương pháp von – ampe

xung vi phân .................................................................................................. 92


hòa tan hấp phụ ........................................................................................... 105

KẾT LUẬN ........................................................................................................ 130

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 134

PHỤ LỤC





vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT

Viết tắt,

ký hiệu Tiếng Việt Tiếng Anh

1 ΔE Biên độ xung Pulse amplitude

2 SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extraction

3 I p Cường độ dòng pic Peak current

4 DC Dòng một chiều Direct current

5 BR Đệm vạn năng Britton-Robinson buffer

6 HMDE Điện cực giọt thủy ngân treo Hanging Mercury Drop Electrode7 RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation

8 R ev Độ thu hồi Recovery

9 LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantification

10 LOD Giới hạn phá hiện Limit of Detection

11 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liqid

Chromatography

12 LLC Sắc kí lỏng – lỏng Liquid – Liquid Chromatography

13 LC – MS Sắc kí lỏng – khối phổ Liquid Chromatography-Mass

Spectrometry

14 E p Thế đỉnh pic Peak potential

15 Eacc Thế tích lũy Accumulation potential

16 Tacc Thời gian tích lũy Accumulation time

17 Tcb Thời gian cân bằng Equilibration time18 ν Tốc độ quét thế Sweep rate

19 ASV Von-ampe hòa tan anot Anodic Stripping Voltammetry

20 CSV Von-ampe hòa tan catot Cathodic Stripping Voltammetry

21 AdSV Von-ampe hòa tan hấp phụ Adsorptive Stripping Voltammetry

22 CV Von-ampe vòng Cyclic Voltammetry

23 DP Xung vi phân Differential Pulse





vii

TTViết tắt,

ký hiệuTiếng Việt Tiếng Anh

24 DPP Cực phổ xung vi phân Differential Pulse Polarography

25 GCE Điện cực than gương Glassy Carbon Electrode

26 CPE Điện cực than mềm Carbon Past Electrode

27 WE Điện cực làm việc Working Electrode

28 AE Điện cực phù trợ Auxiliary Electrode

29 RE Điện cực so sánh Reference Electrode

30 SMDE Điện cực giọt thủy ngântĩnh

Stationary Mercury DropElectrode

31 GMP-

WHO

Thực hành sản xuất tốt- Tổ

chức Y tế thế giới

Good Manufacturing Practices –

World Health Oganization





viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Pha dung dịch đệm photphat theo Dược điển Việt Nam ............... 26Bảng 3.1: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào pH dung dịch nền .......... 40

Bảng 3.2: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào biên độ xung.................. 41

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung ......................................... 42

Bảng 3.4: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào tốc độ quét thế ............... 43

Bảng 3.5: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch ofloxacin ............... 45

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ

ofloxacin..................................................................................... 45

Bảng 3.7: Độ thu hồi của ofloxacin .............................................................. 47

Bảng 3.8: Độ lặp lại của ofloxacin ............................................................... 48

Bảng 3.9: Kết quả định lượng ofloxacin trong thuốc nhỏ mắt Ofloxacin

0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm

Traphaco..................................................................................... 50

Bảng 3.10: Kết quả định lượng ofloxacin trong viên nén Ofloxacin 200mgsản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm; ............... 51

Bảng 3.11: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi ........................................... 55

Bảng 3.12: Sự phụ thuộc I p vào thể tích dung môi ........................................ 56

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................... 56

Bảng 3.14: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ....................... 57

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................... 59

Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào I p. ..... 61

Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo .............. 62

Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước

tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 200mg. .......... 64

Bảng 3.19: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào pH dung dịch nền .. 67

Bảng 3.20: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào biên độ xung .......... 67

Bảng 3.21: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung ....................................... 68





ix

Bảng 3.22: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào tốc độ quét thế ....... 69

Bảng 3.23: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch metronidazol ....... 71


metronidazol ............................................................................... 71

Bảng 3.25: Độ thu hồi của metronidazol ...................................................... 73

Bảng 3.26: Độ lặp lại của metronidazol ........................................................ 74

Bảng 3.27: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Flagyl 250mg

viên nén bao film sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis

Việt Nam. ................................................................................... 76Bảng 3.28: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Metronidazole 250mg

viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây. ............. 76

Bảng 3.29: Sự phụ thuộc I p và E p của clorpheniramin maleat vào biên

độ xung ...................................................................................... 80

Bảng 3.30: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung ....................................... 81

Bảng 3.31: Sự phụ thuộc Ip và Ep của clorpheniramin maleat vào tốc độ

quét thế ...................................................................................... 82

Bảng 3.32: Sự phụ thuộc I p vào thời gian sục khí nitơ .................................. 83

Bảng 3.33: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch clorpheniramin maleat . 84


clorpheniramin maleat ................................................................ 85

Bảng 3.35: Độ thu hồi của clorpheniramin maleat ........................................ 86

Bảng 3.36: Độ lặp lại của clorpheniramin maleat ......................................... 87Bảng 3.37: Kết quả định lượng CPM trong viên nén Clorpheniramin 4

(4mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang ...... 89

Bảng 3.38: Kết quả định lượng CPM trong viên nang Pacemine (4mg

clorpheniramin maleat) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược

phẩm Hà Tây .............................................................................. 89

Bảng 3.39: Sự phụ thuộc I p vào nồng độ dung dịch nền NaOH .................... 94





x

Bảng 3.40: Sự phụ thuộc I p (nA) vào thời gian thủy phân ............................. 94

Bảng 3.41: Sự phụ thuộc I p (nA) vào nhiệt độ thủy phân .............................. 95

Bảng 3.42: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch cefadroxil ............. 99


cefadroxil ................................................................................... 99

Bảng 3.44: Độ thu hồi của cefadroxil ......................................................... 101

Bảng 3.45: Độ lặp lại của cefadroxil .......................................................... 102

Bảng 3.46: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500

mg) sản xuất tại Công ty TNHH MTV Dược phẩm và sinh họcy tế Mebiphar. .......................................................................... 104

Bảng 3.47: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500

mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm TW- Vidapha. .. 105

Bảng 3.48: Sự phụ thuộc I p (nA) vào thế tích lũy ....................................... 107

Bảng 3.49: Sự phụ thuộc I p (nA) vào thời gian tích lũy (tacc) ...................... 108

Bảng 3.50: Các điều kiện ghi đo dòng AdSV với dung dịch cefadroxil ..... 111


cefadroxil ................................................................................. 111

Bảng 3.52: Độ thu hồi cefadroxil theo phương pháp AdSV ........................ 113

Bảng 3.53: Độ lặp lại của cefadroxil (phương pháp AdSV) ........................ 114

Bảng 3.54: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang Ocefacel

(cefadroxil 500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm

Hà Tây ...................................................................................... 116Bảng 3.55: Kết quả định lượng cefadroxil trong thuốc bột Tytdroxil

(cefadroxil 250mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm

Glomed ..................................................................................... 117

Bảng 3.56: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi ......................................... 119

Bảng 3.57: Sự phụ thuộc I p vào thể tích dung môi ...................................... 120

Bảng 3.58: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi .................. 121





xi

Bảng 3.59: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ..................... 122

Bảng 3.60: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................. 123

Bảng 3.61: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu vào I p. .. 124

Bảng 3.62: Kết quả xác định cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo ........... 126

Bảng 3.63: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu

của bệnh nhân uống 1 gói thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg...... 127

Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước

tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 500mg. ........ 128





xii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin ..................................................... 4

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của metronidazol ............................................... 5

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của clorpheniramin maleat ................................ 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil .................................................... 9

Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn ........................................... 22

Hình 1.6: Vật liệu hấp phụ trong pha tĩnh cột HLB ...................................... 22

Hình 1.7. So sánh khả năng lưu giữ giữa cột C18 và cột Oasis® HLB ............ 23

Hình 3.1: Đường CV của ofloxacin 0,04mg/ml trong nền đệm photphat pH = 6,5 ..................................................................................... 39

Hình 3.2: Đường DP của ofloxacin 0,01mg/ml trong các nền đệm ............... 39

Hình 3.3: Đường DP của ofloxacin 3,0 µg/ml trong nền đệm photphat ở

các pH khác nhau ....................................................................... 40

Hình 3.4: Sự phụ thuộc I p vào pH ................................................................. 40

Hình 3.5: Đường DP của ofloxacin 3,0 µg/ml phụ thuộc vào biên độ xung .. 41

Hình 3.6: Sự phụ thuộc I p vào biên độ xung ................................................. 41

Hình 3.7: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào thời gian 1 xung ............. 42

Hình 3.8: Sự phụ thuộc I p vào thời gian 1 xung ............................................ 42

Hình 3.9: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào tốc độ quét thế................ 43

Hình 3.10: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic ............... 43

Hình 3.11: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào thời gian sục khí nitơ.... 44

Hình 3.12: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ ofloxacin ............................... 46Hình 3.13: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào nồng độ ....................... 46

Hình 3.14: Đường CV của 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 10 µg/ml. ......... 52

Hình 3.15: Đường DP của 1,0ml nước tiểu không chứa thuốc (1) và 1,0 ml

nước tiểu chứa ofloxacin 4 µg/ml (2). ......................................... 52

Hình 3.16: Sự phụ thuộc I p thể tích dung môi ............................................... 56

Hình 3.17: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi ..................... 56

Hình 3.18: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ........................ 57





xiii

Hình 3.19: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................... 59

Hình 3.20: Đường DP của dung dịch ofloxacin 4 µg/ml trong: ..................... 60

Hình 3.21: Sự phụ thuộc I p và nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu. ........ 62Hình 3.22: Đường AdSV của ofloxacin trong nước tiểu (mẫu tự tạo) ........... 62

Hình 3.23: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân

uống 2 viên ofloxacin 200mg theo thời gian ............................... 65

Hình 3.24: Đường CV của metronidazol trong nền đệm photphat ................ 66

Hình 3.25: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat: ................ 66

Hình 3.26: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat ở các pH

từ 3,5 đến 6,0 .............................................................................. 66

Hình 3.27: Đồ thị Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào pH dung

dịch nền ...................................................................................... 66

Hình 3.28: Sự phụ thuộc I p vào biên độ xung ............................................... 67

Hình 3.29: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào biên độ xung ................................. 67

Hình 3.30: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian 1 xung ..... 68

Hình 3.31: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt 1 xung .......................... 68Hình 3.32: Đường DP của metronidazol phụ thuộc tốc độ quét thế .............. 69

Hình 3.33: Sự phụ thuộc I p vào tốc độ quét thế ............................................. 69

Hình 3.34: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian sục khí

nitơ ............................................................................................. 70

Hình 3.35: Ảnh hưởng của thời gian sục khi nitơ đến cường độ dòng pic ..... 70

Hình 3.36: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ metronidazol .......................... 72

Hình 3.37: Đường DP của metronidazol ở các nồng độ ................................ 72

Hình 3.38: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc .. 78

Hình 3.39: Đường CV của clorpheniramin maleat 0,05mg/ml trong nền

đệm photphat pH = 4,60 ............................................................. 79

Hình 3.40: Đường DP của clorpheniramin maleat nền đệm photphat ở các

pH khác nhau .............................................................................. 79

Hình 3.41: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào pH của dung dịch nền ....................... 80





xiv


Hình 3.43: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào biên độ xung ..................................... 81

Hình 3.44: Đường DP của clorpheniramin maleat ở các thời gian đặt xungkhác nhau ................................................................................... 82

Hình 3.45: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt 1 xung .......................... 82

Hình 3.46: Đường DP của clorpheniramin maleat ở các tốc độ quét thế

khác nhau ................................................................................... 83

Hình 3.47: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào tốc độ quét thế .................................. 83

Hình 3.48: Đường DP của clorpheniramin maleat đo sau các thời gian sục

khí khác nhau ............................................................................... 84

Hình 3.49: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời gian sục khí nitơ ....................... 84

Hình 3.50: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ clorpheniramin maleat ........... 85

Hình 3.51: Đường DP của clorpheniramin maleat phụ thuộc vào nồng độ ... 85

Hình 3.52: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc .. 91

Hình 3.53: Đường CV của cefadroxil trong nền đệm photphat và nền

NaOH ......................................................................................... 92Hình 3.54: Đường DP của cefadroxil trong nền đệm photphat và nền

NaOH ......................................................................................... 92

Hình 3.55: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ dung dịch nền NaOH .................... 94

Hình 3.56: Đường DP của cefadroxil thủy phân trong dung dịch NaOH

0,16M ở các thời gian khác nhau ................................................ 94

Hình 3.57: Sự phụ thuộc I p (nA) vào thời gian thủy phân ............................. 95

Hình 3.58: Đường DP của cefadro xil thủy phân ở các nhiệt độ từ 30 đến

100oC .......................................................................................... 95

Hình 3.59: Sự phụ thuộc I p (nA) vào nhiệt độ thủy phân .............................. 96

Hình 3.60: Đường DP của cefadroxil phụ thuộc vào biên độ xung .............. 97


Hình 3.62: Đường DP của cefadroxil phụ thuộc vào tốc độ quét thế ............ 98

Hình 3.63: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic ............... 98





xv

Hình 3.64: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính I p vào nồng độ cefadroxil ......... 100

Hình 3.65: Đường DP của cefadroxil ở các nồng độ ................................... 100

Hình 3.66: Phổ CV của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s;60s; 90s; 150s; 180s. ................................................................. 106

Hình 3.67: Phổ DP của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s;

60s; 90s; 180s. .......................................................................... 106

Hình 3.68: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thế tích lũy

(Eacc ) ........................................................................................ 107

Hình 3.69: Sự phụ thuộc I p vào Eacc ............................................................ 107

Hình 3.70: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thời gian tích

lũy (tacc) .................................................................................... 108

Hình 3.71: Ảnh hưởng của thời gian tích lũy đến cường độ dòng pic ......... 108

Hình 3.72: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào tốc độ quét thế 109

Hình 3.73: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic ............. 109

Hình 3.74: Sự phụ thuộc I p vào nhiệt độ ..................................................... 110

Hình 3.75: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ dòng vào nồngđộ cefadroxil. ............................................................................ 112

Hình 3.76: Đường CSV của cefadroxil ở các nồng độ khác nhau ............... 112

Hình 3.77: Sự phụ thuộc I p thể tích dung môi ............................................. 120

Hình 3.78: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi ................... 121

Hình 3.79: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu ...................... 122

Hình 3.80: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi .................. 123

Hình 3.81: Sự phụ thuộc I p và nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu. ..... 125

Hình 3.82: Đường AdSV của cefadroxil trong nước tiểu (mẫu tự tạo) ........ 125

Hình 3.83: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân

uống 2 viên cefadroxil 250mg theo thời gian ............................ 127

Hình 3.84: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân

uống 2 viên cefadroxil 500mg theo thời gian ............................ 128





1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ dùng làm thuốc chữa

bệnh cho con người, trên thị trường Việt Nam cũng có hơn mười nghìn mặt

hàng thuốc. Theo sự phát triển của dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng

đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 7 năm 2009, cả nước có 171 doanh

nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh nghiệp sản xuất tân dược nhưng

chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP-WHO [15]. Sự phát triển các doanh

nghiệp sản xuất thuốc đã đặt ra yêu cầu công tác kiểm nghiệm thuốc phải theo

kịp sự phát triển. Đặc biệt, khi nhiều thuốc generic (thuốc tương đương trị

liệu với thuốc gốc khi thuốc gốc hết thời hạn bản quyền) cùng loại xuất hiện

và được các công ty Dược sản xuất và các nhà điều trị sử dụng thì thấy có một

số thuốc phiên bản này không cho tác dụng điều trị và hiệu quả lâm sàng

giống như biệt dược gốc. Một thuốc generic có thể tương đương bào chế (tức

là có cùng công thức, hàm lượng dược chất, cùng dạng bào chế, cùng cách

dùng, liều lượng) với biệt dược gốc nhưng lại không đạt được hiệu quả điềutrị như thuốc biệt dược gốc thể hiện. Để đạt độ tin cậy cần thiết trong thị

trường dược phẩm, một thuốc generic cần phải được chứng minh tính hiệu

quả và an toàn trong điều trị của nó bằng thử nghiệm chứng minh tương

đương sinh học (bioequivalence) với thuốc biệt dược gốc. Để chứng minh

tương đương sinh học phải tiến hành nhiều phép phân tích định lượng thuốc

trong các dịch sinh học của bệnh nhân để đánh giá mức độ, tốc độ hấp thu vàđào thải thuốc. Đây là các nghiên cứu tốn kém do phải định lượng nhiều mẫu

nên chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam.

Trong kiểm nghiệm dược phẩm và phân tích dược phẩm trong các mẫu

sinh học từ trước đến nay, phương pháp sử dụng để định lượng các hoạt chất

trong thuốc chủ yếu là nhóm các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, GC-

MS/MS, LC-MS/MS) và nhóm các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR…).





2

Dược điển Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC là phương pháp thường qui

để định lượng hoạt chất trong thuốc [1], ngoài ra có sử dụng các phương pháp

trắc quang, các phương pháp chuẩn độ…. Phương pháp HPLC có ưu điểm có

độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do

thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được. Phương pháp trắc

quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời

gian, tốn hóa chất làm mất chất phân tích và độ phân giải không cao. Vì vậy,

việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn

lọc, đơn giản, giá thành thấp, tốc độ hoàn thành nhanh có thể áp dụng rộng rãisong hành với các phương pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương

đương sinh học thuốc là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.

Nhóm các phương pháp điện hóa bao gồm cực phổ và von-ampe có thể

đáp ứng các yêu cầu đặt ra. Trên thế giới đã có một số công trình dùng

phương pháp von-ampe để định lượng các chế phẩm thuốc, dịch sinh học và

một số lĩnh vực khác. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy có rất nhiềudược phẩm có hoạt tính điện hóa. Máy phân tích điện hóa đa năng được ưa

chuộng ở Việt Nam vì ít tiền hơn các máy phân tích quang phổ và sắc ký, chi

phí phân tích cũng rẻ hơn. Hiện nay, tại Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam,

phòng thí nghiệm của nhóm GS.TS. Lê Quốc Hùng và các cộng sự đã chế tạo

được máy phân tích điện hóa đa chức năng có độ chính xác không kém máy

nhập ngoại mà giá thành rẻ hơn rất nhiều.Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp von-ampe còn ít được nghiên cứu

ứng dụng trong phân tích các hợp chất hữu cơ đặc biệt là trong lĩnh vực phân

tích dược phẩm. Thực hiện đề tài "Nghiên cứu xác định hàm lượng một số

chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe."

nhằm đánh giá khả năng áp dụng phương pháp von-ampe để phân tích hoạt chất

có tác dụng chữa bệnh trong các chế phẩm thuốc và dịch sinh học ở Việt Nam.





3

Đề tài chọn các kháng sinh cefadroxil (họ cephalosporin), ofloxacin (họ

quinolon), thuốc kháng virut metronidazol và thuốc kháng histamin

clorpheniramin maleat là các thuốc đang được sử dụng rất phổ biến ở nước ta.

Mục tiêu của đề tài đặt ra là: Xây dựng và đề xuất các qui trình phân tích

bằng Von-Ampe để xác định các thuốc kháng sinh và kháng histamin trong

dược phẩm và nước tiểu. Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi triển khai các

nội dung thực nghiệm sau:

1. Khảo sát xây dựng qui trình phân tích hàm lượng một số kháng

sinh đang được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh bao gồm:Ofloxacin (kháng sinh nhóm quinolon); metronidazol (kháng virut);

clorpheniramin maleat (kháng histamin); cefadroxil (kháng sinh nhóm

cephalosporin).

2. Phân tích hàm lượng một số kháng sinh trong chế phẩm thuốc

đang được bán trên thị trường Việt nam.

3. Khảo sát xây dựng qui trình phân tích hàm lượng thuốc trongnước tiểu bệnh nhân.

4. Phân tích hàm lượng thuốc trong nước tiểu một số bệnh nhân.





4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ OFLOXACIN, METRONIDAZOL,

CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL

1.1.1. Ofloxacin

Ofloxacin là (RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10-

oxo-4-oxa-1-azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-11-

carboxylic acid. Là kháng sinh nhóm quinonol thế hệ thứ hai. [1, 2, 5, 53]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin

Ofloxacin có dạng tinh thể hình kim không màu, ít tan trong nước và

etanol [1, 5]. Trong công thức cấu tạo ofloxacin có khung quinolon, nhân

quinon, có tính axit yếu với pK a1 = 5,8; pK a2 = 7,8 [31]. Hoạt tính điện hóa có

thể gây ra bởi nhóm COOH hoặc các nguyên tử N. Theo Gerong Zhou, trong

môi trường axit yếu có thể xảy ra phản ứng điện hóa [95]:

Ofloxacin là thuốc kháng khuẩn nhóm fluoroquinolon giống như

ciprofloxacin, nhưng ofloxacin khi uống có khả dụng sinh học cao hơn (trên

95%). Ofloxacin được dùng trong các bệnh [3]:

N

O

N

N

F

OO

OH + 2e + H+

N

O

N

N

F

OO

OH

H





5

+ Viêm phế quản nặng do vi khuẩn, viêm phổi,

+ Nhiễm khuẩn Chlamydia tại cổ tử cung hoặc niệu đạo có hoặc không

kèm lậu, lậu không biến chứng, viêm tuyến tiền liệt, viêm đường tiết niệu.

+ Nhiễm khuẩn da và mô mềm.

+ Viêm đại tràng do nhiễm khuẩn.

Ofloxacin được hấp thu nhanh và tốt qua đường tiêu hóa. Khả dụng

sinh học qua đường uống khoảng 100% và có nồng độ đỉnh huyết tương

khoảng 3 - 4 µg/ml, trong 1 - 2 giờ sau khi uống 400 mg. Hấp thu bị chậm lại

khi có thức ăn nhưng tỷ lệ hấp thu không bị ảnh hưởng. Nửa đời trong huyếttương là 5 - 8 giờ; trong trường hợp suy thận, có khi kéo dài 15 - 60 giờ tùy

theo mức độ suy thận [2, 3].

Thận là nơi thải ofloxacin chính, thuốc được lọc qua cầu thận và bài tiết

qua ống thận. 75 - 80% thuốc được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng không

chuyển hóa trong 24 đến 48 giờ, làm nồng độ thuốc cao trong nước tiểu. Dưới

5% thuốc được bài tiết dưới dạng chuyển hóa trong nước tiểu; 4 đến 8% thuốc bài tiết qua phân.

1.1.2. Metronidazol

Metronidazol có tên theo IUPAC là 2-(2-methyl-5-nitroimidazol-1-

yl)ethanol [1, 5], công thức cấu tạo được biểu diễn trên hình 1.2:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của metronidazol

Metrodinazol có dạng tinh thể hoặc bột kết tinh trắng hơi vàng, không

mùi, bền trong không khí nhưng bị sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng.

Metronidazol ít tan trong nước, axeton, rất khó tan trong ete [1, 5].

N

N

CH2 - CH2 - OH

O2 N CH3





6

Metronidazol có tính chất của nhân imidazol và của nhóm nitro thơm.

Nhóm nitro trong phân tử metronidazole có tính chất tương tự như nitro trên

vòng benzene, có tính chất điện hóa. Hoạt tính điện hóa của metronidazol trên

điện cực giọt thủy ngân được A.M Bret dự đoán xảy ra quá trình khử nhóm

nitro [29]:

Metrodinazol là thuốc kháng virus chống lại vi khuẩn kị khí và kí sinh

trùng theo cách ức chế chọn lọc một số chức nǎng tế bào ở vi khuẩn làm cho

chúng bị chết.

Metronidazol có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như

amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí. Cơ chế tác dụng của metronidazol còn

chưa thật rõ. Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml

hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy

cảm. Nồng độ tối thiểu ức chế các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml.

Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống, đạt

nồng độ trong huyết tương khoảng 10 µg/ml khoảng 1 giờ sau khi uống 500

mg. Nửa đời của metronidazol trong huyết tương khoảng 8 giờ. Metronidazolchuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và axit, thải trừ

qua nước tiểu một phần dưới dạng glucuronid.

Nửa đời thải trừ trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ. Nửa đời

của chất chuyển hóa hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ ở người bệnh có chức năng

thận bình thường. Trên 80% liều uống được thải trừ qua thận trong 24 giờ,

chủ yếu là các chất chuyển hóa. Dưới 10% thải trừ dưới dạng chất mẹ.

+ 6e + 6H+

N

N

CH2 - CH2 - OH

O2 N CH3 N

N

CH2 - CH2 - OH

H2 N CH3

+ 2 H2O





7

Khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân. Ở người bệnh bị suy thận, nửa đời

của chất mẹ không thay đổi, nhưng nửa đời của chất chuyển hóa hydroxy kéo

dài gấp 4 đến 17 lần. Chuyển hóa metronidazol có thể bị ảnh hưởng nhiều khi

bị suy gan nặng. Metronidazol có thể loại khỏi cơ thể có hiệu quả bằng thẩm

tách máu [3].

1.1.3. Clorpheniramin maleat

Clorpheniramin maleat có tên theo IUPAC là 3 – (4 – clorophenyl) – N,

N-dimety-3-pyridin-2-yl-propan-1-amin. Công thức cấu tạo được biểu diễn

trên hình 1.6 [1, 5, 53]:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của clorpheniramin maleat

Clorpheniramin maleat có dạng bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng,

dễ tan trong nước, tan được trong etanol, cloroform [1, 5, 53].

Trong thành phần của clorpheniramin maleat có hai hợp phần:

clorpheniramin và axit maleic, có liên kết đôi C=C, nhóm này có thể có hoạt

tính điện hóa. E. Jacobsen [46] đề nghị phản ứng điện cực như sau:

Clorpheniramin maleat là thuốc kháng histamin thế hệ 1.

Clorpheniramin maleat được sử dụng với liều 2 hoặc 4 mg trong chế phẩm

đơn thành phần hoặc phối hợp với các thành phần khác như paracetamol,

Cl

N

N

COOH

CH

COOH

CH.

R. + 2H+ + 2e → R.CHCOOH

CHCOOH

CH2COOH

CH2COOH





8

pseudoephedrin, phenylephrin, phenylpropalamin, dextromethorphan trong

chế phẩm đa thành phần.

Clorpheniramin là một kháng histamin có rất ít tác dụng an thần. Như

hầu hết các kháng histamin khác, clorpheniramin cũng có tác dụng phụ chống

tiết acetylcholin, nhưng tác dụng này khác nhau nhiều giữa các cá thể.

Tác dụng kháng histamin của clorpheniramin thông qua phong bế cạnh

tranh các thụ thể H1 của các tế bào tác động.

Clorpheniramin maleat được dùng để điều trị viêm mũi dị ứng mùa và

quanh năm và những triệu chứng dị ứng khác như: mày đay, viêm mũi vận

mạch do histamin, viêm kết mạc dị ứng, viêm da tiếp xúc, phù mạch, dị ứng

thức ăn, phản ứng huyết thanh; côn trùng đốt; ngứa ở người bệnh bị sởi hoặc

thủy đậu. Hiện nay, clorpheniramin maleat thường được phối hợp trong một

số chế phẩm bán trên thị trường để điều trị triệu chứng ho và cảm lạnh. Tuy

nhiên, thuốc không có tác dụng trong điều trị triệu chứng nhiễm virus.

Clorpheniramin maleat hấp thu tốt khi uống và xuất hiện trong huyếttương trong vòng 30 - 60 phút. Nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong

khoảng 2,5 đến 6 giờ sau khi uống. Khoảng 70% thuốc trong tuần hoàn liên

kết với protein. Clorpheniramin maleat chuyển hóa nhanh và nhiều. Các chất

chuyển hóa gồm có desmethyl - didesmethyl- clorpheniramin và một số chất

chưa được xác định, một hoặc nhiều chất trong số đó có hoạt tính. Nồng độ

clorpheniramin trong huyết thanh không tương quan đúng với tác dụng khánghistamin vì còn một chất chuyển hóa chưa xác định cũng có tác dụng.

Thuốc được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng không đổi hoặc

chuyển hóa, sự bài tiết phụ thuộc vào pH và lưu lượng nước tiểu. Chỉ một

lượng nhỏ được thấy trong phân. Thời gian bán thải là 12 - 15 giờ và ở người

bệnh suy thận mạn, kéo dài tới 280 - 330 giờ. Một số viên nén clorpheniramin

được bào chế dưới dạng tác dụng kéo dài, dưới dạng viên nén 2 lớp. Lớp





9

ngoài được hòa tan và hấp thu giống như viên nén thông thường. Lớp trong

chỉ được hấp thu sau 4 - 6 giờ. Tác dụng của những viên nén kéo dài bằng tác

dụng của hai viên nén thông thường, uống cách nhau khoảng 6 giờ [3].

1.1.4. Cefadroxil

Cefadroxil là (6R,7R)-7-{[(2R)-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino}-3-

methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid monohydrat.

Cefadroxil là cephalosporin nhóm ba thế hệ thứ nhất, là kháng sinh dùng theo

đường uống có phổ kháng khuẩn tương tự cefalexin [1, 3, 5, 53].

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil

Cefadroxil có cả tính chất axit gây ra bởi nhóm cacboxyl (pK a1 = 4,5)và nhóm phenol (pK a2 = 10) và tính bazơ gây ra bởi nhóm amin, tùy pH của

môi trường có thể tồn tại ở dạng phân tử hoặc ion [65].

Các cephalosporin có điểm chung về cấu trúc là gồm một vòng amit

bốn cạnh azetidin-2- on (còn được gọi là vòng -lactam) gắn với một dị vòng

sáu cạnh. Với cấu trúc như vậy, các cephalosporin có đặc điểm chung là khá

bền vững trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm do mở

vòng -lactam. Vòng -lactam nhạy cảm với sự tấn công của tác nhân ái nhân

(A N) tạo ra các dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính kháng sinh.

SH H

COOHCH3O

HO

H2

HO





10

Trong môi trường kiềm cefadroxil bị thủy phân mở vòng lactam tạo ra

các sản phẩm:

Sản phẩm thủy phân của cefadroxil trong môi trường kiềm có phản

ứng như những chất khử cực. Quá trình khử trên điện cực giọt thủy ngân có

thể xảy ra ở các liên kết đôi C = C hoặc C = N, tuy nhiên dễ xảy ra ở lên

kết C = N hơn.

*Ghi chú: R 1 là (HO-C6H5-); R 2 là (CH3-)

Cefadroxil có tác dụng diệt khuẩn, ngăn cản sự phát triển và phân chia

của vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Cefadroxil có

tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm.

R 2

O

HN

C

HCR 1 NH

CH

C

O

CH = N C = C CH2

COO-

SH

O

HN

C

HCR 1 NH

CHC

O

CH2 NH

R 2

C = C CH2

COO-

SH + 2 HO

-

+ 2e + 2 H2O

N

S N

COOHR 2O

O

NH2

CCR 1H H

HN

S N

COO-

R 2O=

O

NH2

CCR 1 CH

O-

C

H H

to

OH-

to

OH-

HN

S

COO-

R 2

O

HN

C

HCR 1 NH

CH

CO

to

OH-R 2

O

HN

C

HCR 1 NH

CH

CO

CH = N C = C CH2

COO-

SH





11

Cefadroxil được chỉ định trong điều trị các nhiễm khuẩn thể nhẹ và

trung bình do các vi khuẩn nhạy cảm [2, 3]:

+ Nhiễm khuẩn đường tiết niệu

+ Nhiễm khuẩn đường hô hấp

+ Nhiễm khuẩn da và mô mềm

+ Các nhiễm khuẩn khác: Viêm xương tủy, viêm khớp nhiễm khuẩn.

Cefadroxil bền vững trong axit và được hấp thụ rất tốt ở đường tiêu

hóa. Với liều uống 500 mg hoặc 1000mg, nồng độ đỉnh trong huyết tương

tương ứng với khoảng 16 và 30 µg/ml, đạt được sau 1 giờ 30 phút đến 2 giờ.

Thức ăn không làm thay đổi sự hấp thụ thuốc. Nửa đời của thuốc trong huyết

tương là khoảng 1 giờ 30 phút ở người chức năng thận bình thường; thời gian

này kéo dài trong khoảng từ 14 đến 20 giờ ở người suy thận.

Thuốc không bị chuyển hóa. Hơn 90% liều sử dụng thải trừ trong nước

tiểu ở dạng không đổi trong vòng 24 giờ qua lọc cầu thận và bài tiết ở ống

thận. Do đó, với liều uống 500 mg, nồng độ đỉnh của cefadroxil trong nước

tiểu lớn hơn 1 mg/ml. Sau khi dùng liều 1000mg, nồng độ kháng sinh trong

nước tiểu giữ được 20 - 22 giờ trên mức nồng độ ức chế tối thiểu cho những

vi khuẩn gây bệnh đường niệu nhạy cảm.

1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH OFLOXACIN, METRONIDAZOL

VÀ CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL.

Ofloxacin, metrodinazol, clorpheniramin maleat và cefadroxil có thểđược xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp trắc

quang, phương pháp sắc ký, phương pháp điện hóa, phương pháp chuẩn độ

oxi hóa khử. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng.

1.2.1. Các phương pháp xác định ofloxacin

Theo Dược điển Việt Nam 4, xác định ofloxacin bằng phương pháp

HPLC với thành phần pha động: Hỗn hợp dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, -





12

acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20). Cột thép không gỉ (25 cm x

4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C -18 (5 m), nhiệt độ cột: duy trì ở 35 oC, detector

quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 294 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích

tiêm: 20 l [1].

Dược điển Anh định lượng ofloxacin theo phương pháp chuẩn độ điện

thế bằng axit pecloric 0,1M, 1,0 ml dung dịch axit pecloric tương đương

36,14 mg ofloxacin [30].

Tamer Ayla đã xác định ofloxacin theo phương pháp von-ampe hòa tan

với điện cực làm việc là HMDE trong nền đệm Britton- Robinson pH 6,00,

khoảng tuyến tính từ 0,079 đến 197,5 µg/ml [78].

Chan Kwok Ping đã xác định đồng thời ofloxacin và moxifloxacin và

sự xâm nhập của chúng vào trong thủy dịch và thủy tinh thể bằng phương

pháp HPLC với detecter huỳnh quang, khoảng tuyến tính từ 10 ng/ml đến 100

µg/ml, giới hạn phát hiện là 10 ng/ml [33].

Rao Yi đã sử dụng phương pháp FIA xác định ofloxacin trong dược phẩm với khoảng tuyến tính từ 0,04 đến 4 µg/ml, giới hạn phát hiện

0,016 µg/ml [66].

Ambrosi Adriano và các cộng sự đã xác định ofloxacin bằng phương

pháp von-ampe xung vi phân trong nền NaClO4 0,2M, điện cực giọt thủy

ngân tĩnh, giới hạn phát hiện 5,2µM [23].

Zhou Gerong đã xác định ofloxacin bằng phương pháp cực phổ xungthường điện cực thủy ngân tĩnh trong nền đệm Britton-Robinson pH = 4,0,

khoảng tuyến tính 8.10-4 M đến 2.10-5 M, giới hạn phát hiện 4.10-6 M [95].

Nhìn chung các nghiên cứu định lượng ofloxacin và kháng sinh nhóm

floquinolon trong dược phẩm và các đối tượng khác thường theo phương

pháp HPLC [20, 34, 54, 56, 61, 73, 85, 89, 93…]





13

1.2.2. Các phương pháp xác định metronidazol

Theo Dược điển Việt Nam, xác định metronidazol bằng phương pháp

trắc quang, bước sóng hấp thụ cực đại 277 nm, cuvet dày 1 cm, dùng dung

dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) làm mẫu trắng [1].

Dược điển Anh định lượng metronidazol theo phương pháp chuẩn độ

điện thế bằng axit pecloric 0,1M, 1,0 ml dung dịch axit pecloric tương đương

17,12 mg metronidazol [30].

Gholivand Mohammad Bagher đã xây dựng phương pháp xác định

metronidazol bằng phương pháp von-ampe hòa tan catot trên điện cực cacbon

nhão phủ màng polime, nền đệm Britton-Robinson pH = 7,0. Giới phát hiện

của phương pháp là 3,59.10-5 mg/l [40].

Bollo đã nghiên cứu tính chất điện hóa của metronidazol bằng phương

pháp von-ampe vòng trong dung dịch hỗn hợp (dimetylfomandehit +

amonixitrat 60 : 40, KCl 0,3M) cho thấy với điện cực HMDE và GCE có sóng

khử tại -1,090 V và -1,082 V [28].

Brett đã nghiên cứu xác định metronidazol bằng phương pháp von-ampe

xung vi phân với điện cực GC biến tính trong đệm axetat pH = 4,5, giới hạn

phát hiện là 3,44 µM [29].

Nhóm tác giả Trương Thị Nguyệt, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Nguyễn

Kim Xuân đã định lượng đồng thời metronidazol, cloramphenicol và

dexamesanthon acetat bằng phương pháp HPLC [12]

Ngoài ra, trên thế giới đã có khá nhiều nghiên cứu tính chất điện hóa và

định lượng metronidazol và các dẫn chất của 5-nitroimidazole bằng phương

pháp điện hóa [26, 40, 41, 47, 49, 55, 59, 62, 67, 81, 88…].

Các nghiên cứu trong nước về định lượng metronidazol ít và chỉ tập

trung theo phương pháp HPLC [1, 12].





14

1.2.3. Các phương pháp xác định clorpheniramin maleat

Theo Dược điển Việt Nam 4, xác định clorpheniramin maleat bằng

phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại, bước sóng 265 nm, cuvet dày

1 cm, dùng dung dịch H2SO4 0,25 M làm mẫu trắng [1].

Dược điển Anh định lượng clorpheniramin maleat bằng phương pháp

chuẩn độ điện thế bằng dung dịch HClO4 0,1M. 0,1 ml dung dịch HClO4

0,1M tương đương 19,54 mg C16H19ClN2.C4H4O4 [30].

Einar Jacobsen và Knut Hbgberg đã nghiên cứu định lượng

clorpheniramin maleat trong chế phẩm bằng phương pháp cực phổ trong nền

H2SO4 0,25M cho sóng cực phổ tại -0,7V [45].

Leena Suntornsuk và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng

clorpheniramin maleat và paracetamol bằng phương pháp HPLC, giới hạn

định lượng là 4 µg/ml [76].

Abdolraouf Samadi – Maybodi đã nghiên cứu xác định clorpheniraminmaleat bằng phương pháp huỳnh quang, giới hạn phát hiện 0,18µg/ml. [69]

Một số tác giả khác: Indrayanto Gunawan [45], García A. [39],

Nevin Erk [37] tiến hành nghiên cứu định lượng clorpheniramin bằng

phương pháp HPLC trong một số chế phẩm thuốc đạt giới hạn định lượng

từ 0,16 đến 2,9 µg/ml.

Bùi Tùng Hiệp, Vũ Khanh đã định lượng chất chuyển hóa củaclorpheniramin trong nước tiểu bằng phương pháp HPLC [43].

Theo một nghiên cứu mới được công bố năm 2012, Amiri M. đã nghiên

cứu phương pháp von-ampe vòng và xung vi phân dùng điện cực than mềm

biến tính định lượng clorpheniramin trong chế phẩm đơn thành phần trên máy

Metrohm 797 VA cho giới hạn phát hiện cỡ 8,0.10-7M [24].





15

1.2.4. Các phương pháp xác định cefadroxil

Theo Dược điển Việt Nam 4, hàm lượng cefadroxil được xác định bằng

phương pháp HPLC với thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril: đệm

photphat pH 5,0 (4 : 96). Cột thép không gỉ (25 cm x 4 mm) được nhồi pha

tĩnh C-18 (5 m hoặc 10 m), detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng

230 nm. Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm: 10 l [1].

Theo dược điển Anh 2007, hàm lượng cefadroxil xác định bằng

phương pháp HPLC với thành phần pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch

dihidrophotphat 2,72 g/l (4:96). Cột thép không gỉ (25cm x 4,6mm) nhồi pha

tĩnh C-18 (5 m), detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm. Tốc

độ dòng: 1,0 ml/phút. Thể tích tiêm: 20 l [30]

Papadoyannis đã xác định bốn kháng sinh họ cephalosporin trong dược

phẩm và dịch sinh học bằng phương pháp HPLC detector quang phổ tử ngoại

đặt ở bước sóng 265 nm. Giới hạn phát hiện đối với cefadroxil và cefaclor là

0,01 µg/ml và 0,005 µg/ml.

Ch. Aswani Kumar và các cộng sự đã xác định cefadroxil theo phương

pháp trắc quang dựa vào phản ứng của cefadroxil với 1, 2-naphthoquinone-4-

sulphonate trong môi trường NaOH tạo thành phức chất màu vàng hấp thụ

cực đại tại 475 nm, giới hạn phát hiện là 10 µg/ml [25].

M. Hefnawy và các cộng sự đã xác định cefadroxil và cefaclor trong

dược phẩm và dịch sinh học bằng phương pháp huỳnh quang, giới hạn pháthiện là 5ng/ml [42].

Mrestania Yahya đã xác định 9 kháng sinh họ cephalosporin trong nước

tiểu bằng phương pháp điện di mao quản vùng với đệm xitrat pH = 6,0, giới

hạn phát hiện cefadroxil 5,0 µg/ml; cefaclor 4,0 µg/ml [60].

Trên thế giới đã có nghiên cứu định lượng cefadroxil và các kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện hóa [21, 38, 45, 68, 71, 92], nhưng





16

chủ yếu là các nghiên cứu định lượng bằng các phương pháp HPLC, FIA,

điện di mao quản… [22, 25, 36, 50, 51, 52, 62, 65, 70, 76, 79, 82, 83…].

Trong nước, có nhóm các tác giả Phùng Thế Đồng, Trần tử An đã có

các nghiên cứu định lượng cephalexin - một chất trong họ cephalosporin bằng

kỹ thuật sóng vuông quét nhanh [6]. Trong một nghiên cứu mới được công

bố, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Chương Huyến và Nguyễn Thị Kim

Thường ở Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã định lượng

cephalexin- bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân, giới

hạn phát hiện 4,8.10-9M [8].

1.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CỰC PHỔ VÀ VON-AMPE

Nhóm các phương pháp phân tích cực phổ và von-ampe là những

phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa.

Các phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, khảo sát

sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế đặt lên điện cực làm việc

trong quá trình điện phân dung dịch phân tích. Phương pháp cực phổ(Polarography) được nhà Hóa học người Sec Jaroslav Hevrovský phát minh ra

năm 1922. Với phát minh này năm 1959 ông đã được tặng giải thưởng Nobel

về hóa học. Hạn chế của phương pháp cực phổ (cổ điển) chính là sự xuất hiện

dòng tụ điện sinh ra trên điện cực giọt thủy ngân, dòng này có cường độ

tương ứng dòng điện gây ra bởi chất điện hoạt với nồng độ khoảng 10 -5M nên

giới hạn định lượng của cực phổ cổ điển là 10-5

M. Hevrovský, Ilkovic và cácnhà Điện hóa đã phát minh ra các phương pháp cực phổ hiện đại như: cực phổ

sóng vuông; cực phổ xung. Các phương pháp này đã đạt giới hạn định lượng

cỡ 10-7 – n.10-8M [9, 10, 13]. Đối với các hợp chất hữu cơ, thường có đặc tính

điện hóa bất thuận nghịch. Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên

cứu về định lượng các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp điện hóa và có

nhiều thành công [68, 71, 75, 84].





17

Vì vậy, trong luận án chúng tôi chọn phương pháp cực phổ xung vi

phân và von-ampe hòa tan hấp phụ để tiến hành định lượng các dược phẩm.

1.3.1. Cực phổ xung vi phân (Diffrerential Pulse Polarography – DPP)

Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng điện

áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm. Ở cuối mỗi chu kỳ giọt,

trên khung điện áp biến đổi người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên

độ thay đổi từ 10 – 100mV, độ dài xung từ 40 – 100ms. Ghi dòng tại hai thời

điểm, thường là 17ms trước khi nạp xung và 17ms trước khi ngắt xung, tại

thời điểm này được xem là dòng tụ điện nhỏ nhất, hai giá trị này được gửi vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Dạng đường cực

phổ có dạng một cực đại. Phương pháp DPP có độ nhạy khoảng 10-7 – 10-8M.

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

I = K.C (1.1)

Trong đó:

Với: n : số e trao đổi trong phản ứng điện cực

F : hằng số Faraday

S : là diện tích bề mặt điện cực

D : hệ số khuếch tán

tx : thời gian một xung

(1.2)

(1.3)

DE : biên độ xung

E1/2

: thế bán sóng





18

1.3.2. Phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV)

1.3.2.1. Nguyên tắc

Nguyên tắc phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ giống như

phương pháp von-ampe hòa tan. Quá trình phân tích theo phương pháp

von-ampe hòa tan hấp phụ cũng gồm ba giai đoạn: Giai đoạn làm giàu, giai

đoạn dừng và giai đoạn hòa tan. Điểm khác biệt căn bản của phương pháp

von am-pe hòa tan hấp phụ với phương pháp von-ampe hòa tan là quá trình

làm giàu. Chất phân tích được hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc (WE)

và được làm giàu. Trong giai đoạn này, thế trên WE được giữ không đổi vàdung dịch phân tích được khuấy trộn đều. Kết thúc giai đoạn này, ngừng

khuấy để dung dịch yên tĩnh trong khoảng 15 – 30 s. Trong giai đoạn hòa

tan, tiến hành quét thế catot để khử các tiểu phân điện hoạt trên bề mặt WE

và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan Iht (dòng hòa tan) và Eht (thế hòa tan).

Trong đó, Iht = f(E), E là thế trên WE. Khi ghi tín hiệu hòa tan có thể sử

dụng một kỹ thuật von – ampe hòa tan nào đó, chẳng hạn von – ampe xung

vi phân, von – ampe sóng vuông,...Thông thường AdSV có thể thực hiện được trên hết các loại điện cực:

HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), than thủy tinh (GC), điện cực graphit

ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hóa học. Tuy nhiên hầu hết các nghiên

cứu sử dụng điện cực HMDE vì điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt dễ

làm sạch, độ lặp lại cao, dễ tự động hóa [7, 9, 10].

1.3.2.2. Giai đoạn làm giàu

Chất phân tích được tích lũy bằng cách hấp phụ lên ranh giới tiếp xúc

dung dịch – điện cực làm việc. Có ba kiểu hấp phụ đặc trưng đó là hấp phụ

theo kiểu điện hóa, hấp phụ do ái lực hóa học và hấp phụ đẳng nhiệt.

Một số hợp chất hữu cơ có nhóm chức có khả năng hấp phụ lên bề mặt

điện cực tại thế xác định (hấp phụ do ái lực hóa học). Đây là một trong những

đối tượng nghiên cứu mới của phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ được

áp dụng để phân tích các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong dược phẩm.





19

1.3.2.3. Giai đoạn dừng

Sau giai đoạn làm giàu ngừng khuấy để dung dịch yên tĩnh trong

khoảng 10 – 30 s để chất phân tích phân bố đều trên bề mặt điện cực và

chuyển dung dịch từ trạng thái động sang trạng thái tĩnh cho kết quả ghi dòng

ổn định hơn.

1.3.2.4. Giai đoạn hòa tan

Giai đoạn này hoàn toàn giống với giai đoạn hòa tan trong phương

pháp von-ampe hòa tan thông thường, tức là quét thế tuyến tính theo thời gian

theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điệncực làm việc và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe hòa

tan, khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe hòa tan catot.

Ngược lại, nếu quét thế theo chiều anot, tức là theo chiều thế dương

dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa

tan bằng kỹ thuật von-ampe. Khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe

hòa tan anot.

Trong phương pháp AdSV, tín hiệu thu được có dạng pic. Tín hiệu

von-ampe hòa tan tỉ lệ thuận với nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện

cực làm việc theo phương trình:

Q = n.F.S.C0

Trong đó, Q (C) là điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã

được hấp phụ, n là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng

cộng, F là hằng số Faraday, S (cm2) là diện tích bề mặt điện cực, C0 (mol/cm2) là nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện cực [9].

Với tốc độ quét thế xác định, dòng pic hoà tan (I p) tỉ lệ thuận với Q, với

S và C0. Khi các điều kiện hấp phụ được lặp lại, C0 tỉ lệ thuận với nồng độ

chất phân tích trong dung dịch (C), nên I p tỉ lệ thuận với S và C. Vì vậy, với

một chất nghiên cứu, một loại điện cực, diện tích điện cực, đặc tính bề mặt

điện cực lặp lại thì cường độ dòng I p = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm,





20

phụ thuộc vào các điều kiện thực nghiệm: điều kiện tích lũy, điều kiện hòa tan

và bản chất của dung dịch chất nghiên cứu.

Thế đỉnh pic hòa tan (E p) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (I p) phụ thuộc

vào các yếu tố như: thành phần nền, pH, thế tích lũy, thời gian tích lũy, bản

chất của điện cực làm việc, kỹ thuật ghi dòng hòa tan. Trong các điều kiện

xác định E p đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích nên dùng

trong phân tích định tính, I p tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích nên

dùng trong phân tích định lượng.

Ngoài những ưu điểm giống như phương pháp ASV, phương phápAdSV còn có những ưu điểm sau:

- Cho phép xác định đồng thời nhiều ion kim loại ở những nồng độ vết

hoặc siêu vết.

- Đạt được độ chọn lọc cao vì có thể lựa chọn phối tử tạo phức bền và

chọn lọc với ion kim loại cần phân tích. Phương pháp AdSV đạt được giới

hạn phát hiện rất nhỏ, khoảng 10

–9

10

–11

M, hoặc 10

-12

M.- Phương pháp AdSV có qui trình phân tích đơn giản: không có giai

đoạn chiết, tách hoặc trao đổi ion và do đó, tránh được sự nhiễm bẩn mẫu

hoặc mất chất phân tích, giảm thiểu được sai số. Mặt khác, có thể loại trừ

được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí

nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, thế điện phân làm giàu, ảnh

hưởng của các chất khác...

- Xác định được gần 60 ion kim loại và hơn 200 hợp chất hữu cơ.

- Phương pháp AdSV đặc biệt có ưu điểm trong phân tích các chất hữu

cơ, dược phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp

phụ trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân và các chất không có hoạt tính điện

hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể xác định bằng cách gắn với các

nhóm như nitro, nitroso… hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính

điện hóa.





21

- Dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được các bài toán

liên quan đến quá trình điện cực, cơ chế của phản ứng xảy ra trên điện cực.

1.4. XỬ LÝ MẪU

1.4.1. Mẫu thuốc

Các mẫu thuốc chuẩn và các chế phẩm thuốc được rung siêu âm hòa

tan trong nước cất với các nồng độ thích hợp để khảo sát các điều kiện và

định lượng.

1.4.2. Mẫu nước tiểu

Mẫu nước tiểu có thành phần phức tạp, gồm 95 - 96% là nước và một ítchất khô. Trong nước tiểu có chứa nhiều chất hóa học như urê, axit uric,

creatinin, natri, kali, lưu huỳnh, photphat, sulfat, NaCl, Flo, Chì, và một số

hoocmon…., khá nhiều thuốc sau khi đi vào cơ thể được thanh thải dưới dạng

không chuyển hóa hoặc dạng chuyển hóa qua cầu thận vào nước tiểu. Người

bình thường không mắc chứng suy thận, một ngày đêm thải ra khoảng 1 – 1,5 lít

nước tiểu. Các chất trong nước tiểu có thể gây kìm hãm phản ứng điện cực, vì

vậy cần phải tách, xử lý mẫu trước khi phân tích.

Trong phân tích các mẫu sinh học thông thường có 3 phương pháp xử

lý mẫu là phương pháp tạo kết tủa, phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương

pháp chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn) [19, 52].

* Chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE)

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu vàlàm sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột chiết pha

rắn, sau đó chất phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích

hợp. Ưu điểm của phương pháp SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm

sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, lượng dung môi sử dụng ít. [19].

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước chính như sau:





22

Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn

Hiện nay, kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được sử dụng khá nhiều để tách

và làm giàu chất phân tích. Chiết pha rắn phù hợp để xử lý các mẫu môi

trường, mẫu thuốc, mẫu lâm sàng [14, 80]. Vật liệu hấp thu trong chiết pha

rắn hiện nay được cải thiện rất nhiều trong cột chiết Oasis HLB. Vật liệu hấp

thu được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon cótính ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước.

Hình 1.6: Vật liệu hấp phụ trong pha tĩnh cột HLB

Mẫu

phân tích

Bơm mẫuqua cột

Rửa các chấtảnh hưởng

Rửa giải ch t phân tích

Các chất ảnh hưởng

Hoạt hóa cột





23

Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là

1,3cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao

(810m2/g). Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra

các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích

phân cực cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm

việc trong khoảng pH rộng.

Hình 1.7. So sánh khả năng lưu giữ giữa cột C18 và cột Oasis® HLB

Qua tham khảo các tài liệu, hiện nay chưa có tài liệu nào công bố qui

trình xử lý mẫu nước tiểu để xác định cefadroxil, và ofloxacin theo phương

pháp von-ampe xung vi phân và von –ampe hòa tan hấp phụ. Theo Dược điển

Việt Nam, cefadroxil được định lượng bằng phương pháp HPLC, cột C-18,

thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril: đệm photphat pH 5,0 (4 : 96).

Ofloxacin được xác định bằng phương pháp HPLC với cột C-18, thành phần

pha động là dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic

băng (580 : 400 : 20) [1]. Đây là các căn cứ quan trọng để khảo sát các điều

kiện xử lý mẫu theo phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB.





24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1. Thiết bị, dụng cụ

1. Máy cực phổ đa năng:

Các phép đo đều được làm việc trên máy cực phổ đa năng 757 và

797VA Computrace do hãng Metrohm (Thụy Sĩ) sản xuất gồm:

- Các điện cực:

+ Điện cực làm việc (WE): Điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE)+ Điện cực so sánh (RE): Ag|AgCl||Cl-; điện cực luôn được bảo quản

trong dung dịch KCl bão hòa.

+ Điện cực phù trợ (AE): Điện cực Pt

- Bình điện phân: Bình điện phân có dung tích 50ml, được chế tạo từ

thuỷ tinh thạch anh. Nắp bình có cấu tạo thích hợp để dẫn khí trơ (N2) đuổi

oxi hoà tan trong dung dịch đo và có một môtơ nhỏ gắn với que khuấy đểkhuấy trộn đều dung dịch đo.

2. Máy đo pH – Meter HM 16S của Nhật Bản

3. Cân phân tích Scientech SA 210 – Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 gam

4. Máy cất nước hai lần WSC/4D của hãng Haminton – Anh

5. Bể điều nhiệt Memmert của Đức

6. Các dụng cụ thủy tinh: Các loại pipet, micropipet, bình định mức,cốc đong, ống đong... đều của Đức sản xuất. (Các dụng cụ đều được rửa sạch

bằng dung dịch HNO3 và hỗn hợp rửa K 2Cr 2O7 và H2SO4 đặc sau đó tráng lại

nhiều lần bằng nước cất hai lần).

7. Các micropipet cho phép lấy dung dịch từ 10µl đến 5000µl.

8. Thiết bị chiết pha rắn và cột chiết pha rắn Oasis HLB Extraction

Cartridge do hãng Water – Mỹ sản xuất, với các thông số:





25

Diện tích bề mặt 804 (m2/g)

Đường kính mao quản trung bình 83 (Å)

Tổng dung lượng mao quản 1,31 (cm3/g)

Kích thước hạt trung bình 29,3 µm

Dung tích cột 6ml

Khối lượng chất nhồi cột 200mg

2.1.2. Hóa chất

- Nước cất được sử dụng là nước cất hai lần trên máy Halminton

- Tất cả các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết

phân tích (PA)

- Các chất chuẩn metronidazol; cefadroxil; ofloxacin; clorpheniramin

maleat là chất chuẩn tinh khiết do Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp.

Dung dịch gốc chuẩn ofloxacin: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn

ofloxacin, hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.

Dung dịch gốc chuẩn clopheniramin maleat: Cân chính xác 50,0mg

chất chuẩn clopheniramin maleat, hòa tan bằng nước cất rồi đến 1000ml, siêu

âm 15 phút.

Dung dịch gốc chuẩn cefadroxil: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn

cefadroxil, hòa tan bằng nước cất rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml,

siêu âm 15 phút.

- Các dung dịch phân tích được pha hàng ngày từ dung dịch chuẩn gốc.

- Các dung dịch đệm pha theo Dược điển Việt Nam 4 [1]:

Dung dịch đệm Britton-Robinson (BR) pH từ 2 đến 12 [1]

- Pha dung dịch H3PO4 0,1M: Lấy 2,8 ml H3PO4 đậm đặc pha loãng và

định mức bằng nước cất đến 500ml.





26

- Pha dung dịch CH3COOH 0,1M: Lấy 3,0 ml CH3COOH băng pha

loãng và định mức bằng nước cất đến 500ml.

- Pha H3BO3 0,1M: Lấy 3,1 gam H3BO3 khan hòa tan và định mức bằng

nước cất đến 500ml.

- Trộn H3PO4 0,1M, CH3COOH 0,1M, H3BO3 0,1M (1:1:1) được hỗn

hợp đệm Britton-Robinson (BR). Dùng CH3COOH đặc và NaOH 50%

để điều chỉnh pH. Kiểm tra bằng máy đo pH.

Dung dịch đệm photphat:[1]

- Pha dung dịch kalidihidrophotphat 0,1M: Cân 13,61 gam KH2PO4 hòa

tan rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml.

- Pha dung dịch NaOH 0,1M: Cân 4,00 gam NaOH khan hòa tan, pha

loãng bằng nước cất thành 1000ml.

Các đệm photphat chuẩn pH từ 5,8 đến 8,0 được pha bằng cách trộn 50

ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,1 M với lượng dung dịch natri hydroxyd

0,1 M như chỉ dẫn trong bảng 2.1 [1] và thêm nước vừa đủ 100 ml.

Bảng 2.1: Pha dung dịch đệm photphat theo Dược điển Việt Nam

pH Số ml dung dịch NaOH

0,1 N

pH Số ml dung dịch

NaOH 0,1 N

5,8 3,72 7,0 29,63

6,0 5,70 7,2 35,00

6,2 8,60 7,4 39,50

6,4 12,60 7,6 42,80

6,6 17,80 7,8 45,20

6,8 23,65 8,0 46,80





27

Dung dịch đệm axetat:

Dung dịch đệm acetat pH 4,4: Hoà tan 136 g natri acetat (TT) và 77 g

amoni acetat (TT) trong nước, thêm nước vừa đủ 1000 ml. Thêm 250 ml

acid acetic băng (TT), trộn đều.

Dung dịch đệm acetat pH 4,6: Hoà tan 5,4 g natri acetat (TT) trong 50

ml nước, thêm 2,4 g acid acetic băng (TT) và thêm nước vừa đủ 100 ml. Điều

chỉnh pH nếu cần.

Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 13,6 g natri acetat (TT) và 6 ml

acid acetic băng (TT) trong nước và thêm nước vừa đủ 1000 ml.

Dung dịch đệm acetat pH 6,0: Hoà tan 100 g amoni acetat (TT) trong

300 ml nước, thêm 4,1 ml acid acetic băng (TT). Nếu cần, điều chỉnh pH

bằng dung dịch amoniac 10 M (TT) hay dung dịch acid acetic 5 M (TT), thêm

nước vừa đủ 500 ml.

2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phân tích hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc

Gồm các chế phẩm thuốc chứa các hoạt chất kháng sinh, kháng virut

hiện đang lưu thông trên thị trường Việt Nam:

2.2.1.1. Thuốc chứa ofloxacin

1. Thuốc viên nén Ofloxacin 200mg sản xuất tại Công ty Cổ phần

Dược phẩm Imexpharm; (Số lô SX: 020512).

2. Thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ

phần Traphaco (Số lô SX: 290811).

2.2.1.2. Thuốc chứa metronidazol

1. Thuốc viên nén bao film Flagyl 250mg sản xuất tại Công ty TNHH

Sanofi – Avantis Việt Nam. Số lô SX: 230911.





28

2. Thuốc viên nén Metrodinazole 250mg sản xuất tại Công ty Cổ phần

Dược phẩm Hà Tây. Số lô SX: 290412.

2.2.1.3. Thuốc chứa clorpheniramin maleat

1. Thuốc Pacemin viên nang (paracetamol 325mg; clorpheniramin

maleat 4mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây. Số lô SX:

121110.

2. Thuốc Clorpheniramin 4mg viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần

Dược phẩm Hậu Giang. Số lô SX: 021210.

2.2.1.4. Các thuốc chứa cefadroxil:

1. Thuốc viên nang Ocefacel (cefadroxil 500mg) sản xuất tại Công ty

Cổ phần Dược Hà Tây.

2. Thuốc viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty TNHH

MTV Dược phẩm và sinh học y tế Mebiphar

3. Thuốc viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần

Dược phẩm TW- Vidapha.4. Thuốc bột Tytdroxil (cefadroxil 250mg) sản xuất tại Công ty Cổ

phần Dược phẩm Glomed.

2.2.2. Phân tích hàm lượng các thuốc trong nước tiểu bệnh nhân

Nước tiểu của các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện 354, Bệnh viện

Thanh Nhàn - Hà Nội và phòng khám tư nhân tại huyện Hoài Đức – Hà Nội.

Các bệnh nhân đều không mắc chứng suy thận.2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe vòng (CV)

Các thí nghiệm đo đường von-ampe vòng được ghi trong một khoảng

thế rộng, xác định giá trị I p và E p của tín hiệu thu được.

- Ghi đường CV trực tiếp: Cho dung dịch cần nghiên cứu vào bình

điện phân, loại khí oxi bằng khí nitơ trong thời gian 300s, ghi đường hòa





29

tan một vòng trong khoảng thế xác định, quan sát sự xuất hiện pic trên

đường phân cực catot và đường phân cực anot, xác định các thông số đặc

trưng của đường CV.

- Ghi đường CV hòa tan hấp phụ:

Bước 1: Tích lũy chất trên bề mặt điện cực tại một thế tích lũy trong

một khoảng thời gian nhất định. Trong giai đoạn này dung dịch được khấy với

tốc độ không đổi, chất nghiên cứu đến bề mặt điện cực, hấp phụ trên bề mặt

điện cực đó.

Bước 2: Cân bằng: ngừng khuấy dung dịch trong 10s để chất phân bố

đều trên bề mặt điện cực.

Bước 3: Hòa tan: ghi đường hòa tan một vòng hoặc đa vòng trong một

khoảng thế nhất định. Quan sát sự xuất hiện pic trên đường phân cực catot và

đường phân cực anot. Xác định các giá trị đặc trưng như thế đỉnh pic, cường

độ dòng pic.

Đường CV của mẫu trắng (nền) là mẫu có thành phần tương tự như

dung dịch nghiên cứu nhưng không chứa chất nghiên cứu được ghi trong cùng

điều kiện với đường CV của các mẫu phân tích và được ghi trước bất kỳ

nghiên cứu nào.

2.3.2. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân (DP)

Bước 1: Loại bỏ khí oxi, sục khí nitơ vào dung dịch trong bình điện hóa

để đuổi khí oxi trong khoảng thời gian nhất định (từ 60s – 180s) trong thời

gian này dung dịch được khuấy đều bởi que khuấy.

Bước 2: Cân bằng, dung dịch sau khi loại bỏ khí oxi, ngừng khuấy

dung dịch trong 10s để ổn định dung dịch và bề mặt điện cực.

Bước 3: Ghi đo dòng xung vi phân trong một khoảng thế nhất định,

quan sát và ghi các giá trị thế đỉnh pic, cường độ dòng pic.





30

2.3.3. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xung vi phân hòa tan –

hấp phụ (DP – AdSV)

Bước 1: Loại bỏ khí oxi và tích lũy chất trên bề mặt điện cực: sục khí

nitơ vào dung dịch trong bình điện hóa để đuổi khí oxi tại thế tích lũy và thời

gian tích lũy thích hợp (đã được khảo sát trước để lựa chọn) trong thời gian

này dung dịch được khuấy đều bởi que khuấy.

Bước 2: Cân bằng, dung dịch sau khi loại bỏ khí oxi, ngừng khuấy

dung dịch trong 10s để ổn định dung dịch và bề mặt điện cực.

Bước 3: Ghi đo dòng xung vi phân trong một khoảng thế nhất định,quan sát và ghi các giá trị thế đỉnh pic, cường độ dòng pic.

2.3.4. Tiến hành thí nghiệm theo kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)

Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) thường được sử dụng cho chất phân tích

trong các đối tượng mẫu sinh học [75]. Cột chiết pha rắn HLB với pha tĩnh

kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước (hydrophilic-

lypophilic water-wettable revered phase) đã được áp dụng rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu nói riêng.

Cột chiết được sử dụng trong luận án là cột chiết HLB Oasis loại 6ml,

chứa 200mg chất hấp thu là sản phẩm trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng

nhau là N-vinylpyrolidon và divinylbenzen. Trước khi tiến hành chiết hoạt

hóa cột bằng 4 ml metanol khoảng 30 phút sau đó rửa cột bằng nước cất hai lần.

2.3.5. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc

Sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Sử dụng phần mềm Excel và Origin

8.0 để vẽ đồ thị, thiết lập phương trình đường thêm chuẩn theo phương pháp

hồi qui tuyến tính dạng y = a + bx.

Từ đó tính Cx theo công thức: Cx = b

a

Với: Cx - nồng độ hoạt chất có trong dung dịch đo

a, b - hệ số phương trình hồi quy.





31

Tính khối lượng hoạt chất có trong a (mg) mẫu cân ban đầu:

m = V Cx F 10-3 (mg)

Trong đó:

m - khối lượng chất phân tích có trong g (mg) mẫu

V - thể tích dung dịch được pha từ g (mg)

F - hệ số pha loãng

Cx - nồng độ của hoạt chất xác định từ phương trình hồi quy

Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả ghi trên nhãn:

C% = 100m

mmn

ni

Trong đó: mi là khối lượng xác định theo phương pháp phân tích

mn là khối lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc

2.3.6. Các bước khảo sát

2.3.6.1. Khảo sát thành phần và pH dung dịch nền

Khảo sát thành phần và pH của dung dịch nền rất quan trọng quyết định

đến kết quả phân tích. Trong dung dịch điện phân để giảm sự điện di và sự

ảnh hưởng của dòng tụ điện người ta cần cho thêm lượng dư chất điện li trơ

vào dung dịch. Chất điện li thường dùng là: KCl; KNO3; NH4Cl; NaOH; HCl.

pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến thế đỉnh và cường độ dòng khuếch tán

giới hạn. Khi thay đổi pH của dung dịch đo, thế đỉnh pic có thể dịch chuyển

về phía âm hơn hoặc dương hơn tùy vào phản ứng điện cực. Trong luận án

chúng tôi đã lựa chọn khảo sát các dung dịch nền NaOH; đệm photphat; đệm

axetat; đệm Britton-Robinson ở các pH từ 2 đến 13 cho các thuốc.

Lấy chính xác một thể tích thuốc chuẩn có nồng độ nhất định cho vào

bình định mức 25 ml, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm 8 – 10 ml

dung dịch đệm, định mức đến vạch. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình điện

phân. Tiến hành ghi đo dòng khuếch tán bằng phương pháp von-ampe xung vi

phân và von-ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ.





32

2.3.6.2. Khảo sát điều kiện thủy phân cefadroxil

* Khảo sát nồng độ NaOH: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng

độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích

khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V = 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0;

6,0 ml), đun cách thủy 60 phút ở nhiệt độ 100oC, lấy ra chuyển vào bình định

mức 25 ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung

dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung

vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ.

* Khảo thời gian thủy phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng

độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích

khoảng 5 ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V là giá trị tốt nhất đã tìm

được từ thí nghiệm trên), đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian t (từ

5 đến 60 phút), lấy ra chuyển vào bình định mức 25,00ml, định mức bằng

nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến

hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan

hấp phụ.

* Khảo sát nhiệt độ thuỷ phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có

nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể

tích khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M, đun cách thủy ở các

nhiệt độ từ 30 đến 100oC, chuyển dung dịch vào bình định mức 25ml, định

mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điệnhóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-

ampe hòa tan hấp phụ.

2.3.6.3. Nghiên cứu cơ bản

Các thông số khảo sát:

- Khoảng quét thế: Khảng quét thế có thể xác định dựa vào phổ CV

của chất điện hoạt. Khoảng quét thế không ảnh hưởng nhiều đến thế đỉnh





33

pic và cường độ dòng pic nhưng cần quét thể trong khoảng thế phù hợp

sao cho lấy hết chân pic, không cần quá dài làm mất thời gian ghi đo

không cần thiết.

- Tốc độ quét thế: Tốc độ quét thế phụ thuộc vào bước nhảy thế, trong

phương pháp von-ampe xung vi phân tốc độ quét thế thường từ 5 đến 20

mV/s, tương ứng với bước nhảy thế từ 2 đến 8 mV. Tốc độ quét càng cao thì

ghi dòng càng nhanh nhưng cũng ảnh hưởng đến cường độ dòng hòa tan và

độ nhạy của phép đo.

- Biên độ xung: Thường từ 10 đến 80 mV, biên độ xung càng cao chiều

cao pic càng lớn nhưng lại làm chân pic rộng, giảm độ phân giải.

- Thời gian đuổi khi oxi: Oxi hòa tan trong nước ảnh hưởng đến quá

trình phân tích các chất hữu cơ trong nước do ảnh hưởng đến chất lượng

đường khuếch tán thậm chí có thể phản ứng với chất phân tích làm giảm nồng

độ của chất phân tích. Vì vậy trước khi đo cần thiết phải đuổi oxi khỏi nền.

Trong phương pháp von-ampe loại bỏ oxi hòa tan trong nước bằng cách sục

khí nito vào dung dịch, thời gian sục khí được chọn khi không có sự ảnh

hưởng đến dòng pic.

- Thế tích lũy Eacc: Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ thế

tích lũy (làm giàu) là thông số quan trọng. Cần tìm được thế tích lũy phù hợp

để chất hấp phụ lên điện cực lớn nhất trong cùng một khoảng thời gian, khi đó

dòng hòa tan sẽ có giá trị lớn nhất, tăng độ nhạy của phép phân tích. Với các

hợp chất hữu cơ một số tác giả thường chọn thế khoảng – 0,4V.

- Thời gian tích lũy tacc: Thời gian tích lũy càng nhiều thì chất hấp phụ

lên điện cực càng lớn làm cường độ dòng hòa tan tăng, nhưng đến một giá trị

nhất định cường độ dòng hòa tan sẽ bão hòa. Tùy thuộc nồng độ chất phân

tích và yêu cầu phân tích mà có thể chọn thời gian tích lũy phù hợp.





34

2.3.7. Xử lý mẫu

Đối với chế phẩm ofloxacin:

Dung dịch gốc thử:

+ Đối với thuốc viên: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung

bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa

khoảng 50,0mg ofloxacin, hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100ml, siêu

âm 15 phút.

+ Thuốc nhỏ mắt: lấy 5 lọ thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml)

đổ dồn vào một lọ nhựa sạch, xác định thể tích trung bình của 1 lọ, lắc trộnkỹ. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch

(dung dịch 1). Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức

25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2A, dung dịch này có

nồng độ tương ứng khoảng 0,3 mg/ml).

Đối với chế phẩm metronidazole

Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bìnhcủa 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng

50,0mg metronidazole, hòa tan bằng khoảng 20ml axit axetic 0,1N rồi dùng

nước cất định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.

Đối với chế phẩm clopheniramin maleat

Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình

của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều.Với chế phẩm đơn thành phần chứa clopheniramin maleat: Cân chính

xác lượng thuốc chứa khoảng 40,0mg clopheniramin maleat, hòa tan bằng

nước, cất rồi định mức đến 1000ml, siêu âm 15 phút.

Với chế phẩm hai thành phần (chứa clopheniramin maleat và

paracetamol): Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 4,0mg clopheniramin

maleat, hòa tan bằng nước cất rồi định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.





35

Đối với chế phẩm cefadroxil

Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung

bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa

khoảng 50,0mg cefadroxil, hòa tan bằng nước cất rồi định mức đến 1000ml,

siêu âm 15 phút.

Trong các mẫu thuốc viên có các tá dược. Để loại bỏ ảnh hưởng của

các tá dược trong phân tích mẫu thuốc chúng tôi định lượng bằng phương

pháp thêm chuẩn.

Trong các mẫu nước tiểu chứa thuốc đem phân tích chứa nhiều tạpchất cần xử lý triệt để bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE).

2.3.8. Xử lý số liệu

Để áp dụng phép phân tích vào thực tế cần phải đánh giá độ tin cậy của

phương pháp. Các đại lượng thống kê dùng để đánh giá độ tin cậy của phương

pháp phân tích gồm: độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD),

giới hạn định lượng (LOQ). [11, 16, 17].2.3.8.1. Độ lặp lại

Độ lặp lại là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị

riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương

pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn.

Độ lặp lại xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Khi độ lệch

chuẩn tương đối nhỏ thì phép phân tích có độ lặp lại tốt hay sai số của phép phân tích nhỏ.

2.3.8.2. Độ đúng

Độ đúng là mức độ gần nhau của kết quả phân tích với giá trị thực (hay

giá trị đã được chấp nhận) µ. Độ đúng của phép phân tích được đánh giá

thông qua việc phân tích mẫu chuẩn. Phương pháp phân tích có độ đúng tốt

khi kết quả xác định được nằm trong khoảng tin cậy của giá trị thực µ ± ε





36

(được thông báo trong chứng chỉ của mẫu chuẩn) hoặc có thể so sánh kết quả

xác định được với giá trị thực theo chuẩn student (t).

Ngoài ra có thể đánh giá độ đúng thông qua việc phân tích mẫu thêm

chuẩn rồi tính độ thu hồi R ev.

2.3.8.3. Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của

mẫu trắng hay tín hiệu nền [16, 17]

Tức là: yL = B B S k y .

Với B y là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau n b thí nghiệm. SB là độ

lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lượng số học được chọn theo độ tin

cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì k ≈3

bn

BjB j 1B

1y

n

B

2 21B Bi Bn 1

i 1S (y y )

Như vậy nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện được

theo phương trình hồi qui dạng y = a + bx trong phương pháp đường chuẩn

được tính theo công thức: B BL

3.S ax

b

Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khi không có chất phân tích thì

không đo được tín hiệu nên có thể thay mẫu trắng bằng mẫu thêm chuẩn bằng

cách thêm một lượng biết trước chất phân tích ở nồng độ nhỏ nhất có thể ghi

tín hiệu vào nền mẫu thực, sau đó đo tín hiệu phân tích và cũng tính độ lệch

chuẩn tương tự như trên.

Trường hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem như độ lệch

chuẩn mẫu trắng SB đúng bằng sai số của phương trình hồi qui, tức là SB = Sy

và tín hiệu khi phân tích mẫu nền yB = a. Khi đó tín hiệu thu được ứng với





37

nồng độ phát hiện YLOD = a+ 3Sy. Sau đó dùng phương trình hồi qui có thể tìm

được LOD [17].

LOD=b

S y.3

2.3.8.4. Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ

thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa

định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền [16,17].

yQ = B y + K. SB Thông thường LOQ được tính với K = 10 tức là

B10.SLOQ

b

2.3.8.5. Giới hạn tuyến tính

Trong phân tích định lượng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị

nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ

thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân

tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến

tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn

tuyến tính gọi là khoảng tuyến tính hay khoảng động học .





38

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG OFLOXACIN

3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin

Khảo sát chọn thành phần và pH dung dịch nền

Khảo sát thành phần và pH của dung dịch nền rất quan trọng quyết định

đến kết quả phân tích. Trong dung dịch điện phân để giảm sự điện di người ta

cần cho thêm lượng dư chất điện li trơ vào dung dịch. Chất điện li thường

dùng là: KCl; KNO3; NH4Cl; NaOH; HCl; các dung dịch đệm như photphat,axetat, Britton-Robinson… pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến thế đỉnh và

cường độ dòng khuếch tán giới hạn. Khi thay đổi pH của dung dịch đo, thế

đỉnh pic có thể dịch chuyển về phía âm hơn hoặc dương hơn tùy vào phản ứng

điện cực.

Tiến hành ghi đo đường von-ampe vòng trên một khoảng thế rộng,

quan sát sự xuất hiện pic trên đường catot và anot để xác định đặc tính trênđiện cực của ofloxacin và khoảng quét thế phù hợp. Từ kết quả thu nhận được

của quá trình ghi đường CV, tiến hành ghi đường DP của thuốc trong khoảng

thế hẹp sao cho lấy hết chân pic mà không cần quá dài mất thời gian ghi đo

không cần thiết.

Tiến hành đo trực tiếp von-ampe vòng dung dịch ofloxacin nồng độ

0,04mg/ml trong các dung dịch nền ở các pH khác nhau trong khoảng thế -0,8V đến -1,6V, thấy trong nền đệm axetat; đệm Britton-Robinson; đệm

photphat pH từ 3 đến 10 xuất hiện pic trên đường catot trong khoảng thế từ -

1,0 đến -1,5V. Đường CV của dung dịch ofloxacin cho thấy quá trình điện

hóa trên điện cực thủy ngân là bất thuận nghịch.

Tiến hành ghi đường DP của dung dịch ofloxacin 0,01mg/ml trong các

nền đệm axetat; đệm Britton-Robinson; đệm photphat ở pH = 6,5 trong





39

khoảng từ -1,0 đến -1,5V. Kết quả trên hình 3.2 cho thấy trong nền đệm

photphat pic cao và cân đối hơn đệm Britton-Robinson và đệm axetat, vì vậy

chọn nền đệm photphat.

-800m -1.00 -1.20 -1.40 -1.60

U (V)

-500n

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.1: Đường CV của ofloxacin

0,04mg/ml trong nền đệm photphat

pH = 6,5

-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50

U (V)

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.2: Đường DP của ofloxacin0,01mg/ml trong các nền đệm

1. nền đệm axetat pH = 6,5

2. nền đệm Britton-Robinson pH = 6,5

3. nền đệm photphat pH = 6,5 (ĐKTN: sục khí 120s; biên độ xung: 0,05V; thời gian 1 xung: 0,04s; tốc độ

quét thế: 12,5mV/s)

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ dòng của dung dịch

ofloxacin 3,0 µg/ml vào pH của dung dịch nền, trong nền đệm photphat pH từ

4,0 đến 8,5. Kết quả cho thấy, ở pH thấp pic nhọn nhưng không cân đối, khi

pH tăng lên thế đỉnh pic dịch chuyển về phía âm hơn pic roãng, cường độ

giảm. Cụ thể, ở pH < 6,0 cho pic nhọn nhưng lệch chân, điều này có thể làm

giảm độ chính xác khi tiến hành định lượng, khi pH tăng lên, pic cân đối hơn

nhưng roãng rộng và giảm cường độ dòng gây bất lợi cho độ chọn lọc và độ

nhạy của phép phân tích. Ở pH từ 6,5 đến 7,0 pic gọn và cân đối vì vậy, chọn

điều kiện dung dịch nền photphat pH = 6,5 cho các thí nghiệm tiếp theo.

1

2 3





40

-1.20 -1. 30 -1.40

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

50.0n

I ( A )

Hình 3.3: Đường DP của

ofloxacin 3,0 µg/ml trong nềnđệm photphat ở các pH khác

nhau

4

14

24

34

44

54

64

7484

94

3 5 7 9

pH

I p ( n A )

Hình 3.4: Sự phụ thuộc I p vào pH

(ĐKTN: sục khí 120s; biên độ xung: 0,05V; thời gian 1 xung: 0,04s; tốc độ

quét thế: 12,5mV/s)Bảng 3.1: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào pH dung dịch nền

pH 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5

- I p (nA) 73,1 67,3 70,4 77,5 82,1 82,1 81,8 76,9 56,6

- E p (V) 1,25 1,28 1,29 1,30 1,31 1,31 1,32 1,36 1,39

Ảnh hưởng của biên độ xung

Trong phân tích điện hóa để hạn chế dòng tụ điện người ta đặt 1 xungvuông góc với khung điện áp biến thiên với biên độ thay đổi trong khoảng 10

mV đến 100mV. Để khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung, tiến hành ghi

đường DP của dung dịch ofloxacin 3,0 µg/ml trong khoảng biên độ xung từ

10mV đến 100mV. Kết quả trình bày trong bảng 3.2, hình 3.5 và hình 3.6.

pH = 6,5

pH tăng từ 4,0 đến 8,5





41

Bảng 3.2: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào biên độ xung

ΔEA(mV) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

- I p (nA) 29,9 45,6 56,6 67,8 79,3 88,4 95,0 103 105 107

- E p (V) 1,34 1,34 1,33 1,32 1,31 1,31 1.30 1,30 1,29 1,28

Khi tăng biên độ xung, I p tăng nhưng chân pic cũng bị lệch hơn, thế

đỉnh pic dịch về phía dương hơn. Với biên độ xung trên 60mV, khi tăng biên

độ xung, I p tăng không nhiều nhưng độ lệch chân pic tăng nhanh, vì vậykhông nên chọn biên độ xung lớn hơn 60mV. Trong luận án, chúng tôi chọn

điều kiện đo với biên độ xung là 50 mV, cường độ dòng pic cao và ổn định.

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.5: Đường DP củaofloxacin 3,0 µg/ml phụ thuộc

vào biên độ xung

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100 120

Biên độ xung (mV)

I p ( n A )

Hình 3.6: Sự phụ thuộc I p vào biên độ xung

(ĐKTN: sục khí 120s; thời gian 1 xung: 0,04s; tốc độ quét thế: 12,5mV/s)

Ảnh hưởng của thời gian 1 xung

Thời gian đặt 1 xung ảnh hưởng rất rõ đến chiều cao pic. Thời gian đặt

1 xung càng nhỏ thì chiều cao pic càng cao, tuy nhiên pic lại mất cân đối, độ

lặp kém làm phép phân tích mất chính xác. Vì vậy khảo sát ảnh hưởng của





42

thời gian 1 xung là rất cần thiết. Trong kỹ thuật von-ampe thường đặt thời

gian 1 xung từ 0,03 đến 0,06s.

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian 1 xung đến cường độ dòng

của dung dịch ofloxacin 3,0µg/ml, thời gian đặt 1 xung từ 0,02 đến 0,1s. Kết

quả trình bày trong bảng 3.3; hình 3.7 và 3.8.

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung

tđặt xung (s) 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10

- I p (nA) 125 95,4 80,5 69,8 55,6 48,1 44,7 40,9 36,7

- E p (V) 1,33 1,33 1,33 1,32 1,32 1,31 1,31 1,31 1,31

Kết quả khảo sát cho thấy ở điều kiện thời gian đặt 1 xung nhỏ hơn

0,03 s pic cao nhưng chân pic lệch. Khi tăng thời gian đặt xung pic thấp hơn,

thế đỉnh pic lệch về phía dương hơn nhưng cân đối. Chọn điều kiện thời gian

đặt xung là 0,04s.

-1. 10 -1. 20 -1. 30 -1. 40 -1. 50

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

Hình 3.7: Đường DP củaofloxacin phụ thuộc vào

thời gian 1 xung

Khảo sát thời gian 1 xung

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

Thời gian (giây)

I p ( n A )

Hình 3.8: Sự phụ thuộc I p vào thời gian 1 xung

(ĐKTN: sục khí 120s; biên độ xung: 50mV; tốc độ quét thế: 12,5mV/s)

Ảnh hưởng của tốc độ quét thế

Tốc độ quét thế phụ thuộc vào bước nhảy thế và thời gian một bước

nhảy thế. Trong phương pháp von-ampe xung vi phân tốc độ quét thế thường





43

từ 10 đến 25 mV/s. Tốc độ quét càng cao thì ghi dòng càng nhanh nhưng cũng

ảnh hưởng đến cường độ dòng hòa tan và độ nhạy của phép đo.

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng von- ampe

xung vi phân với dung dịch ofloxacin 3,0µg/ml. Kết quả được trình bày trên

bảng 3.4, hình 3.9 và hình 3.10.

Bảng 3.4: Sự phụ thuộc I p và E p của ofloxacin vào tốc độ quét thế

Vquét thế (mV/s) 5 10 12,5 25 50

- I p (nA) 72,5 75,6 78,1 92,5 95,8

-1 .1 0 -1 .2 0 -1.3 0 -1. 40

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.9: Đường DP củaofloxacin phụ thuộc vào tốc độ

quét thế

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

tốc độ quét (mV/s)

Ip (nA)

Hình 3.10: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế

đến cường độ dòng pic

(ĐKTN: sục khí 120s; biên độ xung: 50mV; thời gian 1 xung: 0,04s tốc

độ quét thế: 5 ÷ 50 mV/s)

Chiều cao pic không bị ảnh hưởng nhiều bởi tốc độ quét, với tốc độ

quét thế từ 5mV/s đến 12,5mV/s, I p không thay đổi nhiều, chân pic gần như

trùng khít, khi tăng tốc độ quét thế (từ 25mV/s trở lên) I p tăng nhưng có hiện

tượng chân pic lệch đường nền cao làm giảm độ phân giải. Như vậy có thể

chọn tốc độ quét thế từ 5mV/s đến 12,5mV/s để đo nhưng nếu tốc độ quét thế

chậm sẽ làm tăng thời gian phân tích và cường độ dòng nhỏ làm giảm độ

nhạy. Chúng tôi lựa chọn tốc độ quét thế là 12,5mV/s.





44

Ảnh hưởng của oxi hòa tan

Nồng độ oxi hoà tan trong nước khá lớn, khoảng 1,38.10 –3M ở 20oC.

Quá trình khử oxi xảy ra theo hai bước, bước thứ nhất tạo ra hiđro peoxit,

bước tiếp theo khử hiđro peoxit thành nước, theo hai bán phản ứng sau:

O2 + 2H+ + 2 e → H2O2

H2O2 + 2H+ + 2e → 2 H2O

Thế bán sóng của hai quá trình này tương ứng là –0,1V và –0,9V (so

với điện cực calomen bão hoà) [50]. Trong phân tích các hợp chất hữu cơ oxi

hòa tan trong nước có thể ảnh hưởng đến quá trình phân tích do ảnh hưởng

đến chất lượng đường khuếch tán thậm chí có thể phản ứng với chất phân tích

làm giảm nồng độ của chất phân tích. Vì vậy trước khi đo cần thiết phải đuổi

oxi khỏi nền. Trong phương pháp von-ampe loại bỏ oxi hòa tan trong nước

bằng cách sục khí nitơ vào dung dịch đến khi không còn sự ảnh hưởng đến

dòng pic. Tuy nhiên thời gian sục khí dài quá sẽ gây mất thời gian phân tích.

-1. 10 -1.20 -1.30 -1. 40 -1.50

U (V)

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.11: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào thời gian sục khí nitơ

(ĐKTN: sục khí 0 ÷ 300s; biên độ xung: 50mV; thời gian 1 xung: 0,04s tốc độquét thế: 12,5mV/s)

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sục khí nitơ đến đường

dòng von –ampe xung vi phân của dung dịch ofloxacin 3 µg/ml với thời gian

sục khí nitơ từ 0 đến 300s. Kết quả được trình bày trên hình 3.11.





45

Với thời gian sục khí dưới 120s đường nền cao, chân pic lệch, pic

không ổn định. Với thời gian sục khí từ 120s trở lên, pic đều, cân, chiều cao

đỉnh pic ổn định. Chúng tôi chọn thời gian sục khí là 120s.

3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp

Khảo sát khoảng tuyến tính

Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định ofloxacin chúng

tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn định lượng

ofloxacin trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu theo phương pháp von ampe với

các điều kiện đo trong bảng 3.5; nồng độ ofloxacin trong khoảng 2,0 µg/ml

đến 11,0 µg/ml.

Bảng 3.5: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch ofloxacin

Điện cực làm việc HMDE Thời gian 1 xung 0,04s

Chế độ ghi DP Tốc độ quét thế 12,5mV/s

Kích thước giọt 4 Khoảng quét thế -1,1V÷ -1,5V

Thời gian sục khí nitơ 120s Dung dịch nền Đệm photphatBiên độ xung 0,05V pH 6,5

Kết quả trình bày trong bảng 3.6, hình 3.12 và hình 3.13.

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ ofloxacin

Nồng độ ofloxacin (µg/ml) Cường độ dòng (nA)

2,0 - 58,0

2,5 - 66,7

3,0 - 77,44,0 - 106

5,0 - 125

6,0 - 149

7,0 - 168

8,0 - 197

9,0 - 217

11,0 - 263





46

Sử dụng phần mềm MS- Excel và Origin 8.0 để xây dựng đường chuẩn

kiểm tra ý nghĩa thống kê của phương trình hồi qui.

Đường chuẩn ofloxacin

y = 23.028x + 10.1R2 = 0.9995

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12C (microgam/ml)

Ip (nA)

Hình 3.12: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ

ofloxacin

-1. 10 -1. 20 -1. 30 -1. 40

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )


ofloxacin phụ thuộc vào

nồng độ

Kết quả cho thấy trong khoảng 2,0 ÷ 11,0 µg/ml có sự phụ thuộc tuyến

tính rõ rệt giữa cường độ dòng và nồng độ ofloxacin theo phương trình đường

thẳng: IP = (23,028 ± 0,182)Cx + (10,100 ± 1,170); hệ sô tương quan R 2 =

0,9995 rất gần với 1 cho thấy các điểm gần như nằm trên một đường thẳng.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn.

Tính toán Sy bằng chương trình tính chuyên dụng và bảng tính Exel đều cho

kết quả: Sy = 1,44. Từ đó tính được:

Giới hạn phát hiện:

y3.SLOD

b 1,88.10-4 mg/ml;

Tương đương 5,21.10-7M

Giới hạn định lượng:

y10.SLOQ

b 6,28.10-4 mg/ml;

Tương đương 1,74.10-6M





47

Độ đúng của phép đo

Khảo sát độ đúng của phép đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Thuốc

chuẩn được thêm vào với tỉ lệ 80%; 100% và 120% vào dung dịch chuẩn

nồng độ có sẵn là 4,0 µg/ml. Đo 4 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết

quả đo và tính toán được trình bày trong bảng 3.7.

Bảng 3.7: Độ thu hồi của ofloxacin

Tỉ lệ

thêm

vào(%)

Nồng độ

chuẩn thêm

vào nền(µg/ml)

Nồng độ

chuẩn tìmlại (µg/ml)

Nồng độ

tìm lại

trung bình(µg/ml)

Ðộ lệch chuẩn

tương đốiRSD(%)

Độ thu

hồi R ev (%)

80% 3,2

3,20

3,15 1,58 98,443,18

3,13

3,09

100% 4,0

4,10

4,07 1,29 101,754,214,01

3,98

120% 4,8

4,72

4,76 1,13 99,174,79

4,70

4,81

Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng cao, độ thu hồi

trung bình là 99,82%, nằm trong giới hạn cho phép là 98 – 102%.

Độ chính xác

Khảo sát độ lặp lại ở nồng độ 3,0 µg/ml; 5,0 µg/ml; 9,0 µg/ml. Ở mỗi

nồng độ, đo 6 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán

theo phương pháp đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.8.





48

Bảng 3.8: Độ lặp lại của ofloxacin

Mẫu(số xác định

song song) Nồng độ chuẩn

(µg/ml) Nồng độ xácđịnh (µg/ml)

Nồng độ trung bình (µg/ml)

RSD (%)

1 3,00 2,98

2,95 1,27

2 3,00 2,89

3 3,00 2,80

4 3,00 2,95

5 3,00 2,99

6 3,00 3,061 5,00 4,86

4,88 1,16

2 5,00 4,87

3 5,00 4,99

4 5,00 4,87

5 5,00 4,82

6 5,00 4,91

1 9,00 9,12

8,94 0,81

2 9,00 9,203 9,00 8,79

4 9,00 8,77

5 9,00 8,85

6 9,00 8,91

Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng, độ chính xác

cao, độ lệch chuẩn tương đối đều nằm trong giới hạn cho phép (< 2%). Vậy

có thể áp dụng để phân tích định lượng thuốc ofloxacin trong các mẫu thuốc.

3.1.3. Xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc.

Thuốc Ofloxacin hiện đạng lưu hành trên thị trường chủ yếu dưới hai

dạng bào chế: thuốc nhỏ mắt và thuốc viên. Căn cứ vào các kết quả nghiên

cứu và qui định về xác định độ đồng đều hàm lượng và độ đồng đều khối

lượng trong kiểm nghiệm dược phẩm của Bộ Y tế (được qui định trong Dược





49

điển Việt Nam III, phần phụ lục 8.2 8.3) [1; 4], chúng tôi xây dựng qui trình

phân tích đối với hai loại chế phẩm này như sau:

Qui trình xác định với thuốc nhỏ mắt: Theo qui định về định lượng hoạt

chất trong thuốc nhỏ mắt [1; 4], lấy 05 lọ thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3%

(15mg/5ml) đổ dồn vào một lọ nhựa sạch, xác định thể tích trung bình của 1

lọ, lắc trộn kỹ. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50ml, định mức

đến vạch (dung dịch 1). Lấy chính xác 5,00 ml dung dịch 1 chuyển vào bình

định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2A, dung dịch

này có nồng độ tương ứng khoảng 0,3 mg/ml).Dùng micropipet lấy 250,0µl dung dịch 2A vào bình định mức 25ml,

thêm 5ml dung dịch đệm photphat pH = 6,5 rồi định mức bằng nước cất

đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các

điều kiện đã chọn. Hàm lượng ofloxacin được xác định bằng phương pháp

thêm chuẩn.

Qui trình xác định với thuốc viên: Căn cứ vào qui định về định lượnghoạt chất trong thuốc viên nén và viên nang [1; 4], cân 20 viên thuốc, xác

định khối lượng trung bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác

lượng bột tương ứng 50 mg ofloxacin hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển

toàn bộ vào bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ

dung dịch, để lắng trong (dung dịch 1). Lấy 25,00 ml dung dịch 1 chuyển vào

bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2B, dungdịch này có nồng độ tương ứng khoảng 0,25mg/ml).

Dùng micropipet lấy 300,0µl dung dịch 2B vào bình định mức

25,0ml, thêm 5ml dung dịch đệm photphat pH = 6,5 rồi định mức bằng

nước cất đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo

trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng ofloxacin được xác định bằng

phương pháp thêm chuẩn.





50

Hàm lượng ofloxacin trong 1 lọ thuốc được xác định theo công thức:

Hàm lượng ofloxacin /lọ = 3

x

25 50 125 C *10

0,25 5 5

(mg)

Hàm lượng ofloxacin trong 1 viên thuốc được xác định theo công thức:

Hàm lượng ofloxacin /viên = 3x

50 100 20025 C *10

0,3 50 50 (mg)

3.1.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng ofloxacin trong 2 loại thuốc là thuốc nhỏ mắt

Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Traphaco (Số lôSX: 290811) và thuốc Ofloxacin 200mg viên nén sản xuất tại Công ty Cổ

phần Dược phẩm Imexpharm; (Số lô SX: 020512).

Tiến hành 6 lần cân đo mẫu theo qui phân tích đã xây dựng trong mục

3.1.3. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và 3.10.

Bảng 3.9: Kết quả định lượng ofloxacin trong thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3%

(15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Traphaco

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

(mg/ lọ)

Phần trăm so

với ghi trên

nhãn (%)

Số liệu thống kê

1 2,84 14,18 94,57 X = 14,07 (93,80%)

SD = 0,20

RSD = 1,43 %

m = 14,07 ± 0,21

(mức tin cậy 95%)

2 2,77 13,84 92,27

3 2,76 13,81 92,06

4 2,85 14,24 94,91

5 2,85 14,27 95,14

6 2,82 14,08 93,85

Phân tích đối chứng theo phương pháp HPLC 94,3%





51

Bảng 3.10: Kết quả định lượng ofloxacin trong viên nén Ofloxacin 200mg sản

xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm;

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

(mg/viên)

Hàm lượng

phần trăm (%)Số liệu thống kê

1 2,95 196,99 98,49 X = 196,46 (98,23%)

SD = 3,33

RSD = 1,69 %

m = 196,46 ± 3,49


2 3,02 201,60 100,80

3 2,98 198,77 99,39

4 2,90 193,65 96,83

5 2,89 192,83 96,416 2,92 194,94 97,47


Kết quả định lượng hàm lượng ofloxacin trong 2 loại thuốc có độ lệch

chuẩn tương đối < 2% đáp ứng yêu cầu của phương pháp định lượng dược

phẩm theo qui định của Bộ Y tế. Hàm lượng phần trăm ofloxacin so với ghi

trên nhãn của thuốc do Công ty Cổ phần Dược phẩm Traphaco sản xuất từ92,06 đến 95,14; của thuốc do Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm là

96,41 đến 100,80%. Đối chiếu với tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam 4, các

thuốc đều đạt yêu cầu về hàm lượng từ 90% đến 110% so với ghi trên nhãn.

So sánh kết quả phân tích với mẫu gửi đi kiểm nghiệm đối chứng

(MĐC) tại Công ty Cổ phần Hóa dược Việt Nam theo phương pháp HPLC

(chuẩn Dược điển Việt Nam) cho thấy sự sai lệch giữa các kết quả phân tích

là nhỏ, sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.

3.1.5. Nghiên cứu qui trình định lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu

Thực nghiệm thấy rằng, khi đo mẫu nước tiểu không chứa thuốc cùng

điều kiện đo ofloxacin không thấy xuất hiện pic lạ nhưng đường nền bị lệch;

tiến hành đo mẫu nước tiểu chứa thuốc có xuất hiện pic đặc trưng của

ofloxacin nhưng không cân đối (hình 3.14 và 3.15).





52

Khi pha loãng nước tiểu rồi thêm thuốc vào đo thấy pic xuất hiện cân

đối hơn. Như vậy các thành phần tạp chất trong nước tiểu có ảnh hưởng đến

việc ghi đo dòng xung vi phân của ofloxacin nhưng không nhiều (chỉ gây hiệu

ứng lệch chân pic mà không làm chuyển dịch thế đỉnh pic và không xuất hiện

pic lạ gây nhiễu). Có thể thấy nếu nồng độ ofloxacin trong nước tiểu lớn có

thể định lượng trực tiếp, đây có lẽ là ưu điểm rất lớn của phương pháp von-

ampe khi định lượng ofloxacin trong nước tiểu so với các phương pháp khác

đòi hỏi xử lý mẫu rất phức tạp. Để định lượng được các mẫu nước tiểu có

nồng độ ofloxacin thấp (không pha loãng hoặc pha loãng rất ít) vẫn đảm bảođộ chính xác, chúng tôi lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu nước tiểu theo

phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB.

-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60

U (V)

-800n

-600n

-400n

-200n

0

I ( A )

Hình 3.14: Đường CV của 1,0 ml

nước tiểu chứa ofloxacin 10 µg/ml.

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.15: Đường DP của 1,0ml nước

tiểu không chứa thuốc (1) và 1,0 ml

nước tiểu chứa ofloxacin 4 µg/ml (2).Cột chiết Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) với chất hấp

phụ kết hợp cơ chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước. Pha tĩnh này

được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính

ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước. Các nhóm chức

phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên

pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực

1

2





53

cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm

việc trong khoảng pH rộng.

Pha tĩnh Oasis HLB có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực,

các hợp chất acid, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm

giàu các đối tượng thuốc trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh

β-lactam, các sulfonamids, các quinolones….

Có thể thấy, cột chiết Oasis HLB có nhiều ưu điểm hơn cột C18 về

khả năng lưu giữ, tách chiết và khoảng pH làm việc, đặc biệt trong lĩnh

vực phân tích dược phẩm nên chúng tôi lựa chọn cột HLB để xử lý mẫunước tiểu.

Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải:

Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, với cột chiết Oasis HLB

Extraction Cartridge có thể sử dụng dung môi rửa giải là dung dịch CH3OH

để tách hiệu quả các dược phẩm. Theo Dược điển Việt nam Hỗn hợp dung

dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 :20) để phân tích ofloxacin bằng phương pháp HPLC tác giả Chan K. P. và

các đồng nghiệp đã dung hệ dung môi acetonitrile – methanol 0,05M -

TBA·Cl - TFA (37,5 : 12,5 : 949 : 1) phân tích ofloxacin trong dịch sinh học

[33]. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát trên một số hỗn hợp dung môi của

metanol và acetonnitrin.

Với phương pháp chiết pha rắn (SPE), với các mẫu nước, việc lựachọn chất hấp phụ và dung môi rửa giải dựa vào đặc tính phân cực và đặc

tính ion của chất phân tích. Nếu chất phân tích là ion và phân tử phân cực thì

nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion. Trong trường hợp chất phân

tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ

theo nguyên tắc pha đảo. Ofloxacin có tính phân cực, có tính axit yếu với cá

giá trị pK a1

= 5,8; pK a2

= 8,0 [31]; mẫu nước tiểu có pH khoảng 5 đến 6, vì





54

vậy chúng tôi lựa chọn pH của dung môi trong khoảng 4 đến 5, ở điều kiện

này ofloxacin tồn tại ở dạng phân tử không phân ly, quá trình chiết sẽ theo

nguyên tắc pha đảo.

Các hệ dung môi được pha chế từ metanol; acetonnitrin; dung dịch đệm

photphat pH 4,0 và 5,0; đệm axetat pH 4,0 theo tỉ lệ thể tích. Thành phần của

các hệ dung môi khảo sát được thể hiện trong bảng 3.11.

Để đánh giá hiệu quả chiết của các hệ dung môi chúng tôi tiến hành

như sau:

Bước 1: Lấy mẫu nước tiểu người không uống thuốc. Thêm ofloxacin

vào mẫu với nồng độ 0,5mg/ml. Lấy 2,5ml nước tiểu đã thêm thuốc cho chảy

qua cột HLB. Rửa tạp chất bằng đệm photphat. Rửa giải thu hồi mẫu bằng

dung môi khảo sát. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25ml, định

mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác 2,5ml

dung dịch A chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 8ml đệm photphat pH =

6,5, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo

điều kiện xác định ofloxacin đã chọn.

Bước 2: Tiến hành giống như bước 1 nhưng thuốc ofloxacin được thêm

vào dịch chiết thu hồi được sau khi qua cột với một lượng tương đương.

Hiệu quả tách của dung môi được đánh giá thông qua hiệu suất chiết,

tính theo công thức:

t

c

IH (%)

I

trong đó: It: cường độ dòng pic của mẫu giả xử lý theo qui trình (bước 1)

Ic: cường độ dòng pic của mẫu chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng

(bước 2).

Kết quả được trình bày trong bảng 3.11:





55

Bảng 3.11: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi

TT Hệ dung môi (tỉ lệ thể tích) Hiệu suất chiết

1 Acetonnitrin: đệm photphat pH 5,0 (96:4) 66,8

2 Metanol: đệm axetat pH 4,0 (90:10) 77,5

3 Metanol: đệm photphat pH 4,0 (90:10) 79,7

4 Metanol: nước (80:20) 81,3

5 Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10) 86,6

6 Acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) 75,3

(ĐKTN: Thể tích dung môi = 3ml, tốc độ chảy 0,5 ml/phút)

Với hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0

(5:85:10) cho hiệu suất chiết cao, pic gọn không có tín hiệu nhiễu. Vậy,

chọn thành phần dung môi chiết là hỗn hợp Acetonnitrin: metanol: đệm

photphat (5:85:10)

Sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic

Dung môi chiết tốt phải không ảnh hưởng đến pic của chất phân tích,

chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic của

chất ofloxacin. Lấy 0,30 ml dung dịch ofloxacin 0,025mg/ml, thêm 8ml đệm

photphat, Vml hỗn hợp dung môi, định mức thành 25ml được dung dịch

ofloxacin 3,0 µg/ml. Tiến hành ghi đo đường DP trong các điều kiện như

trong bảng 3.4. Kết quả thể hiện trong bảng 3.12 và biểu diễn trong hình 3.16.

Kết quả khảo sát cho thấy, với thể tích dung môi trong khoảng 1ml đến

4,0ml không có sự ảnh hưởng đáng kể đến cường độ dòng pic và thế đỉnh pic,

khi thể tích dung môi lớn hơn 4,0ml có sự giảm cường độ dòng pic, chân pic

lệch, vì vậy không nên dùng thể tích dung môi lớn hơn 4,0 ml. Như vậy hỗn

hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) phù hợp dùng

để tách chiết, phân tích các kháng sinh ofloxacin trong nước tiểu theo phương

pháp von-ampe xung vi phân.





56

Bảng 3.12: Sự phụ thuộc I p

vào thể tích dung môi

V dung

môi (ml)I p

1,0 76,6

1,5 76,6

2,0 76,5

2,5 76,5

3,0 76,3

3 5 75,

4,0 74,6

5,0 69,8

6,0 66,5

50

55

60

65

70

75

80

0 2 4 6 8

V dung môi (ml)

I p ( n A )

Hình 3.16: Sự phụ thuộc I p thể tích dung môi

Khảo sát pH chiết

Tiến hành khảo sát hiệu suất chiết của hệ dung môi acetonnitrin: metanol:

đệm photphat (5:85:10) trong khoảng 2 đến 9, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M và H3PO4 0,1M. Kết quả trình bày trong bảng 3.13 và hình 3.17.

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu

suất chiết vào thể tích dung môi

pHHiệu suất

chi t

2 78,63 86,5

4 86,6

5 85,2

6 82,1

7 68,1

9 56,6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10

pH

H

( % )

Hình 3.17: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào

pH của dung môi





57

Ofloxacin có pK a1 = 5,8; pK a2= 8,0 [31], pH của nước tiểu khoảng 5,5,

trong môi trường pH < pK a1 ofloxacin tồn tại dạng phân tử không phân ly,

không có tính ion, mặt khác phân tử ofloxacin khá phân cực do đó lựa chọn

thực hiện chiết theo cơ chế pha đảo là hoàn toàn phù hợp. Kết quả thí nghiệm

cho thấy với pH dung môi chiết từ 3 đến 4 cho hiệu suất chiết tốt là phù hợp

về khoa học. Vì vậy, chúng tôi chọn điều kiện pha hệ dung môi chiết pH = 4.

Khảo sát tốc độ nạp mẫu và rửa giải

Tốc độ nạp mẫu ảnh hưởng đến sự hấp thu của chất phân tích vào pha

tĩnh. Tốc độ nạp mẫu chậm thì chất hấp thu nhiều, nạp mẫu quá nhanh chất phân tích không đủ thời gian hấp thu trên cột dẫn tới hiệu suất chiết thấp.

Ngoài ra cần căn cứ vào thể tích và nồng độ chất phân tích trong mẫu nạp vào

cột để lựa chọn tốc độ nạp mẫu phù hợp. Theo tài liệu tham khảo [1] đối với

phương pháp HPLC, cột C18 tốc độ bơm mẫu là 1,5ml/phút. Với các mẫu

nước tiểu chứa ofloxacin nồng độ không quá nhỏ, thể tích mẫu nhỏ (khoảng

2,0ml), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ nạp mẫu với cột chiết pha rắnHLB từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.14 và hình 3.18.


suất chiết vào tốc độ nạp mẫu

Tốc độ nạp

mẫu (ml/phút)

Hiệu suất

chiết

0,5 86,6

1,0 86,5

1,5 85,3

2,0 81,2

2,5 76,4

3,0 65,7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3

tốc độ nạp mẫu (ml/phút)

H i ệ u

s u

ấ t c h i ế t ( % )


tốc độ nạp mẫu





58

Kết quả phân tích cho thấy với tốc độ nạp mẫu từ 0,5 đến 1,5 ml/phút

hiệu suất chiết cao (trên 85%). Khi tốc độ nạp mẫu tăng lên đến 3,0 ml/phút

hiệu suất chiết chỉ còn 65,7%. Chúng tôi chọn điều kiện nạp mẫu vào cột với

tốc độ 1,0 ml/phút (thực tế trong khoảng 0,8 – 1,0 ml/phút).

Tốc độ rửa giải ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tốc độ rửa giải nhanh thì

không giải chiết hết, rửa giải chậm gây tốn thời gian phân tích. Trong điều

kiện nghiên cứu, thể tích dung môi rửa giải không lớn (do có sự ảnh hưởng

của dung môi khi đo mẫu) cần rửa giải với tốc độ chậm để giải chiết hết mà

không bị ảnh hưởng bởi dung môi khi đo mẫu. Tiến hành khảo sát sự phụ

thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ rửa giải với 3,0ml hỗn hợp dung môi với tốc

độ từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả cho thấy với tốc độ rửa giải từ 0,5 đến 2,0

ml/phút cho hiệu suất chiết tốt (85,5%), vì vậy chúng tôi chọn điều kiện tốc

độ rửa giải 1,0ml/phút (tương đương tốc độ nạp mẫu).

Khảo sát thể tích dung môi rửa giải Nghiên cứu thể tích dung môi rửa giải thích hợp là rất cần thiết, nếu

thể tích dung môi nhỏ sẽ giảm hiệu suất chiết, thể tích dung môi quá lớn

gây lãng phí và có thể ảnh hưởng đến tín hiệu đo. Chúng tôi tiến hành khảo

sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi là hỗn hợp

acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Kết quả trình bày

trên bảng 3.15 và hình 3.19.





59

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc

hiệu suất chiết vào thể tích

dung môi

V dung

môi (ml)

Hiệu suất

chiết

1,0 76,2

1,5 81,9

2,0 86,4

2,5 86,4

3,0 86,5

3,5 86,3

4,0 84,5

60

65

70

75

80

85

90

0 1 2 3 4 5

V dung môi (ml)

H ( % )

Hình 3.19: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể

tích dung môi

Kết quả phân tích cho thấy, hiệu suất chiết tăng khá nhanh khi tăng thể

tích dung môi từ 1,0 ml đến 2,0 ml, với thể tích dung môi từ 2,5 ml đến 3,5

ml hiệu suất chiết hầu như không tăng thêm. Vì vậy chúng tôi chọn thể tíchdung môi chiết là 2,5ml đảm bảo hiệu suất chiết tốt và ổn định.

Kết luận về điều kiện chiết ofloxacin trong mẫu nước tiểu và xây dựng

qui trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn:

Sau khi tiến hành khảo sát một số điều kiện thích hợp cho quá trình xử

lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết HLB Oasis, rút ra

kết luận về một số điều kiện chiết như sau:

Dung môi: acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10)

Thể tích dung môi: 2,5ml

pH 4,0

Tốc độ chảy 1,0 ml/phút

Từ các kết luận trên, chúng tôi xây dựng qui trình xử lý mẫu nước tiểu

bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) như sau:





60

Qui trình: Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước

cất 2 lần. Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc

độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi

ofloxacin bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0

(5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức

25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dung dịch này có thể

dùng để định lượng ofloxacin bằng qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.3.

Hình 3.20 cho thấy đường DP của ofloxacin trong mẫu nước tiểu sau

xử lý theo qui trình đã xây dựng được ở trên đẹp và cân đối hơn rất nhiều sovới trước khi xử lý. Điều này cho thấy: có thể áp dụng qui trình xử lý mẫu đã

xây dựng được bằng phương pháp chiết pha rắn để phân tích hàm lượng

ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân.

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.20: Đường DP của dung dịch ofloxacin 4 µg/ml trong:

1) Nước tiểu trước khi xử lý; 2) Nước tiểu sau khi xử lý qua cột HLB

Đánh giá phương pháp

Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp chúng tôi tiến hành phân tích

ofloxacin trong mẫu tự tạo. Mẫu tự tạo là mẫu nước tiểu của người bình

thường được thêm ofloxacin ở các nồng độ khác nhau, đem xử lý và định

lượng theo qui trình:

2

1





61

Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần.

Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0

ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin

bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10).

Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml,

định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác

2,50 ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25,00 ml, thêm 8 ml đệm

photphat pH = 6,50, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến

hành đo theo điều kiện đã chọn.Kết quả được trình bày trong bảng 3.16, hình 3.21 và hình 3.22.

Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào I p.

TT C NT (mg/ml) Cđo (µg/ml) I p (nA)

1 0,2 2,0 -51,5

2 0,3 3,0 -76,0

3 0,4 4,0 -95,4

4 0,5 5,0 -117

5 0,6 6,0 -145

6 0,7 7,0 -164

7 0,8 8,0 -187

Kết quả phân tích cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa I p vào nồng

độ ofloxacin.





62

y = 22.575x + 6.5393R² = 0.9986

020406080

100120140160180

200

0 2 4 6 8 10

Ip (nA)

C (microgam/ml)

Đường chuẩn ofloxacin trong NT

Hình 3.21: Sự phụ thuộc I p và nồng độofloxacin trong mẫu nước tiểu.

-1.10 -1. 20 -1.30 -1. 40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.22: Đường AdSVcủa ofloxacin trong nướctiểu (mẫu tự tạo)

Đánh giá độ đúng của phương pháp thông qua độ thu hồi. Tiến hành

phân tích xác định độ thu hồi ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo có sẵn

nồng độ ofloxacin bằng 0,3 mg/ml bằng phương pháp thêm chuẩn. Ofloxacin

được thêm vào mẫu nước tiểu ở các nồng độ 0,24 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,36

mg/ml (tương ứng tỉ lệ thêm vào là 80%, 100% và 120%) rồi xử lý theo qui

trình trên và tiến hành định lượng. Nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu

được tính theo công thức: C NT = 0,10.CX (mg/ml), (trong đó: C NT là nồng độ

ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo; CX là nồng độ ofloxacin trong mẫu đo

sau khi xử lý (µg/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 3.17.

Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo

STT Nồng độ chuẩnthêm vào nước

tiểu (mg/ml)

Nồng độ tìm lạitrong dung dịch

đo (µg/ml)

Nồng độ tìm lạitrong mẫu nước

tiểu (mg/ml)

R e (%)

1 0,24 2,32 0,23 95,83

2 0,30 2,86 0,29 96,67

3 0,36 3,65 0,36 100,00

Độ thu hồi ofloxacin trong mẫu nước tiểu từ 95,37% đến 101,34%.





63

Như vậy, với qui trình xử lý mẫu nước tiểu như trên có thể xây dựng

qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân bằng

phương pháp von-ampe xung vi phân.

Qui trình phân tích: Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết

HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp chất bằng 5ml đệm photphat pH

4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm

photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết

vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 1).

Lấy chính xác V ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm 8 mlđệm photphat pH 6,50, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và

tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.

Hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu được xác định theo phương

pháp thêm chuẩn ofloxacin vào mẫu nước tiểu rồi xử lý theo qui trình trên.

Hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu (C NT) tính theo công thức:

C NT =XC 25 25

*1000 V 2,5 =X0,25*C

V

Trong đó: CX là nồng độ ofloxacin trong mẫu đo (µg/ml)

V: thể tích dung dịch 1 đem đo (ml)

3.1.6. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu

nước tiểu

Áp dụng qui trình phân tích đã xây dựng trong mục 3.1.5 chúng tôi tiến

hành định lượng ofloxacin trong một số mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống

ofloxacin hàm lượng 400 mg/lần (2 viên ofloxacin 200mg).

Kết quả phân tích các mẫu nước tiểu của bệnh nhân được trình bày trên

bảng 3.18. Dựa vào kết quả phân tích mẫu nước tiểu của 1 bệnh nhân theo

thời gian, chúng tôi thấy rằng mẫu nước tiểu thu được sau 8 giờ uống thuốc

có nồng độ ofloxacin cao nhất. Để có thêm kết quả phân tích với các bệnh

nhân khác nhau chúng tôi tiến hành phân tích một số mẫu nước tiểu của bệnh





64

nhân khác sau khi uống thuốc 8 giờ để đánh giá nồng độ đỉnh của thuốc trong

nước tiểu bệnh nhân.

Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu

của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 200mg.

STT KHM Đặc điểm mẫu V mẫu (ml) C NT (mg/ml)

1 MS1 Sau 2 giờ uống thuốc 180 0,08

2 MS 2 Sau 4 giờ uống thuốc 145 0,14

3 MS 3 Sau 6 giờ uống thuốc130

0,30


5 MS 5* Sau 8 giờ uống thuốc 150 0,37





10 MS 10* Tổng nước tiểu sau 24 giờuống thuốc

1320 0,20

*Ghi chú: Mẫu số 5,6,7,10 thuộc các bệnh nhân khác nhau

Kết quả thực nghiệm cho thấy sau khi uống liều 400mg ofloxacin, sau 2

giờ uống thuốc nồng độ thuốc trong nước tiểu khoảng 0,08mg/ml. Nồng đỉnh

trong nước tiểu có thể lớn hơn 0,38 mg/ml, đạt sau khoảng 8 giờ uống thuốc.

Sau 24 giờ uống thuốc lượng đào thải qua nước tiểu khoảng 265 mg (khoảng66,3% liều sử dụng). Như vậy sự đào thải ofloxacin chủ yếu qua cầu thận

dưới dạng không chuyển hóa.

Theo tài liệu tham khảo [3], sau khi uống liều 400mg, 75 - 80% thuốc

được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng không chuyển hóa trong 24 đến 48 giờ,

làm nồng độ thuốc cao trong nước tiểu. Như vậy, kết quả phân tích là hợp lý

và có cơ sở khoa học.





65

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 2 4 6 8 10 12 14

Thời gian (giờ)

C ( m g / m l )

Hình 3.23: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân uống 2

viên ofloxacin 200mg theo thời gian

3.2. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL

Hoạt tính điện hóa của metronidazol trên điện cực giọt thủy ngân được

dự đoán xảy ra quá trình khử nhóm nitro thành amin:

Tiến hành khảo sát các điều kiện thích hợp để định lượng metronidazol

tương tự như với ofloxacin

3.2.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp

Qua tham khảo các tài liệu và khảo sát đo trực tiếp metronidazole trongmột số nền đệm thấy trong nền đệm Britton-Robinson, đệm photphat và đệm

axetat pH từ 3,5 đến 5,0 có xuất hiện pic nhọn, cân đối, cường độ dòng cao,

thay đổi theo nồng độ, E p ít dịch chuyển. Chúng tôi chọn nền đệm photphat để

khảo sát các điều kiện ghi đo.

+ 6e + 6H+

N

N

CH2 - CH2 - OH

O2 N CH3

N

N

CH2 - CH2 - OH

H2 N CH3

+ 2 H2O





66

0 -200m-400m-600m-800m -1.00

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.24: Đường CV của

metronidazol trong nền đệm photphat1. nền đệm photphat pH = 4,52. metrodinazol 0,1mg/ml

-100m -200m -300m -400m

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

25.0n

I ( A )


metronidazol trong nền đệm photphat:1. nền đệm photphat pH = 4,52. metronidazol 2,0 µg/ml

Ảnh hưởng của pH dung dịch nền

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ dòng vào pH của dung dịch

metronidazol 2,0 µg/ml trong nền đệm photphat pH từ 3,5 đến 6,0. Kết quả

cho thấy khi pH tăng lên thế đỉnh pic dịch chuyển về phía âm hơn pic roãng,

cường độ giảm làm giảm độ chọn lọc và độ nhạy của phép phân tích. Ở pH từ

4,5 pic gọn và cân đối vì vậy chúng tôi chọn điều kiện dung dịch nền photphat

pH = 4,5 cho các thí nghiệm tiếp theo.

0 -100m -200m -300m -400m -500m

-120n

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )


metronidazol trong nền đệm

photphat ở các pH từ 3,5 đến 6,0

50

60

70

80

90

100

110

120

2 4 6 8

I p ( n A )

pH

Hình 3.27: Đồ thị Sự phụ thuộc I p và E p

của metronidazol vào pH dung dịch nền

12

1

2

Chiều pH tăng từ 3,5 đến 6,0

pH = 4,5





67

Bảng 3.19: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào pH dung dịch nền

pH 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0

-I p (nA) 97,6 98,2 106 110 101 88,5 82,1 69,7

-E p (V) 0,176 0,185 0,233 0,261 0,286 0,320 0,398 0,435

Ảnh hưởng của biên độ xung

Để khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung, tiến hành ghi đường DP của

dung dịch metronidazol 2,0 µg/ml trong khoảng biên độ xung từ 10mV đến

100mV. Kết quả trình bày trong bảng 3.20, hình 3.28 và hình 3.29.

Bảng 3.20: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào biên độ xung

ΔEA (mV)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

- I p (nA) 49,7 65,6 69,6 87,8 98,8 115 121 132 148 161

- E p (V) 0,296 0,274 0,274 0,265 0,261 0,260 0,252 0,251 0,246 0,235

Khi tăng biên độ xung, I p tăng, thế đỉnh pic dịch về phía dương hơn.

Khi biên độ xung nhỏ pic thấp, khi biên độ xung lớn pic cao nhưng chiều rộng

chân pic tăng sẽ giảm độ nhạy và độ chọn lọc. Chúng tôi chọn điều kiện đo

với biên độ xung là 60 mV, cường độ dòng pic cao, ổn định và cân đối.

0 -100m -200m -300m -400m -500m

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.28: Sự phụ thuộc I p


0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 20 40 60 80 100 120


I p ( n A

)

Hình 3.29: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào biên

độ xung





68


Thời gian đặt 1 xung ảnh hưởng rất rõ đến chiều cao pic. Thời gian đặt

1 xung càng nhỏ thì chiều cao pic càng cao, tuy nhiên pic lại mất cân đối, độ

lặp kém làm phép phân tích mất chính xác. Vì vậy khảo sát ảnh hưởng của

thời gian 1 xung là rất cần thiết. Trong kỹ thuật von-ampe thường đặt thời

gian 1 xung từ 0,03 đến 0,06s.


của dung dịch metronidazol 2,0µg/ml, thời gian đặt 1 xung từ 0,02 đến 0,1s.

Kết quả trình bày trong bảng 3.21; hình 3.30 và 3.31.Bảng 3.21: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung

tđặt xung (s) 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09

- I p (nA) 148 125 113 92,8 84,6 79,1 64,7 50,9

- E p (V) 0,223 0,248 0,263 0,269 0,272 0,275 0,282 0,289

Kết quả khảo sát cho thấy ở điều kiện thời gian đặt 1 xung nhỏ hơn

0,03 s pic cao nhưng chân pic lệch. Khi tăng thời gian đặt xung pic thấp hơn,

thế đỉnh pic lệch về phía dương hơn nhưng cân đối. Chọn điều kiện thời gian

đặt xung là 0,04s.

0 -100m -200m -300m -400m -500m

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )


metronidazol phụ thuộc

vào thời gian 1 xung

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

Thời gian 1 xung (s)

I p ( n A

)

Hình 3.31: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời gian

đặt 1 xung





69



xung vi phân với dung dịch metronidazol 2,0µg/ml, bước nhảy thế cố định ở

5mV. Kết quả được trình bày trên bảng 3.22 hình 3.32 và hình 3.33. Theo

chiều tăng của tốc độ quét thế, cường độ dòng tăng ít, nhưng tốc độ quét thế

tăng cũng làm chân pic nâng cao độ lặp kém. Ngược lại nếu tốc độ quét thế

chậm sẽ làm tăng thời gian phân tích và cường độ dòng nhỏ làm giảm độ

nhạy. Ở tốc độ quét thế 12,5mV/s pic gọn, cân đối, vì vậy chọn tốc độ quét

thế là 12,5mV/s.

Bảng 3.22: Sự phụ thuộc I p và E p của metronidazol vào tốc độ quét thế

Vquét thế (mV/s) 5 10 12,5 25 50

- I p (nA) 91,2 94,8 98,3 104 105

- E p (V) 0,257 0,252 0,257 0,242 0,238

0 -100m-200m -300m-400m -500m

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )


metronidazol phụ thuộc

tốc độ quét thế

50

60

70

80

90

100

110

0 10 20 30 40 50 60

V quét thế (mV/s)

I p ( n A )

Hình 3.33: Sự phụ thuộc I p vào tốc độ quét thế





70


Tương tự như đã trình bày ở phần 3.1, trong phân tích các hợp chất hữu

cơ oxi hòa tan trong nước có thể ảnh hưởng đến quá trình phân tích do ảnh

hưởng đến chất lượng đường khuếch tán thậm chí có thể phản ứng với chất phân

tích làm giảm nồng độ của chất phân tích. Vì vậy trước khi đo cần thiết phải đuổi

oxi khỏi nền. Trong phương pháp von-ampe loại bỏ oxi hòa tan trong nước bằng

cách sục khí nitơ vào dung dịch đến khi không còn sự ảnh hưởng đến dòng pic.

Tuy nhiên thời gian sục khí dài quá sẽ gây mất thời gian phân tích.

Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sục khí nitơ đến đườngdòng von –ampe xung vi phân của dung dịch metronidazol 2,0 µg/ml với thời

gian sục khí nitơ từ 0 đến 300s. Kết quả được trình bày trên hình 3.34 và 3.35.

0 -100m -200m -300m-400m -500m

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )


metronidazol phụ thuộcvào thời gian sục khí nitơ

50

60

70

80

90

100

110

0 50 100 150 200 250 300 350

Thời gian sục khí nitơ (s)

I p (

n A )

Hình 3.35: Ảnh hưởng của thời gian sục khi nitơ


Với thời gian sục khí 0s xuất hiện pic phụ ở - 41,7mV làm lệch chân

pic gây ảnh hưởng rõ rệt đến chiều cao pic. Tăng thời gian sục khí nitơ, pic

phụ giảm, sau thời gian sục khí 90s pic phụ gần như biến mất hẳn, chân pic

cân đối, chiều cao và thế đỉnh, thể hiện ở các đường DP gần như trùng nhau

điều này khẳng định thời gian sục khí 90s đảm bảo không còn ảnh hưởng của

oxi hòa tan. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian sục khí là 90s.





71


Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định metrodinazol

chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn định

lượng metronidazol trong mẫu thuốc theo phương pháp von ampe xung vi

phân với các điều kiện đo trong bảng 3.23; nồng độ metronidazol trong

khoảng 0,5 µg/ml đến 5,0 µg/ml.

Bảng 3.23: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch metronidazol

Điện cực làm việc HMDE Thời gian đặt một xung 0,05s


Kích thước giọt 4 Khoảng quét thế 0,0V÷ -0,5V

Thời gian đuổi oxi 90s Dung dịch nền Đệm photphat

Biên độ xung 0,05V pH nền 4,5

Kết quả trình bày trong bảng 3.24. hình 3.37. Sử dụng kết quả phân

tích xây dựng đường chuẩn bằng phần mềm Excel và Origin 8.0 thu được

đường chuẩn trên hình 3.38.

Bảng 3.24: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độmetronidazol

Nồng độ metronidazol (µg/ml) Cường độ dòng (nA)

0,5 27,8

1,0 53,7

1,5 78,6

2,0 105

2,5 127

3,0 154

3,5 178

4,0 202

4,5 226

5,0 252





72

Đường chuẩn Metrodinazol

y = 49.538x + 4.18R2 = 0.9998

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3 4 5 6

C (microgam/ml)

Ip (nA)

Hình 3.36: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độmetronidazol

0 -100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.37: Đường DP

của metronidazol ở các

nồng độ

Kết quả, trong khoảng nồng độ metronidazol từ 0,5 đến 5,0 µg/ml có sự

phụ thuốc tuyến tính giữa nồng độ metronidazol và I p theo phương trình hồi

qui: IP = (49,54 ± 0,23)Cx + (4,18 ± 0,70); hệ số tương quan R 2 = 0,9998 cho

thấy các điểm gần như nằm trên một đường thẳng.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn.




y3.SLOD

b

1,82.10-5 mg/ml; tương đương 1,08.10-7M


y10.SLOQ

b 6,06.10-5 mg/ml; tương đương 3,60.10-7M

Độ đúng

Khảo sát độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn. Đo

3 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Thuốc chuẩn được thêm vào với tỉ lệ





73

80%; 100% và 120% vào dung dịch chuẩn nồng độ có sẵn là 2,0 µg/ml. Đo 3

mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán được trình bày

trong bảng 3.25.

Bảng 3.25: Độ thu hồi của metronidazol

Tỉ lệ

thêm

vào

(%)

Nồng độ

chuẩn thêm

vào nền

(µg/ml)

Nồng độ

chuẩn tìm

lại

(µg/ml)

Nồng độ

tìm lại

trung bình

(µg/ml)


tương đối

RSD (%)

Độ thu

hồi

R ev (%)

80 1,6

1,60

1,55 1,26 96,871,52

1,52

1,55

100 2,0

2,09

2,03 1,17 101,501,992,00

2,06

120 2,4

2,42

2,39 1,09 99,582,45

2,34

2,36Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng cao, độ thu hồi


Độ chính xác

Khảo sát độ lặp lại ở nồng độ 1,0 µg/ml; 3,0 µg/ml; 4,5 µg/ml. Ở mỗi

nồng độ, đo 6 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán

được trình bày trong bảng 3.26.





74

Bảng 3.26: Độ lặp lại của metronidazol

Mẫu(số xác

định songsong)

Nồng độ chuẩn(µg/ml)

Nồng độ xácđịnh (µg/ml)


RSD (%)

1 1,00 0,98

1,01 2,00

2 1,00 0,99

3 1,00 1,02

4 1,00 1,03

5 1,00 1,016 1,00 1,03

1 3,00 3,01

2,96 1,94

2 3,00 3,04

3 3,00 2,89

4 3,00 2,98

5 3,00 2,96

6 3,00 2,911 4,50 4,38

4,43 1,90

2 4,50 4,34

3 4,50 4,42

4 4,50 4,56

5 4,50 4,51

6 4,50 4,39


cao, độ lệch chuẩn tương đối đều nằm trong giới hạn cho phép < 2%.

Với các kết quả khảo sát về điều kiện đo, khoảng tuyến tính, độ đúng,

độ chính xác có thể kết luận: việc định lượng metronidazol bằng phương pháp

von-ampe xung vi phân là hoàn toàn thỏa mãn các điều kiện của phép định

lượng dược phẩm theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế.





75

3.2.3. Xây dựng qui trình định lượng metronidazol trong các mẫu thuốc

Kết quả phân tích trong các mẫu thuốc

Thuốc metronidazol hiện đạng lưu hành trên thị trường chủ yếu dưới

dạng bào chế thuốc viên nén và viên nén bao phim. Căn cứ vào các kết quả

nghiên cứu và qui định về xác định độ đồng đều hàm lượng và độ đồng đều

khối lượng trong kiểm nghiệm dược phẩm của Bộ Y tế (được qui định trong

Dược điển Việt Nam III, phần phụ lục 8.2 8.3) [1; 4], chúng tôi xây dựng qui

trình phân tích đối với chế phẩm chứa metronidazol như sau:

Qui trình xác định: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bìnhcủa 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng bột tương ứng 50,0 mg

metronidazole hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển toàn bộ vào bình định

mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ dung dịch, để lắng

trong (dung dịch 1). Lấy 2,50 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức

50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2, dung dịch này có nồng

độ tương ứng khoảng 0,025mg/ml).Dùng micropipet lấy 1000 µl dung dịch 2 vào bình định mức 25,0ml,

thêm 5ml dung dịch đệm photphat pH = 4,5 rồi định mức bằng nước cất đến

vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều

kiện đã chọn. Hàm lượng metronidazole được xác định bằng phương pháp

thêm chuẩn. Hàm lượng metronidazol trong 1 viên thuốc được xác định theo

công thức:

Hàm lượng metronidazol/viên = 3x

50 100 25025 C *10

1,0 2,5 50 (mg)

3.2.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng metronidazol trong các

mẫu thuốc

Tiến hành định lượng metrodinazole trong 2 loại thuốc là Flagyl 250mg

viên nén bao film sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis Việt Nam (Số





76

lô SX: 230911) và thuốc Metronidazole 250mg viên nén sản xuất tại Công ty

Cổ phần Dược phẩm Hà Tây; (Số lô SX: 290412).

Tiến hành 6 lần cân đo mẫu theo qui trình trên. Kết quả được trình bàytrong bảng 3.27 và 3.28.

Bảng 3.27: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Flagyl 250mg viên

nén bao film sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis Việt Nam.

Mẫu Nồng độ(µg/ml)

Hàm lượngmetronidazol/viên

Hàm lượng phần trăm (%)


1 0,96 239,98 95,99 X = 242,98

(97,19%)

SD = 3,08

RSD = 1,27 %

m = 242,98 ±3,23


2 0,97 243,12 97,25

3 0,96 241,35 96,54

4 0,98 245,05 98,02

5 0,96 240,40 96,16

6 0,99 247,95 99,18


Bảng 3.28: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Metronidazole

250mg viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây.

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

metronidazol/viên

Hàm lượng

phần trăm (%)


1 0,96 239,50 95,80 X = 241,12

(96,45%)SD = 2,86

RSD = 1,18 %

m = 241,12 ±1,378


2 0,95 238,20 95,28

3 0,98 244,35 97,74

4 0,96 240,62 96,25

5 0,98 244,96 97,99

6 0,96 239,10 95,64






77

Các kết quả phân tích đều có RSD nhỏ (nhỏ hơn 2,0% theo tiêu chuẩn

của Bộ Y tế), đáp ứng yêu cầu của phương pháp định lượng dược phẩm. Hàm

lượng của metronidazol trong các thuốc đều đạt yêu cầu từ 95,0 đến 105,0%

so với hàm lượng ghi trên nhãn.




trong khoảng cho phép.

3.2.5. Nghiên cứu định lượng metronidazol trong mẫu nước tiểu

Metronidazol sau khi vào cơ thể bị đào thải qua phân và qua đường

nước tiểu chủ yếu dưới dạng chuyển hóa [2, 3]. Để thử nghiệm khả năng phân

tích định lượng metronidazol trong nước tiểu bệnh nhân chúng tôi tiến hành

các thí nghiệm với các mẫu:

1. Mẫu nước tiểu người bệnh trước khi uống thuốc (không chứa thuốc);2. Mẫu nước tiểu người bệnh sau khi uống thuốc 2 giờ

3. Mẫu nước tiểu người bệnh sau khi uống thuốc 3 giờ

4. Thêm dung dịch chuẩn metronidazol vào mẫu nước tiểu người bệnh

với nồng độ 2,0 µg/ml.

Các mẫu tiến hành ghi đo dòng DP với điều kiện đo như khi lập đường

chuẩn định lượng metronidazol (bảng 3.23). Kết quả trình bày trong hình 3.38.





78

-100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

Hình 3.38: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc

1) Mẫu nước tiểu của người không uống thuốc;

2) Mẫu nước tiểu của người sau khi uống thuốc 2 giờ;

3) Mẫu nước tiểu người sau khi uống thuốc 3 giờ;

4) Mẫu nước tiểu người sau khi uống thuốc 2 giờ, thêm

metronidazol với nồng độ 2,0 µg/ml

Nhận xét: Mẫu nước tiểu người không uống thuốc đã xuất hiện các pic

nhỏ cho thấy mẫu nước tiểu có thành phần phức tạp. Mẫu nước tiểu của người

sau khi uống thuốc có đường nền cao, không xuất hiện pic đặc trưng của

metronidazol. Như vậy metronidazol có thể đã bị chuyển hóa sau khi vào cơ

thể. Sự khác nhau giữa đường DP của nước tiểu người trước khi uống thuốc

và sau khi uống thuốc cũng cho thấy thuốc có ảnh hưởng nhất định đến thành

phần nước tiểu. Để khẳng định điều này chúng tôi tiến hành thêm dung dịch

chuẩn metronidazol vào mẫu nước tiểu của người sau khi uống thuốc 2 giờ rồi

ghi đường DP (đường số 4). Kết quả ghi đo thu được đường DP với pic đặc

trưng của metronidazol. Việc xuất hiện pic đặc trưng của metronidazol khi

thêm vào mẫu nước tiểu cho thấy thành phần nền nước tiểu không cản trở

nhiều đến sự xuất hiện pic của metronidazol, do đó có thể khẳng định trong

4

3

1

2





79

mẫu nước tiểu người đã uống metronidazol hầu như không còn metronidazol

nguyên dạng, nói cách khác metronidazol đã bị chuyển hóa sau khi vào cơ thể

người qua đường uống.

3.3. NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLORPHENIRAMIN

MALEAT

3.3.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp

Khảo sát chọn thành phần và pH dung dịch nền

-600m -800m -1.00 -1.20 -1.40

U (V)

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.39: Đường CV của

clorpheniramin maleat 0,05mg/ml

trong nền đệm photphat pH = 4,60

-800m-900m-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.40: Đường DP củaclorpheniramin maleat nền đệm photphat ở các pH khác nhau

Khảo sát đo von-ampe vòng của dung dịch clorpheniramin maleat trong

một số nền đệm khác nhau, kết quả thấy trong các nền đệm axetat; đệm

Britton-Robinson; đệm photphat xuất hiện pic khử trên đường phân cực catot

trong khoảng từ -0,8 đến -1,2V. Quan sát dạng đường cong có thể thấy quá

trình điện cực là quá trình bất thuận nghịch, phù hợp với phản ứng đề xuất:

pH tăng từ 3,0 đến 7,0

pH = 4,6

R. + 2H+ + 2e → R.CHCOOH

CHCOOH

CH2COOH

CH2COOH





80

Tiến hành ghi đo đường xung vi phân của dung dịch clorpheniramin

maleat, so sánh pic xuất hiện, thấy trong nền đệm photphat pic cao và cân đối,

vì vậy chúng tôi chọn nền đệm photphat để khảo sát ở các yếu tố khác.

Khảo sát sự ảnh hưởng của pH với dung dịch clorpheniramin maleat

20,0 µg/ml trong khoảng pH từ 3,0 đến 7,0. Kết quả trên hình 3.40 và hình

3.41 cho thấy ở pH = 4,6 pic cao, cân đối, vì vậy chọn pH = 4,6 để tiến hành

các khảo sát tiếp theo.

0

10

20

30

40

50

60

2 3 4 5 6 7 8pH

I p ( n A )

Hình 3.41: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào pH của dung dịch nền Khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung

Để khảo sát ảnh hưởng của biên độ xung, tiến hành ghi đường DP của

dung dịch clorpheniramin maleat 20,0 µg/ml trong khoảng biên độ xung từ

10mV đến 100mV. Kết quả trình bày trong bảng 3.29 và hình 3.42 và 3.43.

Bảng 3.29: Sự phụ thuộc I p và E p của clorpheniramin maleat vào biên độ xung

ΔEA (mV) 20 30 40 50 60 70 80 90

- I p (nA) 22,6 30,8 38,2 48,8 55,8 59,7 67,9 74,6

- E p (V) 1,01 1,00 0,998 0,991 0,991 0,990 0,990 0,991

Khi tăng biên độ xung, I p tăng, thế đỉnh pic ít dịch chuyển. Khi biên độ

xung nhỏ pic cân nhưng thấp và tù, khi biên độ xung lớn pic nhọn và cao hơn.





81

Khi biên độ xung lớn hơn 60mV pic gọn nhưng lệch, chân pic cao ảnh hưởng

đến độ nhạy và độ lặp lại của phép đo. Chúng tôi chọn điều kiện đo với biên

độ xung là 60 mV, ở điều kiện này cường độ dòng cao, pic ổn định và khá cân đối.

-800m -900m -1.00 -1.10 -1.20

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.42: Sự phụ thuộc I p


0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100


I p ( n A )

Hình 3.43: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào biên độ

xung



của dung dịch clorpheniramin maleat 20,0 µg/ml, thời gian đặt 1 xung từ 0,01

đến 0,09s. Kết quả trình bày trong bảng 3.30; hình 3.44 và 3.45.

Bảng 3.30: Sự phụ thuộc I p vào thời gian đặt xung

tđặt xung (s) 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09

- I p (nA) 56,8 55,6 54,6 52,8 50,6 48,8 45,5 45,8- E p (V) 0,998 0,997 0,995 0,995 0,995 0,994 0,994 0,995

Kết quả khảo sát cho thấy ở điều kiện thời gian đặt 1 xung 0,01s pic

cao nhọn nhưng bị biến dạng, xuất hiện nhiều pic lạ. Với thời gian đặt xung từ

0,02 đến 0,09 s không có sự biến đổi nhiều về thế đỉnh pic và chiều cao pic

nhưng với biên độ xung nhỏ hơn 0,04s độ lặp không tốt. Vì vậy, chọn điều

kiện thời gian đặt xung là 0,04s.





82

-800m -900m -1.00 -1.10 -1.20

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.44: Đường DP củaclorpheniramin maleat ở cácthời gian đặt xung khác nhau

30

35

40

45

50

55

60

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1

Thời gian đặt 1 xung (s)

I p ( n A )

Hình 3.45: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời

gian đặt 1 xung



xung vi phân với dung dịch clorpheniramin maleat 20,0µg/ml với bước nhảy

thế cố định ở 5mV. Kết quả được trình bày trên bảng 3.31, hình 3.46 và hình3.47. Theo chiều tăng của tốc độ quét thế, cường độ dòng tăng, nhưng tốc độ

quét thế tăng cũng làm chân pic lệch, pic rộng, giảm độ phân giải. Ngược lại

nếu tốc độ quét thế chậm sẽ làm tăng thời gian phân tích và cường độ dòng

nhỏ làm giảm độ nhạy. Ở tốc độ quét thế 12,5mV/s pic gọn, cân đối, vì vậy

chọn tốc độ quét thế là 12,5mV/s.

Bảng 3.31: Sự phụ thuộc I p và E p của clorpheniramin maleat vào tốc độ quét thế

Vquét thế (mV/s) 5 10 12,5 25 50

- I p (nA) 53,5 56,7 58,3 65,5 69.8

- E p (V) 0,996 0,996 0,996 1,00 1,01





83

-800m -900m -1.00 -1.10 -1.20

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.46: Đường DP củaclorpheniramin maleat ở các tốc

độ quét thế khác nhau

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60

Tốc độ quét (mV/s)

I p ( n A )

Hình 3.47: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào tốc

độ quét thế


Nồng độ oxi hòa tan ảnh hưởng nhiều đến quá trình ghi đo dòng xung vi

phân của các chất hữu cơ vì oxi có phản ứng điện hóa trên điện cực giọt thủy

ngân và có thể phản ứng ảnh hưởng với chất phân tích. Vì vậy việc sục khí nitơ

để loại bỏ ảnh hưởng của oxi hòa tan trong dung dịch đo là rất cần thiết. Với

mỗi chất phân tích sự ảnh hưởng của oxi hòa tan cũng khác nhau, thời gian sục

khí quá dài làm mất thời gian phân tích không cần thiết nên cần khảo sát tìm

thời gian sục khí thích hợp vừa đủ để loại bỏ ảnh hưởng của oxi hòa tan.

Tiến hành ghi đo dòng xung vi phân của dung dịch clorpheniramin

maleat 20,0 µg/ml sau các khoảng thời gian sục khí nito: 0s, 30s, 60s, 90s,120s, 180s, 300s. Kết quả trình bày trên bảng 3.32 và hình 3.48 và 3.49.

Bảng 3.32: Sự phụ thuộc I p vào thời gian sục khí nitơ

Thời gian

sục khí (s)0 30 60 90 120 180 300

- I p (nA) 23,6 26,3 42,9 54,1 53.8 54,2 54,3





84

-800m -900m -1.00 -1.10 -1 .20

-60.0n

-50.0n

-40.0n

-30.0n

-20.0n

-10.0n

0

I ( A )

Hình 3.48: Đường DP củaclorpheniramin maleat đo sau

các thời gian sục khí khác nhau

0

10

20

30

40

50

60

0 100 200 300 400

Thời gian sục khí nitơ (s)

I p ( n A )

Hình 3.49: Đồ thị sự phụ thuộc I p vào thời

gian sục khí nitơ


Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn

Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định clorpheniramin

maleat chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đườngchuẩn định lượng clorpheniramin maleat trong mẫu thuốc phương pháp von

ampe với các điều kiện đo trong bảng 3.33; nồng độ clorpheniramin maleat

trong khoảng 5,0 µg/ml đến 45,0 µg/ml.

Bảng 3.33: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch clorpheniramin maleat

Điện cực làm việc HMDE Thời gian 1 xung 0,04s


Kích thước giọt 4 Khoảng quét thế - 0,8V ÷ -1,2V

Thời gian sục khí nitơ 90s Dung dịch nền Đệm photphat

Biên độ xung 0,05V pH 4,60

Kết quả trình bày trong bảng 3.33, hình 3.50 và hình 3.51.





85


clorpheniramin maleat

Nồng độ clorpheniramin (µg/ml) Cường độ dòng (nA)

5 15,4

10 29,4

15 40,8

20 53,8

25 65,5

30 76,3

35 92,0

40 104

45 117


kiểm tra ý nghĩa thống kê của phương trình hồi qui.

Đường chuẩn clorpheniramin

y = 2.517x + 3.0972

R2 = 0.9991

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50

C (microgam/ml)

I p ( n A )

Hình 3.50: Sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ

clorpheniramin maleat

-800m -900m -1.00 -1.10 -1.20

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )


clorpheniramin maleat phụ

thuộc vào nồng độ

Kết quả cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính rõ rệt giữa cường độ dòng

và nồng độ clorpheniramin maleat trong khoảng 5,0 ÷ 45,0 µg/ml.





86

Phương trình đường thẳng:

IP = (2,52 ± 0,03)Cx + (3,10 ± 0,79);

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn.




y3.SLOD

b 1,20.10-3 mg/ml; tương đương 3,08.10-6M

Giới hạn định lượng:y10.S

LOQ b

4,01.10-3 mg/ml; tương đương 1,03.10-5M

Độ đúng

Khảo sát độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn.

Thuốc chuẩn được thêm vào với tỉ lệ 80%; 100% và 120% vào dung dịch

chuẩn nồng độ có sẵn là 10,0 µg/ml. Đo 3 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo

sát. Kết quả đo và tính toán được trình bày trong bảng 3.35.Bảng 3.35: Độ thu hồi của clorpheniramin maleat

Tỉ lệ thêmvào(%)

Nồng độ chuẩnthêm vào nền

(µg/ml)

Nồng độchuẩn tìmlại (µg/ml)

Nồng độ tìmlại trung bình

(µg/ml)

Ðộ lệch chuẩntương đốiRSD(%)

Độ thu hồi

R ev (%)

80 8,0

8,20

8,09 1,64 101,12

8,16

8,09

7,90

100 10,0

10,12

9,91 1,48 99,109,89

9,82

9,80

120 12,0

11,89

11,83 1,09 98,5811,98

11,69

11,77





87



Độ chính xác

Khảo sát độ lặp lại ở nồng độ 10,0 µg/ml; 20,0 µg/ml; 30,0 µg/ml. Ở

mỗi nồng độ, đo 6 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính

toán theo phương pháp đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.36.

Bảng 3.36: Độ lặp lại của clorpheniramin maleat

Mẫu(số xác định

song song)




RSD (%)

1 10,0 10,26

10,07 1,51

2 10,0 10,16

3 10,0 10,05

4 10,0 10,15

5 10,0 9,866 10,0 9,92

1 20,0 19,72

19,901,13

2 20,0 20,25

3 20,0 19,85

4 20,0 19,63

5 20,0 19,87

6 20,0 20,06

1 30,0 29,28

29,49 1,22

2 30,0 29,87

3 30,0 28,99

4 30,0 29,26

5 30,0 29,75

6 30,0 29,79





88


cao, độ lệch chuẩn tương đối đều nằm trong giới hạn cho phép < 2%. Vậy có

thể áp dụng để phân tích định lượng thuốc clorpheniramin maleat trong các

mẫu thuốc.

3.3.3. Xây dựng qui trình định lượng clorpheniramin maleat trong

mẫu thuốc.

Thuốc có thành phần clorpheniramin maleat hiện đạng lưu hành trên thị

trường chủ yếu được bào chế dưới dạng viên nén đơn thành phần và hai thành

phần với paracetamol. Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu và qui định về xác

định độ đồng đều hàm lượng và độ đồng đều khối lượng trong kiểm nghiệm

dược phẩm của Bộ Y tế (được qui định trong Dược điển Việt Nam III, phần

phụ lục 8.2 8.3) [1; 4], chúng tôi xây dựng qui trình phân tích đối với hai loại

chế phẩm này như sau:

Qui trình xác định: cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình

của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng bột tương ứng 4 mgclorpheniramin maleat hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển toàn bộ vào

bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ dung dịch,

để lắng, lọc (bỏ phần dung dịch đầu), dung dịch này có nồng độ tương ứng

khoảng 40 µg/ml (dung dịch A).

Dùng pipet lấy 5,0ml dung dịch A vào bình định mức 25ml, thêm 10ml

dung dịch đệm photphat pH = 4,6 rồi định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹrồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm

lượng clorpheniramin maleat được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Hàm lượng clorpheniramin maleat (CPM) trong 1 viên thuốc được xác

định theo công thức:

Hàm lượng CPM /viên = 3x

10025 C 10

5 (mg)





89

3.3.4. Áp dụng thực tế phân tích trong các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng trong 2 loại thuốc là thuốc clorpheniramin 4

(clorpheniramin maleat 4mg) viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược

phẩm Hậu Giang (Số lô SX: 021210) và thuốc Pacemin (paracetamol 325mg;

clorpheniramin maleat 4mg) viên nang sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược

phẩm Hà Tây; (Số lô SX: 121110).

Tiến hành 6 lần cân đo mẫu theo qui trình trên. Kết quả được trình bày

trong bảng 3.37 và 3.38.

Bảng 3.37: Kết quả định lượng CPM trong viên nén Clorpheniramin 4 (4mg)

sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang


Hàm lượngmg/ viên

Phần trăm sovới ghi trênnhãn (%)


1 8,24 4,12 103,06X = 4,12 (102,91%)

SD = 0,052RSD = 1,27 %

m = 4,12 ± 0,05(mức tin cậy 95%)

2 8,40 4,20 105,043 8,23 4,11 102,86

4 8,17 4,09 102,195 8,09 4,04 101,086 8,26 4,13 103,23Phân tích đối chứng theo phương pháp HPLC 101,8%

Bảng 3.38: Kết quả định lượng CPM trong viên nang Pacemine (4mg

clorpheniramin maleat) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây


Hàm lượngCPM/ viên

Phần trăm so

với ghi trênnhãn (%) Số liệu thống kê

1 8,30 4,15 103,78X = 4,22 (105,58%)

SD = 0,068RSD = 1,61 %

m = 4,22 ± 0,07(mức tin cậy 95%)

2 8,35 4,18 104,46

3 8,45 4,22 105,58

4 8,51 4,25 106,35

5 8,68 4,34 108,54

6 8,38 4,19 104,74






90

Kết quả định lượng hàm lượng clorpheniramin maleat trong 2 loại

thuốc có độ lệch chuẩn tương đối < 2% đáp ứng yêu cầu của phương pháp

phân tích. Hàm lượng phần trăm clorpheniramin maleat so với ghi trên nhãn

của thuốc do Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang sản xuất từ 101,08%

đến 105,04% (trung bình 102,91%); của thuốc do Công ty Cổ phần Dược

phẩm Hà Tây là 103,78% đến 108,54% (trung bình 105,58%). Đối chiếu với

tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam 4, các thuốc đều đạt yêu cầu về hàm

lượng từ 90% đến 110% so với ghi trên nhãn.

So sánh kết quả phân tích với mẫu gửi đi kiểm nghiệm đối chứng(MĐC) tại Công ty Cổ phần Hóa dược Việt Nam theo phương pháp HPLC


là nhỏ, sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.

3.3.5. Nghiên cứu phân tích clorpheniramin maleat trong nước tiểu

Theo các tài liệu tham khảo, clorpheniramin maleat sau khi vào cơ

thể bị chuyển hóa nhanh và nhiều. Các chất chuyển hóa gồm có desmethyl- didesmethyl- clorpheniramin và một số chất chưa được xác định. Thuốc

được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu, sự bài tiết phụ thuộc vào pH và lưu

lượng nước tiểu [2, 3]. Để thử nghiệm khả năng phân tích định lượng

clorpheniramin maleat trong nước tiểu bệnh nhân chúng tôi tiến hành các

thí nghiệm với các mẫu:

1. Mẫu nước tiểu người bệnh trước khi uống thuốc (không chứa thuốc);2. Mẫu nước tiểu người bệnh sau khi uống thuốc 1 giờ



5. Thêm dung dịch chuẩn clorpheniramin maleat vào mẫu nước tiểu

người bệnh với nồng độ 20,0 µg/ml.





91

Các mẫu tiến hành ghi đo dòng DP với điều kiện đo như khi lập đường chuẩn

định lượng clorpheniramin maleat (bảng 3.32). Kết quả trình bày trong hình 3.52

-800m -900m -1.00 -1.10 -1.20

U (V)

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.52: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc

1) Mẫu nước tiểu của người không uống thuốc;

2) Mẫu nước tiểu của người sau khi uống thuốc 2,3,4 giờ;

3) Mẫu nước tiểu người sau khi uống thuốc 2 giờ, thêm

clorpheniramin maleat với nồng độ 20,0 µg/ml Nhận xét: Mẫu nước tiểu người không uống thuốc đã xuất hiện các pic

nhỏ cho thấy mẫu nước tiểu có thành phần phức tạp. Mẫu nước tiểu của người

sau khi uống thuốc có đường nền cao, không xuất hiện pic đặc trưng của

clorpheniramin maleat. Sự khác nhau giữa mẫu nước tiểu người đã uống

thuốc và chưa uống thuốc cho thấy thuốc có ảnh hưởng nhất định đến thành

phần nước tiểu. Như vậy clorpheniramin maleat có thể đã bị chuyển hóa saukhi vào cơ thể. Để khẳng định điều này chúng tôi tiến hành thêm dung dịch

chuẩn clorpheniramin maleat vào mẫu nước tiểu của người sau khi uống

thuốc 2 giờ rồi ghi đường DP (đường số 3). Kết quả ghi đo thu được đường

DP với pic đặc trưng của clorpheniramin maleat. Điều này một lần nữa khẳng

định clorpheniramin maleat đã bị chuyển hóa sau khi vào cơ thể người qua

đường uống và việc định lượng clorpheniramin maleat trong nước tiểu người

3

1

2





92

bệnh sau khi uống thuốc không thực hiện được bằng phương pháp von-ampe

xung vi phân với điện cực HMDE.

3.4. NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CEFADROXIL


xung vi phân

3.4.1.1. Khảo sát các điều kiện thích hợp

Chọn dung dịch nền

Tiến hành quét CV sản phẩm thủy phân của cefadroxil trong một số

nền đệm và nền NaOH. Đường CV của cefadroxil trong nền đệm photphat và

nền NaOH 0,16M (hình 3.52) cho thấy trên đường phân cực catot có xuất hiện

pic khử cao, nhọn tại E p = - 0,78 V, trên đường phân cực anot xuất hiện pic

rất yếu. Như vậy quá trình khử của cefadroxil trên điện cực giọt thủy ngân

gần như bất thuận nghịch.

-200m -400 m -6 00m -8 00m -1. 00

U (V)

-1.00u

0

1.00u

I ( A )

Hình 3.53: Đường CV của cefadroxiltrong nền đệm photphat và nền NaOH

1. nền NaOH

2. cefadroxil 0,1mg/ml trong nền đệm

photphat pH = 13

3. cefadroxil 0,1mg/ml trong nền

NaOH 0,16M

0 -500m -1.00 -1.50

U (V)

-3.00u

-2.00u

-1.00u

0

I ( A )

Hình 3.54: Đường DP của cefadroxiltrong nền đệm photphat và nền NaOH

1. nền NaOH không có cefadroxil

2. cefadroxil 0,1mg/ml trong nền đệm

photphat pH = 13

3. cefadroxil 0,1mg/ml trong nền

NaOH 0,16M

12

3

1

2

3





93

Kết quả khảo sát đo trực tiếp sản phẩm thủy phân của cefadroxil trong

các nền đệm axetat; đệm Britton-Robinson; đệm photphat pH từ 3 đến 13; nền

NaOH 0,1M đến 0,2M thấy trong môi trường axit, nền đệm axetat; Britton-

Robinson có pH dưới 7 không xuất hiện pic; trong nền đệm photphat pH = 13;

nền NaOH 0,1 đến 0,2 M có xuất hiện pic nhọn khá cân đối, cường độ dòng

cao, thay đổi theo nồng độ, E p ít dịch chuyển.

So sánh đường DP của cefadroxil trong nền đệm photphat pH = 13 và

nền NaOH (hình 3.54) thấy rằng pic trong 2 nền tương tự nhau nhưng trong

nền NaOH pic thu được cao và cân đối hơn, nền NaOH cũng phù hợp để thủy

phân thuốc hơn, vì vậy chọn nền là dung dịch NaOH với nồng độ trong

khoảng 0,1M đến 0,2M trong các nghiên cứu tiếp theo.

Trong phản ứng thủy phân, các điều kiện tiến hành phản ứng rất quan

trọng. Thực nghiệm cho thấy với dung dịch cùng nồng độ khi thủy phân

cefadroxil ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ, cường độ dòng

ghi được thấp hơn khi thủy phân 30 phút ở nhiệt độ 100 oC. Vì vậy, chúng tôi

khảo sát các điều kiện thủy phân cefadroxil trong dung dịch NaOH.

Khảo sát điều kiện thủy phân

* Ảnh hưởng của nồng độ NaOH thủy phân:

Tiến hành đo cường độ dòng pic của dung dịch chuẩn cefadroxil nồng

độ 1,0 µg/ml, thủy phân 60 phút ở 100oC trong các nồng độ NaOH khác nhau

thu được kết quả trong bảng 3.39 và hình 3.55.

Kết quả khảo sát cho thấy với 4ml dung dịch NaOH 1M thủy phân ở

100oC trong 60 phút rồi định mức thành 25 ml (nồng độ NaOH sau khi định

mức là 0,16M) cho pic cao và ổn định, vì vậy chúng tôi chọn nồng độ NaOH

0,16M cho các nghiên cứu tiếp theo.





94

Bảng 3.39: Sự phụ thuộc I p vàonồng độ dung dịch nền NaOH

TT Nồng độ NaOH (CM)

- I p (nA)

1 0,04 1552 0,08 1833 0,12 2314 0,16 248

5 0,20 2406 0,24 232

0

50

100

150

200

250

300

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Nồng độ NaOH (CM)

I p ( n A )

Hình 3.55: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độdung dịch nền NaOH

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân:

Tiến hành thủy phân cefadroxil trong dung dịch NaOH ở nhiệt độ

100oC trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả được trình bày trong

bảng 3.40; hình 3.56 và hình 3.57.

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.56: Đường DP của cefadroxil thủy

phân trong dung dịch NaOH 0,16M ở các

thời gian khác nhau


(nA) vào thời gian thủy phân

TT

Thời gian

thủy phân

(phút)

- I p

(nA)

1 5 30,92 15 102

3 30 192

4 45 303

5 60 320

5’

15’

30’

45’

60’





95

0

50

100

150

200

250

300

350

0 20 40 60 80

thời gian thủy phân (phút)

Ip (nA)

Hình 3.57: Sự phụ thuộc I p (nA) vào thời gian thủy phân

(ĐKTN: C cefadroxil = 1,0 µg/ml, C NaOH = 0,16M, nhiệt độ thủy phân: 100oC) Kết quả phân tích cho thấy sau thời gian 45 phút đến 60 phút thủy

phân, dung dịch thu được cho cường độ dòng pic cao và ổn định. Chúng tôi

chọn thời gian thủy phân là 45 phút ở các nghiên cứu tiếp theo.

Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân:

Tiến hành thủy phân cefadroxil trong dung dịch NaOH ở các nhiệt độ

từ 30o

C đến 100o

C trong thời gian 45 phút. Kết quả được trình bày trong hình3.58 và bảng 3.41, đồ thị biểu diễn trên hình 3.59.

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.58: Đường DP của cefadro xilthủy phân ở các nhiệt độ từ 30 đến 100oC

(ĐKTN: C cefadroxil = 1,0 µg/ml,C NaOH = 0,16M, thời gian thủy phân:

60phút)

Bảng 3.41: Sự phụ thuộc I p (nA) vàonhiệt độ thủy phân

TT Nhiệt độ thủy

phân (oC)- I p (nA)

1 30 59.4

2 40 69.73 50 115

4 60 175

5 70 256

6 80 292

7 90 301

8 100 301





96

0

50

100

150

200

250

300

350

0 20 40 60 80 100 120nhiệt độ thủy phân (oC)

Ip (nA)

Hình 3.59: Sự phụ thuộc I p (nA) vào nhiệt độ thủy phân

Kết quả phân tích cho thấy tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 80 oC đến

100oC, thời gian 45 phút, dung dịch thu được cho cường độ dòng pic cao ổn

định. Chúng tôi chọn điều kiện nhiệt độ thủy phân là 90oC.

Kết luận về điều kiện thủy phân cefadroxil: Sau khi khảo sát ảnh

hưởng của các điều kiện thủy phân cefadroxil trong dung dịch NaOH, cácđiều kiện thích hợp thủy phân cefadroxil để ghi đo dòng xung vi phân được

rút ra như sau:

Nồng độ NaOH sau khi định mức: 0,16M

Nhiệt độ: 90oC

Thời gian: 45 phút

Ảnh hưởng của biên độ xungKhảo sát ảnh hưởng của biên độ xung với đường DP của dung dịch

cefadroxil 0,40µg/ml. Khi tăng biên độ xung, I p tăng, thế đỉnh pic dịch về

phía dương hơn, khi ΔEA > 60mV chân pic bị lệch. Chúng tôi chọn điều kiện

đo với biên độ xung là 50 mV, cường độ dòng pic cao và ổn định.





97

-500m -600m -700m -800m

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )


cefadroxil phụ thuộc vào

biên độ xung

0

50

100

150

200

250

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12


I p ( n A )

Hình 3.61: Sự phụ thuộc I p vào biên độ xung



xung vi phân với dung dịch cefadroxil 0,40µg/ml. Kết quả được trình bày trên

hình 3.62 và hình 3.63.

Trong điều kiện không làm giàu, cường độ dòng tăng chậm trong

khoảng quét thế từ 5 đến 15mV/s, sau đó gần như không tăng trong khoảng

quét thế từ 15 đến 50mV/s. Điều này được giải thích: trong khoảng tốc độ

quét thế nhỏ, khi tăng tốc độ quét thế, lượng chất điện hoạt tham gia phản ứng

tăng làm tăng cường độ dòng, khi tốc độ quét thế lớn, chất phân tích khuếch

tán đến điện cực không kịp tốc độ quét nên dòng hầu như không tăng, nếu

tiếp tục tăng tốc độ quét dòng sẽ không tăng nữa.





98

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )


cefadroxil phụ thuộc vào tốc

độ quét thế

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

0 10 20 30 40 50 60

V quét thế (mV/s)

I p ( n A )



ĐKTN: Nồng độ Cefadroxil 0,1µg/ml; thủy

phân 90oC trong thời gian 45 phút; nền

NaOH 0,16M; t acc = 0 s; t cb = 10s; sục khí

N 2 180s; E range = - 0,5V đến - 0.9V)

Trong luận án chúng tôi lựa chọn tốc độ quét thế là 12,5mV/s, ở điềukiện này tín hiệu dòng cao và ổn định.

3.4.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp


Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định cefadroxil chúng


cefadroxil trong mẫu thuốc với các điều kiện đo trong bảng 3.42, kết quả thuđược biểu diễn trong bảng 3.43:





99

Bảng 3.42: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch cefadroxil

Điện cực làm việc HMDE Thời gian đặt một xung 0,04s


Kích thước giọt 4 Khoảng quét thế -0,5V÷ -0,9V

Thời gian đuổi oxi 90s Dung dịch nền NaOH 0,16M

Thời gian làm giàu 0s Nhiệt độ thuỷ phân 90oC

Biên độ xung 0,05V Thời gian thủy phân 45 phút

Bảng 3.43: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ cefadroxil

Nồng độ cefadroxil

(µg/ml)- E p (V) - I p (nA)

0,20 0,701 38,9

0,24 0,707 47,0

0,32 0,702 72,7

0,40 0,706 99,3

0,60 0,711 155

0,80 0,721 218

1,00 0,728 278

1,20 0,733 336

1,60 0,736 451

2,00 0,746 567

Đường chuẩn và phổ đồ của cefadroxil ở các nồng độ được biểu diễn

trong hình 3.64 và 3.65.





100

Đường chuẩn cefadroxil

y = 295x - 20.331R2 = 0.9998

0

100

200

300

400

500

600

0 0.5 1 1.5 2 2.5

C (microgam/ml)

Ip (nA)

Hình 3.64: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính I p vào

nồng độ cefadroxil

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-500n

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.65: Đường DPcủa cefadroxil ở các

nồng độ

Xây dựng đường chuẩn và kiểm tra thống kê trên phần mềm Origin 8.0

cho thấy phương trình hồi qui có ý nghĩa thống kê. Như vậy, có sự phụ thuộc

tuyến tính giữa nồng độ cefadroxil trong khoảng 0,2 đến 2,0 µg/ml và cường

độ dòng pic theo phương trình hồi qui:

IP = (295,00 ± 1,35)*Cx – (20,33 ± 1,37) với R 2 = 0,9998.





Giới hạn phát hiện:y3.S

LOD b

2,37.10-2 µg/ml; tương đương 6,22.10-8 M


y10.SLOQ

b 7,90.10-2 µg/ml; tương đương 2,07.10-7 M





101

Độ đúng

Khảo sát mẫu trắng (mẫu không có cefadroxil) không có tín hiệu điện

hóa, vậy sự có mặt của tá dược trong mẫu không ảnh hưởng đến quá trình

định lượng. Khảo sát độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm

chuẩn với dung dịch chuẩn nồng độ 0,5 µg/ml. Tiến hành thêm vào mẫu

chuẩn các nồng độ tương ứng với 80%, 100% và 120% nồng độ có sẵn trong

nền. Đo 3 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán được

trình bày trong bảng 3.44.

Bảng 3.44: Độ thu hồi của cefadroxil

Tỉ lệ

thêm

vào

(%)

Nồng độ

chuẩn thêm

vào nền

(µg/ml)

Nồng độ

chuẩn tìm

lại

(µg/ml)

Nồng độ

tìm lại

trung bình

(µg/ml)


tương đối

RSD(%)

Độ thu

hồi H

(%)

80% 0,40

0,39

0,392 1,40% 98,12%0,390,39

0,40

100% 0,50

0,50

0,492 1,35% 98,40%0,49

0,49

0,49

120% 0,600,60

0,607 1,02% 101,17%0,61

0,62

0,60

Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng cao, độ lệch

chuẩn thấp (<2%) độ thu hồi trung bình là 99,23%, nằm trong giới hạn cho

phép là 98 – 102%.





102

Độ chính xác



toán được trình bày trong bảng 3.45.

Bảng 3.45: Độ lặp lại của cefadroxil

Mẫu(số xác

định song

song)




RSD (%)

1 0,30 0,30

0,292 1,40%

2 0,30 0,29

3 0,30 0,29

4 0,30 0,29

5 0,30 0,29

6 0,30 0,29

1 0,90 0,91

0,897 1,15%

2 0,90 0,91

3 0,90 0,89

4 0,90 0,89

5 0,90 0,89

6 0,90 0,89

1 1,50 1,48

1,495 1,38%

2 1,50 1,48

3 1,50 1,51

4 1,50 1,47

5 1,50 1,51

6 1,50 1,52







103

Nhận xét: Qua nghiên cứu khảo sát các điều kiện phân tích cefadroxil

cho thấy: cefadroxil với phân tử khá cồng kềnh, có vòng β-lactam ngưng tụ

với vòng 6 cạnh không có hoạt tính điện hóa trực tiếp. Thực nghiệm đã cho

thấy với các hệ đệm axetat, photphat, Britton-Robinson có pH = 2 ÷ 8 không

có tín hiệu điện hóa. Khi bị thủy phân trong môi trường kiềm cefadroxil tạo

thành các sản phẩm chứa nhóm C = N và C = C có phản ứng khử trên điện

cực thủy ngân. Trong nền đệm photphat và nền NaOH sản phẩm thủy phân

của cefadroxil cho pic nhọn tại thế khoảng -0,7V. Nghiên cứu đường von-

ampe vòng cho thấy sản phẩn thủy phân của cefadroxil có hoạt tính điện hóagần thuận nghịch, pic khử cao hơn píc oxi hóa nhiều lần vì vậy chọn pic khử

để phân tích. Thực nghiệm đã thành công khi chọn điều kiện thủy phân và các

điều kiện ghi đo phổ von-ampe xung vi phân cho thế đỉnh pic khá ổn định.

Khoảng tuyến tính là 0,2 – 2,0 µg/ml với R 2 = 0,9998, LOD = 6,22.10-8M,

LOQ = 2,07.10-7M. Các kết quả nghiên cứu về độ đúng, độ chính xác đều

nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế về định lượng dược phẩm.3.4.1.3. Xây dựng qui trình định lượng cefadroxil trong mẫu thuốc.

Thuốc cefadroxil hiện đạng lưu hành trên thị trường chủ yếu dưới

thuốc viên. Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu và qui định về xác định độ

đồng đều hàm lượng và độ đồng đều khối lượng trong kiểm nghiệm dược

phẩm của Bộ Y tế (được qui định trong Dược điển Việt Nam III, phần phụ

lục 8.2 8.3) [1; 4], chúng tôi xây dựng qui trình phân tích đối với hai loại chế

phẩm này như sau:

Qui trình xác định: cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình

của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng bột tương ứng 50,0 mg

cefadroxil hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức

100 ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ dung dịch, để lắng trong

(dung dịch 1). Lấy 2,50 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 50 ml,

định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2).





104

Dùng micropipet lấy 0,30 ml dung dịch 2, thêm nước cất đến khoảng

5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1,0M, thủy phân trong 45 phút, để nguội,

chuyển vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ

rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn.

Hàm lượng cefadroxil được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Hàm

lượng cefadroxil trong 1 viên thuốc được xác định theo công thức:

Hàm lượng cefadroxil/viên = 3x

50 100 50025 C *10

0,3 2,5 50 (mg)

3.4.1.4. Áp dụng thực tế phân tích các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng cefadroxil trong 2 loại thuốc là Cefadroxil 500mg

viên nang dạng bột sản xuất tại Công ty TNHH MTV Dược phẩm và sinh học

y tế Mebiphar (Số lô SX: 020810) và Công ty Cổ phần Dược phẩm TW-

Vidapha; (Số lô SX: 020910).



Bảng 3.46: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500 mg)

sản xuất tại Công ty TNHH MTV Dược phẩm và sinh học y tế Mebiphar.

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

cefadroxil / viên

Hàm lượng


1 0,299 498,50 99,70X = 491,72 (98,34%)

SD = 5,63

RSD = 1,14 %

m = 491,72 ± 5,91


2 0,295 492,33 98,473 0,291 484,33 96,87

4 0,297 495,83 99,17

5 0,296 493,67 98,73

6 0,291 485,67 97,13






105

Bảng 3.47: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500 mg)

sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm TW- Vidapha.

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

cefadroxil / viên

Hàm lượng


1 0,290 482,67 96,53 X = 487,44 (97,49%)

SD = 6,61

RSD = 1,36 %

m = 487,44 ± 6,94(mức tin cậy 95%)

2 0,288 480,83 96,17

3 0,292 487,33 97,47

4 0,290 484,17 96,83

5 0,299 498,83 99,77

6 0,294 490,83 98,17


Các kết quả phân tích đều có RSD nhỏ (<2,0%), đáp ứng yêu cầu của

phương pháp phân tích. Các kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng

cefadroxil trong các viên thuốc từ 96,53 đến 99,77 % so với ghi trên nhãn, đối

chiếu với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4 [1] thấy thuốc của các công ty

trên đều đạt tiêu chuẩn 90 đến 110% so với ghi trên nhãn.




trong giới hạn cho phép sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.


hòa tan hấp phụ

3.4.2.1. Nghiên cứu đặc tính hấp phụ của cefadroxil trên điện cực HMDE

Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác biết trước, tiến hành quét

thế von-ampe vòng và von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân trong điều kiện

thích hợp với thời gian làm giàu khác nhau. Khả năng hấp phụ của thuốc trên

điện cực được thể hiện qua cường độ pic tăng theo thời gian làm giàu.





106

Kết quả nghiên cứu khả năng hấp phụ của cefadroxil trên điện cực giọt

thủy ngân đối với dung dịch cefadroxil thể hiện trong hình 3.66 và 3.67.

-400m -600m -800m -1.00 -1.20

U (V)

-140n

-120n

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

I ( A )

Hình 3.66: Phổ CV của thuốc

cefadroxil ở các thời gian làm giàu:

0s; 30s; 60s; 90s; 150s; 180s.

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

Hình 3.67: Phổ DP của thuốc

cefadroxil ở các thời gian làm giàu:

0s; 30s; 60s; 90s; 180s.

Có sự tăng mạnh của cường độ dòng pic theo thời gian làm giàu cho

thấy cefadroxil có khả năng hấp phụ tốt trên điện cực giọt thủy ngân. Ảnh hưởng của thế tích lũy (E acc )

Thế tích lũy là yếu tố rất quan trọng quyết định khả năng hấp phụ và

tham gia phản ứng khử cực của chất trên bề mặt điện cực. Vì vậy chúng tôi

khảo sát ảnh hưởng của thế tích lũy trước khi khảo sát các yếu tố khác ảnh

hưởng khác đến cường độ dòng hấp phụ. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của

thế tích lũy đến dung dịch có nồng độ 0,1 µg/l. Kết quả được trình bày trênhình 3.68, bảng 3.478và hình 3.69.

Ở thế hấp phụ từ -0,3 V đến -0,4V giá trị cường độ dòng cao và ổn

định. Chúng tôi chọn thế hấp phụ -0,4 V cho các nghiên cứu tiếp theo.





107

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )

Hình 3.68: Đường DP-AdSV củacefadroxil phụ thuộc vào thế tích lũy (Eacc )

Bảng 3.48: Sự phụ thuộc I p (nA)

vào thế tích lũy

TT -Eacc (V) - I p (nA)1 0,1 56,52 0,2 74,93 0,3 96,04 0,4 97,0

5 0,5 88,8

0

20

40

60

80

100

120

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6-Eacc (V)

Ip (nA)

Hình 3.69: Sự phụ thuộc I p vào Eacc

Ảnh hưởng của thời gian tích lũy (t acc )

Thời gian tích lũy là khoảng thời gian chất hấp phụ lên điện cực.

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian tích lũy đối với dung dịch

cefadroxil nồng độ 0,1 µg/ml. Kết quả được trình bày trên hình 3.70, bảng

3.49 và hình 3.71.





108

-500m -600m -700m -800m -900m

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.70: Đường DP-AdSV của

cefadroxil phụ thuộc vào thời gian

tích lũy (tacc)

Bảng 3.49: Sự phụ thuộc I p (nA) vàothời gian tích lũy (tacc)

TT tacc (s) - I p (nA)1 0 262 30 55,23 60 86,44 90 1085 120 121

6 180 1387 240 1528 300 162

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 50 100 150 200 250 300 350

Thời gian tích lũy (s)

I p ( n A )

Hình 3.71: Ảnh hưởng của thời gian tích lũy đến cường độ dòng pic

Khi tăng thời gian làm giàu từ 0s đến 60s, cường độ dòng pic tăng

nhanh, sau 60s cường độ dòng tăng chậm hơn khi tăng thời gian làm giàu. Sự

tăng thời gian tích lũy làm tăng lượng chất hấp phụ trên điện cực nên khi quét

thế, lượng chất hòa tan tăng làm tăng cường độ dòng. Tiếp tục tăng thời gian

tích lũy chất phân tích tiếp tục được hấp phụ trên điện cực nhưng khi quét thế





109

không thể hòa tan hết chất đã hấp phụ, vì vậy sự tăng cường độ dòng tăng

chậm. Nếu tiếp tục tăng thời gian tích lũy cường độ dòng sẽ đạt bão hòa và

không tăng thêm nữa. Như vậy, tùy thuộc nồng độ cần xác định mà có thể

chọn thời gian làm giàu khác nhau. Chúng tôi chọn thời gian làm giàu là 60s.


Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ tốc độ quét thế ảnh

hưởng nhiều đến cường độ dòng hấp phụ. Khi chất phân tích đã hấp phụ trên

điện cực khi tăng tốc độ quét thế lượng chất phân tích bị hòa tan tăng làm

tăng cường độ dòng. Tiến hành khảo sát sảnh hưởng của tốc độ quét thế đến

dòng hấp phụ với dung dịch cefadroxil 0,1µg/ml với các điều kiện đo khác cố

định. Kết quả biểu diễn trên hình 3.72 và 3.73.

-500m -600m -700m -800m -900m

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

Hình 3.72: Đường DP-AdSV

của cefadroxil phụ thuộc vào

tốc độ quét thế

406080

100120140160180200

0 10 20 30 40 50 60

Tốc độ quét thế (m V/s)

I p ( n A )



ĐKTN: Cefadroxil 0,1µg/ml; thủy phân 90oC

trong thời gian 45 phút; nền NaOH 0,16M;

t acc = 60 s; t cb = 10s; sục khí N 2 180s) Khi tốc độ quét thế trong khoảng 5mV đến 25mV cường độ dòng tăng

khá nhanh, khi tăng tốc độ quét thế lên 50mV/s cường độ dòng giảm chứng tỏ

dòng hấp phụ đã bão hòa. Tốc độ quét thế tăng cũng làm bán chiều rộng pic

tăng giảm độ chọn lọc. Chúng tôi chọn tốc độ quét thế là 12,5mV/s pic gọn và

ổn định.





110

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Thay đổi nhiệt độ của dung dịch khi đo trong khoảng từ 10 đến 60oC

với dung dịch đo là cefadroxil 0,1µg/ml để xét sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến

dòng hấp phụ. Kết quả biểu diễn trên hình 3.74.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70

Nhiệt độ (oC)

I p

( n A )

Hình 3.74: Sự phụ thuộc I p vào nhiệt độ

Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến cường độ dòng

hấp phụ hòa tan. Cường độ dòng đạt cao nhất ở khoảng nhiệt độ 25oC đến

40oC. Khoảng nhiệt độ dưới 20oC, khi tăng nhiệt độ dòng tăng do tốc độ phản

ứng điện cực tăng, khi nhiệt độ cao hơn 35oC cường độ dòng giảm do khi

nhiệt độ cao làm giảm hấp phụ trên điện cực. Ở khoảng nhiệt độ 25oC đến

30oC cường độ dòng không thay đổi nhiều, vì vậy để thuận lợi cho quá trình

làm thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi chọn điều kiện nhiệt độ phòng thí

nghiệm (khoảng 25oC) để phân tích.

3.4.2.2. Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp


Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định cefadroxil chúng


cefadroxil trong mẫu thuốc theo phương pháp von ampe hòa tan hấp phụ với





111

các điều kiện đo trong bảng 3.50; nồng độ cefadroxil trong khoảng 0,04 µg/ml

đến 0,4 µg/ml. Kết quả trình bày trong bảng 3.51, hình 3.75 và hình 3.76.

Bảng 3.50: Các điều kiện ghi đo dòng AdSV với dung dịch cefadroxil

Điện cực làm việc HMDE Biên độ xung 0,05V

Chế độ ghi DP Thời gian một xung 0,05s

Kích thước giọt 4 Tốc độ quét thế 12,5mV/s

Tốc độ khuấy 2000 vòng/ph Khoảng quét thế -0,5V÷ -0,9V

Thời gian đuổi oxi 90s Dung dịch nền NaOH 0,16MThế làm giàu -0,4V Nhiệt độ thuỷ phân 90oC

Thời gian làm giàu 60s Thời gian thủy phân 45 phút

Thời gian cân bằng 10s Nhiệt độ 25oC

Bảng 3.51: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ cefadroxil

Nồng độ cefadroxil

(µg/ml) - E p (V) -I p (nA)0,04 0,732 33,8

0,06 0,732 50,1

0,08 0,736 69,8

0,10 0,735 95,8

0,12 0,741 118

0,15 0,741 1500,18 0,743 181

0,25 0,748 249

0,30 0,755 304

0,35 0,760 356

0,40 0,762 412





112


kiểm tra ý nghĩa thống kê của phương trình hồi qui. Kết quả cho thấy phương

trình hồi qui có ý nghĩa thống kê. Có sự phụ thuộc tuyến tính rõ rệt giữa

cường độ dòng và nồng độ cefadroxil trong khoảng 0,04 ÷ 0,4 µg/ml.

Phương trình đường thẳng:

IP = (1050,5691 ± 6,8169).Cx – (10,2868 ± 1,4905)

Đường chuẩn Ce fadroxil

y = 1050.6x - 10.287R2 = 0.9996

0

50

100

150

200

250

300

350400

450

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

C (microgam/ml)

Ip (nA)

Hình 3.75: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa

cường độ dòng vào nồng độ cefadroxil.

-5 00 m -6 00 m -7 00 m -800m -900m

U (V)

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.76: Đường CSV củacefadroxil ở các nồng độ

khác nhau




kết quả: Sy = 2,51. Từ đó tính được:Giới hạn phát hiện:

y3.SLOD



y10.SLOQ






113

Độ đúng

Khảo sát độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn với

nồng độ có sẵn là 0,10 µg/ml, lượng thêm vào tương ứng 80%; 100%; 120%

so với nồng độ có sẵn. Đo 3 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo

và tính toán được trình bày trong bảng 3.52.

Bảng 3.52: Độ thu hồi cefadroxil theo phương pháp AdSV

Tỉ lệ

thêmvào

(%)

Nồng độ

chuẩn thêmvào nền

(µg/ml)

Nồng độ

chuẩn tìmlại

(µg/ml)

Nồng độ

tìm lạitrung bình

(µg/ml)


tương đối

RSD(%)

Độ thu hồiR ev (%)

80 0,08

0,077

0,079 1,27 98,750,079

0,079

0,079

100 0,10

0,100

0,101 1,14 101,000,100

0,102

0,102

120 0,12

0,118

0,118 1,20 98,330,116

0,119

0,119


từ 98,33 đến 101,00, nằm trong giới hạn cho phép là 98 – 102%.





114

Độ chính xác



toán được trình bày trong bảng 3.53.

Bảng 3.53: Độ lặp lại của cefadroxil (phương pháp AdSV)

Mẫu(số xác

định song

song)

Nồng độ chuẩn

(µg/ml)

Nồng độ xác

định (µg/ml)

Nồng độ trung

bình (µg/ml)RSD (%)

1 0,05 0,049

0,049 2,00

2 0,05 0,0493 0,05 0,0494 0,05 0,0495 0,05 0,051

6 0,05 0,0481 0,15 0,151

0,148 1,63

2 0,15 0,1503 0,15 0,1484 0,15 0,1505 0,15 0,146

6 0,15 0,1451 0,30 0,306

0,304 1,41

2 0,30 0,3103 0,30 0,3034 0,30 0,3055 0,30 0,299

6 0,30 0,299





115



Nhận xét: Khả năng hấp phụ trên điện cực giọt thủy ngân đã được xác

nhận bằng thực nghiệm qua sự tăng mạnh cường độ dòng pic theo thời gian

hấp phụ. Với thời gian làm giàu 60s trên điện cực giọt thủy ngân khoảng

tuyến tính 0,04 ÷ 0,4 µg/ml R 2 = 0,9996, LOD = 1,88.10-8 M; LOQ =

6,28.10-8M. Kết quả nghiên cứu thực nghiệm về độ đúng, độ chính xác của

phương pháp cho thấy phương pháp có độ đúng, độ chính xác đạt yêu cầu

của phương pháp định lượng dược phẩm của Bộ Y tế. So sánh với phương

pháp định lượng cefadroxil bằng phương pháp DP, phương pháp DP-AdSV

cho độ nhạy cao hơn khoảng 6 lần, tuy nhiên nếu tăng thời gian làm giàu, độ

nhạy của phương pháp chắc chắn sẽ cao hơn, cho phép định lượng với nồng

độ rất nhỏ.

3.4.2.3. Xây dựng qui trình định lượng cefadroxil trong mẫu thuốc.

Qui trình xác định: Theo qui định về kiểm nghiệm dược phẩm [4], tiến

hành cân 20 viên (hoặc 5 gói) thuốc, xác định khối lượng trung bình của 1

viên (hoặc 1 gói), nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng bột tương ứng

50,0mg cefadroxil hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển toàn bộ vào bình

định mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ dung dịch, để

lắng trong (dung dịch 1). Lấy 2,50 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức

50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2).

Dùng micropipet lấy 50µl dung dịch 2, thêm nước cất đến khoảng 5ml,

thêm 4ml dung dịch NaOH 1,0M, thủy phân trong 45 phút ở 90 oC, để nguội,

chuyển vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ

rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn.

Hàm lượng cefadroxil được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.





116

Hàm lượng cefadroxil trong 1 viên thuốc được xác định theo công thức:

Hàm lượng cefadroxil/viên = 3x 50 100 50025 C *100,05 2,5 50

(mg)

Hàm lượng cefadroxil trong 1 gói thuốc được xác định theo công thức:

Hàm lượng cefadroxil/gói = 3x

50 100 25025 C *10

0,05 2,5 50 (mg)

3.4.3.4. Áp dụng thực tế phân tích các mẫu thuốc

Tiến hành định lượng cefadroxil trong 2 loại thuốc là Ocefacel 500mgviên nang dạng bột (sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây; Số lô

SX: 020411, sản xuất ngày 01/04/2011) và Tytdroxil 250mg dạng bột pha hỗn

dịch uống (sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Glomed; số lô SX:

1104012, sản xuất ngày 07/04/2011).



Bảng 3.54: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang Ocefacel (cefadroxil500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

cefadroxil / viên

Hàm lượng


1 0,049 494,1 98,82 X = 485,30 (97,06%)

SD = 5,78

RSD = 1,19 %

m = 485,30 ± 6,07


2 0,049 486,9 97,38

3 0,048 479,7 95,94

4 0,048 485,8 97,16

5 0,049 487,2 97,44

6 0,048 478,1 95,62

Phân tích đối chứng theo phương pháp HPLC 96,2





117

Bảng 3.55: Kết quả định lượng cefadroxil trong thuốc bột Tytdroxil (cefadroxil

250mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Glomed

Mẫu Nồng độ

(µg/ml)

Hàm lượng

cefadroxil / viên

Hàm lượng


1 0,050 248,3 99,32 X = 242,36 (96,94%)

SD = 3,30

RSD = 1,36 %

m = 242,36 ± 3,47


2 0,048 240,9 96,36

3 0,048 241,95 96,78

4 0,049 243,75 97,50

5 0,048 239,8 95,92

6 0,048 239,45 95,78

Phân tích đối chứng theo phương pháp HPLC 98,3

Các kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng cefadroxil trong các

viên thuốc từ 96,62 đến 98,82 % so với ghi trên nhãn, trong các gói thuốc bột

là 95,78 đến 99,32 đối chiếu với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4 [1] thấythuốc của các công ty trên đều đạt tiêu chuẩn 90 đến 110% so với ghi trên

nhãn. Như vậy các thuốc trên đều đạt chuẩn về hàm lượng hoạt chất.




trong giới hạn cho phép, sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.

3.4.2.5. Nghiên cứu định lượng cefadroxil trong các mẫu nước tiểu

Mẫu nước tiểu là mẫu có thành phần phức tạp. Nước tiểu gồm 95 - 96%

là nước và một ít chất khô (4 - 5%). Trong nước tiểu có chứa nhiều chất hóa

học như urê, axit uric, creatinin, natri, kali, lưu huỳnh, photphat, sulfat,

NaCl, Flo, Chì, và một số hoocmon, có thể có lượng rất nhỏ protein và chất

hoạt động bề mặt. Các chất trong nước tiểu có thể gây ức chế phản ứng điện





118

hóa hoặc gây nhiễu, gây sai số lớn khi định lượng thuốc trong nước tiểu. Vì

vậy việc xử lý mẫu nước tiểu trước khi định lượng là rất cần thiết.

Theo các tài liệu tham khảo [3], nồng độ cefadroxil trong nước tiểu

người bệnh sau uống liều 1000mg cefadroxil, khi đạt đỉnh có thể trên 2,0

mg/ml. Đây là nồng độ khá lớn, để phân tích hàm lượng cefadroxil trong

nước tiểu theo phương pháp von-ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ thì phải

pha loãng. Ngược lại, với những mẫu nước tiểu lấy khi mới uống thuốc và khi

thuốc đã đào thải gần hết, nồng độ thuốc rất thấp. Như vậy nồng độ của thuốc

trong nước tiểu có khoảng dao động lớn nếu phân tích trực tiếp không thể đạtđộ chính xác cần thiết.

Chúng tôi lựa chọn phương pháp xử lý mẫu nước tiểu theo phương

pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB tương tự như đối với ofloxacin.

Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải:

Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, với cột chiết Oasis HLB Extraction

Cartridge có thể sử dụng dung môi rửa giải là CH3OH để tách hiệu quả các

dược phẩm. Theo Dược điển Việt nam và dược điển Anh đều dùng hỗn hợp

dung môi acetonnitrin: đệm photphat pH 5,0 để phân tích cefadroxil bằng

phương pháp HPLC. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát trên một số hỗn hợp

dung môi của metanol và acetonnitrin. Các hỗn hợp dung môi có pH trong

khoảng 5 đến 6, tương đương pH của mẫu nước tiểu.

Các dung môi được pha chế từ metanol; acetonnitrin; dung dịch đệm

photphat pH 5,0; nước cất theo tỉ lệ thể tích. Thành phần của các hệ dung môi

khảo sát được thể hiện trong bảng 3.56.

Để đánh giá hiệu quả chiết của các hệ dung môi chúng tôi tiến hành

như sau:

Bước 1: Lấy mẫu nước tiểu người không uống thuốc. Thêm cefadroxil

vào mẫu với nồng độ 0,5mg/ml. Lấy chính xác 10,00 ml nước tiểu đã thêm

thuốc chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch





119

(dung dịch 1). Cho 2,5 ml dung dịch 1 đi qua cột chiết HLB, rửa tạp chất bằng

5ml dung dịch đệm photphat pH 5,0; rửa giải thu hồi cefadroxil bằng hỗn hợp

dung môi cần khảo sát. Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào

bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng

micropipet lấy chính xác 1000 µl dung dịch A, thêm nước cất đến thể tích

khoảng 5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1M, thủy phân trong 45 phút ở 90oC,

chuyển vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện

phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.

Bước 2: Tiến hành giống như bước 1 nhưng thuốc cefadroxil đượcthêm vào dịch chiết thu hồi được sau khi qua cột với một lượng tương đương.

Hiệu quả tách của dung môi được đánh giá thông qua hiệu suất chiết,

tính theo công thức:

t

c

IH (%)

I

trong đó: It: cường độ dòng pic của mẫu giả xử lý theo qui trình (bước 1)

Ic: cường độ dòng pic của mẫu chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng

(bước 2).

Kết quả được trình bày trong bảng 3.56:

Bảng 3.56: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi

TT Hệ dung môi (tỉ lệ thể tích) Hiệu suất chiết

1 Acetonnitrin: đệm photphat pH 5,0 (96:4) 68,7

2 Metanol: nước (95:5) 75,5

3 Metanol: nước (90:10) 77,8



(ĐKTN: pH = 5 – 6, thể tích dung môi = 3ml, tốc độ chảy 0,5 ml/phút)





120

Với hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) cho

hiệu suất chiết cao, pic gọn không có tín hiệu nhiễu. Vậy, chọn thành phần

dung môi chiết là hỗn hợp acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10).

Sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic

Dung môi chiết tốt phải không ảnh hưởng đến pic của chất phân tích,

chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic của

chất cefadroxil. Tiến hành đo phổ của dung dịch cefadroxil 0,1 µg/ml trong

điều kiện có thêm dung môi acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) với các

thể tích khác nhau. Kết quả thể hiện trong bảng 3.57 và hình 3.77.



V dungmôi (ml)

I p

1,0 92,51,5 92,6

2,0 92,22,5 92,13,0 91,83,5 90,84,0 89,55,0 87,6

70

75

80

85

90

95

0 1 2 3 4 5 6

V dung môi (ml)

I p ( n A )

Hình 3.77: Sự phụ thuộc I p thể tích dung môi

Kết quả khảo sát cho thấy, với thể tích dung môi trong khoảng 1ml đến

5ml không có sự ảnh hưởng đáng kể đến cường độ dòng pic và thế đỉnh pic. Như vậy hỗn hợp dung môi acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) phù hợp

dùng để tách chiết, phân tích các kháng sinh nhóm cephalosporin trong nước

tiểu theo phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ.

Khảo sát pH chiếtMẫu nước tiểu thường có pH khoảng 5 ÷ 6, Dược điển Việt Nam và

Dược điển Anh dùng phương pháp HPLC sử dụng dung môi pha động có pH

= 5,0 (đệm photphat). Cefadroxil có nhóm axit và nhóm amin, pK a1 = 4,5;





121

pK a2 = 10,0. Điểm pH đẳng điện của cefadroxil trong khoảng 5 đến 6, trong

khoảng này có thể thực hiện chiết theo nguyên tắc pha đảo, vì vậy, chúng tôi

khảo sát hiệu suất chiết của hệ dung môi acetonnitrin: metanol: nước

(10:80:10) trong khoảng 4,0 đến 7,0; điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH

0,1M và H3PO4 0,1M. Kết quả trình bày trong bảng 3.57. Kết quả cho thấy

với pH dung môi chiết từ 5,0 đến 6,0 nằm trong khoảng điểm đẳng điện của

cefadroxil cho hiệu suất chiết tốt là phù hợp về mặt khoa học. Kiểm tra pH

của hệ dung môi acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) thấy rằng pH trong

khoảng 5,0 đến 6,0 khi sử dụng hệ dung môi này không dùng đệm photphat

cho hiệu suất chiết tương đương vì vậy chúng tôi chọn điều kiện pha hệ dung

môi chiết bằng nước cất mà không chuẩn bị hệ đệm photphat.


suất chiết vào pH của dung môi

pH Hiệu suất chiết

3 71,6

4 78,9

5 83,8

6 84,2

7 81,1

9 68,1

5,8

(pha bằngnước cất)

84,9

50

55

60

65

70

75

80

85

90

0 2 4 6 8 10pH

H ( % )


pH của dung môi

Khảo sát tốc độ nạp mẫu và rửa giải

Như đã trình bày trong mục 3.1, tốc độ nạp mẫu ảnh hưởng đến sự hấp

thu của chất phân tích vào pha tĩnh. Theo tài liệu tham khảo [1] đối với

phương pháp HPLC, cột C18 tốc độ bơm mẫu là 1,5ml/phút. Với các mẫu





122

nước tiểu chứa cefadroxil nồng độ không quá nhỏ, thể tích mẫu nhỏ (khoảng

2,0ml), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ nạp mẫu với cột chiết pha rắn

HLB từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.59 và hình 3.82.Bảng 3.59: Sự phụ thuộc hiệu

suất chiết vào tốc độ nạp mẫu

Tốc độ nạp mẫu

(ml/phút)

Hiệu suất

chiết

0,5 83,5

1,0 83,5

1,5 82,8

2,0 79,2

2,5 74,4

3,0 63,7

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3tốc độ nạp mẫu (ml/phút)

H i ệ u s u

ấ t c h i ế t ( % )


tốc độ nạp mẫu

Kết quả phân tích cho thấy với tốc độ nạp mẫu từ 0,5 đến 1,5 ml/phúthiệu suất chiết cao (trên 83%). Khi tốc độ nạp mẫu tăng lên đến 3,0 ml/phút

hiệu suất chiết chỉ còn 63,7%. Chúng tôi chọn điều kiện nạp mẫu vào cột với

tốc độ 1,0 ml/phút (thực tế trong khoảng 0,8 – 1,0 ml/phút).

Tốc độ rửa giải ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tốc độ rửa giải nhanh thì

không giải chiết hết, rửa giải chậm gây tốn thời gian phân tích. Trong điều

kiện nghiên cứu, thể tích dung môi rửa giải không lớn (do có sự ảnh hưởngcủa dung môi khi đo mẫu) cần rửa giải với tốc độ chậm để giải chiết hết mà

không bị ảnh hưởng bởi dung môi khi đo mẫu. Tiến hành khảo sát sự phụ

thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ rửa giải với 3,0ml hỗn hợp dung môi với tốc

độ từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình cho thấy với tốc độ rửa giải từ 0,5 đến

2,0 ml/phút cho hiệu suất chiết tốt (trên 83%), vì vậy chúng tôi chọn điều kiện

tốc độ rửa giải 1,0ml/phút (tương đương tốc độ nạp mẫu).





123

Khảo sát thể tích dung môi rửa giải

Thể tích dung môi rửa giải ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết, nếu thể

tích dung môi nhỏ sẽ chiết không hết chất hấp phụ, hiệu suất chiết nhỏ, tăng

thể tích dung môi có thể tăng được hiệu suất chiết nhưng thể tích dung môi

quá lớn gây lãng phí và có thể ảnh hưởng đến tín hiệu đo dòng. Chúng tôi tiến

hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi là hỗn hợp

acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10). Kết quả trình bày trên bảng 3.60 và

hình 3.82. Kết quả phân tích cho thấy, hiệu suất chiết tăng khá nhanh khi tăng

thể tích dung môi từ 1,0 ml đến 2,5 ml, với thể tích dung môi từ 2,5 ml đến4,0 ml hiệu suất chiết hầu như không tăng. Vì vậy chúng tôi chọn thể tích

dung môi chiết là 2,5ml.


suất chiết vào thể tích dung môi

V dung

môi (ml)

Hiệu suất

chiết

1,0 66,7

1,5 78,9

2,0 82,4

2,5 83,4

3,0 83,5

3,5 83,6

4,0 83,5

50

55

60

65

70

75

80

8590

95

100

0 1 2 3 4 5V dung môi (ml)

H ( % )

Hình 3.80: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết


Kết luận về điều kiện chiết pha rắn cefadroxil trong mẫu nước tiểu:

Dung môi: hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10)

Thể tích dung môi: 2,5ml

pH 5 ÷ 6

Tốc độ chảy 1ml/phút (thực tế khoảng 0,8 ÷ 1,0 ml/phút)





124

Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp chúng tôi tiến hành phân tích

cefadroxil trong mẫu tự tạo. Mẫu tự tạo là mẫu nước tiểu của người bình

thường (không uống thuốc) được thêm cefadroxil ở các nồng độ khác nhau

(xem bảng 3.61) đem xử lý và định lượng theo qui trình:

Hoạt hóa cột chiết bằng 4ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần.

Lấy chính xác 10,00 ml nước tiểu chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng

nước cất định mức đến vạch (dung dịch 1). Cho 2,5 ml dung dịch 1 đi qua cột

chiết HLB với tốc độ chảy 0,8 ÷ 1,0 ml/phút, rửa tạp chất bằng 5ml dung dịch

đệm pH 5,0; rửa giải thu hồi cefadroxil bằng 3ml hỗn hợp acetonnitrin-

metanol-nước (10:80:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào

bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng

micropipet lấy chính xác 1000 µl dung dịch A, thêm nước cất đến thể tích

khoảng 5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1M, thủy phân trong 45 phút ở 90oC,

chuyển vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện

phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.

Bảng 3.61: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu vào I p.

TT C NT (mg/ml) Cđo (µg/ml) I p (nA)

1 0,25 0,05 31,5

2 0,50 0,10 76,8

3 1,00 0,20 1454 1,50 0,30 228

5 2,00 0,40 332

6 2,50 0,50 415

Kết quả phân tích được trình bày trong hình 3.81 và hình 3.82 cho thấy

sự phụ thuộc giữa I p vào nồng độ cefadroxil là tuyến tính.





125

y = 851.77x - 15.241R² = 0.9965

100

200

300

400

500 DC cefadroxil trong NT

Hình 3.81: Sự phụ thuộc I p và nồng độ

cefadroxil trong mẫu nước tiểu.

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

Hình 3.82: Đường AdSV

của cefadroxil trong nước

tiểu (mẫu tự tạo)

Chúng tôi tiến hành đánh giá độ đúng của phương pháp thông qua độ

thu hồi. Tiến hành phân tích xác định độ thu hồi cefadroxil trong mẫu nước

tiểu tự tạo có sẵn nồng độ cefadroxil bằng 0,50 mg/ml bằng phương pháp

thêm chuẩn. Cefadroxil được thêm vào mẫu nước tiểu ở các nồng độ 0,4mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,6 mg/ml (tương ứng tỉ lệ thêm vào là 80%, 100% và

120%) rồi xử lý theo qui trình trên và tiến hành định lượng. Nồng độ

cefadroxil trong mẫu nước tiểu được tính theo công thức: C NT =5.CX (mg/ml),

trong đó: C NT là nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo (mg/ml); CX

là nồng độ cefadroxil trong mẫu đo sau khi xử lý (µg/ml). Kết quả được trình

bày trong bảng 3.60. Kết quả cho thấy, độ thu hồi cefadroxil trong mẫu nướctiểu từ 96,88% đến 98,50% đạt yêu cầu phân tích.

Như vậy, với qui trình xử lý mẫu nước tiểu như trên có thể định lượng

cefadroxil trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân bằng phương pháp von-ampe

hòa tan hấp phụ xung vi phân.





126

Bảng 3.62: Kết quả xác định cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo

STT

Nồng độ chuẩn

thêm vào nướctiểu (mg/ml)

Nồng độ tìm lại

trong dung dịchđo (µg/ml)

Nồng độ tìm lại

trong mẫu nướctiểu (mg/ml)

R e (%)

1 0,4 0,077 0,387 96,75

2 0,5 0,096 0,492 98,40

3 0,6 0,118 0,590 98,33

Áp dụng qui trình phân tích trên chúng tôi tiến hành định lượng

cefadroxil trong một số mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống cefadroxil liều1000mg (2 viên cefadroxil 500mg) và 250mg (1 gói Tytdroxil 250mg).

Qui trình phân tích: Lấy chính xác 10,00 ml nước tiểu chuyển vào

bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch (dung dịch 1). Cho

2,50ml dung dịch 1 đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa

tạp chất bằng 5ml đệm photphat pH 5,0; rửa giải thu hồi cefadroxil bằng 3ml

hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10). Chuyển toàn bộ dịch chiết

vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2).

Dùng micropipet lấy chính xác khoảng 100µl đến 1000µl dung dịch 2 (tùy

thuộc vào nồng độ cefadroxil trong nước tiểu), thêm nước cất đến thể tích

khoảng 5ml, thêm 4ml dung dịch NaOH 1M, thủy phân trong 45 phút ở

90oC, chuyển vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch rồi chuyển vào

bình điện phân và tiến hành đo. Hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu

được xác định theo phương pháp thêm chuẩn cefadroxil vào mẫu nước tiểu

rồi xử lý theo qui trình trên. Hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu

(C NT) tính theo công thức:

C NT = XC 25 10 25* *

1000 V 1 2,5 = x2,5*C

V (mg/ml)

Trong đó: CX là nồng độ cefadroxil trong mẫu đo (µg/ml)

V: thể tích dung dịch 2 đem thủy phân và đo (ml)





127

Kết quả phân tích hàm lượng cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống

các liều 250mg và liều 1000mg được trình bày trên các bảng 3.63, 3.64 và

được biểu diễn trên đồ thị ở hình 3.85 và hình 3.86.


của bệnh nhân uống 1 gói thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg.

STT KHM Đặc điểm mẫu V mẫu (ml) C NT (mg/ml)


2 MS 2* Sau 2,5 giờ uống thuốc210

0,45

3 MS 3* Sau 2,5 giờ uống thuốc 220 0,44

4 MS 4* Sau 2,5 giờ uống thuốc 230 0,42



7 MS 7* Tổng nước tiểu sau 24 giờuống thuốc

1.130 0,20

*Ghi chú: Mẫu số 2,3,4,7 thuộc các bệnh nhân khác nhau

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.450.5

0 2 4 6 8 10 12

Thời gian (giờ)

C

( m g / m l )

Hình 3.83: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống

2 viên cefadroxil 250mg theo thời gian





128


của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 500mg.

STT KHM Đặc điểm mẫuV mẫu

(ml)

C NT

(mg/ml)

1 MS1 Sau 1 giờ uống thuốc 90 1,61



4 MS 4* Sau 3 giờ uống thuốc88

1,95





9 MS 9*Tổng nước tiểu sau 24 giờ

uống thuốc

1.5800,56

*Ghi chú: Mẫu số 4,5,9 thuộc các bệnh nhân khác nhau

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 2 4 6 8 10 12

Thời gian (giờ)

C

( m g / m l )

Hình 3.84: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống

2 viên cefadroxil 500mg theo thời gian





129

Kết quả phân tích mẫu nước tiểu cho thấy sau khi uống thuốc

cefadroxil nồng độ cefadroxil trong nước tiểu đạt đỉnh trong khoảng 2 đến 3

giờ đầu tiên. Nồng độ đỉnh của cefadroxil trong nước tiểu có thể đạt trên

2,01mg/ml đối với liều 1000mg và 0,45 mg/ml đối với liều 250mg. Phần lớn

thuốc được thải trừ sau khi uống thuốc khoảng 10 giờ. Sau khi uống thuốc 24

giờ, có đến gần 90% cefadroxil thải trừ qua đường nước tiểu. Đối chiếu với

các tài liệu tham khảo, chúng tôi thấy các kết quả hợp lý về mặt khoa học.





130

KẾT LUẬN

Sau thời gian nghiên cứu tài liệu, tiến hành thực nghiệm, phân tích số

liệu chúng tôi rút ra kết luận lần đầu tiên ở Việt Nam đã xây dựng thành công

các qui trình phân tích kháng sinh, kháng virut, kháng histamin bằng phương

pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ. Các kết quả

nghiên cứu cho thấy hoàn toàn có thể áp dụng các phương pháp von-ampe

trong kiểm nghiệm dược phẩm như một phương pháp chuẩn. Cụ thể:

1. Đã nghiên cứu tìm ra các điều kiện thích hợp nhất xây dựng qui trình

phân tích ofloxacin trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với các điều kiện cơ bản: nền đệm photphat pH = 6,5; khoảng quét

thế: -1,1V÷ -1,5V;

- Giới hạn phát hiện: LOD = 5,21.10-7M;

- Giới hạn định lượng: LOQ = 1,74.10-6M.

2. Đã nghiên cứu xây dựng thành công qui trình phân tích metronidazol

trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với các điều kiện

thích hợp nhất: nền đệm photphat pH = 4,5; khoảng quét thế: 0,0V÷ -0,5V.


- Giới hạn định lượng: LOQ = 3,604.10-7M.

3. Đã nghiên cứu xây dựng thành công qui trình phân tích

clorpheniramin maleat trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi

phân với các điều kiện thích hợp nhất: nền đệm photphat pH = 4,6; khoảng

quét thế: - 0,8V ÷ - 1,2V.


- Giới hạn định lượng: LOQ = 1,03.10-5M

4. Đã nghiên cứu tính chất hấp phụ của sản phẩm thủy phân của

cefadroxil trên điện cực HMDE và xây dựng thành công qui trình phân tích

định lượng cefadroxil trong dược phẩm bằng phương pháp von-ampe xung vi

phân và von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân với các điều kiện thích hợp:





131

- Thủy phân trong dung dịch NaOH, nhiệt độ 90oC, thời gian 45 phút.

- Điều kiện tích lũy: thế tích lũy: Eacc = -0,4V; thời gian tích lũy: 60s

- Điều kiện đo: nền NaOH 0,16M; khoảng quét thế: -0,5V ÷ -0,9 V.

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp von-

ampe xung vi phân: LOD = 6,22.10-8M; LOD = 2,07.10-7 M

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp von-

ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân: LOD = 1,88.10-8M; LOQ = 6,28.10-8 M

5. Đã phân tích định lượng các thuốc ofloxacin; metronidazol;

clorpheniramin maleat; cefadroxil trong một số chế phẩm thuốc đang lưuhành trên thị trường Hà Nội. Kết quả phân tích đáng tin cậy. Kết quả cho thấy

các chế phẩm đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam 4 về thành phần phần

trăm so với ghi trên nhãn. Các kết quả phân tích một lần nữa khẳng định hoàn

toàn có thể áp dụng phương pháp von-ampe với các ưu điểm nổi trội là tốc độ

hoàn thành nhanh, ít tốn kém, độ nhạy cao trong kiểm nghiệm dược phẩm.

6. Đã nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột chiết

HLB để xử lý nước tiểu xác định ofloxacin và cefadroxil bằng phương pháp

von-ampe xung vi phân và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ với các

điều kiện chiết được khảo sát:

*Xác định ofloxacin trong nước tiểu:

Hệ dung môi: acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10)

pH chiết: 4,0

Độ thu hồi từ 95,37% đến 101,34%.* Xác định cefadroxil trong nước tiểu:

Hệ dung môi: hỗn hợp acetonnitrin-metanol-nước (10:80:10)

pH chiết: 5 ÷ 6

Độ thu hồi từ 96,88% đến 98,50%.

7. Việc phân tích các mẫu nước tiểu bệnh nhân điều trị bằng ofloxacin

và cefadroxil bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan





132

hấp phụ đã được áp dụng để theo dõi quá trình thanh thải của thuốc qua cầu

thận. Các kết quả phân tích cho thấy thuốc được đào thải phần lớn dưới dạng

không chuyển hóa. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng các thuốc

metronidazol và clorpheniramin maleat sau khi vào cơ thể đã bị chuyển hóa

thành các dạng khác nhau và không thể định lượng được theo phương pháp

von-ampe với các điều kiện đã xác định thuốc gốc.

Việc nghiên cứu thành công phương pháp von-ampe xung vi phân và

von-ampe hòa tan hấp phụ định lượng thuốc trong chế phẩm và trong nước

tiểu bệnh nhân cho phép mở ra hướng phát triển ứng dụng phương pháp von-ampe với ưu điểm nổi trội là tốc độ hoàn thành nhanh, giá thành rẻ trong đánh

giá sinh khả dụng và thử nghiệm tương đương sinh học của thuốc ở Việt nam

nâng cao tính an toàn và hiệu quả của sử dụng thuốc.





133

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2011)

“Nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất trong thuốc kháng sinh

cefalexin bằng phương pháp von-ampe xung vi phân sử dụng HMDE”, Tạp

chí Hóa học, T. 49 (2ABC), Tr. 258-263, 2011.

2. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2012),

“Nghiên cứu phương pháp định lượng hoạt chất trong thuốc kháng sinh

cefaclor bằng phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ”, Tạp chí Công

nghiệp hóa chất , số 4/2012, tr 31-36.

3. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, Hà Văn Dũng,

(2012), “Nghiên cứu xác định hoạt chất cefadroxil trong thuốc kháng sinh bằng

phương pháp von - ampe xung vi phân” Tạp chí Khoa học Công nghệ, Trường

Đại học Công nghiệp Hà Nội, số 9/2012, tr 34-38.


“Nghiên cứu xác định hoạt chất cefadroxil trong thuốc kháng sinh bằng phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ”, Tạp chí Phân tích Hóa lý sinh,

T.18 (1), tr 9-13.


“Nghiên cứu xác định hoạt chất metronidazol trong dược phẩm bằng phương

pháp von – ampe xung vi phân”, Tạp chí Hóa học, T.51 (2C), tr 915-919.


“Nghiên cứu xác định hoạt chất cefadroxil trong nước tiểu bằng phương phápvon - ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ”, Tạp chí Phân tích Hóa lý sinh,

T.18 (2), tr 43-477. Trần Quang Hải, Dương Quang Phùng, Từ Vọng Nghi, (2013),

“Nghiên cứu xác định hoạt chất cefaclor trong nước tiểu bằng phương pháp

von - ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ”, Tạp chí Khoa học Công nghệ,

Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, số 15/2013, tr 15-18.





134

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2002; 2006; 2009), Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

2. Bộ Y tế (2007), Dược lý học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.

3. Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

4. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.

5.

Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Hóa dược tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.

6. Phùng Thế Đồng, Phan Ngọc Trang Thư, Mai Thu Hà, Lê Song Phương

Loan, Trần tử An, Nguyễn Trọng Giao (2007), “Nghiên cứu định lượng

Cephalexin trong chế phẩm thuốc bột bằng kỹ thuật sóng vuông quét

nhanh trên điện cực giọt chậm”, Tạp chí dược học, 47 (375), tr. 35-39.

7. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung

(2007), Hóa học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ,

Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

8. Trần Chương Huyến, Nguyễn Thị Kim Thường (2010), “Xác định

cephalexin bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân”,

Tạp chí Phân tích Hóa, Lý và sinh học, T.15(3), tr 166-172.

9. Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), Một số phương

pháp phân tích điện hóa hiện đại, (Tài liệu giảng dạy của chương trìnhVH2, Đại học Tổng hợp Hà Nội).

10. Từ Vọng Nghi (2011), Các phương pháp phân tích điện hóa hiện đại,

(Chuyên đề cho học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành hóa

phân tích, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN).

11. Lê Đức Ngọc (1999), Xử lí số liệu và kế hoạch hóa thực nghiệm, Đại học

Quốc gia Hà Nội.





135

12. Trương Thị Nguyệt, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Nguyễn Kim Xuân

(2004), “Định tính, định lượng đồng thời metronidazol, cloramphenicol

và dexamesanthon acetat trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 2, tr.8-20.

13. Dương Quang Phùng (2009), Một số phương pháp phân tích điện hóa,

Nhà xuất bản Đại học sư phạm Hà Nội, Hà Nội.

14. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Đại học Quốc gia

Hà Nội.

15.

Minh Tâm, Thủy Tiên (15/6/2010), “Thị trường dược phẩm Việt Nam:Lớn mạnh trong môi trường cạnh tranh khốc liệt”, Sài Gòn Giải phóng

online,Thứ ba, 15/06/2010, 09:30 (GMT + 7).

16. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích,

Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

17. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm

định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất bản

Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

18. Viện Kiểm nghiệm (1976), Định lượng vitamin, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội.

19. Vũ Đình Vinh (1996), Hướng dẫn sử dụng các xét nghiệm hóa sinh,

Nhà xuất bản Y học, Hà nội.

20. Phùng Thị Vinh (2005), Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và định

lượng Norfloxacin trong dịch sinh học, Báo cáo kết quả đề tài nghiêncứu cấp Bộ, Bộ Y tế.

Tài liệu Tiếng Anh

21. Al-ghamdi A.H., Al-shadokhy M.A., Al-warthan, Abdulrahman A.

(2004), “Electrochemical determination of Cephalothin antibiotic by

adsorptive stripping voltammetric technique”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 35, pp. 1001-1009.





136

22. Aly Fatma A., Alarfaffj Nawal A., Alwarthan Abdulrahman A. (1998),

“Permanganate-based chemiluminescence analysis of cefadroxil

monohydrate in pharmaceutical samples and biological fluids using flow

injection”, Talanta, Vol. 47, pp. 471–478.

23. Ambrosi Adriano, Antiochia Riccarda, Campanella Luigi , Dragone

Roberto, Lavagnini Irma (2005), “Electrochemical determination of

pharmaceuticals in spiked water samples” Journal of Hazardous

Materials, Vol. 122, pp. 219–225.

24.

Amiri M., Alimoradi M., Nekoueian K., and Bezaatpour A. (2012),“Cobalt Flower-like Nanostructure as Modifier for Electrocatalytic

Determination of Chloropheniramine”, Industrial & Engineering

Chemistry Research, Vol. 51, pp. 14384−14389

25. Aswani Kumar Ch., Gurupadayya BM., Navya Sloka S., Chandan RS

and Thejaswini JC (2011), “Colorimetric Determination of Cefadroxil

and Ceftriazone in Pharmaceutical Dosage Forms” Tropical Journal of

Pharmaceutical Research Vol. 10 (1), pp. 81-88.

26. Bartletta P.N. , Ghoneima E. , El-Hefnawy G., El-Hallag I. (2005),

“Voltammetry and determination of metronidazole at a carbon fiber

microdisk electrode”, Talanta, Vol. 66, pp. 869–874.

27. Basci N.E., Hanioglu-Kargi S., Soysal H., Bozkurt A., Kayaalp S.O.

(1997), “ Determination of ofloxacin in human aqueous humour by high-

performance liquid chromatography with fluorescence detection”, Journalof Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 15, pp. 663–666.

28. Bollo S., Vergara L.J. Núňnez., Squella J.A. (2004), “Cyclic

voltammetric determination of free radical species from

nitroimidazopyran: a new antituberculosis agent” Journal of

Electroanalytical Chemistry, Vol. 562, pp. 9–14.





137

29. Brett A.M., Serrano S.H.P., Gutz I., La-Scalea M.A., (1997),

“Electrochemical reduction of metronidazole at a DNA-modified

glassy carbon electrode” Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Vol.

42, pp. 175-178.

30. British Pharmacopoiea 2007, version 11.0.

31. Burkhead Matthew S., Wang Heeyoung, Fallet Marcel, Gross Erin M.

(2008), “Electrogenerated chemiluminescence: An oxidative-reductive

mechanism between quinolone antibiotics and tris(2,2’-

bipyridyl)ruthenium(II)”, Analytica Chimica Acta, Vol. 613, pp. 152-162.32. Cavalcanti Janesmar C.M., Oliveira Natália V., Moura Maria Aline

B.F., Fruttero Roberta, Bertinaria Massimo, Goulart Marilia O.F. (2004),

“Evidence of self-protonation on the electrodic reduction mechanism of

an anti-Helicobacter pylori metronidazole isotere” Journal of

Electroanalytical Chemistry, Vol. 571, pp. 177–182.

33. Chan Kwok Ping, Chu Kai On, Lai Wico Wai-Kwan, Choy Kwong

Wai, Wang Chi Chiu, Lam Dennis Shun-Chiu, Pang Chi Pui (2006),

“Determination of ofloxacin and moxifloxacin and their penetration in

human aqueous and vitreous humor by using high-performance liquid

chromatography Xuorescence detection”, Analytical Biochemistry, Vol.

353, pp. 30–36.

34. Chang Chui-Shiang, Wang Wei-Hsien and Tsai Chin-En (2010),

“Simultaneous determination of 18 quinolone residues in marine andlivestock products by liquid chromatography tandem mass spectrometry”,

Journal of food and drug analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 87-97.

35. El-Gindy Alaa, Walily Abdel Fattah M. El, Bedair Mohamed F. (2000),

“First-derivative spectrophotometric and LC determination of

cefuroxime and cefadroxil in urine” Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, Vol. 23, pp. 341–352.





138

36. Espinosa B.M., Ruiz – Sáncheazb A.J., Sasncheazb – Rojasc F., Bosch –

Ojedac C. (2008), “Recent development in the analytical determination

of cefadroxil”, Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 3(5), pp.

217-232.

37. Erka Nevin, Kartalb Murat (1998), “Simultaneous high performance

liquid chromatographic and derivative ratio spectra spectrophotometry

determination of chlorpheniramine maleate and phenylephrine

hydrochloride”, Il Farmaco, Vol. 53, pp. 617 – 622.

38.

Fogg A.G., Fayad N.M., Burgess C. anf Mcglynn A. (1979),“Differential pulse polarographic determination of cephalosporin and their

degration products”, Analytica Chimica Acta, Vol. 108, pp. 205-211.

39. Garcíaa A., Rupéreza F.J., Marína A., De la Mazab A., Barbasa C.

(2003), “Poly(ethyleneglycol) column for the determination of

acetaminophen, phenylephrine and chlorpheniramine in pharmaceutical

formulations” Journal of Chromatography B, Vol. 785, pp. 237–243.

40. Gholivand Mohammad Bagher, Torkashvand Maryam (2011), “A novel

high selective and sensitive metronidazole voltammetric sensor based on

a molecularly imprinted polymer-carbon paste electrode” Talanta, Vol.

84, pp. 905–912.

41. Gui Yi, Ni Yong Nian, Kokot Serge (2011), “Simultaneous

determination of three 5-nitroimidazoles in foodstuffs by differential

pulse voltammetry and chemometrics” Chinese Chemical Letters, Vol.22, pp. 591–594.

42. Hefnawy M., El-Shabrawy Y., Belal F. (1999), “Spectrofluorometric

determination of alpha-aminocephalosporins in biological fluids and

pharmaceutical preparations” Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, Vol 21, pp. 703-707.





139

43. Bui Tung Hiep, Vu Khanh, Nguyen Kim Hung, Thuilliera A.,

Gimeneza F. (1998), “Determination of the enantiomers of

chlorpheniramine and its main monodesmethyl metabolite in urine

using achiral–chiral liquid chromatography”, Journal of

Chromatography B, Vol. 707, pp. 235–240.

44. Indrayanto G., Sunarto A., Adriani Y. (1995), “Simultaneous assay of

phenylpropanolamine hydrochloride, caffeine, paracetamol,

glycerylguaiacolate and chlorpheniramine maleat in SilabatTM tablet

using HPLC with diot array detection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 13, pp. 1555-1559.

45. Ivaska A. and Nordstrom F. (1983), “Determination of some

cephalosporin by differential pulse polarography and linear scan

voltammetry”, analytica chimica acta, vol. 146, pp. 87-95.

46. Jacobsen E. and Høgberg K. (1974), “Polarographic determination of

chlorpheniramine maleate in pharmaceuticals”, Analytica Chimica Acta,

Vol. 71, pp. 157-163.

47. Jafari M. T., Rezaei B., and Zaker B. (2009), “Ion Mobility

Spectrometry as a Detector for Molecular Imprinted Polymer Separation

and Metronidazole Determination in Pharmaceutical and Human Serum

Samples” Analytical Chemistry, Vol. 81, No. 9, pp. 3585 – 3591.

48. Jenkins Kevin M., Young Michael S. (2003), “Determination of

Flouroquinolone Residues in Bovine Kidney Using SPE andLC/MS/MS”, Water Coporation, USA.

49. Jiang Xiaohua, Lin Xiangqin (2006), “Voltammetry of the interaction of

metronidazole with DNA and its analytical applications”

Bioelectrochemistry Vol. 68, pp. 206 – 212.

50. Kai Masaaki, Kinoshita Hiromi, Morizono Mikio (2003),

“Chromatographic determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by





140

means of fluorescence, chemiluminescence and mass spectrometry”

Talanta Vol. 60, pp. 325 -/334.

51. Kai Masaaki, Kinoshita Hiromi, Ohta Kazuko, Hara Shuuji, Lee Myung

Koo, Lu Jianzhong (2003), “Sensitive determination of a β-lactam

antibiotic, cefaclor by liquid chromatography with chemiluminescence

detection” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 30,

pp. 1765 -1771.

52. Kovach P.M., Lantz R.J. (1991), “Hight-perfomance liquid

chromatographic determination of loracarbef, a potential metabolite,cefaclor and cephalexin in human plasma, serum and urine”, Journal of

Chromatography, Vol. 567, pp. 129-139.

53. Lednicer, Mtscher and Georg. (1990), The Organic Chemistry of Drug

Synthesis, Vol. 4. Wiley.

54. Lee H-B., Peart T.E., Suoboda M.L. (2007), “Determination of

ofloxacin, norfloxacin and ciprofloxacin in sewage by selective solid-

phase extration, liquid chromotography with fluorescence detection and

liquid chromotography – tandem mass spectrometry”, Journal of

Chromatography A, Vol. 1139, pp. 45 – 52.

55. Mandal P.C. (2004), “Reactions of the nitro radical anion of

metronidazole in aqueous and mixed solvent: a cyclic voltammetric

study” Journal of Electroanalytical Chemistry, Vol. 570, pp. 55–61.

56. Maraschiello C., Cusido E., Abellan M. And Vilageliu J. (2001),“Validation of an analytical procedure for the determination of

fluoroquinolone ofloxacin in chicken tissues”, Journal of

Chromatography B and Biomedical Sci. Appl , Vol. 754, pp. 311-318.

57. Miyazawa N., Uematsu T., Mizuno A., Nagashima S. and Nakashima M.

(1991), “Ofloxacin in human halr determined by high performance liquid

chromatography”, Forensic Science International, Vol. 51, pp. 65 – 77.





141

58. Morelli Basilio (2003), “Derivative spectrophotometry in the analysis of

mixtures of cefotaxime sodium and cefadroxil monohydrate”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol.32, pp. 257-/267.

59. Mottier P., Huré I., Gremaud E., and Guy P. A. (2006), “Analysis of

Four 5-Nitroimidazoles and Their Corresponding Hydroxylated

Metabolites in Egg, Processed Egg, and Chicken Meat by Isotope

Dilution Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry”, Journal

of Agricultural and Food Chemistry, Vol 54, pp. 2018 – 2026.

60.

Mrestania Yahya, Neuberta Reinhard H.H., Hrtl Albert, WohlrabJohannes (1997), “Determination of cephalosporins in urine and bile by

capillary zone electrophoresis” Analytica Chimica Acta, Vol 349, pp.

207-213.

61. Niessen W.M.A. (1998) “Analysis of antibiotics by liquid

chromatography–mass Spectrometry”, Journal of Chromatography A,

Vol. 812, pp. 53–75.

62. Özkan S. A., Y. Özkan Y., Şentürk Z., (1998) “Electrochemical

reduction of metronidazole at activated glassy carbon electrode and its

determination in pharmaceutical dosage forms” Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 17, pp. 299–305.

63. Patel Yagnesh P., Shah Nehal, Bhoir I. C., Sundaresan M. (1998),

“Simultaneous determination of five antibiotics by ion-pair high-

performance liquid chromatography” Journal of Chromatography A,Vol. 828, pp. 287–290.

64. Peia Qi, Yanga Guo-Ping, Li Zuo-Jun, Peng Xiang-Dong, Fan Jing-Hui,

Liua Zhao-Qian (2011), “Simultaneous analysis of amoxicillin and

sulbactam in human plasma by HPLC-DAD for assessment of

bioequivalence”, Journal of Chromatography B, Vol. 879, pp. 2000– 2004.





142

65. Quesada-Molina Carolina, Claude Berengere, Garcia-Campana Ana M.,

Olmo-Iruela Monsalud del, Morin Philippe (2012), “Convenient solid

phase extraction of cephalosporins in milk using a molecularly imprinted

polymer”, Food Chemistry, Vol. 135, pp. 775–779.

66. Rao Yi, Tonga Yan, Zhanga Xinrong, Luoa Guoan, Baeyens Willy R.G.

(2000), “Determination of ofloxacin using a chemiluminescence flow-

injection method” Analytica Chimica Acta, Vol. 416, pp. 227–230.

67. Rezaei B., Damiri S. (2010), “Fabrication of a nanostructure thin film

on the gold electrode using continuous pulsed-potential technique and itsapplication for the electrocatalytic determination of metronidazole”

Electrochimica Acta, Vol. 55, pp. 1801–1808.

68. Rodrigues L.N.C., Zanoni M.V.B., Fogg A.G. “Indirect polarographic

and cathodic stripping voltammetric determination of cefaclor as an

alkaline degradation product”, Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, Vol. 21, pp. 497–505.

69. Samadi-Maybodi Abdolraouf, Akhoondi Reza (2011), “Characteristic of

peroxyoxalate-chemiluminescence intensity in the presence of

Chlorpheniramine maleate and its analytical application”, Journal of

Luminescence, Vol 131, pp. 1666–1671.

70. Samanidou V.F., Hapeshi E.A., Papadoyannis I.N. (2003), “Rapid and

sensitive high-performance liquid chromatographic determination of four

cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals and body fluids” Journal ofChromatography B, Vol 788, pp. 147–158.

71. Schrider B., Voigtz R., Patsch R., Horn G. And Spencker F.B.

(1988),“Pulse Polarographic determination of beta-lactam antibiotica and

its clinical applications”, Fresenius Z Anal Chem, Vol. 331, pp. 529-530.

72. Shao Bing, Suna Xiaojie, Zhang Jing, Hub Jianying, Dong Huiru, Yanga

Yi (2008), “Determination of ofloxacin enantiomers in sewage using two-





143

step solid-phase extraction and liquid chromatography with fluorescence

detection”, Journal of Chromatography A, Vol. 1182, pp. 77–84.

73. Shervington Leroy A., Abba Michael, Hussain Bushra, Donnelly James

(2005), “The simultaneous separation and determination of five

quinolone antibotics using isocratic reversed-phase HPLC: Application

to stability studies on an ofloxacin tablet formulation”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 39, pp. 769–775.

74. Simpson N.J.K. (2000), Solid-Phase Extraxtion, Marcel Dekker Inc., USA.

75.

Skoog D.A., West D.M., (1980), Principles of instrumental analysis,Sauder college, 2nd, USA.

76. Sun Yuanyuan, Tang Yuhai, Yao Hong, Zheng Xiaohui (2004),

“Potassium permanganate–glyoxal chemiluminescence system for flow

injection analysis of cephalosporin antibiotics: cefalexin, cefadroxil, and

cefazolin sodium in pharmaceutical preparations”, Talanta, Vol. 64, pp.

156–159.

77. Suntornsuk Leena, Pipitharome Ongart, Wilairat Prapin (2003),

“Simultaneous determination of paracetamol and chlorpheniramine

maleate by micellar electrokinetic chromatography”, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 33, pp. 441–449.

78. Tamer Ayla (1990), “Adsorptive stripping voltammetric determination

of ofloxacin” Analytica Chimica Acta, Vol. 231, pp. 129-131.

79. Thongpoona Chalermporn, Liawruangrath Boonsom, LiawruangrathSaisunee, Wheatley R. Alan, Townshend Alan (2006), “Flow injection

chemiluminescence determination of cefadroxil using potassium

permanganate and formaldehyde system” Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, Vol 42, pp. 277–282.

80. Thurman E.M., Mills M.S. (1998), Solid-Phase Extraction, John Wiley

& Sons, Inc., New York, USA.





144

81. Tocher Joanne H. and Edwards David I. (1994), “Evidence for the

direct interation of reduced metronidazole derivatives with DNA bases”,

Biochemical pharmacology, vol. 48, no. 6, pp. 1089-l094.

82. Toothaker R.D., Wright D.S. and Pachla L.A. (1987), “Recent analytical

methods for cephalosporin in biological fluids”, Antimicrobial agents

and chemotherapy, Vol. 31(8), pp. 1157-1163.

83. Valassisa I.N., Parissi-Pouloua M., Macherasb P. (1999) “Quantitative

determination of cefepime in plasma and vitreous fluid by high-

performance liquid chromatography” Journal of Chromatography B,Vol. 721, pp. 249–255.

84. Vire J.C., Kauffmann J.M. and Patriarche G.J. (1989),“Adsorptive

stripping voltammetry applied to drug analysis: A powerful tool”,

Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 7(12), pp.

1323-1335.

85. Vynchta G.V., Amaya J., Guy B., Brigitte T., Guy M-R., Edwin D.P.,

Rosa R.A. (2002), “Multiresidue determination of (fluoro)quinolone

antibiotics in swine kidney using liquid chromatography–tandem mass

spectrometry”, Journal of Chromatography A, Vol. 952, pp. 121–129.

86. Wang J. (1985), Stripping analysis-principles, instrumentation anf

application , VCH publishers Inc., USA.

87. Wang J. (1990), “Recent advances in stripping analysis”, Fresennius

Journal of Analytical Chemistry, Vol. 337, pp. 508-511. 88. Wang Zhenhui, Zhou Hongxun and Zhou Shupingz (1993), “Study on

the determination of metronidazole in human serum by adsorptive

stripping voltammetry”, Talanta, Vol. 40, No. 7, pp. 1073-1075.

89. Xiao Yang, Chang Hong, Jia Ai, Hu Jianying (2008), “ Trace analysis of

quinolone and fluoroquinolone antibiotics from wastewaters by liquid

chromatography–electrospray tandem mass spectrometry”, Journal of

Chromatography A, Vol. 1214, pp. 100–108.





145

90. Xu Min, Zhang Yu-cui, Xu Zhi-hong, Zeng Zheng-zhi (2012), “Crystal

structure, biological studies of water-soluble rare earth metal complexes

with an ofloxacin derivative”, Inorganica Chimica Acta, Vol. 384, pp.324–332.

91. Xu M., Ma H., Song J. (2004),“Polarographic behavior of cephalexin

and its determination in pharmaceuticals and human serum“, Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 35, pp. 1075-1081.

92. Yin Xue-Bo, Kang Jianzhen, Fang Lanyun, Yang Xiurong, Wang

Erkang (2004), “Short-capillary electrophoresis with

electrochemiluminescence detection using porous etched joint for fast

analysis of lidocaine and ofloxacin”, Journal of Chromatography A, Vol.

1055, pp. 223–228.

93. Yiruhan, Wang Qiao-Jun, Mo Ce-Hui, Li Yan-Wen, Gao Peng, Tai Yi-

Ping, Zhang Yan, Ruan Zhi-Li, Xu Jia-Wei (2010), “Determinationoffour

fluoroquinolone antibiotics in tap water in Guangzhou and Macao”,

Environmental Pollution, Vol. 158, pp. 2350 – 2358.

94. Zhang Fenfen, Gu Shuqing, Ding Yaping, Li Li, Liu Xiao (2013),

“Simultaneous determination of ofloxacin and gatifloxacin on cysteic

acid modified electrode in the presence of sodium dodecyl benzene

sulfonate”, Bioelectrochemistry, Vol. 89, pp. 42–49.

95. Zhou Gerong, Pan Jinghao (1995), “Polarographic and voltammetric

behaviour of ofloxacin and its analytical application”, Analytica Chimica Acta, Vol. 307, pp. 49-53.





PHỤ LỤC





Phụ lục 1: Các đường von – ampe hòa tan của ofloxacintrong các mẫu thuốc và mẫu nước tiểu

Hình P1.1: Đường DP củaofloxacin trong thuốc

Imexphar1. Mẫu thuốc2. Thêm ofloxacin 2 μg/ml3. Thêm ofloxacin 4 μg/ml

4.

Thêm ofloxacin 6 μg/ml

Hình P1.2: Đường DP củaofloxacin trong thuốc nhỏ mắt1. Mẫu thuốc2. Thêm ofloxacin 3 μg/ml3. Thêm ofloxacin 6 μg/ml

Hình P1.3: Đường DP củaofloxacin trong nước tiểu

1. Mẫu tự tạo (0,3+2,4)2. Thêm ofloxacin 0,1 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,2mg/ml





Hình P1.6: Đường DP củaofloxacin trong mẫu NT

1. Mẫu đo (MS1)2. Thêm ofloxacin 0,05 mg/ml 3. Thêm ofloxacin 0,1 mg/ml

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1. 10 -1. 20 -1. 30 -1. 40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1. 10 - 1. 20 -1. 30 -1. 40

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1. 10 - 1. 20 -1.3 0 -1. 40

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

1

2

4

3

1

2

3

1

2

3

1

23

1

23

1

23





Hình P1.7: Đường DP của

ofloxacin trong mẫu nước tiểu

1. Mẫu đo (MS2)2. Thêm ofloxacin 0,1mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,2mg/ml

Hình P1.8: Đường DP củaofloxacin trong mẫu nước tiểu

1. Mẫu đo (MS3)2. Thêm ofloxacin 0,2 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,4 mg/ml4. Thêm ofloxacin 0,5 mg/ml




1. Mẫu đo (MS5)2. Thêm ofloxacin 0,15 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,3 mg/ml


1. Mẫu đo (MS6)2. Thêm ofloxacin 0,15 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,3 g/mlThêm ofloxacin 0,45 mg/ml

Hình P1.12: Đường DP củaofloxacin trong mẫu NT


-1.10 -1. 20 -1.30 -1. 40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

1

2

3

1

2

34

1

2

34

1

2

34

1

23

4

1

2

3







1. Mẫu đo (MS8)2. Thêm ofloxacin 0,2mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,4mg/ml4. Thêm ofloxacin 0,6mg/ml



1. Mẫu đo (MS9)2. Thêm ofloxacin 0,1 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,2 mg/ml

Hình P1.15: Đường DP

của ofloxacin trong mẫunước tiểu

1. Mẫu đo (MS10)2. Thêm ofloxacin 0,1 mg/ml3. Thêm ofloxacin 0,2 mg/ml4. Thêm ofloxacin 0,3 μg/ml

-1.10 -1.20 -1.30 -1.40

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1. 20 -1. 30 -1. 40

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-1.10 -1 .20 -1 .30 -1.4 0

U (V)

-150n

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )1

23

4

1

2

3

1

23

4





Phụ lục 2: Các đường von – ampe hòa tan của metrodinazol vàclopheniramin maleat trong các mẫu thuốc

Hình P 2.1: Một số đường DP của metronidazol trong thuốc Flagyl 250mg

Hình P 2.2: Một số đường DP của metronidazol trong thuốc Metronidazole 250mg

Hình P 2.3: Một số đường DP của Clopheniramin maleat trong thuốcClopheniramin 4

0 - 100m - 200m -300m -400m - 500m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

0 -100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

0 -100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

0 -100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

0 -100m -200m -300m -400m -500m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-800m -90 0m -1.00 -1.10 -1 .2 0

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

- 80 0m -9 00 m -1 .0 0 -1 .1 0 - 1. 2 0

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )





Hình P 2.4: Một số đường DP của Clopheniramin maleat trong thuốcPacemine

-800m - 900m - 1. 00 -1. 10 -1.20

U (V)

-125n

-100n

-75.0n

-50.0n

-25.0n

0

I ( A )

-800m - 900m - 1. 00 -1. 10 -1.20

U (V)

-100n

-80.0n

-60.0n

-40.0n

-20.0n

0

I ( A )





Phụ lục 3: Các đường von – ampe hòa tan của cefadroxil trong các mẫuthuốc và mẫu nước tiểu

Hình P.3.1: Đường DP của thuốc

cefadroxil sản xuất tại Công ty

CPDP Mebiphar

Hình P.3.2: Đường DP của

thuốc cefadroxil sản xuất tại

Công ty CPDP TW- Vidapha

Hình P.3.3: Đường DP -AdSV của thuốc Ocefacel

(cefadroxil 500 mg) sản xuấttại Công ty Cổ phần Dược

phẩm Hà Tây

Hình P.3.4: Đường DP -AdSV của thuốc bột

Tytdroxil (cefadroxil 250mg)sản xuất tại Công ty Cổ phần

Dược phẩm Glomed

- 50 0m - 600 m -7 00m - 800 m - 90 0m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-50 0m -600 m -7 00m -800 m -90 0m

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )





Hình P3.7: Đường AdSVcủa cefadroxil trong NT

1. Mẫu tự tạo (0,5+0,4)2. Thêm 0,1 μg/ml3. Thêm 0,2 μg/ml

Hình P3.8: ĐườngAdSV của cefadroxil

trong NT1. Mẫu tự tạo (0,5+0,5)2. Thêm 0,1 μg/ml3. Thêm 0,2 μg/ml4. Thêm 0,3 μg/ml

Hình P3.9: Đường AdSVcủa cefadroxil trong NT

1. Mẫu tự tạo (0,5+0,6)2. Thêm 0,1 μg/ml3. Thêm 0,2 μg/ml

Hình P3.10: Đường AdSVcủa cefadroxil trong nướctiểu của nhân uống 1 gói

Tytdroxil 250 mg

1.Mẫu MS1 (V = 1ml)2.Thêm 0,3 mg/ml3.Thêm 0,6 mg/ml

Hình 3.11: Đường AdSVcủa cefadroxil trong mẫunước tiểu bệnh nhân uống

1 gói Tytdroxil 250 mg

1. Mẫu MS2 (V = 1ml)2. Thêm 0,3 mg/ml3. Thêm 0,6 mg/ml

Hình 3.12: ĐườngAdSV của cefadroxiltrong mẫu nước tiểu

bệnh nhân uống 1 góiTytdroxil 250 mg

1. Mẫu MS3 (V = 1ml)2. Thêm 0,3 mg/ml3. Thêm 0,6 μg/ml

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-500n

-400n

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-600n

-400n

-200n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

1

2

3

1

2

3

1

2

4

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3





Hình 3.13: Đường AdSVcủa cefadroxil trong mẫu

nước tiểu bệnh nhân uống1 gói Tytdroxil 250 mg

1. Mẫu MS4(V = 1ml)2. Thêm 0,4 mg/ml3. Thêm 0,8 mg/ml



1. Mẫu MS5(V = 1ml)2. Thêm 0,2 mg/ml3. Thêm 0,4 mg/ml

Hình 3.15: Đường AdSVcủa cefadroxil trong mẫu

nước tiểu bệnh nhân uống1 gói Tytdroxil 250 mg

1. Mẫu MS6(V = 5ml)2. Thêm 0,05 mg/ml3. Thêm 0,1 mg /ml



1. Mẫu MS7(V = 2ml)2. Thêm 0,2 mg/ml

3. Thêm 0,4 mg/ml

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3





Hình P3.17: Đường AdSVcủa cefadroxil trong mẫu

nước tiểu bệnh nhân uống 2

viên cefadroxil 500 mg

1. Mẫu MS1(V = 0,25ml)2. Thêm 0,1 μg/ml3. Thêm 0,2 μg/ml


nước tiểu bệnh nhân uống 2

viên cefadroxil 500 mg


Hình P3.19: ĐườngAdSV của cefadroxiltrong mẫu nước tiểu

bệnh nhân uống 2 viêncefadroxil 500 mg










1. Mẫu MS6(V = 0,3ml)2. Thêm 1 mg/ml3. Thêm 2 mg/ml

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-200n

-100n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3






nước tiểu bệnh nhân uống 2viên cefadroxil 500 mg

1. Mẫu MS7(V = 0,3ml)2. Thêm 1 mg/ml3. Thêm 2 mg/ml


trong mẫu nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên

cefadroxil 500 mg1. Mẫu MS8(V = 2ml)2. Thêm 0,1 mg/ml3. Thêm 0,2 mg/ml


trong mẫu nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên

cefadroxil 500 mg1. Mẫu MS9(V = 0,5ml)2. Thêm 0,5 mg/ml3. Thêm 1 mg/ml

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-300n

-250n

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )

-500m -600m -700m -800m -900m

U (V)

-200n

-150n

-100n

-50.0n

0

I ( A )1

2

3

1

2

3

1

2

3





Phụ lục 4: Kết quả phân tích độc lập các mẫu thuốctại Phòng Kiểm nghiệm – Công ty Cổ phần Dược phẩm TW 1- Phabaco





Phụ lục 5.1: Danh sách các bệnh phẩm chứa ofloxacin

STT KHM Họ và tên bệnh nhân Tuổi Nơi lấy mẫu

1 MS1 Nguyễn Xuân Huy 32

Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

2 MS 2 Nguyễn Xuân Huy 32Phòng khám tư nhân

Hoài Đức


Hoài Đức

4 MS 4

Nguyễn Xuân Huy 32

Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

5 MS 5* Vũ Văn Ánh 38 Bệnh viện 354

6 MS 6* Trần Vi Thiềng 45 Bệnh viện 354

7 MS 7* guyễn Đạt Nam 36 Bệnh viện 354


Hoài Đức


Hoài Đức

10 MS 10* Nguyễn Thị Thoa 34 Bệnh viện 354





Phụ lục 5.2: Danh sách các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân uống 1 gói

thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg

STT KHM Họ tên bệnh nhân Tuổi Nơi lấy mẫu

1 MS 1 Nguyễn Thế Hữu 34Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

2 MS 2* Chu Xuân Ánh 28Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

3 MS 3* Nguyễn Đình Khoa 32Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

4 MS 4* Nguyễn Thị Thơm 38Phòng khám tư nhân

Hoài Đức


Hoài Đức


Hoài Đức

7 MS 7* Trần Đức Long 40Phòng khám tư nhân

Hoài Đức





Phụ lục 5.3. Danh sách các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân uống

cefadroxil (2 viên thuốc hàm lượng 500mg)

STT KHM Họ tên Tuổi Nơi lấy mẫu

1 MS1 Trần Đức Minh 35 Phòng khám tư nhânHoài Đức

2 MS 2 Trần Đức Minh 35Phòng khám tư nhân

Hoài Đức

3 MS 3* Phạm Thành Công 37 Bệnh viện 354

4 MS 4* Trần Văn Thịnh 32 Bệnh viện 354

5 MS 5* Hoàng Văn Bá 30 Bệnh viện 354


Hoài Đức



nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và...

Documents