BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Quách Thị Minh Thu

NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ

HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

Quách Thị Minh Thu

NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA ULVAN CÓ

HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý

Mã sỗ: 62.44.01.19

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS Thành Thị Thu Thủy

2. PGS.TS Trần Thị Thanh Vân

Hà Nội - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Quách Thị Minh Thu

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới tập thể cán bộ

hướng dẫn khoa học PGS.TS Thành Thị Thu Thủy - Viện Hóa học và PGS.TS Trần

Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hai PGS là những người Thầy đã chia sẻ

kinh nghiệm, hướng dẫn tôi cách tiếp cận với lĩnh vực khoa học chuyên sâu mà tôi

đang theo đuổi, cũng như các vấn đề khác trong cuộc sống trong suốt thời gian thực

hiện luận án.

Đặc biệt, tôi xin cảm ơn Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng - Viện

Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện

tốt nhất về thời gian cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành

luận án của mình.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Yuguchi Yoshiaki– Trường Đại học Điện

-Truyền thông Osaka đã giúp thực hiện phép đo SAXS và tạo mọi điều kiện thuận

lợi để tôi có thể hoàn thành công việc trong thời gian thực tập tại Nhật Bản.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, các anh chị

phụ trách Đào tạo sau Đại học - Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi

thủ tục cần thiết.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và những

người thân luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Quách Thị Minh Thu

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii

MỤC LỤC .................................................................................................... iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ vi

DANH MỤC HÌNH .................................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... x

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3

1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển ............................... 3

1.1.1. Phân loài rong biển ............................................................................ 3

1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển ........................... 6

1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển ................................................... 7

1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu ............................................... 7

1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ ................................................. 8

1.1.3.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục ................................................ 9

1.1.4. Rong lục chi Ulva và ulvan ............................................................ 12

1.1.4.1. Rong lục chi Ulva ....................................................................... 12

1.1.4.2. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan .................................. 12

1.1.4.3. Các tính chất hóa lý của ulvan .................................................... 16

1.1.4.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan .................................. 18

1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ...................... 22

1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC ........................................... 22

1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ...................................................... 22

1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................... 23

1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS ..................................................... 27

1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS ......................................... 28

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội

dung nghiên cứu của luận án. ................................................................. 30

iv

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... 30

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................... 32

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................... 38

2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ................................................................ 38

2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong ............................................ 39

2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan ............................................................. 42

2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học .............................................................. 44

2.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 47

2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan ........................................... 47

2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ........................................ 48

2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ................................................... 48

2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................... 48

2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 49

2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) ...................................... 49

2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ......................................... 49

2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên ................................... 49

2.3.1. Sulfate hóa ....................................................................................... 49

2.3.2. Acetyl hóa ........................................................................................ 50

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 52

3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu ................................................................ 52

3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan ............................... 52

3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan .................................. 53

3.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 58

3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) ........................ 58

3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N) ....................... 67

3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N) ........................... 82

3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H) ............................ 92

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh

học của ulvan ....................................................................................... 101

v

3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa ........................................................ 101

3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa ......................................................... 106

KẾT LUẬN CHUNG ................................................................................. 108

KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................................... 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 113

PHỤ LỤC .................................................................................................. 131

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13C- NMR Carbon-13 nuclear magnetic

resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

1H- NMR Proton nuclear magnetic resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

AOAC Association of Official Analytical

Chemist

Hiệp hội hóa học phân tích

COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H

CS% Cell survival % % tế bào sống sót

DA Degree of Acetyl Mức độ acetyl hóa

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

DS Degree of Sulfation Mức độ sulfate hóa

ESI -MS Electron spray ionization mass

spectrometry

Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện

Gal Galactose Galactose

GlcA Glucuronic acid Glucuronic acid

GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel

HeLa Henrietta lacks Dòng tế bào ung thư cổ tử cung

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan người

HMBC Heteronuclear mutiple bond

connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

HSQC Heteronuclear single-quantum

coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

IdoA Iduronic acid Iduronic acid

IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại

MALDI-MS Matrix assisted laser desorption

ionization mass spectrometry

Phổ khối lượng ion hóa khử hấp thụ nền

laze

Man Mannose Mannose

MCF-7 Michigan cancer foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú người

MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

Mn Number average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình số

Mw Weight average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình khối

NOESY Nuclear Overhauser effect

Spectroscopy

Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H-1H

OD Optical density Mật độ quang học

Rha Rhamnose Rhamnose

SAXS Small Angle X-ray scattering Tán xạ tia X góc nhỏ

SEM Scanning Electron Microscope Hiển vi điện tử quét

vii

SP Sulfate polysaccharide Sulfate polysaccharide

UL-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca

UL-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva lactuca

UL-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca

UR-Ac Ulvan acetyl hóa từ UR-N

UR-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata

UR-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva reticulata

UR-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata

UR-S Ulvan sulfate hóa từ UR-N

UroA Uronic acid Uronic acid

Xyl Xylose Xylose

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu ............................................................. 4

Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ............................................................... 4

Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục .............................................................. 5

Hình 1.4. Biểu đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide

[38] ........................................................................................................................ 11

Hình 1.5. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [38] .......................................... 14

Hình 1.6. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua Ca2+: hoặc a) của borate ester hoặc

một phần của b) carboxylate hoặc một phần của c) sulfate [1, 51] ......................... 17

Hình 1.7. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ

13C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan ...................................... 24

Hình 1.8. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide ..... 26

Hình 1.9. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111] ............................................. 28

Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS ............................................... 29

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa ............................ 35

Hình 2.1. Hình ảnh của mẫu rong nghiên cứu ........................................................ 38

Hình 2.2. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục .................................. 43

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm tế bào sống sót ................. 56

vào nồng độ ulvan UL-N ....................................................................................... 56

Hình 3.2. Phổ IR của UR-H .................................................................................. 59

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của UR-H ........................................................................ 60

Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của UR-H ....................................................................... 61

Hình 3.5. Phổ COSY của UR-H ........................................................................... 62

Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H ........................................................................... 62

Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H .......................................................................... 63

Hình 3.8. Phổ ESI-MS của UR-H ......................................................................... 65

Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ......................... 66

Hình 3.10. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 419 ........................ 67

Hình 3.11. Phổ IR của UR-N ................................................................................ 68

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của UR-N ...................................................................... 69

Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của UR-N ..................................................................... 70

Hình 3.14. Phổ COSY của UR-N .......................................................................... 71

Hình 3.15. Phổ HSQC của UR-N .......................................................................... 72

ix

Hình 3.16. Phổ HMBC của UR-N ......................................................................... 73

Hình 3.17. Phổ ESI-MS của UR-N ....................................................................... 74

Hình 3.18. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ......................... 75

Hình 3.19. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaUroASO3]- tại m/z 419 ............. 76

Hình 3.20. Sơ đồ phá mảnh của UR-N ................................................................... 77

Hình 3.21. Cấu trúc ulvan UR-N từ rong lục Ulva reticulata .................................. 78

Hình 3.22. Biểu đồ Kratky của dung dịch UR-N 1% trong nước ............................ 78

và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 78

Hình 3.23. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR-N 1% trong nước........................... 79

và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 79

Hình 3.24. a) Đơn vị cấu trúc để xây dựng mô hình cấu trúc phân tử, b) Mô hình

cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học ............................. 81

Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu

trúc phân tử. .......................................................................................................... 81

Hình 3.26. Phổ IR của UL-N ................................................................................ 83

Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của UL-N ...................................................................... 84

Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của UL-N ..................................................................... 85

Hình 3.29. Phổ COSY của UL-N .......................................................................... 86

Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N .......................................................................... 87

Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N ......................................................................... 88

Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N .............................................................. 90

Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ....................... 91

Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của UL-H ...................................................................... 92

Hình 3.35. Phổ 13C-NMR của UL-H ..................................................................... 93

Hình 3.36. Phổ COSY của UL-H .......................................................................... 94

Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H .......................................................................... 95

Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H ......................................................................... 97

Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ........................ 99

Hình 3.40. Phổ IR của UR-N (a) và UR-S (b) ..................................................... 102

Hình 3.41. Phổ 13C-NMR của UR-N (a) và UR-S (b) .......................................... 103

Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b) ............................................... 103

Hình 3.43. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-S (b) ................................................. 104

Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac ...................................... 106

Hình 3.45. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-Ac (b) ............................................... 107

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide [38] ............... 10

Bảng 1.2. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển ...... 23

Bảng 1.3. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng

glucose và galactose [104] ..................................................................................... 25

Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô) ....................... 41

Bảng 2.2. Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan ............................................... 44

Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan ................................. 52

Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan ...... 53

Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan ........................... 55

Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan .......................... 57

Bảng 3.5. Kết quả xác định khối lượng phân tử của 4 mẫu ulvan .......................... 58

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ IR của UR-H ..................................................... 59

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H ................................ 64

Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ IR của UR-N ..................................................... 68

Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N ................................ 74

Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N ............................... 89

Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H ............................... 98

Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S .......... 105

1

MỞ ĐẦU

Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành

công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Hàng năm, theo ước

tính sản lượng rong biển của thế giới đạt 15 triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn

vào năm 2020. Polysaccharide là các polymer sinh học được tìm thấy trong tự nhiên

trên cả thực vật và động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem

là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và đa dạng. Trên thế giới, các

nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong biển, chia làm 03 ngành

rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong nâu

(Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte).

Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có

hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất

phenolic, alkaloid,… trong đó polysaccharide được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất

do khả năng ứng dụng đa dạng của nó [1]. Việt Nam là đất nước có một vùng biển

nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km, là nguồn cung cấp các loài rong biển

phong phú và đa dạng, rong lục với trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc

về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm

69 loài với hai loài phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca.

Rong lục chi Ulva phân bố rộng và mọc tự nhiên ven biển, được đánh giá

giàu ulvan là một loại sulfate polysaccharide có nhiều hoạt tính sinh học như chống

đông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu, chống ung thư, kháng nấm… Do đó, việc

sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ ulvan phục vụ cho mục đích chữa bệnh đang

được chú ý.

Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục chi Ulva và Enteromorpha.

Cũng giống như các sulfate polysaccharide từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất

phức tạp, nó được cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose,

xylose, các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa

lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Do cấu trúc của ulvan từ rong lục rất

phức tạp làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, do đó cản trở sự

phát triển của các sản phẩm thuốc chữa bệnh. Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho

2

thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian với hoạt

tính sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng thể cấu trúc

của ulvan là rất cần thiết và đòi hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều

phương pháp. Hiện nay, một hướng nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các

dẫn xuất của hợp chất thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu

tố cấu trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính sinh học

cao hơn mẫu tự nhiên.

Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như carrageenan,

alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các kết quả tốt ứng dụng vào

cuộc sống thì cho đến nay chưa có công bố nào về polysaccharide từ các loài thuộc

ngành rong lục nói chung và ulvan từ chi Ulva nói riêng.

Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu cấu trúc của ulvan

có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata”, để nghiên cứu

cấu trúc của ulvan-một polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của

sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan nhằm góp phần

hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và mở rộng khả năng

ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2 loài

rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata.

Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính

sinh học của ulvan.

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án gồm:

1. Thu thập 2 loài rong lục phổ biến nhất thuộc chi Ulva ở Việt Nam là Ulva

reticulata và Ulva lactuca

2. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan

tách chiết từ 2 loài rong trên.

3. Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt.

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và acetyl

hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển

Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển là loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảo

biển. Rong biển có thế sống ở cả hai môi trường nước mặn và nước lợ, chúng mọc

trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới tầng nước sâu với

điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp.

1.1.1. Phân loài rong biển

Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong

biển và chia thành 3 ngành có giá trị kinh tế cao dựa vào màu sắc của chúng, bao

gồm: rong đỏ có khoảng 6500 loài; rong nâu với khoảng 1800 loài và rong lục

khoảng 1500 loài [2, 3].

So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong

biển đa dạng và phong phú [4, 5]. Các khảo sát điều tra cho thấy số lượng các loài

rong biển tại các vùng biển như sau: Phú Quốc có 108 loài; Trường Sa 66 loài; Vịnh

Hạ Long 99 loài; Cồn Cỏ 48 loài; Bạch Long Vĩ 46 loài. Riêng vùng Nha Trang có

210 loài. Năm 2003, tác giả Đàm Đức Tiến, Trần Đình Toại và CS cho biết riêng

vùng ven biển Bắc Bộ đã có 259 loài [6, 7].

Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các nhà khoa

học Việt Nam cùng thống nhất xếp chúng vào 3 ngành trong hệ thống phân loại 10

ngành của Gollerbakh năm 1977 [8]:

+ Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

+ Ngành rong nâu (Phaeophyta)

+ Ngành rong lục (Chlorophyta)

Rong nâu: Là loài rong thường có kích thước lớn, loại lớn thường dài

khoảng 20 mét, loài trung bình dài từ 2-4 mét, các loài nhỏ hơn dài từ 30–60 cm [2,

3]. Chúng chứa sắc tố xanthophyll-fucoxanthin cùng với chlorophyll a và c nên cá

thể của rong nâu đều thể hiện màu nâu lục đặc trưng. Rong nâu là loài rong phổ

biến nhất với trữ lượng lớn, khoảng 1800 loài, thường sinh trưởng ở vùng biển đá,

nước biển lạnh thuộc bán cầu Bắc, chúng không chỉ mọc trên đá mà còn trên các

chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác.

4

Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt Nam,

Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ…. Trước đây, rong nâu được sử dụng

để tách iodine và kalium. Trong thời gian gần đây, rong nâu được khai thác rộng rãi

để chiết tách alginate và fucoidan. Hình 1.1 là ảnh của một số loài rong nâu.

Sargassum microcystum Padina australis

Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu

Rong đỏ: Là loài rong có kích thước nhỏ hơn rong nâu, thường dài từ vài

centimet đến hàng mét; tuy nhiên rong đỏ không luôn luôn có màu đỏ: thỉnh thoảng

chúng có màu tím, thậm chí là nâu đỏ nhưng chúng vẫn được xếp vào ngành rong

đỏ do những đặc tính khác như màu sắc của chúng là do các hạt sắc tố

phycobilin tạo thành, phycobilin là sắc tố đặc trưng cho rong đỏ. Ngành rong

đỏ có khoảng 6500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ. Phần lớn các loài rong đỏ

sống ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số ít thuộc dạng một tế bào hay

quần thể. Rong đỏ có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh,

phần lớn chia nhánh kiểu một trục, một số ít theo kiểu hợp trục [2, 3, 9]. Hình 1.2 là

ảnh của một số loài rong đỏ.

Porphyra Vietnameusis Acanthophora spicifera

Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ

5

Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile, Indonesia,

Philippine tiếp đến là Thailand, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii, Ấn Độ, Anh,

Mỹ … Trên thế giới, rong đỏ được sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ cuộc

sống con người, một số loài có hàm lượng cao về agar, carageenan, furcellaran được

sử dụng để chế biến keo rong biển và làm phụ gia thực phẩm.

Các loài rong đỏ được chia thành hai nhóm chính [8]:

- Nhóm rong cho agar (Agarophit): Bao gồm các loại như Gelidium,

Gracilaria và Acanthopeltis.

- Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophit): Bao gồm các loại như

Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea và Furcellaria.

Rong lục: Là loài rong có kích thước nhỏ giống như rong đỏ, chúng bao gồm

cả những loài đơn bào và đa bào. Rong lục chứa chlorophylls cả hai dạng a và b.

Trên thế giới, rong lục phân bố chủ yếu tập trung tại Philipine, tiếp theo là Hàn

Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài như Ulva

reticulata, Ulva lactuca, Caulerpa racemosa, … Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải

rác ở các nước: Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia, Achentina,

Bangladesh… [2, 10]. Hình 1.3 là ảnh của một số loài rong lục.

Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục

6

1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển

Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho rất nhiều ngành

công nghiệp như thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm. Rong còn được dùng

để làm phân bón, cung cấp nhiều K, Ca, P cho đất... [11]. Rong biển được coi là loại

thực phẩm có giá trị cao, cả góc độ ẩm thực và dinh dưỡng.

Tại các nước trong vùng châu Á - Thái Bình Dương, rong biển được tiêu thụ

nhiều nhất, chiếm 80% tổng sản lượng toàn cầu, châu Âu chỉ tiêu thụ 1%, rong biển

được dùng nhiều để nấu súp, làm sushi, trộn salad … [2, 3].

Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide,

polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó,

polysaccharide là thành phần chính của rong biển, được coi là nguồn đường vô tận

của rong biển, được cho là rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà khoa học

quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học [3, 10]. Ngoài chức năng là

làm vật liệu tạo nên thành tế tào, các polysaccharide giữ nhiều chức năng quan

trọng khác đối với tế bào như trao đổi chất và bảo vệ tế bào do chúng có độ bền cơ

học cao [12, 13].

Từ rong biển, người ta đã sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị

hàng năm được ước tính đạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD. Trong đó các polysaccharide đóng

góp phần lớn giá trị của rong. Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa

(mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”,

“extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tương tự, thường có nghĩa là nó chứa một

trong số các hydrocolloid được chiết từ rong biển [14].

Các nghiên cứu về giá trị thành phần dinh dưỡng của rong biển [2, 11] cho

thấy rong biển rất giàu dưỡng chất, ngoài thành phần đạm rất cao, rong biển còn

chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine (yếu tố vi

lượng tối cần thiết cho tuyến giáp), các vitamin (A, E, C, B12 và B1) và chất xơ [1,

11]. Hàm lượng sinh tố A trong rong biển cao gấp 2 - 3 lần so với cà rốt, gấp 10 lần

trong bơ, hàm lượng calcium cao gấp 3 lần so với sữa bò, vitamin B2 cao gấp 4 lần

trong trứng, vitamin C, E cao gấp nhiều lần trong rau quả.

Thực tiễn cho thấy rong biển còn có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước

thải. Một số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như: Zn và

Cd từ nước bị ô nhiễm [3, 10]. Cũng do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng

7

có trong rong khá cao nên rong còn được dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh

thiếu một số chất như sắt, iodine….[3].

Polysaccharide từ rong biển có tính chất đặc biệt là dễ tạo gel, có độ nhớt cao

rất dễ tạo màng nên chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kinh tế như:

công nghệ thực phẩm (chế biến thịt, sữa, làm bánh kẹo), làm thuốc đánh răng, dùng

trong mỹ phẩm…ngoài ra chúng còn là nguồn nguyên liệu để làm dược phẩm [2,

10]. Do tính chất dễ tạo màng, có thể dùng polysaccharide tự nhiên để tạo màng

polymer sinh học, khi sử dụng polysaccharide để làm vật liệu chế tạo màng sinh

học, màng này giữ lại nhiều tính chất tốt của polysaccharide tự nhiên. …Một điều

quan trọng là các phế thải của chúng (màng sau khi sử dụng) không gây ô nhiễm

môi trường, vì các vật liệu này sau khi thải ra môi trường sẽ dần phân hủy bởi các

hệ vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên [1].

Tại Hội nghị Bali về khí hậu trái đất, một nhóm nhà khoa học cho biết rong

và rêu biển có thể là một vũ khí hữu hiệu chống lại sự ấm dần của trái đất do chúng

có khả năng hút khí carbon dioxide trong khí quyển với một tốc độ tương đương với

những cánh rừng nhiệt đới rộng lớn.

Polysaccharide từ rong biển còn có tác dụng hấp thụ cholesterol thải ra ngoài

cơ thể, khiến hàm lượng cholesterol trong máu duy trì ở mức cân bằng. Nhiều

nghiên cứu khoa học trong thời gian gần đây cũng đã xác nhận, rong biển có tác

dụng phòng chống virus và phòng chống ung thư [16, 17].

1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển

1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu

Fucoidan là sulfate polysaccharide có trong rong nâu, fucoidan chiếm hàm

lượng khoảng 0,6 - 4% trọng lượng rong khô và cấu trúc của nó thay đổi theo loài

nhưng thành phần chính vẫn là đường fucose và nhóm sulfate [18]. Cấu trúc của

fucoidan trong rong biển là vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay

đổi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường đơn khác

nhau [19, 20]. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng.

Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói

riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc

đường. Các fucoidan có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều vấn đề cần làm sáng tỏ

8

như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh

và polymer hóa của chúng. Vì vậy, cho tới nay, việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng

vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao

mới nhất [21, 22]. Hiện nay phương pháp sử dụng phổ khối ion hóa phun mù điện

(ESI-MS) đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, ứng dụng trong

nghiên cứu cấu trúc fucoidan [23, 24, 25].

Bằng phương pháp sắc ký, phổ IR và NMR đã cho các thông tin về thành

phần đường, kiểu liên kết của các đường trong phân tử fucoidan, nhưng các thông

tin về trật từ sắp xếp của các đường cũng như vị trí của nhóm sulfate trong phân tử

vẫn chưa được xác định, do đó chưa giải thích được các đặc tính sinh học khác nhau

của các phân đoạn fucoidan một cách rõ ràng và thuyết phục [18, 19].

Fucoidan có hoạt tính sinh học rất phong phú, nhiều hoạt tính sinh học quí

báu như hoạt tính chống khối u, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn,

kháng nấm, chống đông tụ máu và hoạt tính chống lại các virus như HIV [26, 27,

28]. Ngoài ra, fucoidan còn được mô tả có nhiều tác dụng sinh học lý thú khác như

tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu, giảm LDL-cholesterol, triglyceride máu,

tăng HDL-cholesterol, ức chế miễn dịch nên có thể sử dụng fucoidan trong các

trường hợp ghép phủ tạng … [29, 30].

1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ

Carrageenan là sulfate polysaccharide mạch thẳng, có khả năng tạo gel và

làm đặc dung dịch. Carrageenan tồn tại trong một số rong đỏ thuộc họ

Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài rong như

Gigartina, Chondrus, Iridaea, Eucheuma [31].

Carrageenan được tạo thành từ các đường galactose mạch thẳng với hàm

lượng sulfate khác nhau (trong khoảng 15%-40%). Các loại carrageenan khác nhau

thì khác nhau về thành phần và cấu dạng, vì thế chúng tạo nên một khoảng biến đổi

rộng các tính chất lưu biến cũng như các tính chất đặc biệt khác [32].

Cũng như các polysaccharide tự nhiên khác, carrageenan cũng không có khối

lượng phân tử xác định. Carrageenan thương mại loại dùng trong ngành chế biến thực

phẩm có khối lượng trung bình nằm trong khoảng 200 000 g/mol. Các tính chất của

9

carrageenan phụ thuộc rất lớn vào khối lượng mol phân tử của chúng và chúng gần

như mất đi nếu mol phân tử nhỏ hơn 100 000 g/mol [33].

Do carrageenan là polymer được tạo thành từ khoảng 1000 mắt xích nên khả

năng của sự biến đổi cấu trúc là rất lớn. Cho đến nay, ba loại carageenan chính tồn

tại trong tự nhiên là kappa-(-), iota-(i-) và lambda-(-) carrageenan.

Cấu trúc của carrageenan đã được nghiên cứu từ những năm 50 của thế kỷ

20. Tuy nhiên cấu trúc chi tiết cũng như cấu hình không gian của carrageenan vẫn

chưa được nghiên cứu đầy đủ. Việc sử dụng phổ MS và NMR trong nghiên cứu cấu

trúc của carrageenan còn gặp nhiều khó khăn do sự phức tạp của phổ và cn nhiều

vấn đề như liên kết hydro nội/ ngoại phân tử hay vai trò của nhiệt độ và dung môi

làm ảnh hưởng đến cấu trúc [33, 34].

Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học,

đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel rất khác nhau. Các carrageenan đều

chứa nhóm thế sulfate trong phân tử, hàm lượng và vị trí của nhóm este sulfate ảnh

hưởng lớn đến sự tạo gel của chúng.

Carrageenan thể hiện hoạt tính sinh học quí như: khả năng kháng nhiều loại

virus (đặc biệt là rotavirus gây bệnh tiêu chảy), trong đó lambda-carrageenan thể

hiện khả năng ức chế rotavirus mạnh nhất [35]; hoạt tính chống u bướu (khả năng

ức chế di căn của tế bào ung thư) [36]. Hoạt tính sinh học của sulfate carrageenan

phụ thuộc vào trọng lượng phân tử, cấu trúc carbohydrate cũng như hàm lượng và

vị trí liên kết của các nhóm sulfate [37].

1.1.3.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục

Trên thế giới, các loài rong lục cho sulfate polysaccharide được chia thành 4

nhóm chính [38]:

- Nhóm rong lục cho ulvan: Bao gồm các loài rong lục thuộc 2 chi Ulva và

Enteromorpha. Từ năm 2000, nhóm rong cho ulvan được gọi chung là chi Ulva

[http://www.algaebase]. Ulvan có thành phần đường gồm: Rha, Xyl, UroA, Glu,

Gal, Man … và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác

nhau, tạo nên cấu trúc rất đa dạng, phức tạp gồm nhiều kiểu liên kết glycoside như:

Ở Rha: α-(1→4)-, α-(1→3)-, α-(1→3,4)- và α-(1→2,3,4)-, ở Xyl: β-(1→4)-, β-

10

(1→2,4)-; ở Glu: β-(1→4)- và β-(1→3); ở GlcA: β-(1→4)-. Nhóm sulfate trong

phân tử ulvan đều ở vị trí carbon C-3 hoặc C-2 của Rha.

Bảng 1.1. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide [38]

Họ Chi Loài Monostromataceae

Monostroma M. latissimum M. nitidum M. angicava

Ulvaceae

Enteromorpha

E. clathrata E. compressa E. intestinalis E. linza E. prolifera

Ulva

U. arasakii U. armoricana U. clathrata U. conglobata U. fasciata U. lactuca U. pertusa U. reticulata U. rigida U. rotundata

Capsosiphonaceae Capsosiphon C. fulvescens Cladophoraceae Chaetomorpha C. antennina Bryopsidaceae Bryopsis B. plumose Halimedaceae Halimeda H. monile Caulerpaceae Caulerpa C. brachypus

C. cupressoides C. lentillifera C. prolifera C. racemosa C. sertularioides

Codiaceae Codium C. adhaerens C. cylindricum C. dwarkense C. fragile C. istmocladum C. latum C. pugniformis C. tomentosum C. vermilara C. yezoense

11

- Nhóm rong lục cho sulfate arabinogalactan: Bao gồm các loài rong lục

thuộc chi Codium như C. fragile, C. adhaerens, C. cylindricum… Thành phần

đường chủ yếu trong phân tử sulfate arabinogalactan là Ara, Gal với lượng nhỏ Glc,

Man, Xyl và nhóm sulfate tạo thành cấu trúc chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ

khác nhau: β-(1→3)-D-Gal và β-L-Ara với hàm lượng sulfate cao, Gal bị sulfate hóa

ở carbon C-2 và C-4 hoặc chỉ ở C-4 và phần nhỏ ở C-6; β-(1→3)-D-Gal và lượng

nhỏ β-(1→3,6)-Gal, với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí carbon C-4, phần nhỏ ở C-6.

- Nhóm rong lục cho sulfate galacotan: Bao gồm các loài thuộc chi

Caulerpa, chủ yếu là loài C. cupressoides và C. racemosa. Sulfate galacotan là một

loại polysaccharide hỗn hợp từ nhiều loại monosaccharide khác nhau với thành

phần chủ yếu là đường Gal, lượng nhỏ các đường Glc, Man, Xyl và nhóm sulfate

tạo thành chuỗi với nhiều kiểu liên kết glycoside: (1→3)- và (1→3,6)-Gal, (1→4)-

và (1→3,4)-Ara, (1→4)-Glu, với nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của (1→4)-Ara

và C-6 của (1→3)-Gal, (1→3)-β-D-Gal và (1→6)-β-D-Gal, nhóm sulfate ở vị trí

carbon C-2.

Theo biểu đồ ở Hình 1.4 cho thấy: nhóm rong lục chứa số lượng lớn các loài

cho sulfate polysaccharide bao gồm các chi Ulva (38%), Enteromorpha (nay gọi là

Ulva) (14%), Monostroma (14%), Codium (16%), và Caulerpa (11%). Các chi còn

lại bao gồm Capsosiphon, Chaetomorpha, Bryopsis, và Halimeda, chỉ chiếm 7%

trong tổng số (Hình 1.4).

Hình 1.4. Biểu đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide

[38]

12

1.1.4. Rong lục chi Ulva và ulvan

1.1.4.1. Rong lục chi Ulva

Trong thời gian gần đây, trên thế giới, rong lục là nguồn tài nguyên tự nhiên

ngày càng được quan tâm sử dụng trong cuộc sống nhiều hơn phục vụ đời sống con

người như làm thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm đặc biệt là trong lĩnh vực y học.

Rong lục là một trong 3 ngành rong chính đã biết hiện nay, chúng tồn tại

trong tự nhiên với số lượng lớn và rất đa dạng về thành phần loài, bao gồm những

chi chủ yếu sau: Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora, Valonia,

Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium... Trong đó có nhiều loài thuộc các chi

rong lục là Ulva, Enteromorpha, Caulerpa, Codium được sử dụng như là nguồn

thức ăn phổ biến [38].

Ở nước ta, rong lục là ngành có trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu

thuộc về các chi rong Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi

Ulva gồm 69 loài trong tổng số 100 loài đã được định danh trên thế giới.

Rong lục chi Ulva được cho là rất giàu protein, polysaccharide, các vitamin

và các khoáng chất, trong đó, polysaccharide ngày càng được quan tâm nhiều nhất

do chúng có những tính chất vật lý và hóa học đáng chú ý và có nhiều tiềm năng

ứng dụng trong y sinh học.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, có 4 dạng polysaccharide được tìm thấy từ

rong lục chi Ulva bao gồm: dạng tan trong nước là ulvan, dạng không tan trong

nước là cellulose, dạng tan trong kiềm là xyloglucan mạch thẳng và lượng nhỏ

glucuronan [13].

1.1.4.2. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan

Ulvan là sulfate polysaccharide từ rong lục thuộc chi Ulva, được biết đến là

các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học quý báu như

điều chỉnh hệ miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, chống đông tụ và kháng vi

sinh vật kiểm định [3, 38, 39]. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan

phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau

thu hái [12, 13]. Do đó, việc sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ ulvan tự nhiên

phục vụ cho mục đích chữa bệnh đang được chú ý nhiều hơn và đóng vai trò quan

trọng trong các đề tài nghiên cứu. Tuy nhiên, các ulvan từ rong lục có cấu trúc rất

13

đa dạng và không đồng nhất, làm cho việc nghiên cứu cấu trúc của chúng gặp nhiều

khó khăn, cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc chữa bệnh.

Ulvan là sulfate polysaccharide tan trong nước, được phân lập chủ yếu từ 2

chi rong lục Ulva và Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae. Ulvan được tạo nên bởi các

thành phần đường chủ yếu là rhamnose (Rha), xylose (Xyl), các acid là acid

glucuronic (GlcA), acid iduronic (IdoA) và nhóm sulfate để tạo thành mạch

polymer sinh học với disaccharide chính là acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng A

((β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(→1)) và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B ((α-

L-IdoA-(1→4)-α-L-Rha3S (→1)). Cấu trúc hóa học này tương tự như các

glycosaminoglycans (GAGs) của động vật có vú, có hoạt tính chống đông máu như

heparin.

Ulvan thường được chiết bằng dung dịch nước ở nhiệt độ 80º-90ºC với sự có

mặt của tác nhân cation chelat hóa trị 2, như ammonium oxalate. Hiệu suất chiết

tách thu được từ 8% đến 29% trọng lượng rong khô [13] và hiệu suất chiết ulvan từ

15% đến 70% tùy thuộc loài rong. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng GlcA và Rha

tồn tại ở dạng acid aldobiouronic và 4-O-α-D-glucuronosyl-L-Rha, tương ứng (Hình

1.6). Ulvan từ một số loài rong lục như Ulva lactuca, Enteromorpha compressa,

Enteromorpha intestinalis, Ulva rigida, và Ulva arasakii được tạo thành từ các hợp

phần Rha, Xyl, GlcA, IdoA và sulfate với tỉ lệ tương ứng 16,8%-45%, 2,1%-12%,

0,5%-6,4%, 6,5%-19,0% và 16%-23,2% [12]. Nghiên cứu của tác giả Quemener

[40] đã chứng minh rằng, IdoA (1,1%-9,1%) cũng là một carbohydrate thành phần

trong ulvan, các thành phần đường mannose (Man) và galactose (Gal) cũng được

tìm thấy trong phân tử ulvan và tùy thuộc vào loài rong nghiên cứu, ví dụ như Man

và Gal là các đường được tìm thấy trong polysaccharide chiết tách từ rong lục Ulva

conglobata; gần đây, đường arabinose (Ara) được phát hiện là một monosaccharide

có trong rong lục Enteromorpha clathrata.

Theo các nghiên cứu trước đây, khối lượng phân tử của một polysaccharide

bị ảnh hưởng lớn bởi một vài yếu tố, đối với ulvan khối lượng phân tử thay đổi từ

150 000 g/mol đến 2 000 000 g/mol. Các phân tử ulvan có xu hướng tập hợp lại với

nhau làm ảnh hưởng đến việc xác định khối lượng phân tử Mw. Các loại ulvan khác

nhau xảy ra hiện tượng phân tử bị tụ lại khác nhau do đó khối lượng phân tử cũng

khác nhau, sự khác nhau về thành phần và cách sắp xếp các phân tử đường cũng tác

14

động đến tính chất tập hợp này, nó có thể lý giải cho tính chất đa phân tử của ulvan.

Tuy nhiên, ulvan được biết đến gồm 2 thành phần đại phân tử chính là thành phần

có khối lượng phân tử cao (Mw = 500 000–800 000 g/mol) và thành phần với khối

lượng phân tử thấp (Mw=150 000–200 000 g/mol). Trong đó, phần có khối lượng

phân tử cao là phổ biến và có độ nhớt cao hơn [38].

Các kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy ulvan từ Enteromorpha được tạo

thành bởi liên kết glycoside ở Rha là α-(1→4)-, α-(1→3)-, α-(1→3,4)- và α-

(1→2,3,4)-, liên kết glycoside ở Xyl là β-(1→4)- và β-(1→2,4)-. Kết quả nghiên

cứu ulvan phân lập từ Ulva lactuca chỉ ra rằng, phần lớn liên kết glycoside ở Rha

trong phân tử ulvan là liên kết α-(1→4)- và Rha bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-3.

Những nghiên cứu sau đó cũng cho thấy, cấu trúc của ulvan có những đặc trưng

sau: liên kết glycoside ở Xyl là β-(1→4)- và β-(1→3)-, liên kết glycoside ở Glu là

β-(1→4)- và β-(1→3)-, liên kết glycoside ở GlcA là β-(1→4)-. Gần đây, những số

liệu nghiên cứu khẳng định lại sự có mặt của 2-sulfate Xyl trong phân tử ulvan và

chứng minh là hầu hết các nhóm sulfate trong phân tử ulvan từ rong lục Ulva đều ở

vị trí carbon C-3 hoặc C-2 của Rha [38, 40-44].

Hình 1.5. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [38]

15

Thành phần chính trong cấu trúc của ulvan là acid sulfate aldobiouronic, gồm

có 2 dạng là IdoA và GlcA. Các loài Ulva khác nhau cho ulvan với cấu trúc của

dạng chuỗi disaccharide lặp lại là khác nhau, các disaccharide được phân thành 2

dạng chính là dạng A (A3s) với β-D-GlcA nối với L-Rha3S tạo thành dimer qua liên

kết glycoside (1→4) (β-D-GlcA-(1→4)-L-Rha3S) và dạng B (B3s) với sự có mặt

của α-L-IdoA nối với α-L-Rha3S cũng qua liên kết glycoside ở vị trí (1→4) (Hình

1.5).

Lahaye và CS [43] và Hela và CS [12] đã nghiên cứu cấu trúc hóa học của

ulvan từ loài rong lục Ulva lactuca, kết quả chỉ ra rằng polysaccharide được tạo

thành bởi phần lớn là chuỗi liên kết glycoside ở Rha dạng (1→4) và (1→2,4) và

Rha bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-3, liên kết glycoside ở GlcA là β-(1→4)-, liên

kết glycoside ở Xyl là (1→4)- và (1→3)- và xylose bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-

2. Gần đây, những số liệu nghiên cứu khẳng định lại sự có mặt của 2-sulfate Xyl

trong phân tử ulvan và chứng minh là hầu hết các nhóm sulfate trong phân tử ulvan

từ rong lục Ulva đều ở vị trí carbon C-3 hoặc C-2 của Rha-(1→4)-.

Trong nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ rong lục Ulva rigida, Ray và CS

[44] cho thấy: sau khi mẫu ulvan bị thủy phân nhẹ trong môi trường acid tạo

oligosaccharide và desulfate hóa, cấu trúc hóa học của những oligomer này được

xác định bằng phổ NMR. Các tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên kết

glycoside trong phân tử ulvan có dạng sau: α-L-Rha-(1→ 4)-D-Xyl; β-D-GlcA-

(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl; β-D-GlcA-(1→4)-L-Rha3S; β-D-GlcA-(1→4)-[β-

D-GlcA-(1→2)]-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl và β-D-GlcA-(1→4)-[β-D-GlcA-(1→2)]-

α-L-Rha. Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết trong phân ulvan thường xảy ra ở vị

trí C-2 của liên kết (1→4)-α-L-Rha là β-D-GlcA; nhóm tác giả cũng khẳng định

lại rằng nhóm sulfate nằm ở vị trí C-3 của rhamnose. Các nghiên cứu sau đó cho

thấy các liên kết glycoside và vị trí nhóm sulfate trong cấu trúc của ulvan này là

phổ biến cho các loài Ulva khác nhau [39, 41, 42].

Nghiên cứu của Delattre và CS [4] cho rằng các sulfate polysaccharide với

khối lượng phân tử lớn được chiết tách từ rong lục Ulva armoricana là ulvan có cấu

trúc dạng B3s. Các tác giả cũng đã chứng minh sự có mặt của các chuỗi lặp lại -

A3s-A3s-, -A3s-B3s-, -A3s-U3s-, -A3s-GlcA-A3s- trong cấu trúc phân tử ulvan, ở

đây U3s là 3-sulfate ulvanobiose. 3-sulfate Ulvanobiose được xem là một dạng

16

ulvan khi Xyl thế chỗ acid uronic hoặc GlcA là nhánh ở vị trí C-4 của Rha3S (Hình

1.5).

Tóm lại, ulvan từ chi rong lục Ulva được tạo nên bởi các thành phần chính

chủ yếu là các đường Rha, Xyl, các acid GlcA, IdoA và nhóm sulfate tạo thành

chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau. Cấu trúc chi tiết của các phân tử

ulvan từ các loài rong lục Ulva đã được các nhà khoa học công bố, bao gồm, kiểu

liên kết glycoside, sự sắp xếp các phân tử đường, cách phân nhánh và/hoặc kiểu

sulfate hóa. Các chuỗi oligosaccharide ulvan khác nhau này được tìm thấy trong

những polysaccharide có nguồn gốc từ các loài rong Ulva khác nhau, được giải

thích là do chúng bị tác động bởi các nhân tố sinh lý môi sinh làm ảnh hưởng đến

quá trình sinh tổng hợp của rong. Ví dụ, 2 mẫu ulvan từ rong lục Ulva rigida thu hái

được ở quần đảo Canary-Spain và Brittany-France, cùng có chung cấu trúc chuỗi

dạng -A3s-A3s-, -A3s-U3s-, -A3s-U2s,3s- ; khác nhau ở cấu trúc dạng -A3s-U3s-

U3s-, -A3s-U2s,3s-U3s-, và -A3s-U2s,3s-U3s-U3s- đối với mẫu xuất xứ từ quần

đảo Canary; còn mẫu từ Brittany chuỗi cấu trúc có dạng -A2g,3s-U3s và -A2g3s-

U2s,3s-. Trong đó U2s,3s là 2,3-disulfate ulvanobiose và A2g,3s gán cho dạng A

acid 3-sulfate ulvanobiouronic bị thế ở vị trí C-2 của Rha3S bởi một GlcA (Hình

1.5).

1.1.4.3. Các tính chất hóa lý của ulvan

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, ulvan có cấu trúc đa dạng là do thành phần

hóa học của ulvan rất phức tạp [45]. Tính đều đặn cục bộ của ulvan tự nhiên dựa

vào sự lặp lại của các đơn vị là A3s và B3s (Hình 1.5), tồn tại trong thời gian ngắn

gây ra sự tạo thành gel yếu [46]. Cấu trúc đều đặn của ulvan bền là do tương tác hút

và đẩy sinh ra giữa các nhóm chức của ulvan, đặc biệt là lực tĩnh điện. Ulvan là một

polymer mang điện do trong cấu trúc của nó chứa nhóm carboxylic và sulfate, độ

bền của ulvan phụ thuộc và pH và nồng độ ion trong dung dịch. Điện tích thực

trong ulvan tác động đến hình dạng của chuỗi polymer và điều khiển quá trình

chuyển từ dạng này sang dạng khác của chuỗi [45]. Về phương diện hóa học, khả

năng thay đổi hình dạng của ulvan là rất rõ ràng phụ thuộc vào hiệu lực tự nhiên của

các nhóm chức. Độ tan và hình thái học của ulvan tác động sâu đến khả năng phản

ứng của nó trong môi trường làm việc.

17

Ulvan được biết đến là chỉ tan trong nước và bản chất là có khả năng hút

nước cao. Tuy nhiên, dung dịch thu được không trong suốt, cho thấy dạng tập hợp

cực nhỏ của vật liệu polymer không phân tán hoàn toàn trong dung môi. Thực vậy,

khi phân tích mẫu ulvan trong dung dịch nước, người ta thấy sự có mặt của các tập

hợp dạng hình cầu được nối với nhau bởi các sợi rất nhỏ [47]. Sự có mặt nhóm

methyl ở rhamnose trong phân tử ulvan với hàm lượng lớn được cho là nguyên nhân

của tính chất kị nước khác thường của polysaccharide mang điện tích [47]. Tính

nhớt thấp khác thường của ulvan trong dung dịch cũng có thể bị quy cho là do các

tập hợp hình cầu bị cô đặc lại, không đặc trưng cho các polymer mang điện, hình

dạng của các tập hợp hình cầu tăng lên về thể tích dẫn đến tăng độ nhớt [48, 49]. Sự

hình thành các tập hợp siêu nhỏ trong dung dịch cũng không cho phép phân tích

được khối lượng chính xác của ulvan, dạng tập hợp khác nhau ảnh hưởng mạnh đến

sự phân bố peak, điều này thường biểu hiện rất rõ trên sắc đồ của phương pháp đo

sắc ký thẩm thấu gel GPC [49, 50].

Hình 1.6. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua Ca2+: hoặc a) của borate ester hoặc

một phần của b) carboxylate hoặc một phần của c) sulfate [1, 51]

18

Ulvan còn có khả năng tạo gel trong nước giống với alginate, khả năng tạo

gel này đặc biệt liên quan đến tạo borate ester, điều kiện tối ưu cho sự tạo thành

hydrogel là khi có mặt của acid boric và ion calcium trong dung dịch với pH = 7,5,

hydrogel tạo thành với độ đàn hồi (storage modulus) khoảng 250Pa. Cơ chế của sự

tạo gel là không tạo mạng hoàn toàn, bắt nguồn từ việc tạo thành borate ester với

ulvan 1,2-diol tiếp theo bằng liên kết ngang qua ion Ca2+. Ion calcium sẽ làm cầu

nối của phức và/hoặc làm cho borate ester trở nên bền hơn (Hình 1.6.a), nhóm

sulfate và acid carboxylic cũng có thể tạo liên kết với ion Ca2+ (Hình 1.6.b,c) góp

phần vào quá trình tạo gel của ulvan [13, 51]. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua

Ca2+ được mô tả ở Hình 1.6.

1.1.4.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan

Các nghiên cứu chỉ ra rằng polysaccharide có hoạt tính sinh học quý báu là

do sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử [52]. Ulvan và các oligosaccharide của

nó là những sufate polysaccharide nên nó cũng thể hiện có hoạt tính sinh học phong

phú như khả năng chống oxy hóa [53, 54], chống đông tụ [55], kháng vi sinh vật

kiểm định [56] và tăng khả năng miễn dịch [57]. Thêm nữa, ulvan còn được biết

đến là có nhiều tác dụng sinh học khác như tác dụng hạ mỡ máu [58], giảm

cholesterol, giảm LDL-cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL-cholesterol [59, 60],

điều chỉnh miễn dịch nên có thể sử dụng ulvan trong các trường hợp ghép phủ tạng

… Những hoạt tính nêu trên đã được các nhà khoa học chứng minh ở cả mô hình thí

nghiệm in vitro và in vivo. Do vậy, ulvan là hợp chất rất có giá trị cho khả năng sử

dụng vật liệu sinh học trong những lĩnh vực y sinh, và có thể phát hiện ra “chìa

khóa” để phát triển hoạt tính sinh học của ulvan.

1.1.4.4.1. Hoạt tính chống ô xy hóa

Những kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học của ulvan cho thấy, ulvan là

hợp chất có tác dụng chống oxy hóa rất tốt [61, 62], hoạt tính chống oxy hóa thể

hiện ở khả năng làm sạch gốc tự do superoxide, khả năng quét gốc hydroxyl và gốc

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), khả năng oxy hóa tổng và khả năng khử sắt.

Khả năng chống oxy hóa của ulvan phụ thuộc chủ yếu vào thành phần và cấu trúc

hóa học của chúng, đặc biệt phụ thuộc vào khối lượng phân tử, thành phần sulfate

và sự phân bố nhóm sulfate trong phân tử [52]. Các nhà khoa học đã thành công khi

tăng hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan bằng cách xử lý mẫu ulvan với sulphur

19

trioxide/N,N-dimethylformamide [63] hoặc điều chế các dẫn xuất của ulvan với

nhóm thế phù hợp (bằng cách acetyl hóa và benzoyl hóa) nhằm làm tăng hoạt tính

của ulvan tự nhiên [64].

Một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng hoạt tính chống oxy hóa của sulfate

polysaccharide tăng lên khi khối lượng phân tử của chúng tăng [65]. Sự ảnh hưởng

của hàm lượng sulfate đến hoạt tính chống oxy hóa của các sulfate polysaccharide

từ rong lục là vấn đề còn nhiều tranh cãi. Ví dụ, các ulvan chiết tách từ rong Ulva

fasciata với hàm lượng sulfate khác nhau đã được thử hoạt tính chống oxy hóa trên

mô hình thí nghiệm in vitro; kết quả chỉ ra rằng các ulvan với hàm lượng sulfate

thấp biểu hiện hoạt tính cao hơn [66, 67]. Sự liên quan giữa thành phần sulfate và sự

phân hủy gốc superoxide có quan hệ tuyến tính, tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu

trúc và cơ chế chống oxy hóa cho tới nay vẫn chưa được làm sáng tỏ [68].

1.1.4.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính chống đông tụ máu của các

ulvan chiết tách từ rong lục. Người ta thấy rằng, hoạt tính chống đông tụ máu của

ulvan phụ thuộc vào thành phần đường tự nhiên, vị trí nhóm sulfate và hàm lượng

sulfate trong phân tử [69, 70] và nhóm sulfate là yếu tố cần thiết cho hoạt tính

chống đông tụ máu [71]. Ngoài ra, khối lượng phân tử cũng là yếu tố quan trọng tác

động đến khả năng chống đông tụ máu của ulvan, những ulvan với khối lượng phân

tử lớn hơn có khả năng ức chế sự nghẽn mạch máu tốt hơn. Acid uronic không là

thành phần cần thiết cho hoạt tính chống đông tụ máu, nhưng nó có thể làm tăng

khả năng chống đông tụ máu thông qua việc cải thiện độ linh hoạt của chuỗi đường

[72, 73].

Các nhà khoa học đã chứng minh rằng ulvan có cấu trúc giống với heparin,

nó được dùng rộng rãi để ngăn chặn sự rối loạn nghẽn tĩnh mạch [74, 75].

Tầm quan trọng của việc tìm ra nguồn nguyên liệu tự nhiên có hoạt tính

chống đông tụ máu thay thế cho heparin đang rất được quan tâm là do khi sử dụng

heparin, gây nhiều tác dụng phụ liên quan đến miễn dịch và bệnh chuyển hóa, thêm

nữa quá trình tinh chế heparin phải qua nhiều bước rất phức tạp [76]. Vì vậy, đòi

hỏi liệu pháp điều trị chống đông tụ máu an toàn hơn là rất cần thiết. Do đó, sulfate

polysaccharide và ulvan có nguồn gốc tự nhiên sẽ là nguyên liệu được thay thế cho

heparin một cách rất hiệu quả và đáp ứng được yêu cầu an toàn.

20

1.1.4.4.3. Hoạt tính điều chỉnh hệ miễn dịch và chống ung thư

Những tài liệu nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, hầu hết các loại sulfate

polysaccharide phân lập được từ rong biển được biết đến đều thể hiện hoạt tính điều

chỉnh hệ miễn dịch ở động vật có vú, do chúng có khả năng làm tăng hiệu lực của

các bạch huyết cầu [77, 78].

Ulvan là điển hình cho các hợp chất có cấu trúc giống với sulfate

chondroitin, là một proteoglycan được tạo thành bởi bạch huyết cầu và bạch cầu

đơn nhân to của người ở những nơi dễ bị viêm [79, 80, 81], do đó ulvan có hoạt tính

điều chỉnh hệ miễn dịch tương tự sulfate chondroitin. Ulvan từ Ulva rigida đã được

công bố là có khả năng điều chỉnh hoạt động của bạch huyết cầu chuột và được

chứng minh là do trong thành phần của ulvan này có chứa các nhóm sulfate [16,

57]. Tác động tăng cường miễn dịch của sulfate polysaccharide từ rong lục chủ yếu

dựa trên sự thay đổi bạch huyết cầu. Một vài nghiên cứu trên thí nghiệm in vitro chỉ

ra rằng, sulfate polysaccharide từ rong lục thể hiện hoạt tính chống sự tăng sinh vô

hạn độ, ngăn chặn khối u phát triển trên chuột rất tốt ở vài dạng tế bào ung thư.

1.1.4.4.4. Hoạt tính hạ mỡ máu và chống độc cho gan

Ulva được biết đến là loại rong biển chứa thành phần dinh dưỡng tốt, có khả

năng chống lại sự thoái hóa do các enzym nội sinh, thường được dùng phối kết hợp

trong thực đơn của người bị bệnh béo phì, người đái tháo đường do thành

phần alga alkan mannitol trong rong biển cho một lượng calo rất thấp [54]. Người ta

cho rằng các nhóm mang điện trong phân tử ulvan có khả năng kết hợp với các acid

trong mật đã làm tăng sự bài tiết phân do đó đẩy mạnh sự suy giảm cholesterol

trong máu [60, 82-83]. Ulvan đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm nồng độ

LDL-cholesterol trong huyết thanh và làm tăng bài tiết mật hàng ngày ở chuột [59,

84]. Tác dụng làm giảm cholesterol trong máu của ulvan phụ thuộc rất nhiều vào

khối lượng phân tử của chúng, các dẫn xuất của ulvan với khối lượng phân tử thấp

không làm giảm hàm lượng cholesterol trong huyết thanh nhưng làm cho những

động vật có hàm lượng mỡ cao trở về bình thường [60, 85].

1.1.4.4.5. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra rằng các sulfate polysaccharide từ

rong lục có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của các vi khuẩn Gram dương

(Gr (+)) và vi khuẩn Gram âm (Gr (-)), trong khi đó lại kích thích hệ thống miễn

21

dịch. Những nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng các sulfate polysaccharide từ rong

biển có khả năng ngăn chặn một số loại viêm nguy hiểm xuất hiện trong màng não,

một biến chứng nguy hiểm của viêm do virus và vi khuẩn [56]. Phát hiện trên thêm

gợi ý rằng các sulfate polysaccharide từ rong biển có khả năng diệt vi khuẩn trong

khi đó lại tăng cường hệ miễn dịch, đây là tính chất quý mà ít thuốc có được [77].

1.1.4.4.6. Hoạt tính kháng virus

Những năm gần đây, các sulfate polysaccharide từ rong lục được biết đến

như là nguồn những chất tự nhiên mới trong việc tìm ra thuốc chống virus. Các

nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các sulfate polysaccharide này có khả năng kháng virus

là do trong cấu trúc của chúng có chứa nhóm sulfate [86].

Hoạt tính kháng virus ở mô hình thí nghiệm in vitro của sulfate rhamnan

chiết tách từ rong lục Monostroma latissimum cũng đã được thử nghiệm, kết quả

cho thấy: Polysaccharide này thể hiện hoạt tính hỗ trợ chống HIV-1 [87]. Hoạt tính

chống virus HSV-1 của 11 sulfate polysaccharide tự nhiên từ 10 loài rong lục khác

nhau cũng đã được nghiên cứu, kết quả chỉ ra rằng, tất cả các sulfate polysaccharide

từ rong lục Enteromorpha compressa đều thể hiện hoạt tính chống virus HSV-1

mạnh với nồng độ IC50 (50% inhibitory concentrations) là 388,5 µg/mL [88, 89].

Một phân đoạn sulfate polysaccharide được phân lập từ rong lục Cornus racemosa

có khả năng chống virus HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero với IC50 ở 2,2-

4,2µg/mL nhưng không gây độc với tế bào vật chủ [90].

Các tác giả [91] cũng chỉ ra rằng khả năng chống virus của các sulfate

polysaccharide phụ thuộc vào hàm lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate, thành phần

đường và khối lượng phân tử.

1.1.4.4.7. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau

Trên thế giới, các sulfate polysaccharide có nguồn gốc từ rong lục đã được

biết đến để làm thuốc kháng viêm và giảm đau, ulvan phân lập từ rong Ulva lactuca

là bằng chứng rõ ràng cho tính chất kháng viêm do tác dụng làm giảm phù nề ở

chuột sau 4 ngày thí nghiệm, nghiên cứu này đã công bố ở tạp chí Mar. Drugs 2014

[38]. Ở một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng, thành phần đường và sulfate cũng

như cấu trúc của ulvan ảnh hưởng tới khả năng kháng viêm [92, 93].

22

1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide

1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách

các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột sắc ký. GPC có

thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lượng phân tử trung

bình khối Mw, khối lượng phân tử trung bình số Mn, khối lượng phân tử trung bình

Mz và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố khối lượng phân tử của

nó (Mw/Mn). GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymer

tổng hợp hay các polymer tự nhiên như polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông

tin về sự phân bố khối lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn

phức tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer và các chất

phụ gia [94]

1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR

Phương pháp phổ hồng ngoại là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi

trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide

nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác

định vị trí nhóm chức trong phân tử ionic polysaccharide [34, 95]. Phân tích phổ

hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên kết điển hình trong cấu trúc

của phân tử polysaccharide: các băng sóng hấp thụ ở 820–850, 1220–1260 và 1640–

1650 cm 1 là đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C–O–S của nhóm sulfate ở

vị trí axial, liên kết S=O của nhóm sulfate, và liên kết COO- của acid uronic, tương

ứng; các dải hấp thụ ở 3420–3450 và 1050–1070 cm 1 được gán cho dao động của

liên kết O–H và C– O–C, tương ứng [96, 97].

Phổ IR đã được áp dụng thành công để phân tích các polysaccharide như

pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong

biển. Mặc dù việc sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại đặc biệt hiệu quả khi xác

định vị trí của nhóm sulfate trong cấu trúc của polysaccharide nhưng chúng vẫn còn

một số hạn chế nhất định, đó là không xác định được dạng hỗn hợp

monosaccharide, vị trí liên kết của vòng glycoside cũng như sự khác nhau giữa hai

đồng phân quang học D, L của các gốc đường. Bảng 1.2 cho thông tin về các nhóm

đặc trưng của phổ IR trong phân tích polysaccharide [98, 99, 100].

23

Bảng 1.2. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển

Tần số (cm-1) Nhóm dao động Hình dạng Chất đặc trưng

3423 -OH hóa trị (có liên

kết H) Rộng, rất mạnh

Fucoidan, ulvan,

carrageenan

2936 -CH hóa trị Nhọn, trung bình Fucoidan, ulvan,

carrageenan

1630 COO- hóa trị của acid

uronic Nhọn, rất mạnh

Fucoidan, ulvan,

carrageenan

1235 S=O Nhọn, mạnh Fucoidan, ulvan,

carrageenan

1080 C-O-C hóa trị Nhọn, rất mạnh Fucoidan, ulvan,

carrageenan

842 nhóm sulfate tại vị trí

C-4 Nhọn, trung bình

Fucoidan, ulvan,

carrageenan

820 nhóm sulfate tại vị trí

C-2 và/hoặc C-3 Vai, trung bình

Fucoidan, ulvan,

carrageenan

1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu trong

nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, phổ NMR [101, 103] được thể hiện bằng

độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TPP, DSS…). Đặc trưng phổ

1H- và 13C-NMR của polysaccharide được thể hiện theo Hình 1.7.

Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu

(không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [12, 103]. Phổ

cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các tín hiệu cộng hưởng proton

anomer với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ4,4-5,8 ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ

tích phân tương đối của các tín hiệu cộng hưởng ở vùng anomeric cũng có thể đánh

giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích thành phần

hoá học của polysaccharide có thể phù hợp với kết quả phân tích phổ 1H-NMR. Dựa

vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H NMR, các nhóm thế có thể được xác định

hoặc dự đoán được sự có mặt của chúng. Tiếp theo, số lượng của các

24

monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng

anomeric của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC [13, 104].

Hình 1.7. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ

13C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan

So với tín hiệu cộng hưởng từ phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR thường có tín

hiệu yếu hơn nhưng nó có lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc

polysaccharide là do độ dịch chuyển hóa học (δ) trong phổ 13C-NMR được trải rộng

trên thang đo (từ 0 ppm đến 200 ppm), nên đã khắc phục được hiện tượng chồng

chéo của các tín hiệu trên phổ 1H-NMR (thang đo chỉ từ 0-12 ppm). Thực vậy, trên

phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (δ4,4 – 5,8 ppm) được

tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các tín hiệu cộng hưởng ở các vị trí

nonanomeric proton (δ3,2 – 4,5 ppm) trong khi đó, trên phổ 13C-NMR, độ dịch

chuyển hóa học của các tín hiệu anomeric carbon (δ90–110 ppm) lại tách biệt rất rõ

và không hề trùng chập với các tín hiệu cộng hưởng của các nonanomeric carbon

25

(δ60 – 85 ppm). Với polysaccharide có nhóm de-oxygen như nhóm –CH3, tín hiệu

xuất hiện tại vùng trường cao hơn (δ15–20 ppm) [42, 96]

Bảng 1.3. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng

glucose và galactose [104]

Monosac

charide

H-1

C-1

H-2

C-2

H-3

C-3

H-4

C-4

H-5

C-5

H-6a

C-6

H-6b

-D-Glc 5,11 0,30

97,5 4.5

3.520,06

72,51,0

3,760,10

73,80,4

3,410,05

70,70,6

3,740,10

72,90,5

3,640,16

61,40,4

3,780,08

-D-Glc 4,840,46

102,92,4

3,310,05

74,11,1

3,550,07

76,31,4

3,510,13

70,41,0

3,550,09

76,01,3

3,770,05

61,51,0

3,940,05

-D-Gal 5,160,35

99,13,1

3,890,12

68,91,3

3,930,16

70,21,7

4,120,19

68,61,9

4,110,29

71,02,0

3,730,07

61,70,8

3,730,04

-D-Gal 4,680,26

103,52,4

3,530,17

71,72,1

3,800,16

73,51,7

4,080,18

67,92,0

3,740,20

75,51,1

3,740,05

61,80,7

3,740,05

Độ chuyển dịch hóa học của các proton anomer và carbon anomer của mỗi

monosaccharide đều được nhận biết riêng, phụ thuộc vào cấu hình hay : tín hiệu

- proton anomer sẽ xuất hiện tại vùng có độ chuyển dịch hóa học δ5–6 ppm trong

khi đó với - proton anomer là tại vùng δ4–5 ppm; tín hiệu của - carbon anomer

xuất hiện tại vùng δ95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết - carbon anomer

xuất hiện tại vùng δ100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa thành phần acid

uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại vùng δ170–180

ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C-6 trong

pyranose và C-5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng trường cao (δ60–64 ppm),

trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm

hydroxyl (C-2, 3, 4 trong pyranose và C-2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng

26

δ65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C-5 trong pyranose và C-4 trong

furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía trường yếu với δ5–10 ppm

[105, 106, 107].

Trong phân tử polysaccharide, các vị trí được thế của monosaccharide được

gọi là vị trí aglycon, tương ứng với nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của

liên kết glycoside. Từ dữ liệu phổ NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng

mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học

của các monosaccharide không thế. Trật tự các đơn phân trong mạch của

polysaccharide được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông

tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và NOESY.

Một cách tổng quát về độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide theo Hình

1.8

Hình 1.8. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide

27

1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS

Cho đến tận những năm đầu của thập kỷ 80, việc làm thế nào để phân tích

các hợp chất cao phân tử bằng phương pháp phổ khối và làm cho khối phổ trở thành

detector mạnh trong kỹ thuật phân tích lỏng vẫn còn là một thách thức. Một thời

gian dài, ðối với các polysaccharide, phương pháp khối phổ chỉ có thể được áp dụng

sau khi đã có sự chuyển hoá hoá học. Trước hết, mẫu được thuỷ phân để tạo thành

các mono hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần được methyl hoá để có

thể phân tích bằng GC/MS. Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, tiêu tốn

thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu được chỉ cho biết gián tiếp về các đơn

phân hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do

các đơn phân đã được methyl hoá nên có thể thông tin về nhóm thế của đơn phân sẽ

bị mất đi. Chính vì thế phương pháp phổ khối (MS) sử dụng kĩ thuật ion hoá thông

thường và chùm electron không phát huy sức mạnh đối với các mẫu polysaccharide.

Những vướng mắc về kĩ thuật ion hoá đối với các đại phân tử đã được giải

quyết nhờ sự ra đời gần như đồng thời của 2 kĩ thuật: ion hóa phun mù điện ESI

(Electro Spray Ionisation) và ion hóa khử hấp thụ nền laser MALDI (Matrix-

Assited Laser Desorption Ionisation). Đây là bước nhảy vọt về mặt kĩ thuật đã đưa

khối phổ thành một công cụ mạnh trong nghiên cứu các phân tử sinh học lớn, và nó

đã được trao giải Nobel 2002 cùng với những thành tựu về cộng hưởng từ hạt nhân.

Một ưu điểm của kĩ thuật ESI là đối với những phân tử lớn có nhiều trung tâm điện

tích thì tỷ số khối lượng/điện tích trở nên đủ nhỏ để cho phép chất có thể được phân

tích bằng các máy khối phổ thông thường. Cả hai phương pháp MALDI-TOF-MS

và ESI–MS đều đưa ra các mảnh có số khối m/z tương đương nhau và cung cấp

thông tin về cấu trúc polysaccharide, tuy nhiên phương pháp ESI–MS thì nhạy hơn

với ion có m/z nhỏ còn với phương pháp MALDI-TOF-MS thì tốt hơn với ion có

m/z lớn [108].

Theo các nghiên cứu [20, 109, 110] polysaccharide tự nhiên được thủy phân

(enzym hóa) thu được hỗn hợp oligosaccharide và được kiểm tra bằng phổ khối

MALDI-TOF-MS và phổ khối ESI–MS. Tuy nhiên hỗn hợp oligopolysaccharide

thường phức tạp và các mảnh có khối lượng mol tương đương nhau, do vậy việc xác

định cấu trúc hoàn chỉnh là rất khó, nhưng có thể khắc phục bằng cách sử dụng phổ

khối nhiều lần để nghiên cứu cấu trúc một cách hoàn chỉnh. Các nghiên cứu gần đây

28

đưa các dữ liệu trên phổ khối của polysaccharide như: nhóm khử cuối trong

oligosaccharide, các nhóm thay thế nhóm hydroxyl và vị trí liên kết glycoside của

oligosaccharide hoặc gán cho các mảnh oligosaccharide đã được xác định. Tuy

nhiên, quá trình biến tính hay phương pháp tạo dẫn xuất từ polysaccharide tự nhiên

(khử, thủy phân) cần thực hiện cẩn thận để không bị ảnh hưởng đến cấu trúc

polysaccharide và dẫn xuất (cấu trúc phụ thuộc vào quá trình khử, môi trường pH).

Hiện nay, phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật Tandem – MS là

công cụ rất hữu hiệu để phân tích cấu trúc chuỗi của polysaccharide [108],

bằng cách sử dụng hai hay nhiều hơn số lần phân tích trên một mẫu đo. Lần đầu

bằng cách sử dụng từ trường bắn phá chọn một ion muốn nghiên cứu từ hỗn hợp,

sau đó xem chi tiết các phân mảnh của ion được chọn này.

Cơ chế phân mảnh của cacbohydrate đã được Domon và Costello đề xuất

[111]. Sự phân mảnh của các oligosaccharides được diễn ra chủ yếu ở các vị trí

anomer hay ở các liên kết glycoside (Hình 1.10). Các ion mảnh tách ra được kí hiệu

là Ai, Bi, Ci và Xj, Yj , Zj, trong đó i và j là vị trí liên kết của ion mảnh tách ra tính

từ đầu không khử và đầu khử, tương ứng. Liên kết giữa carbon anomeric với oxy

được đánh số vị trí là 0.

O

OH

O H

O H

O H

O

O

HO H

O H

O H

O

O

HO H

O H

O HR

A 1 B 1 C 1

X 1

Y 1

Z 1

B 2

C 2

Y 2Z 2

Hình 1.9. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111]

Như vậy, sự phân mảnh của các oligosaccharide nhìn chung chủ yếu diễn ra

ở các vị trí anomer hay ở các liên kết glycoside.

1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS

Hiện nay, các phương pháp tán xạ là rất hữu hiệu được các nhà khoa học ứng

dụng hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung

29

dịch [33, 112], nguyên tắc của các phương pháp này là dựa vào đường cong tán xạ,

có thể biết được các thông số cấu trúc như trọng lượng, kích thước và hình dạng của

phân tử chất tan.

Các quá trình tán xạ đều tuân theo phương trình Bragg:

=dsin

Với d và là bước sóng của tia tới, kích thước của vật tán xạ và góc tán

xạ. Như vậy, với góc tán xạ nhỏ thì có thể nghiên cứu được phân tử lớn. Đường tán

xạ phản ánh sự phụ thuộc của cường độ tán xạ vào góc tán xạ.

Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS

Phương pháp SAXS [112, 113] với bước sóng nhỏ (λ = 0,154 nm) có thể đo

được các kích thước của phân tử ở kích thước cỡ nano, là phương pháp rất hữu hiệu

trong việc nghiên cứu kích thước, hình dạng của các chất ở kích thước nhỏ từ 1-100

nm trong dung dịch, dựa vào giá trị của bán kính từ hồi chuyển để xác định hình

dạng của phân tử chất tan. Ví dụ: với phân tử chất tan có dạng hình trụ đường tán xạ

biểu diễn bằng phương trình:

I(q) = exp (-q2R2gc/2)

Với Rgc là bán kính hồi chuyển của mặt cắt; I(q) là cường độ tán xạ và q là

biên độ của vector tán xạ. Rgc được xác định bởi độ dốc của đường ln(q.I(q)) và q2

– được gọi là “Guinier plot”, với điều kiện qRgc<1.

30

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến

nội dung nghiên cứu của luận án.

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hướng nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ

rong biển đã và đang được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu

cập nhật theo xu hướng của các nước tiên tiến trên thế giới, bao gồm: chiết tách,

thử hoạt tính và biến tính để tìm các sản phẩm có hoạt tính cao hơn hay nghiên

cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính.

Nhóm nghiên cứu về vật liệu biển tại Viện Nghiên cứu & Ứng dụng công

nghệ Nha Trang, với lợi thế địa lý gần vùng biển, là nơi tập trung nhiều loài rong

biển đã có một số kết quả nghiên cứu về rong biển. Các nhà khoa học ở đây đã

thu thập, phân loại, chiết tách và xác định cấu trúc nhiều loại polysaccharide từ

rong biển có ứng dụng thực tế cao như agar, carrageenan, alginate hay fucoidan

[18, 114-117].

Tác giả Bùi Minh Lý và CS [99] đã sử dụng các phương pháp phổ NMR

và ESI-MS để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan tách chiết từ rong nâu

Sargassum polycystum, kết quả cho thấy, cấu trúc bộ khung chính của fucoidan ở

đây có dạng α-L-fucose liên kết với nhau qua liên kết 1-3 và nhóm thế sulfate

nằm chủ yếu ở vị trí carbon C-2 và một phần ở vị trí carbon C-4. Tác giả Nguyễn

Duy Nhứt [98] với luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa” đã thành công

trong việc xác định cấu trúc của 2 phân đoạn fucoidan có và không có hoạt tính

kháng ung thư chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii và Sargassum polycystum,

bước đầu đã đề xuất mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng ung thư của fucoidan.

Tác giả Nguyễn Duy Nhứt [98] với luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh

Khánh Hòa” đã thành công trong việc xác định cấu trúc của 2 phân đoạn fucoidan

có và không có hoạt tính kháng ung thư chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii

và Sargassum polycystum, bước đầu đã đề xuất mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính

kháng ung thư của fucoidan.

31

Tác giả Thành Thị Thu Thủy và CS [113] đã nghiên cứu cấu trúc của

fucoidan từ rong nâu Turbinaria ornate thu thập ở Nha Trang – Việt Nam bằng

phương pháp phổ khố lượng với kỹ thuật ion hóa phun mù điện (ESI-MS) và kỹ

thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), đây là cách tiếp cận mới trong việc nghiên

cứu cấu trúc polysaccharide nói chung, fucoidan nói riêng, bằng cách này cấu

trúc phức tạp của fuocidan đã được làm sáng tỏ. Các phương pháp ESI-MS và

SAXS cũng đã được tác giả và CS dùng để nghiên cứu cấu trúc của các fucoidan

khác từ rong nâu Sargassum crasifolium và Padina austrasis, trong nghiên cứu

này hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch đường ruột của fucoidan cũng đã được

công bố [119].

Khi nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hàm lượng sulfate cao được phân

lập từ rong nâu Sargassum polycystum bằng sắc ký trao đổi ion, tác giả Bilan, và CS

[99, 120] bằng phương pháp NMR và ESI-MS đã chỉ ra rằng, sự phân bố các mảnh

galactose dọc theo mạch chính dường như khá phức tạp, ảnh hưởng rất lớn đến cấu

trúc không gian và hoạt tính sinh học của polysaccharide.

Tác giả Trần Vĩnh Thiện [121] với luận án tiến sĩ “Điều chế, khảo sát cấu

trúc và tính chất của alginate và oligosaccharide tách từ rong mơ khu vực Bắc Hải

Vân và ứng dụng của chúng” đã thành công trong việc khảo sát chi tiết ảnh hưởng

của các yếu tố đến tỷ lệ tách và khối lượng phân tử trung bình của alginate từ rong

mơ khu vực Bắc Hải Vân theo quy trình acid, cũng như cấu trúc của các alginate

thu được.

Tác giả Hồ Đức Cường [100] đã bảo vệ thành công luận án tiến sỹ hóa học

năm 2014 với đề tài “Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của

fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum

swartzii của Việt Nam”, tác giả đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa học

bằng các phương pháp phổ như IR, NMR, MS và cấu trúc không gian bằng phương

pháp LS, SAXS của fucoidan và alginate chiết tách từ rong nâu Sargassum

henslowianum và Sargassum swartzii, 2 focuidan nghiên cứu có tác dụng hạ mỡ máu

trên mô hình động vật béo phì.

Tác giả Phạm Đức Thịnh [118] với luận án tiến sỹ hóa học “Nghiên cứu

phân tích cấu trúc, thành phần và hoạt tính của fucoidan từ rong biển Việt Nam” đã

32

phân tích được thành phần hóa học của fucoidan từ 8 loài rong nâu phổ biến nhất ở

Việt Nam S. oligocystum, S. denticapum, S. swartzii, S. polycystum, S. mcclurei,

Padina australis và Turbiaria ornata; tác giả đã thành công trong việc sử dụng các

phương pháp phổ IR, NMR cùng với việc kết hợp 2 kỹ thuật MALDI-TOF/MS/MS

và ESI-MS/MS để nghiên cứu cấu trúc của các mẫu fucoidan trong luận án.

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về rong lục đã được một số nhà khoa học tiến

hành. Tuy nhiên các nghiên cứu hầu hết mới chỉ tập trung vào việc phân loại, đánh

giá trữ lượng, điều kiện sinh thái, khai thác rong [6, 7, 9, 122]. Kết quả nghiên cứu

cho thấy: tại 10 đảo thuộc quần đảo Trường Sa, các nhà khoa học đã xác định được

255 loài rong biển, trong đó, rong Lục có 69 loài chiếm 27,0%; vùng triều ven biển

một số tỉnh (Quảng Ninh, Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng

Bình) phát hiện được 45 loài rong biển, trong đó rong Lục (Chlorophyta) có 16 loài

chiếm 35,5%.

Tác giả Đặng Diễm Hồng và CS [123] đã nghiên cứu các thành phần dinh

dưỡng của một số loài rong trong đó có rong lục Ulva reticulata. Kết quả chỉ ra

rằng, các loài rong biển nghiên cứu rất giàu protein, lipid (đặc biệt là các acid béo),

các vitamin và các nguyên tố đa lượng và vi lượng. Trong nghiên cứu này, tác động

sinh lý học của dịch chiết từ rong lục Ulva reticulata lên sự chuyển hóa acid béo ở

gan cũng được kiểm tra trên chuột. Nhóm nghiên cứu này cũng nghiên cứu hoạt

tính kháng viêm và giảm đau trên động vật của dịch chiết methanol từ một số loài

rong biển sinh trưởng ở biển Việt Nam, trong đó có loài rong lục Ulva reticulata

với liều 500 mg/kg trọng lượng cơ thể. Kết quả cho thấy dịch chiết của rong lục này

thể hiện tác động làm giảm đau và kháng viêm mà không có tác động độc tính nào

kể cả ở liều cao, kết quả này củng cố thêm sự khẳng định rằng có thể sử dụng rong

biển này làm nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị kháng viêm [124].

Cho đến nay, chưa có một công bố nào về qui trình chiết tách, thành phần,

cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học của polysaccharide từ các loài thuộc ngành

rong lục nói chung và chi Ulva nói riêng.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, các polysaccharide từ rong biển như carrageenan từ rong

đỏ, fucoidan từ rong nâu và ulvan từ rong lục cùng được quan tâm nghiên cứu,

33

trong đó ulvan từ rong lục đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ

những năm 1950. Thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc chiết

tách và xác định thành phần đường trong ulvan từ các loài rong lục khác nhau.

Brading [125] và Percival [126] đã xác định sulfate, rhamnose, xylose, và acid

glucuronic là các thành phần hóa học có trong ulvan. Tuy nhiên, phải đến năm

1997, Quemener và CS [40], nhờ vào phương pháp cắt mạch hóa học kèm

enzym, mới phát hiện ra acid iduronic cũng là một đơn vị đường trong ulvan.

Các tác giả cũng khẳng định rằng, thành phần đường, tỉ lệ đường đơn, hàm lượng

sulfate trong ulvan phụ thuộc rất nhiều vào loài rong, vị trí địa lý nơi rong thu

hái và thời điểm thu hái.

Ảnh hưởng của việc xử lý rong tươi (như làm khô trong không khí, trong

tủ đông lạnh, giữ trong dung môi và hỗn hợp dung môi hữu cơ…) đến hiệu suất

chiết, tính chất hóa lý và lưu biến của ulvan từ rong lục Ulva rotundata đã được

Robic và Lahaye nghiên cứu [71].

Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để chiết tách ulvan từ rong

lục dựa vào tính tan được trong nước của nó. Các phương pháp chiết tách ulvan từ

rong lục được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu gồm chiết bằng

dung môi nước [1, 14, 127-130], acid [96, 131]và kiềm [13, 47, 49]; trong đó,

phương pháp chiết bằng dung môi nước được sử dụng nhiều nhất.

Hela Y và CS [131] đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết tách đến

hiệu suất chiết và tinh chế ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng dung môi acid. Kết

quả chỉ ra rằng các yếu tố như pH, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đều ảnh hưởng

đến hiệu suất chiết tách và độ tinh khiết của ulvan.

Các nghiên cứu của Lahaye [13] và Robic [47, 49] đã chiết ulvan bằng cách

đun bột rong khô trong dung dịch natri oxalate ở nhiệt độ khoảng 80º-90ºC, sau đó

kết tủa bằng methanol thu được ulvan. Kết quả cho thấy, hàm lượng của ulvan là

khoảng 8%-29% trọng lượng của rong khô, tùy thuộc vào loài rong, vị trí thu

mẫu và phương pháp chiết tách. Những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các

điều kiện chiết tách như dung môi (acid, nồng độ dung dịch natri oxalate, nước),

nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu suất chiết tách, thành phần và tỉ lệ các đường

trong ulvan, khối lượng phân tử và phân bố khối lượng phân tử, cấu trúc ulvan cho

thấy có sự phụ thuộc rất lớn của các yếu tố này vào phương pháp chiết tách.

34

Tác giả Lerio và CS đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva rigida bằng dung

môi acid, thu được ulvan có thành phần chủ yếu được tạo thành từ các disaccharide

bao gồm GlcA và Rha sulfate. Trong nghiên cứu này, các tác giả cũng đã chứng

minh rằng, nhóm sulfate có trong thành phần phân tử ulvan từ rong lục Ulva rigida

đóng vai trò quan trọng, quyết định đến hoạt tính chống khối u của phân tử ulvan.

Thí nghiệm cho thấy tác động chống khối u của ulvan giảm đáng kể sau khi các

ulvan bị khử sulfate [57].

Qi và CS đã có nhiều công trình nghiên cứu [83, 84] về ulvan từ rong lục

Ulva pertusa và những dẫn xuất của chúng, ví dụ như các acetylate ulvan (AUs) và

các ulvan có hàm lượng sulfate cao (HUs), để đánh giá hoạt tính hạ mỡ máu. Hoạt

tính hạ mỡ máu có sự khác nhau rõ ràng giữa ulvan tự nhiên và các dẫn xuất của

chúng đã được quan sát.

Costa, Alves và CS [127] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng

dung môi nước, mẫu ulvan thu được được đo khối lượng phân tử, xác định thành

phần hóa học và phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ NMR. Kết quả cho thấy,

mẫu ulvan thu được được tạo thành bởi các thành phần chính là rhamnose (22,4%),

acid glucuronic (22,5%), xylose (3,7%), acid iduronic (3,1%) và glucose (1,0%);

hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan cũng rất cao (32,2%); khối lượng phân tử của

ulvan chiết tách được là rất cao (790 000 g/mol). Cấu trúc của phân tử sulfate

polysaccharide từ rong lục Ulva lactuca được tạo thành chủ yếu bởi disaccharide

acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng A3s: [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→]

và một lượng nhỏ của acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B3s: [→4)-α-L-IdoA-

(1→4)-α-L-Rha3S-(1→].

Wenjun Mao và CS [128, 132] đã thu thập và chiết tách ulvan từ Ulva

conglobuta ở 3 vị trí địa lí khác nhau là Quingdao, Yantai và Rizhao bằng dung

môi nước và khảo sát hoạt tính chống đông tụ máu của chúng. Kết quả nghiên

cứu cho thấy ulvan tách từ rong biển ở vùng biển Quingdao có hàm lượng sulfate

cao nhất và có hoạt tính chống đông tụ máu tốt nhất.

Masakuni Tako và CS [96] đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa

học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa thu thập ở vùng biển Okinawa – Nhật Bản,

bằng các phương pháp phổ IR và NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên

35

kết glycoside có dạng sau: α-D-GlcA hoặc α-L-IdoA-[(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-

L-Rha, (1→4)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Xyl. Sự

phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí C-2 của liên kết (1→4)-α-

L-Rha là β-D-GlcA; tác giả cũng khẳng định nhóm sulfate nằm ở vị trí C-3 và C-

2 của rhamnose; ở vị trí C-3 của xylose, chuỗi liên kết trong cấu trúc của ulvan có

dạng như ở Hình 1.11 dưới đây.

Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa

Tác giả Qi và CS đã sử dụng dung môi nước để chiết tách ulvan từ rong

lục Ulva pertusa, sau đó điều chế các dẫn xuất của ulvan tự nhiên này bằng cách

acetyl hóa và benzoyl hóa với khối lượng phân tử khác nhau, sau đó thử hoạt

tính chống oxy hóa trên mô hình thí nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy, những

mẫu ulvan bị acetyl hóa và benzoyl hóa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao

hơn mẫu ulvan tự nhiên, điều này đã chứng minh rằng khi thay đổi cấu trúc hóa

học ulvan tự nhiên thì hoạt tính chống oxy hóa sẽ tăng lên; khối lượng phân tử

ulvan cũng ảnh hưởng đáng kể tới hoạt tính chống oxy hóa của chúng, ulvan với

khối lượng phân tử thấp có hoạt tính cao hơn ulvan có khối lượng phân tử cao.

Trong những nghiên cứu khác, các tác giả trên cũng đã điều chế các dẫn xuất

sufate của ulvan tự nhiên với các hàm lượng sulfate khác nhau, kết quả thử hoạt

tính cho thấy: các mẫu có hàm lượng sulfate khác nhau thể hiện hoạt tính chống

oxy hóa khác nhau, ulvan với hàm lượng sulfate cao hơn ulvan tự nhiên thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa cao hơn [63-65, 133]. Hoạt tính gây độc tế bào cũng đã

được Qi nghiên cứu trên chuột với các ulvan từ rong lục Ulva pertusa, kết quả

cho thấy, chúng thể hiện khả năng gây độc tế bào rất tốt [134].

Lahaye, Robic và các CS là nhóm nghiên cứu rất mạnh về cấu trúc của

ulvan trên thế giới hiện nay. Phương pháp chủ yếu mà các tác giả sử dụng để

36

nghiên cứu cấu trúc ulvan là phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Các công

trình của nhóm nghiên cứu này cho thấy rằng cấu trúc ulvan rất phức tạp và phụ

thuộc nhiều vào loài rong nghiên cứu [97, 105, 106]. Các tác giả cũng đã quan

tâm đến các sulfate đường hiếm như 3-sulfate rhamnose và 2-sulfate xylose

trong ulvan và cho rằng: Rhamnose, thành phần chủ yếu của ulvan, được sử dụng

như là tiền chất để tổng hợp các hợp chất thơm tạo tiền đề cho khả năng ứng

dụng rhamnose trong lĩnh vực công nghiệp dược phẩm.

Ulvan là sulfate polysaccharide có điện tích cao, tan được trong nước và

được tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, acid glucuronic, acid iduronic,

xylose và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide

chính là acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng A (β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S →1)

và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B (α-L-IdoA-(1→4)-α-L-Rha3S →1)

(Hình 1.5) [38].

Lahaye, Robic và các CS [105, 107] đã nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ

rong lục Ulva rigida bằng cách thủy phân tạo oligosaccharide và desulfate hóa.

Cấu trúc hóa học và chuỗi đường của những oligomer này được xác định bằng

phổ NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên kết glycoside có dạng sau:

α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl, β-D-GlcA-(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl, β-D-GlcA-

(1→4)-α-L-Rha3S, β-D-GlcA-(1→4)-[β-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl

và β-D-GlcA-(1→4)-[β-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Rha. Sự phân nhánh ở các chuỗi

liên kết thường xảy ra ở vị trí carbon C-2 của liên kết (1→4)-α-L-Rha là β-D-

GlcA; tác giả cũng khẳng định lại rằng nhóm sulfate nằm ở vị trí carbon C-3 của

rhamnose. Các nghiên cứu sau đó cho thấy các liên kết glycoside và vị trí sulfate

này trong cấu trúc ulvan là phổ biến cho các loài Ulva khác nhau.

You S.G và CS [135] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva pertusa ở biển

Hàn Quốc bằng dung môi nước, sau đó sử dụng các phương pháp GC/MS và

NMR để xác định cấu trúc của ulvan thu được. Các tác giả đã khẳng định rằng,

mạch chính của phân tử ulvan được tạo thành bởi liên kết của α-(1→4)-L-

rhamnose hoặc β-(1→4)-D-acid glucuronic với β-(1→2)-L-rhamnose và β-

(1→4)-D-xylose, sự phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của (1→4)-rhamnose và

nhóm sulfate hầu hết được tìm thấy trên acid glucuronic ở vị trí carbon C-3.

37

Hanaa và CS [136] đã nghiên cứu chiết ulvan từ loài rong lục Ulva lactuca,

kết quả phân tích thành phần bằng HPLC chỉ ra rằng, ulvan chiết tách được có

thành phần chính gồm rhamnose, xylose, acid glucouronic và sulfate cùng lượng

nhỏ mannose và fucose. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy: các ulvan đều thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa, chống đông tụ máu tốt; có khả năng kháng virus cúm

HSV-1 cao, đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên cả 2 dòng tế bào ung thư là

ung thư vú (MCF7) và ung thư gan (HepG2) với IC50=0,54 µg/ml và 9,22 µg/ml,

tương ứng.

Lahaye Marc [107] đã nghiên cứu thành phần và cấu trúc của 2

oligosaccharide từ loài rong lục Ulva rigida được thu thập từ 2 vùng biển khác nhau

(Tây Ban Nha và Pháp). Kết qủa chỉ ra rằng thành phần đường của 2 ulvan tách

chiết được là giống nhau nhưng với tỷ lệ khác nhau; cấu trúc hóa học và chuỗi

polysaccharide trong 2 phân tử ulvan được nghiên cứu bằng phương pháp phổ

NMR, kết quả đã khẳng định rằng, cả 2 ulvan đều có cấu trúc mạch chính dạng acid

3-sulfate ulvanobiuronic dạng A3s [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha 3-sulfate-(1→]

nhưng chúng khác nhau ở mạch nhánh và vị trí phân nhánh. Như vậy, thành phần và

cấu trúc của ulvan từ cùng một loài rong phụ thuộc vào vị trí địa lý nơi rong sinh

sống.

Như vậy, qua tổng quan tình hình nghiên cứu cho thấy, ở Việt Nam các

polysaccharide từ rong lục còn chưa được nghiên cứu. Các nghiên cứu trên thế

giới cho thấy ulvan từ các loài rong lục có cấu trúc rất đa dạng và có hoạt tính

sinh học phong phú. Trong nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ các loài rong lục,

các tác giả hầu hết mới chỉ tập trung khai thác phương pháp phổ như phổ hồng

ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân mà chưa thấy có tài liệu nào ứng dụng

phương pháp phổ khối lượng hay các phương pháp vật lý hiện đại khác như

phương pháp tán xạ ánh sáng hay tán xạ tia X góc nhỏ để nghiên cứu cấu trúc

ulvan.

38

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ

2 loài rong lục thuộc chi Ulva phổ biến ở vùng biển Nha Trang của Việt Nam là

Ulva reticulate và Ulva lactuca. .

2.1.1. Thu thập và định danh rong

Các mẫu rong lục thu thập được dùng để chiết ulvan được thu hái tại vùng

biển Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa, tháng 4/2014 bao gồm 2 loài sau:

+ Rong lục Ulva reticulata

+ Rong lục Ulva lactuca

Rong lục Ulva lactuca

Rong lục Ulva reticulata

Hình 2.1. Hình ảnh của mẫu rong nghiên cứu

39

Các mẫu rong lục được định danh bởi TS. Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu và

Ứng dụng công nghệ Nha trang). Tiêu bản của 2 mẫu rong nghiên cứu được lưu trữ

tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang và Viện Hóa học với kí

hiệu UR-14 (Ulva reticulata) và UL-14 (Ulva lactuca). Sau khi thu hái, 2 mẫu rong

lục được rửa sạch bằng nước biển để loại các chất bẩn cơ học, sau đó rửa nhanh

dưới vòi nước máy và phơi trong bóng râm. Rong được sấy khô trong tủ sấy tại

nhiệt độ 50ºC. Rong khô được nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong

2.1.2.1. Phương pháp xác định thành phần hóa học của rong

Phân tích độ ẩm, hàm lượng tro, protein thô, chất béo thô, carbohydrate theo

phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC [137].

a) Xác định độ ẩm của rong:

- Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi

nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được

độ ẩm của mẫu.

- Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu vào trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ

100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm của mẫu

được tính theo công thức:

khối lượng mẫu trước sấy (g) - khối lượng sau sấy (g) Độ ẩm (%) = x 100

khối lượng mẫu trước sấy (g)

Ở mẫu rong nghiên cứu, chúng tôi xác định được độ ẩm của rong là 8%.

b) Hàm lượng tro:

- Nguyên tắc của phương pháp xác định hàm lượng tro: Mẫu được nung ở

nhiệt độ 550º - 600°C để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, đem cân phần tro

của mẫu sau khi nung và tính ra phần trăm tro có trong mẫu.

- Tiến hành thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550º – 600°C

đến khối lượng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác

đến 0,0001g. Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích với độ

chính xác như trên, cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550º –

600°C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thường khoảng

40

6 - 7 giờ. Trường hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc

HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng.

Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác như trên. Tiếp tục nung

thêm ở nhiệt độ như trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho

đến khối lượng không đổi.

- Tính toán kết quả: Hàm lượng tro theo % được tính theo công thức:

X = ((G2 - G)/(G1 - G)) × 100

Trong đó G: khối lượng chén (g)

G1: khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)

G2: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)

c) Protein thô:

Lượng nitơ có trong mẫu được xác định bằng phương pháp micro-Kjeldahl,

được tiến hành như sau: Cân khoảng 2g mẫu rong khô, cho vào bình cầu 100ml, cho

thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10g K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O.

Hỗn hợp này được đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đun tăng mạnh nhiệt độ lên.

Khi dung dịch chuyển thành không màu hoặc trong suốt, tiếp tục đun thêm 1 giờ

nữa, để nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800ml. Thêm

vào 100ml dung dịch NaOH 40%, lắp bình với hệ thống chưng cất, bình hứng có 25

ml dung dịch H2SO4 0,1N và tiến hành chưng cất. Khi hai phần ba lượng chất lỏng

đã được cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hoàn toàn chưa. Bình hứng được lấy

ra chuẩn độ với dung dịch KOH 0,1N. Khi đó, lượng protein thô được tính theo

công thức sau:

Protein = Nitơ x 6,25

d) Hàm lượng lipid:

Hàm lượng lipid trong mẫu được phân tích theo phương pháp của Bligh và CS

(1959) [138]. Cân chính xác 2 g rong khô, cho vào bình cầu 100ml. Thêm vào 20ml

methanol và 10ml chloroform, lắc kỹ. Sau đó thêm 10ml chloroform, tiếp tục lắc kỹ

rồi thêm 10ml nước cất, tiếp tục lắc mạnh, lọc bỏ bã. Dịch lọc được ly tâm với tốc

độ quay 1000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch sẽ được tách thành hai

pha, tách bỏ pha nước, thu pha hữu cơ và cất quay loại dung môi trên máy cất quay

chân không ở nhiệt độ 60°C. Quá trình tách chiết được thực hiện 3 lần cho đến khi

41

thu được toàn bộ lượng chất béo thô trong mẫu rong nghiên cứu, làm khô sản phẩm

bằng nitơ lỏng, đưa vào bình hút ẩm đến khối lượng không đổi.

e) Phân tích tổng carbohydrate

Được xác định bằng phương pháp phenol-acid sulfuric [139]. Hỗn hợp gồm

1ml dung dịch mẫu có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml được cho vào ống so màu, thêm

1ml phenol 4,0%, 5,0 ml acid H2SO4 đậm đặc 95,5% (d=1,84g/ml) và lắc mạnh, sau

đó để yên 10-20 phút. Sau đó, hỗn hợp được đo mật độ quang tại bước sóng 490

nm. Dung dịch chuẩn được dùng là glucose hoặc galactose.

3.1.2.2. Kết quả về thành phần hóa học của rong

Thành phần hóa học chính của rong bao gồm protein, lipid, sulfate,

carbohydrate và tro, các thành phần này bị ảnh hưởng rất lớn bởi môi trường nơi

rong sinh sống. Kết quả nghiên cứu về thành phần chính của 2 loại rong Ulva

reticulata và Ulva lactuca thu hái ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa của Việt

Nam được tóm tắt trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô)

Rong lục Protein Lipid Tro Sulfate Carbohydrate

Ulva reticulata 9,1 0,5 23,6 4,2 14,2

Ulva lactuca 7,75 0,5 20,7 3,4 6,7

Kết quả phân tích thành phần hóa học của 2 mẫu rong nghiên cứu cho thấy,

hàm lượng protein dao động từ 7,75 đến 9,1%, hàm lượng lipid <1% và hàm lượng

tro từ 20-24%. So sánh với các tài liệu đã công bố trên thế giới [43, 44] hàm lượng

protein có trong rong lục từ 10 đến 47%, hàm lượng tro dao động từ 20 đến 40% và

hàm lượng lipit < 4%. Như vậy, rong biển sinh trưởng tại vùng biển Nha Trang –

Khánh Hòa nhìn chung có hàm lượng protein nhỏ hơn, hàm lượng tro và lipit là

tương đương so với các nghiên cứu trên. Hàm lượng sulfate và carbohydrate trong 2

mẫu rong nghiên cứu tương ứng là từ 3,4-4,2% và 6,7-14,2%. So sánh với kết quả

nghiên cứu trên thế giới thì 2 loài rong lục Ulva reticulata và Ulva lactuca của Việt

Nam có hàm lượng sulfate và carbohydrate thấp hơn [12, 13, 140, 141]. Điều đó

42

một lần nữa khẳng định vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng rất ảnh hưởng đến thành

phần hóa học của rong.

2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan

Trước khi tiến hành chiết ulvan, mẫu rong lục được loại chất màu và các chất

hữu cơ có khối lượng phân tử thấp như sau: Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào

một lượng bột rong lục, khuấy mạnh rồi ngâm ở nhiệt độ phòng qua đêm. Hỗn hợp

được lọc để loại dung môi, tiếp tục cho ethanol vào và khuấy mạnh, bước này lặp

lại 3 lần. Sấy chân không đến khối lượng không đổi thu được mẫu bột rong dùng để

chiết ulvan.

Sau khi nghiên cứu tham khảo các quy trình và điều kiện chiết tách ulvan từ

rong lục mà các tác giả đã công bố, chúng tôi đã khảo sát và đưa ra các quy trình để

chiết tách ulvan từ 2 loại rong lục thu thập được như sau:

2.1.3.1. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi nước:

Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch nước ở nhiệt độ 80º-90ºC

trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện như trên. Gộp

dịch chiết trong 2 lần, ly tâm lấy dịch trong, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích

còn khoảng 100 ml, thêm tiếp cồn tuyệt đối vào để kết tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1).

Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối

lượng không đổi thu được ulvan thô. Ký hiệu UR-N, UL-N [127-129].

2.1.3.2. Quy trình chiết bằng dung môi acid:

Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch acid HCl 0,05-0,1N ở

nhiệt độ 90ºC trong 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện

như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa dịch chiết bằng dung dịch NaOH

0,1N rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó cô quay cho đến khi thể tích còn khoảng 100

ml, thêm cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy

tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối lượng không đổi thu

được ulvan thô. Ký hiệu UR-H, UL-H [96, 131].

2.1.3.3. Quy trình chiết ulvan bằng dung môi kiềm:

Ngâm chiết 20 g bột rong trong 400 ml dung dịch kiềm NaOH 0,1N ở nhiệt

độ 60ºC, thời gian 2h. Lọc lấy dịch chiết. Bã rong được chiết tiếp lần 2 ở điều kiện

như trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần, trung hòa dịch chiết bằng dung dịch HCl 0,1N

43

rồi ly tâm lấy dịch trong, sau đó, cô quay cho đến khi thể tích còn 100 ml. Thêm

cồn tuyệt đối vào để tủa ulvan (Vcồn:Vdịch = 4:1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa

nhiều lần bằng cồn 96º. Sấy tủa ở 60°C đến khối lượng không đổi thu được ulvan

thô. Ký hiệu UR-K, UL-K [13, 47, 49].

Tinh chế ulvan: mẫu ulvan thô được hòa tan trong nước cất và được tiến

hành tinh chế bằng màng thẩm tách MWCO 10000 (Da) của hãng Thermo

Scientific – USA dưới vòi nước chảy trong 72h để loại các chất thấp phân tử, sau đó

kết tủa ulvan bằng cồn tuyệt đối, ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 96º, sấy

tủa ở 60ºC đến khối lượng không đổi, thu được mẫu ulvan sạch.

Sơ đồ tổng quát về quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục được

đưa ra ở Hình 2.2.

Hình 2.2. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục

Mẫu bột rong lục khô (20 g)

1. 400 ml dung môi ở 80º-90º trong 2h, 2 lần 2. Lọc bỏ bã 3. Ly tâm loại cặn 4. Trung hòa dung dịch 5. Cất quay giảm thể tích

Dịch chiết

1. Bổ sung EtOH 2. Ly tâm lấy tủa

Ulvan sạch

Ulvan thô

1. Hòa tan trong nước cất 2. Cho qua màng thẩm tách trong 72h 3. Kết tủa bằng EtOH 4. Ly tâm lấy tủa

44

Kết quả về hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan được đưa ra ở Bảng 2.2.

Bảng 2.2. Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan

Mẫu UR-N UR-H UR-K UL-N UL-H UL-K

Hiệu suất

(%w) 8,3 7,2 5,1 6,5 6,4 4,1

2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học

Các phép thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm

sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Phòng Hóa phân tích và triển khai công

nghệ - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, thuộc Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.1.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Xác định hoạt tính độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm bao

gồm: HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và HeLa (ung thư cổ tử cung).

Các dòng tế bào được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy

DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0

mM natri pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế

bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều

kiện 37ºC, 5% CO2.

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử chuẩn nhằm sàng lọc, phát

hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều

kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [142].

Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (20 ml) pha trong dimethyl sulfoxide 10% được đưa vào các giếng

của khay có 96 giếng để có nồng độ 100 mg/ml; 20 mg/ml; 4 mg/ml; 0,8 mg/ml.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm

để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

45

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 ml môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3 - 5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180

ml) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được

cố định tế bào bằng acid trichloracetic – TCA.

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng

bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37ºC. Đổ bỏ SRB và

các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acid acetic rồi để khô trong không khí

ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM dung dịch đệm base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Xác định khả năng sống sót

của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100

% sống sót =

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

% ức chế tế bào = 100% - % sống sót

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine

(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các

nồng độ 10 mg/ml; 2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,08 mg/ml. Giá trị IC50 của Ellipticine luôn

ổn định trong khoảng từ 0,25 - 0,56 mg/ml trên tất cả các dòng tế bào ung thư

nghiên cứu.

Dimethyl sulfoxide 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50

(nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính

TableCurve.

2.1.4.2. Hoạt tính chống đông tụ máu

Xác định hoạt tính chống đông tụ máu theo phương pháp của Anderson và

CS [143] trên chuột nhắt trắng dòng BALB/c. Hút 10µl mẫu nghiên cứu hoặc

46

dextrose hoặc nước cất vào ống eppendof. Hút 50µl máu chuột vào các ống

eppendof đã có mẫu thử hoặc aspirin hoặc dextrose hoặc nước cất. Lắc nhẹ và để ở

nhiệt độ phòng. Ghi thời gian máu bị đông tụ. Aspirin (Sigma) được sử dụng làm

đối chứng tham khảo. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.1.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phương pháp

khuyếch tán đĩa thạch theo phương pháp của Vanden và CS [144] với 100 µl dịch

nuôi cấy có chứa 107 – 108 khuẩn và lượng dịch chiết sử dụng để thử hoạt tính là

200 µl. Chất đối chứng là mẫu trắng (dung môi nước). Các chủng vi sinh vật kiểm

định bao gồm : Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas

aeruginosa, Listeria monocytogenes (L. mono). Vi khuẩn Gr(+): Bacillus cereus,

Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus. Nấm men: Candida albicans.

Vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Trypcase Soya Broth

(TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong

môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn). Môi trường nuôi cấy vi

sinh vật: Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth đối với

nấm; Trypcase Soya Broth đối với vi khuẩn. Môi trường thí nghiệm: Eugon broth

đối với vi khuẩn và Myco phil đối với nấm.

Mẫu ulvan được hoà tan trong dung môi nước với nồng độ 4-10 mg/ml.

Chuyển vào mỗi giếng của đĩa vi lượng 96 giếng 10 µl dung dịch mẫu thử theo các

nồng độ đã được pha loãng. Bổ sung thêm vào mỗi giếng 190 µl vi sinh khuẩn và

nấm tương ứng đã hoạt hoá. Để trong tủ ấm 37ºC trong 24h đối với vi khuẩn và

30ºC trong 48h đối với nấm. Tiến hành đồng thời với mẫu trắng.

Xác định đường kính vòng vô khuẩn trên các mẫu có hoạt tính.

2.1.4.4. Hoạt tính chống oxy hóa

- Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Prieto và CS [145].

Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml, thêm vào 3 ml chất phản ứng (0,6 M acid

sulfuric, 28 mM natri phosphate và 4 mM amoni molybdat). Phản ứng được tiến

hành tại nhiệt độ 95ºC trong 3h, để nguội đo tại bước sóng 695 nm. Độ hấp thụ của

47

hỗn hợp tăng tại bước sóng 695 nm chỉ ra khả năng oxy hóa tổng của mẫu nghiên

cứu. Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo acid ascorbic.

- Xác định khả năng khử sắt theo phương pháp Zhu và CS [146].

Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml đệm phốt phát

pH= 7,2 và 0,2 ml dung dịch kali ferricyanide 1%. Hỗn hợp được giữ ở 50ºC trong

20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2 ml CCl3COOH 10%. Sau cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp

trên và 0,125 ml nước cất được đặt vào giếng 96 lỗ cùng với 0,02 ml FeCl3. Độ hấp

thụ của hỗn hợp tăng tại bước sóng 655 nm chỉ ra khả năng khử sắt của mẫu nghiên

cứu.

2.2. Xác định cấu trúc của ulvan

2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan

- Xác định hàm lượng sulfate: Xác định hàm lượng sulfate bằng phương

pháp khối lượng [147, 148]. Mẫu được thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch HCl

1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M được thêm dư vào dung

dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng

không đổi. Sau đó định lượng BaSO4. Hàm lượng sulfate có trong mẫu được tính

theo công thức sau:

10096

233(%)

4

xm

xm

DS

BaSO

Trong đó DS: hàm lượng sulfate (%); mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g); m:

khối lượng mẫu thử nghiệm (g).

- Xác định hàm lượng acid uronic: Xác định bằng phương pháp của Bitter và

CS [149]. Thủy phân hỗn hợp gồm 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 100 µg/ml và 6 ml

H2SO4 đậm đặc ở 100ºC trong 20 phút, sau đó để nguội tới nhiệt độ phòng. Tiếp

theo thêm 0,2 ml dung dịch carbazol 0,1% trong ethanol 96º và lắc đều, phản ứng

được tiến hành tiếp ở 100ºC trong 10 phút. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 527

nm. Acid glucuronic được dùng làm chất chuẩn.

48

- Xác định thành phần đường: Xác định theo phương pháp của Billan và CS

[150]. Nguyên tắc là thủy phân ulvan thành các monosaccharide, chuyển các

monosaccharide sang dẫn xuất alditol acetate rồi định lượng bằng GC.

+ Thủy phân khử từng phần trên hệ NaBH4/TFA

Cân 15 mg ulvan vào trong ống nghiệm (có nắp) chứa 1ml TFA 2,0M. Đem

đun nóng ống nghiệm ở nhiệt độ 80oC trong 3h. Sau khi để nguội thêm chính xác

1ml dung dịch inositol 1mg/ml, lắc đều. Dung dịch được lọc, loại tủa, rồi thêm 2ml

ethanol và cô quay đến cạn. Sau đó thêm 1ml NH4OH 1M để đuổi acid còn dư, sấy

khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC. Cặn thu được được hoà tan trong 0,5

ml dung dịch NaBH4 10% vừa pha trong NH4OH 1M, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng và

để qua đêm. NaBH4 dư được phân huỷ bằng 0,5ml CH3COOH đậm đặc. Tách acid

boric và trimethyl borat bằng cách cho bay hơi nhiều lần ở nhiệt độ 40oC với

methanol để cặn thu được chỉ còn là alditol.

+ Phản ứng acetyl hoá các alditol

Cho 1ml acid anhydric acetic và 1ml pyridine vào bình có chứa ulvan đã

được thuỷ phân ở trên và đem đun nóng ở 100oC trong 1 giờ. Sau đó làm lạnh, bay

hơi khô ở nhiệt độ 40oC. Alditol acetat trong hỗn hợp được chiết bằng ethyl acetat.

Xác định thành phần đường đơn trên máy sắc kí GC-FID Agilent (Mỹ).

2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Phép đo khối lượng phân tử bằng phương pháp GPC được thực hiện ở Phòng

Thí nghiệm Phân tích Trung Tâm – Ðại học Khoa học Tự nhiên - Hồ Chí Minh, trên

máy HPLC Agilent 1100 với pha động là dung dịch NaNO3 0,1N, pha tĩnh là cột

Ultrahydrogel 500 (300 mm x 7.8 mm ID), tốc độ dòng 1ml/phút. Đầu dò RID.

2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ

môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở

nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE

49

500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS

(acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) được dùng làm chất chuẩn nội.

2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LTQ Orbitrap XLTM, Thermo

SCIENTIFIC kiểu ion hóa âm tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự

nhiên Hà Nội, dung môi MeOH : H2O = 1:1. Khí phun mù là N2 với áp suất khí là

30 psi với tốc độ phun khí 650 lít/giờ tại nhiệt độ là 180ºC.

2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS)

Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được thực hiện tại BL19B2,

SPring-8, Hyogo, Nhật Bản.

Tia X được phát ở bước sóng = 0,149 nm. Phép đo kéo dài 600 giây để

đảm bảo đủ thời gian đo cần thiết mà mẫu không bị phá hủy bởi tia X. Kết quả được

tính toán bằng đồ thị Kratky (q2I(q) vs q) và đồ thị Guinier (ln(qI(q)) vs q2 ). Ở đây,

I(q) là cường độ tán xạ và q được định nghĩa bằng (4)sin(với là bước sóng,

là góc tán xạ. Từ đồ thị Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc có thể xác định được.

Giá trị Rgc cho biết cấu trúc không gian của chất đo ở kính thước cỡ nano [151].

Chuẩn bị mẫu đo:

Mẫu ulvan nồng độ 1 mg/ml trong nước và trong dung dịch NaCl 0,5M được

chuẩn bị cho phép đo SAXS.

2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)

Ảnh SEM được chụp trên hệ thiết bị Nova NaNoSEM 450 – FEI tại Khoa

Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên

2.3.1. Sulfate hóa

Dẫn xuất sulfate hóa của ulvan được tổng hợp theo phương pháp của Lihong

Fan và CS [152]. Qui trình được tiến hành theo 2 bước như sau:

- Bước 1: Tạo tác nhân sulfate hóa: Hòa tan khoảng 5,2g sodium bisul te

trong 40 ml nước cất rồi đưa vào bình 3 cổ và lắp vào hệ thống đun hồi lưu cách

50

thủy. Sau đó, hòa tan hoàn toàn khoảng 3,16g sodium nitrite trong 10ml nước cất và

đưa vào phễu nhỏ giọt, nhỏ từ từ vào bình 3 cổ ở trên, phản ứng được tiến hành với

khuấy từ ở 90ºC trong 1,5h. Tác nhân sulfate hóa được tạo thành theo phương trình:

4NaHSO3 + NaNO2 (NaSO3)3N + Na2SO3 + 2H2O

- Bước 2: Tổng hợp ulvan sulfate: tác nhân sulfate hóa tạo thành ở trên được

điều chỉnh đến pH=9 bằng dung dịch NaOH 0,1M. Tiếp theo hòa tan 1,0 g ulvan

UR-N bằng 30 ml nước cất rồi thêm từ từ vào bình cầu 3 cổ ở trên và khuấy mạnh,

phản ứng được tiến hành ở 60ºC trong 4h. Sau đó hỗn hợp được cất loại bỏ dung

môi, thẩm tách qua màng MWCO 3500 (Da) để làm sạch rồi được thêm ethanol 96°

để kết tủa ulvan sulfate, sản phẩm được sấy ở 50ºC đến khối lượng không đổi. Dẫn

xuất ulvan sulfate thu được được kí hiệu là UR-S.

Xác định hàm lượng sulfate trong mẫu bằng phương pháp khối lượng: 0,5g

mẫu UR-S được hòa tan với 10ml nước cất thành dung dịch, sau đó thêm 3ml dung

dịch HCl 1M và thủy phân hỗn hợp ở nhiệt độ 100°C trong 8h, thêm tiếp dung dịch

BaCl2 1M đến dư để kết tủa lượng sulfate sau khi thủy phân, ly tâm lấy tủa, sấy tủa

ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng BaSO4 và tính được hàm

lượng sulfate có trong mẫu theo công thức như ở phần 3.2.1.

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

2.3.2. Acetyl hóa

Dẫn xuất acetyl của ulvan tự nhiên được tổng hợp theo phương pháp của

Xiao-xiao Liu và CS [153, 154] như sau: 0,5 g UR-N được hòa tan trong bình cầu

với 6 ml nước, thêm 6 ml NaOH 1M khuấy mạnh tại nhiệt độ 30ºC trong 30 phút để

tạo sodium ulvan, thêm tiếp 4ml dung dịch acid anhydride acetic, tiến hành phản

ứng ở 75ºC trong 4 giờ. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 7,0, cất loại dung môi,

thẩm tách qua màng MWCO 3500 (Da) để làm sạch và kết tủa bằng ethanol 96°.

Dẫn xuất acetyl của ulvan được kí hiệu là UR-Ac, được sấy khô tại 50ºC đến khối

lượng không đổi.

Xác định hàm lượng acetyl trong mẫu UR-Ac bằng phương pháp phân tích

thể tích theo Luis.A [155] : Theo phương pháp chuẩn độ ngược: 0,5g UR-Ac được

hòa tan trong hỗn hợp ethanol (50 ml) /nước (100 ml), lắc đều trong 30 phút ở nhiệt

51

độ 50°C. Thêm tiếp vào 20 ml dung dịch KOH 0,2M và lắc đều. Chuẩn độ lượng

KOH dư bằng dung dịch HCl 0,2M với chỉ thị phenolphtalein. Tiến hành tương tự

với mẫu trắng UR-N tự nhiên.

Hàm lượng acetyl được tính theo công thức

10043,0.).(

(%) 0 xm

NVVDA

AcUR

HClTN

Trong dó: DA: hàm lượng acetyl (%); V0: thể tích mẫu trắng (ml); VTN: thể

tích mẫu nghiên cứu (ml); NHCl: nồng độ đương lượng acid HCl; mUR-Ac: khối lượng

mẫu thử nghiệm (g). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình.

52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu

3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan

Rong lục có thành phần polysacharide rất phức tạp, do vậy mẫu được tiến

hành chiết theo 3 quy trình là chiết nước, chiết acid và chiết kiềm như mô tả trong

phần thực nghiệm. Kết quả về hiệu suất chiết tách và thành phần hóa học của

polysaccharide theo 3 quy trình chiết được đưa ra ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy cả 6

mẫu ulvan đều có thành phần đường chủ yếu là rhamnose và 4 loại đường khác là

galactose, xylose, mannose và glucose nhưng với các tỷ lệ khác nhau. Hàm lượng

sulfate trong các mẫu ulvan thu được dao động ở khoảng 13-19%, hàm lượng acid

uronic rất lớn nằm trong khoảng 18-23% tính theo khối lượng rong khô, trong đó, 2

mẫu ulvan chiết bằng nước cho hàm lượng sulfate cũng như hàm lượng acid uronic

là cao nhất và tỷ lệ đường Rha cũng khá cao so với các ulvan chiết bằng acid và

kiềm. So sánh với các kết quả phân tích thành phần hóa học của ulvan ở các nghiên

cứu trên thế giới cho thấy, ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục của Việt Nam có hàm

lượng sulfate thấp hơn còn hàm lượng acid uronic là tương đương [156, 157].

Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan

Ulvan

SO3Na

(% khối

lượng)

Acid uronic

(% khối

lượng)

Thành phần monosaccharide ( % mol)

Rha Gal Xyl Man Glu

UR-N 17,60 22,5 1 0,03 0,06 0,01 0,06

UR-H 14,3 19,3 1 0,1 0,11 0,01 0,21

UR-K 13,2 19,8 1 0,1 0,14 0,03 0,14

UL-N 18,9 21,5 1 0,03 0,07 0,01 0,06

UL-H 15,1 18,7 1 0,01 0,10 0,01 0,06

UL-K 14,2 18,2 1 0,04 0,09 0,01 0,07

53

Như vậy, ta thấy thành phần hóa học của 6 mẫu ulvan là khác nhau tùy thuộc

vào quy trình chiết tách chúng.

Mục đích nghiên cứu của luận án là nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt

tính sinh học. Do vậy, cả 6 mẫu ulvan mà chúng tôi chiết tách được đều được đánh

giá hoạt tính sinh học.

3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan

3.1.2.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Theo các kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học [77, 85] thì dịch chiết từ

rong lục có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định rất tốt. Do vậy, chúng tôi thử hoạt

tính kháng vi sinh vật kiểm định của cả 6 ulvan chiết tách được, kết quả được chỉ ra

ở Bảng 3.2.

Kết quả cho thấy, trong 6 mẫu ulvan chiết tách từ 2 loài rong lục nghiên cứu,

UL-N và UR-N cho kết quả tốt nhất thể hiện dương tính với E. coli, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus cereus và Enterobacter cloace, UR-H và UL-H thể hiện hoạt

tính tốt với E. coli trong khi UR-K và UL-K không thể hiện hoạt tính đối với các

chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu này. Theo Bảng 3.1, UL-N có hàm lượng

sulfate cao nhất, điều này cũng phù hợp với xu hướng của các sulfate

polysaccharide là phân tử có hàm lượng sulfate cao thường có hoạt tính sinh học

cao.

Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan

Vi Khuẩn UR-H UR-N UR-K UL-H UL-N UL-K Đối chứng

Gram

(-)

E. coli ++ ++ - ++ +++ - +++

Pseudomonas aeruginosa - + - - + - +++

Vibrio haveyi - - - - - - +++

Gram

(+)

Bacillus cereus - - - - ++ - +++

Streptococcus faecalis - - - - - +++

Enterobacter cloace - ++ - + ++ - +++

Staphylococcus aureus - - - - - - +++

Các ký hiệu tính theo đường kính vòng tròn kháng khuẩn: (+++) 14 – 20mm;

(++) 12 – 14mm; (+) 8 – 11mm; (-) không ảnh hưởng.

54

3.1.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Quy trình thử nghiệm xác định hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào

ung thư HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và HeLa (ung thư cổ tử cung)

của cả 6 mẫu ulvan chiết tách được từ 2 loài rong lục nghiên cứu được tiến hành

theo như mô tả ở phần thực nghiệm, các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính

chính xác. Hóa chất Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng để làm chất đối chứng

dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10mg/ml; 2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,08mg/ml.

Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm.

Kết quả thử nghiệm cho thấy, các mẫu chiết kiềm UL-K và UR-K không thể

hiện hoạt tính này. Trong khi đó, các mẫu ulvan chiết nước và chiết acid đều thể

hiện hoạt tính tốt trên cả 3 dòng tế bào ung thư, cụ thể như sau: UR-H với IC50 =

47,75-50,69 µg/ml; UR-N với IC50 = 31,31-36,37 µg/ml; UL-N với IC50 = 25,09-

36,33 µg/ml và UL-H với IC50 = 40,74-50,93 µg/ml. Kết quả được đưa ra ở Bảng

3.3.

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan UR-H, UR-N, UL-N

và UL-H cho thấy, khi tăng nồng độ mẫu thử lên thì phần trăm (%) tế bào sống sót

giảm và đạt 0% khi nồng độ ulvan ở 100 µg/ml.

55

Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan

% tế bào sống sót Nồng độ

(µg/ml)

UR-H Nồng độ

(µg/ml)

UR-N Nồng

độ

(µg/ml)

Ellipticine HepG2 HeLa MCF-7 HepG2 HeLa MCF-7

100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00 HepG2 HeLa MCF-7

20 42,26 50,30 44,72 20 50,34 36,29 48,74

4 70,18 69,05 76,84 4 84,22 83,05 89,66 10 1,33 3,31 5,93

0,8 83,24 90,44 85,45 0,8 94,90 96,44 95,91

IC50

(µg/ml) 49,10±1,56 47,75±2,37 50,69±1,86

IC50

(µg/ml) 31,31±1,56 34,75±1,38 36,37±1,73

2 29,14 21,87 28,86

Nồng độ

(µg/ml)

UL-H Nồng độ

(µg/ml)

UL-N

HepG2 HeLa MCF-7 HepG2 HeLa MCF-7 0,4 49,42 48,89 48,58

100 0,00 0,00 0,00 100 0,00 0,00 0,00

20 50,21 55,34 48,67 20 60,67 66,24 58,71 0,08 81,59 77,13 76,92

4 71,46 73,58 79,45 4 78,13 77,0 67,89

0,8 92,42 94,26 95,53 0,8 89,30 88,0 87,41

IC50

(µg/ml)

0,50 0,34 0,45 IC50

(µg/ml) 40,74±2,21 44,25±2,32 50,93±1,67

IC50

(µg/ml) 29,67±2,87 36,33±3,84 25,09±1,36

56

Mối quan hệ giữa hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư

HepG2, MCF7 và HeLa trước và sau xử lý với mẫu UL-N ở các nồng độ khác nhau

(0,8; 4; 20 và 100 µg/ml) được biểu diễn trên Hình 3.1, tương ứng.

HepG2

0

20

40

60

80

100

0 0.8 4 20 100Concentration (mg/ml)

Cell

Viab

ility

(%)

MCF-7

0

20

40

60

80

100

0 0.8 4 20 100Concentration (mg/ml)

Cel

l Via

bili

ty (

%)

Hela

0

20

40

60

80

100

0 0.8 4 20 100Concentration (mg/ml)

Cel

l Via

bili

ty (

%)

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm tế bào sống sót

vào nồng độ ulvan UL-N

57

3.1.2.3. Hoạt tính chống oxy hóa

Theo các kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các sulfate

polysaccharide phân lập từ các loài rong lục Codium, Caulerpa, Bryopsis, Ulva, và

Enteromorpha đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa rất tốt [38, 154,

157]. Do vậy, chúng tôi thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan chiết tách

được, thông qua các phép thử khả năng khử sắt và hoạt tính chống oxy hóa tổng số,

quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa được mô tả như phần thực nghiệm. Kết quả

được chỉ ra ở Bảng 3.4

Kết quả cho thấy, 6 mẫu ulvan nghiên cứu thể hiện hoạt tính chống oxy hóa

khá tốt, đặc biệt là ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata thể hiện hoạt tính

mạnh nhất ở khả năng khử sắt ứng với giá trị 4,86 mg Fe2+/g ulvan và hoạt tính oxy

hóa tổng ứng với giá trị 3,96 mg acid ascorbic/g ulvan.

Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan

TT Mẫu Hoạt tính khử sắt

(mg Fe2+/g ulvan)

Hoạt tính chống oxy hóa

tổng số (mg AcidAscobic/g

ulvan)

1 UL-N 2,51 3,75

2 UL-H 1,93 2,60

3 UL-K 0,01 1,12

4 UR-N 4,86 3,96

5 UR-H 1,34 2,56

6 UR-K 0,22 0,86

Kết luận: Từ kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các mẫu ulvan tự nhiên

chiết tách được ở trên, chúng tôi đã lựa chọn các mẫu sau cho mục đích nghiên cứu

cấu trúc:

- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-N)

- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (kí hiệu: UR-H)

- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-N)

- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (kí hiệu: UL-H)

58

Lí do chúng tôi lựa chọn các mẫu trên đó là: Hai mẫu UL-N và UR-N đều

thể hiện hoạt tính sinh học rất tốt, đây là 2 mẫu ulvan được chiết bằng nước từ 2 loài

rong lục nghiên cứu – là phương pháp chiết đã được nhiều nhà khoa học trên thế

giới ứng dụng để chiết ulvan từ rong lục cho mục đích nghiên cứu cấu trúc và hoạt

tính sinh học như ở phần tổng quan tài liệu đã nêu; hai mẫu UL-H và UR-H thể hiện

hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định khá tốt, ngoài ra

chúng được chiết bằng dung môi acid – là phương pháp chiết được ít nhà khoa học

ứng dụng để chiết ulvan.

3.2. Xác định cấu trúc của ulvan

Khối lượng phân tử trung bình khối Mw, khối lượng phân tử trung bình số

Mn và độ phân tán khối lượng phân tử Mw/Mn được xác định bằng phương pháp

sắc ký thẩm thấu gel GPC, kết quả được đưa ra ở Bảng 3.5. Cũng giống như các

sulfate polysaccharide tự nhiên khác, ulvan là polymer có độ phân tán cao với giá trị

Mw/Mn từ 2,19 đến 5,16 và Mw cũng rất cao từ 8,1x104 g/mol đến 3,47x105 g/mol,

tùy theo điều kiện chiết tách. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đã

công bố là khối lượng phân tử của ulvan từ 1,8x105 g/mol đến 2,0x106 g/mol, phụ

thuộc vào điều kiện chiết tách, vị trí địa lý và thời gian thu hái rong [13, 38].

Bảng 3.5. Kết quả xác định khối lượng phân tử của 4 mẫu ulvan

Ulvan Mw

(x103 g/mol) Mw/Mn

UR-N 281 4,26

UR-H 119 5,16

UL-N 347 2,79

UL-H 81 2,19

3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H)

Đối với phân tử sulfate polysaccharide, hoạt tính sinh học không những phụ

thuộc vào hàm lượng của nhóm sulfate trong phân tử mà vị trí của nhóm sulfate gắn

trên mạch phân tử cũng là yếu tố then chốt có ảnh hưởng quyết định đến hoạt tính

sinh học [154].

59

Trong luận án này, khi nghiên cứu cấu trúc hóa học của ulvan, phổ hồng

ngoại được sử dụng để có các thông tin ban đầu về vị trí của nhóm sulfate trên mạch

phân tử của ulvan, phổ IR của UR-H được đưa ra trên Hình 3.2.

Hình 3.2. Phổ IR của UR-H

Trên phổ IR, chúng tôi thấy xuất hiện băng sóng hấp thụ ở 848 cm 1 được

gán cho liên kết C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí axial. Dải hấp thụ ở 761 cm-1 là

dao động C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí equatorial; ở 1078 cm-1 là dao động của

liên kết glycoside C-O-C; dải hấp thụ tại 1624 cm 1 là do dao động của nhóm

COO của acid uronic. Thêm nữa, dải phổ rộng tại 3315 cm 1 là đặc trưng cho dao

động của nhóm OH có liên kết hydro, băng hấp thụ ở 2927 cm 1 được gán cho dao

động hóa trị của nhóm CH [95, 96, 100]. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của

ulvan với các dao động đặc trưng được đưa ra trên Bảng 3.6

Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ IR của UR-H

Nhóm dao động Hình dạng Tần số (cm-1)

-OH hóa trị (có liên kết H) Rộng, rất mạnh 3315

COO- của uronic acid Nhọn, mạnh 1624

C-O-S của nhóm sulfate Nhọn, trung bình 848, 761

C-O-C của liên kết glycoside Nhọn, trung bình 1078

C-H liên kết hóa trị Rộng, vừa 2927

60

Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của ulvan chiết bằng acid từ rong lục Ulva

reticulala lần lượt được đưa ra ở Hình 3.3 và Hình 3.4.

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của UR-H

Quan sát phổ cho thấy có sự trùng chập của các vạch phổ, điển hình cho mẫu

polymer có cấu trúc phức tạp. Phân tích phổ 1H-NMR, chúng tôi kí hiệu A, B, C là

các cụm peak tương ứng với 3 tín hiệu của proton anomer ở δ5,30; δ4,65 và δ5,20

ppm.Trên phổ, xuất hiện tín hiệu ở vùng trường cao (δ1,17 ppm) được gán cho

proton gắn với C-6 ứng với nhóm CH3 của rhamnose và các tín hiệu ở vùng δ3,4-

4,3 ppm là các proton của vòng pyranose. Phân tích các tín hiệu cộng hưởng trên

phổ 13C-NMR cho thấy, các tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường thấp ứng với dộ

chuyển dịch hóa học khoảng δ94–102 ppm là đặc trưng cho các carbon anomer, còn

các carbon còn lại trong vòng sẽ ở vùng δ72–80 ppm. Tín hiệu ở vùng trường cao

(δ17-18 ppm) đặc trưng cho nhóm C-CH3 và tín hiệu điển hình cho nhóm carboxyl

ở vùng trường thấp ứng với δ167 ppm. Bốn tín hiệu ở δ63,39; 63,32; 63,12; 63,06

ppm là các tín hiệu gán cho nhóm CH2 (C-6) của galactose và/hoặc glucose và/hoặc

CH2 (C-5) của xylose.

61

Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của UR-H

Với sự hỗ trợ của phổ hai chiều 2D NMR: COSY, HSQC và HMBC, việc

nghiên cứu cấu trúc của ulvan được thuận lợi hơn và có độ chính xác cao. Các

proton từ H-1 đến H-6 của A được xác định dựa vào các tín hiệu trên phổ COSY

(Hình 3.5), từ đây các carbon từ C-1 đến C-6 cũng lần lượt được gán dựa vào phổ

HSQC (Hình 3.6). Trên phổ HSQC, từ tín hiệu của proton anomer H-1(A) có độ

dịch chuyển hóa học ở δ5,3 ppm sẽ xác định được carbon anomer C-1(A) tương ứng

với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ102-103 ppm, độ dịch chuyển hóa học của

H-1(A) đặc trưng cho H anomer. Tương tự như vậy, từ vị trí tín hiệu cộng hưởng

của các proton H-2 đến H-5 sẽ xác định được vị trí các tín hiệu carbon C-2 đến C-5,

tương ứng. Ta thấy, tín hiệu của C-2 (δ79-80 ppm), C-3 (δ75-77 ppm) và C-4

(δ74-76 ppm) đã bị đẩy về vùng trường thấp chứng tỏ rằng liên kết glycoside ở

rhamnose trong mẫu ulvan UR-H có thể là (12,3,4) và/hoặc nhóm sulfate ở vị trí

C-2, C-3 và C-4. Kết quả này được khẳng định một lần nữa thông qua mối tương

quan giữa H-1(A) và C-2(A), C-3(A), C-4(A) trên phổ HMBC (Hình 3.7).

62

Hình 3.5. Phổ COSY của UR-H

Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H

63

Đối với cụm B, tín hiệu của proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR ứng với

độ dịch chuyển hóa học ở δ4,65 ppm, đây là giá trị cộng hưởng đặc trưng cho

proton anomer H. Điều này được khẳng định một lần nữa bằng việc phân tích phổ

HSQC: carbon anomer C-1(B) ở δ98,39 ppm và δ98,52 ppm có liên hệ với proton

H-1(B) tại δ4,65 ppm. Dựa vào tín hiệu của H-1(B), từ phổ COSY các tín hiệu tại

δ3,2 ppm và δ3,75 ppm lần lượt được gán cho H-2(B) và H-3(B), tương ứng; còn từ

phổ HSQC các tín hiệu tại δ77 ppm và δ74 ppm được gán cho C-2(B) và C-3(B),

tương ứng.

Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H

Ta thấy, tín hiệu carbon C-2 của acid uronic bị đẩy về vùng trường thấp,

chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside (Bảng 3.7). Đối với gốc C, tín

hiệu cộng hưởng của proton anomer H-1 trên phổ 1H-NMR nằm ở vùng trường thấp

(δ5,2 ppm) là điển hình cho H. Bằng việc kết hợp các phổ 1D và 2D, gán được

proton anomer H-1(C) tại δ5,2 ppm, carbon C-1(C) tại δ94,51 ppm và δ94,70 ppm.

Tương tự như vậy, lần lượt gán được H-2(C) ở δ3,6 ppm và C-2(C) ở δ77 ppm.

64

Trên phổ 13C-NMR, cho thấy, tín hiệu cộng hưởng của C-2 của acid uronic bị đẩy

về vùng trường thấp chứng tỏ C-2 là carbon tham gia liên kết glycoside, do vậy

khẳng định được rằng liên kết glycoside của C trong phân tử ulvan là kiểu liên kết

(12) (Bảng 3.7). Các kết quả nghiên cứu trước [97, 105] đã chứng minh rằng,

ulvan từ rong lục Ulva có thành phần chính là -rhamnose, - acid glucuronic và -

acid iduronic, do đó B được đề xuất là (12)- acid glucuronic và C là (12)-

acid iduronic. Các carbon anomer C-1(B) và C-1(C) bị tách thành 2 tín hiệu, có thể

được lý giải là do liên kết của monomer B và C với 2 cấu dạng and . Chuỗi liên

kết glycoside trong mạch polymer của phân tử ulvan được suy ra từ việc phân tích

phổ HMBC (Hình 3.7), trên phổ HMBC thể hiện tương tác giữa H-1(C) và C-4(A),

H-1(B) và C-2 (A).

Từ kết quả phân tích phổ NMR ở trên, có thể kết luận rằng phân tử ulvan

chiết acid từ rong lục Ulva reticulata được cấu thành bởi 2 disaccharide tạo thành

chuỗi như sau: [→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)-

-L-Rha-(1→], phân nhánh ở C-2 của acid uronic và nhóm sulfate xuất hiện ở cả 3

vị trí C-2, C-3 và C-4 của Rha. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR và 13C-NMR chi tiết

của UR-H được tóm tắt trong Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H

Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6

A

→2)--L-Rha-(1→

→4)--L-Rha-(1→

102-

103

/5,30

79-80

/3,63

75-77

/ 3,95

74-76

/3,85

75-76

/3,65

17-18

/1,17

B

→2)--D-GlcA-1(→

98,52;

98,39

/4,65

77,0

/3,20

74,0

/3,75

74,0

/ 3,85 - 167

C

→2)--L-IdoA-1(→

94,70;

94,51

/5,20

77,5

/3,60

76,0

/3,95

74,0

/3,85

-

167

65

Mẫu ulvan được thủy phân với điều kiện đưa ra ở phần thực nghiệm, thu

được mẫu phù hợp với nghiên cứu cấu trúc bằng phương pháp phổ khối, phổ ESI-

MS của mẫu ulvan được đưa ra trên Hình 3.8. Trên phổ khối của UR-H ta thấy xuất

hiện disaccharide dạng [RhaUroASO3]- biểu hiện qua peak [M-H]- tại m/z 419. Các

peak ion mảnh với số khối m/z 243 và m/z 195 tương ứng với các monosaccharide

là monosulfate rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic [UroA], số khối ở m/z 503 là của

ion mảnh monosulfate trirhanose [Rha3SO3]-. Số khối tại m/z 339 được gán cho ion

mảnh [RhaUroA]- còn peak tại m/z 401 là của [RhaUroASO3-H2O]-.

Hình 3.8. Phổ ESI-MS của UR-H

66

Hình 3.9 là phổ ESI-MS/MS của ion mảnh ứng với m/z 243, các công trình

nghiên cứu [100, 113] chỉ ra có sự ảnh hưởng của vị trí nhóm sulfate lên phổ MS.

Trên phổ, cho thấy có peak khá mạnh tại m/z 183 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate

ở vị trí C-4 của rhamnose, số khối ở m/z 139 là do nhóm sulfate ở vị trí C-2 của

rhamnose. Một peak ion mảnh có cường độ yếu tại tại m/z 169 là minh chứng rằng

ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 3 của rhamnose. Như vậy, ulvan chiết acid

với kí hiệu UR-H mà chúng tôi nghiên cứu có rhamnose bị sulfate ở cả 3 vị trí: chủ

yếu ở C-2 và C-4, một phần nhỏ ở C-3. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu

được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên.

Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243

Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh tại m/z 419 được đưa ra ở Hình 3.10, ion

mảnh với số khối m/z 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside có cường độ

mạnh, các ion mảnh khác có cường độ nhỏ tại m/z 139, 225 và một mảnh m/z

193. Ngoài ra, trên phổ còn có các mảnh tại m/z 339 là do mảnh m/z 419 mất

nhóm SO3 và mảnh tại m/z 401 là do mảnh m/z 419 bị loại nước.

67

Hình 3.10. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 419

Kết hợp với việc phân tích phổ NMR ở trên, cấu trúc mạch chính của ulvan

chiết tách bằng dung môi acid từ rong lục Ulva reticulata Việt Nam được đưa ra có

dạng [→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-Rha-

(1→], phân nhánh ở C-2 của acid uronic với nhóm sulfate ở cả 3 vị trí C-2, C-3 và

C-4 của Rha. Đây là một ulvan có cấu trúc mới so với các ulvan đã được công bố

thì chưa thấy xuất hiện liên kết (1→2) ở mạch chính.

3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N)

Trên phổ IR của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (Hình 3.11),

cho thấy, có dải hấp thụ ở vùng 845 cm 1 được gán cho dao động của liên kết C-O-

S của nhóm sulfate ở vị trí axial. Ngoài ra còn có dải hấp thụ tại vùng 783 cm-1

được cho là dao động đặc trưng cho liên kết C-O-S của nhóm sulfate ở vị trí

equatorial, dải hấp thụ trong vùng khoảng 1595 cm 1 đặc trưng cho nhóm COO

của acid uronic. Hơn nữa, băng sóng ở vùng 3261-3370 cm 1 là dao động của nhóm

OH hóa trị có liên kết hydro trong phân tử, ở 2922 cm 1 là dao động hóa trị của liên

68

kết C-H, và dải hấp thụ ở 1028 cm 1 đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C [95,

105]. Kết quả phân tích phổ IR được tóm tắt ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ IR của UR-N

Nhóm dao động Hình dạng Tần số (cm-1)

-OH hóa trị (có liên kết H) Rộng, mạnh 3261-3370

-CH hóa trị Nhọn, trung bình 2922

COO- hóa trị Nhọn, rất mạnh 1595

C-O-C hóa trị Nhọn, rất mạnh 1028

C-O-S của nhóm sulfate Nhọn, mạnh 845

Hình 3.11. Phổ IR của UR-N

Phổ 1H và 13C-NMR của UR-N được đưa ra ở Hình 3.12 và 3.13, phân tích

phổ 1H-NMR, cho thấy rằng trên vùng anomeric xuất hiện 2 tín hiệu ứng với độ

chuyển dịch hóa học ở δ4,82 và δ4,63 ppm, được ký hiệu A và B, tương ứng. Một

tín hiệu ở vùng trường cao ứng với độ chuyển dịch hóa học δ1,3 ppm được cho là

69

proton gắn với C-6 của nhóm methyl của rhamnose và các tín hiệu cộng hưởng

trong vùng δ3,35-4,59 ppm là đặc trưng của các proton vòng pyranose (Bảng 3.9).

Các kết quả phân tích phổ 13C-NMR của mẫu polysaccharide UR-N cũng cho

thấy trong vùng anomeric xuất hiện các tín hiệu carbon anomer ứng với độ chuyển

dịch hóa học δ100–103 ppm và các tín hiệu ở vùng δ69–80 ppm là của carbon vòng,

tín hiệu ở δ17 ppm là đặc trưng cho carbon của nhóm methyl C-CH3, còn tín hiệu

cộng hưởng ở δ177,6 ppm là điển hình cho carbon của nhóm carboxyl (Bảng 3.9).

Trên phổ 13C-NMR, không thấy xuất hiện tín hiệu ở vùng khoảng δ63 ppm đặc

trưng cho sự có mặt của carbon C-6 của nhóm CH2 của galactose và/hoặc glucose

và/hoặc carbon C-5 của nhóm CH2 xylose, điều này cho chúng ta thông tin rằng,

trong mẫu ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata, chỉ chứa một lượng rất nhỏ

các thành phần đường như galactose, glucose và xylose, do đó không thể phát hiện

được các đường này trên phổ NMR.

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của UR-N

70

Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của UR-N

Tương tác của các proton được kiểm tra trên phổ COSY (Hình 3.14), từ đây

các proton từ H-1 đến H-6 của A lần lượt được gán. Proton anomer H-1(A) với độ

chuyển dịch hóa học ä4,82 ppm có tương tác với H-2(A) với δ4,2 ppm, thể hiện rõ

thông qua peak đường chéo; tương tác giữa proton H-2 với proton H-3 có độ

chuyển dịch hóa học δ4,59 ppm; tương tác giữa H-3 và H-4, H-4 và H-5 cũng được

thể hiện qua peak đường chéo như trên Hình 3.14. Dựa vào các proton đã xác định

được ở trên cùng với những thông tin thu được từ phổ HSQC (Hình 3.15), các

carbon từ C-1 đến C-6 được xác định. Những thông tin thu được về độ chuyển dịch

hóa học của proton và carbon (Bảng 3.9) chỉ ra rằng A là dạng đặc trưng của 6-

deoxyhexopyranose, chính là rhamnose. Độ dịch chuyển hóa học của proton anomer

H-1 của A ở δ4,82 ppm chỉ ra rằng, dạng liên kết của A có thể là α hoặc . Tuy

71

nhiên, các nghiên cứu trước cho thấy ulvan tự nhiên chứa α-rhamnose, vì vậy có thể

kết luận rằng A ở đây là α-rhamnose. Trên phổ 13C-NMR, chúng tôi thấy các tín

hiệu cộng hưởng của carbon C-3 và C-4 của A bị đẩy về vùng trường thấp tương

ứng với độ dịch chuyển hóa học δ78,91 ppm và δ78,86 ppm, chứng tỏ A tham gia

liên kết glycoside qua liên kết (13,4) và/hoặc bị sulfate hóa ở vị trí C-3 và C-4.

Hình 3.14. Phổ COSY của UR-N

Đối với B, từ tín hiệu của proton anomer H-1 ở δ4,63 ppm trên phổ COSY,

chúng tôi gán được các proton H-2, H-3, H-4 và H-5 với độ dịch chuyển hóa học

tương ứng là δ3,35; δ3,64; δ3,65 và δ3,82 ppm, và bằng phổ HSQC xác định được

các carbon C-2, C-3, C-4 và C-5 ở δ74,58; δ74,83; δ79,48 và δ76,70 ppm tương

ứng. Carbon C-6 của nhóm carboxyl nằm ở vùng trường thấp do mật độ điện tử lệch

về phía các nguyên tử oxy có độ âm điện lớn trong nhóm, nên có độ dịch chuyển

72

hóa học lớn nhất trong phổ tương ứng ở δ177,6 ppm. Ta thấy, tín hiệu cộng hưởng

của carbon C-2 và C-4 bị đẩy về vùng trường thấp chứng tỏ B tham gia liên kết

glycoside ở cả 2 vị trí (12) và (14). Độ dịch chuyển hóa học của proton H-1

của B tại δ4,63 ppm là đặc trưng cho kiểu liên kết -linked. Tham khảo các nghiên

cứu trên thế giới [97, 105] cho thấy, ulvan từ rong lục Ulva chứa thành phần chủ

yếu là -rhamnose, -acid glucuronic và -acid iduronic, cùng với căn cứ vào

những thông tin thu được qua phân tích phổ ở trên, đưa đến kết luận rằng B là -

acid glucuronic.

Hình 3.15. Phổ HSQC của UR-N

Liên kết glycoside trong mạch phân tử UR-N được xác định từ phổ HMBC

(Hình 3.16), trên phổ HMBC cho thấy có tương tác giữa proton H-1(A) và carbon

C-4(B), proton H-1(B) và carbon C-4(A), H-4(A) và C-1(B). Điều này một lần nữa

khẳng định trong phân tử ulvan mà chúng tôi chiết tách được chứa cả 2 dạng liên

73

kết glycoside: Rha-(14)-GlcA và GlcA-(14)-Rha. Kết hợp với các thông tin thu

được từ phổ COSY và HSQC, chúng tôi có được kết luận là rhamnose tham gia liên

kết theo kiểu glycoside 14 và bị sulfate hóa ở vị trí C-3, acid glucuronic có 2 kiểu

liên kết là glycoside 12 và 14. Các kết quả này cho dự đoán rằng acid

glucuronic nối với rhamnose qua liên kết glycoside 14 ở mạch chính, trùng với

các nghiên cứu [95, 107]. Trong các nghiên cứu này, tác giả Lahaye đã chứng minh

rằng cấu trúc của ulvan từ rong lục Ulva rigida có dạng A3s [→ 4)-β -D-GlcA-(1→

4)-α-L-Rha3S-(1→] và bị phân nhánh ở C-2 của β-D-GlcA.

Hình 3.16. Phổ HMBC của UR-N

Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ ở trên, có thể kết luận rằng,

phân tử ulvan UR-N được cấu thành bởi disaccharide tạo thành chuỗi [→4-β-D-

GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid

glucuronic. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C được đưa ra ở Bảng 3.9.

74

Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N

Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6

A

4)--L-Rha3S-(1

100,51/

4,82

69,71/

4,20

78,91/

4,59

78,86/

3,79

68,89/

4,13

17,60/

1,30

B

2,4)--D-GlcA-(1

103,83/

4,63

74,58/

3,35

74,83/

3,64

79,48/

3,65

76,70/

3,82 177,60

Hình 3.17. Phổ ESI-MS của UR-N

Phổ ESI-MS của UR-N được đưa ra trên Hình 3.17. Trên phổ xuất hiện peak

ion mảnh [M-H]- tại m/z 419 biểu hiện sự có mặt của disaccharide dạng

75

[RhaUroASO3]-. Monosulfate rhamnose [RhaSO3]- và acid uronic [UroA]- cho các

peak tại m/z 243 và m/z 195 tương ứng, mảnh khối ở m/z 503 là của ion monosulfate

trirhamnose [Rha3SO3]-. Mảnh khối tại m/z 339 được gán cho ion [RhaUroA]- còn

peak với m/z 401 là của ion mảnh [RhaUroASO3-H2O]-. Phổ ESI-MS/MS của ion

mảnh với m/z 243 được đưa ra ở Hình 3.18, trên phổ, chúng tôi thấy có peak với

cường độ mạnh tại m/z 169 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở vị trí C-3 của

Rha. Điều này cũng phù hợp với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và

NMR ở trên. Theo như các nghiên cứu về ulvan đã công bố thì hầu hết nhóm

sulfate thường ở vị trí số 3 của rhamnose. Do vậy, ulvan mà chúng tôi nghiên cứu

có cấu trúc dạng A3s, là dạng cấu trúc phổ biến của nhiều ulvan đã được nghiên

cứu trước đó.

Hình 3.18. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243

76

Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh tại m/z 419 được đưa ra ở Hình 3.19, ion

mảnh với m/z 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside (dạng Y) có cường độ

mạnh, các mảnh khác có cường độ nhỏ tại m/z 225 (Z1) và một mảnh với m/z 193

(C1). Các kết quả này chứng tỏ rằng ulvan đang nghiên cứu bị sulfate hóa tại vị trí

C-2 của rhamnose. Ngoài ra trên phổ còn có các mảnh tại m/z 339 là do mảnh m/z

419 mất nhóm SO3 và mảnh tại m/z 401 là do mảnh 419 bị loại nước. Sơ đồ phá

mảnh của UR-N được đưa ra ở Hình 3.20.

Hình 3.19. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaUroASO3]- tại m/z 419

77

O

OH

OH

OSO3-

OH

O,3 X, m/z=169

3

4

O

OH

OH

OH

OSO 3-

O,2A, m/z=183

O

OSO3-

OH

OH OH

O,2X, m/z=139

2

243

Y1

O,2X1

139

O OH

O

O

OHOH

OOH

CH3

OH O

OH

H H

H

H HH H

SO

OOH

Z1

225

C1

193

243

Y1

225

Z1

C1

193

O OH

O

O

OHOH

OOH

CH3

O OH

OH

HH

H

H HH H

SO

O

OH

O,3X0

169

2550,1X1

O

O

O

OH

OH

O OH

OH

H

H

H H

H

H

SO

O

OH

OHCH3

119

0,1A1

225

Z1

0,1X1

255

Hình 3.20. Sơ đồ phá mảnh của UR-N

78

Kết hợp với việc phân tích phổ NMR ở trên, có thể kết luận rằng cấu trúc

mạch chính của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata Việt Nam có dạng

A3s: [--D-GlcA-(14)--L-Rha3S-(1] và phân nhánh ở vị trí carbon C-2

của acid glucuronic với nhóm sulfate ở vị trí C-3 của Rha (Hình 3.21).

Hình 3.21. Cấu trúc ulvan UR-N từ rong lục Ulva reticulata

Hiện nay, các phép đo tán xạ là phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc

không gian của phân tử polymer. Kết quả đo SAXS của dung dịch 1% ulvan UR-N

trong nước và trong NaCl 0,5M biểu diễn dưới dạng đường cong tán xạ trên biểu đồ

Kratky [Hình 3.22] và Guinier [Hình 3.23].

7x10-3

6

5

4

3

2

1

0

q2I(

q)

543210

q, nm-1

Ulva reticulata Forsskål 1% in water in 0.5 M NaCl aq

Hình 3.22. Biểu đồ Kratky của dung dịch UR-N 1% trong nước

và trong NaCl 0,5 M

79

Biểu đồ Kratky thể hiện sự biến thiên của cường độ tán xạ (q2I(q), với I(q) là

cường độ tán xạ tại q) theo góc tán xạ q. Qua biểu đồ Kratky của mẫu UR-N trên

hình 3.22, mẫu đo trong dung dịch nước, tại góc tán xạ nhỏ có peak tạo thành do

tương tác tĩnh điện và peak này bị mất khi dung dịch được thêm NaCl do các nhóm

mang điện bị che phủ (screening). Ulvan là một sulfate polysaccharide với hàm

lượng sulfate cao, do vậy sự xuất hiện của peak này là một minh chứng về sự có

mặt của các nhóm mang điện (nhóm sulfate) trong phân tử ulvan.

-8

-7

-6

-5

-4

-3

ln(q

I(q

))

6543210

q2

Ulva reticulata Forsskål 1% in water, Rgc=1.35nm in 0.5 M NaCl aq, Rgc=1.37nm

Hình 3.23. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR-N 1% trong nước

và trong NaCl 0,5 M

Áp dụng công thức gần đúng của Guinier cho hình dáng phân tử kiểu que

(rod-like) tương tự các sulfate polysacchrie chiết tách từ các loài rong biển khác như

carrageennan từ rong đỏ hay fucoidan từ rong nâu [33, 112, 113], biểu đồ mặt cắt

ngang Guinier (cross-sectional Guinier plot) của UR-N biểu diễn trên hình 3.23 với

trục tung là ln(qI(q)) và trục hoành là q2. Độ dốc của phần tuyến tính của biểu đồ

cho phép xác định giá trị của bán kính hồi chuyển của UR-N là Rgc=1,35nm (trong

nước) và 1,37 nm (trong dung dịch NaCl 0,5M). Đối với các polysaccharide

80

mạch thẳng không phân nhánh như carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc

khoảng 0,4-0,5 nm, điều này cho thấy UR-N có mạch nhánh tương đối dài, giống

như fucoidan chiết tách từ các loài rong nâu. Kết quả nghiên cứu về cấu trúc

không gian cũng phù hợp với cấu trúc hóa học xác định được theo các phương

pháp phổ IR, NMR và ESI-MS ở trên là ulvan có cấu trúc mạch nhánh.

Ngoài ra, trên các biểu đồ Kratky và Guinier có đoạn tăng lên đột ngột (up-

turn behavior) khi tiến đến góc tán xạ nhỏ có thể được cho là do có sự tập hợp

(aggregation) của các phân tử ulvan trong dung dịch. Điều này cũng có thể xảy ra vì

một tính chất vật lý đặc trưng của ulvan được biết đến là rât dễ tạo gel trong môi

trường nước [46, 51].

Phương pháp SAXS không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian

của phân tử mà còn giúp đưa ra các thông tin chi tiết hơn về cấu trúc hóa học như

độ dài mạch nhánh và sự phân bố của mạch nhánh trên mạch chính. Để làm được

điều này, một mô hình phân tử của UR-N được xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học

đã xác định bằng các phương pháp phổ (Hình 3.21), sau đó, đường tán xạ tính toàn

từ mô hình phân tử được so sánh (fitting) với đường tán xạ thực nghiệm nhận được

từ phép đo SAXS. Ở đây, phương trình Debye [164] được sử dụng để tính toán

đường tán xạ từ mô hình phân tử.

n

j

n

j

n

jk jk

jk

kjkjjiqd

qdqgqgffqgfqI

1

1

1 1

22 sin)()(2)()(

trong đó, fi và djk là khối lượng của nguyên tử tán xạ j và khoảng cách giữa nguyên

tử j và k. Yếu tố hình dạng gj (q) đối với một nguyên tử được biểu diễn bằng hình

cầu với bán kính bằng bán kính Van der Waals, Rj, của nguyên tử j.

3)(

)cos()()sin(3

qR

qRqRqRg

j

jjj

j

Giá trị Rgc có thể biểu hiện cho mức độ phân nhánh và độ dài mạch nhánh

của cấu trúc phân nhánh của phân tử polymer. Với UR-N, kết quả cho thấy mô hình

cấu trúc phân tử xây dựng với n = 5 và m =4 (Hình 3.24) thì biểu đồ tán xạ Kratky

thu được từ thực nghiệm SAXS và tính toán dựa trên mô hình cấu trúc phân tử có

độ trùng nhau (fitting) khá tốt (Hình 3.25).

81

a)

Chú thích: G: Glucuronic acid, R– Rhamnose, liên kết ở mạch chính (1→ 4), liên kết ở mạch nhánh (1 → 2).

b)

Hình 3.24. a) Đơn vị cấu trúc để xây dựng mô hình cấu trúc phân tử, b) Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học

Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu

trúc phân tử.

82

Trên thế giới ulvan từ rong lục Ulva lactuca đã được nghiên cứu nhiều do

chúng có cấu trúc phức tạp và có nhiều hoạt tính sinh học quý. Yaich và CS [158]

đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của điều kiện chiết tách đến hiệu suất chiết tách, thành

phần hóa học, khối lượng phân tử, các tính chất lưu biến và cấu tạo ulvan từ rong

lục Ulva lactuca. Nghiên cứu của Hanaa và CS [136] đã chỉ ra rằng ulvan từ rong

lục Ulva lactuca thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, chống đông tụ tốt; có khả năng

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, có khả năng kháng virus cúm HSV-1 cao.

Chiu và CS [17] đã chứng minh rằng ulvan từ rong lục Ulva lactuca còn có khả

năng ức chế virus viêm não Nhật Bản. Thêm nữa, các kết quả nghiên cứu [97, 106]

chỉ ra rằng cấu trúc của ulvan từ Ulva lactuca rất đa dạng và phức tạp, được cấu

thành bởi (1→4)- và (1→2,4)-Rha3S và (1→4)-GlcA và (1→4)-Xyl2S, phụ thuộc

nhiều vào phương pháp chiết tách, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và thời điểm thu

hái. Costa và CS [127] đã nghiên cứu cấu trúc hóa học của ulvan từ loài rong lục

giống với loài rong mà chúng tôi đang nghiên cứu nhưng thu thập ở vùng biển của

Bồ Đào Nha, kết quả chỉ ra rằng polysaccharide được tạo thành bởi phần lớn là

chuỗi liên kết glycoside ở Rha dạng (1→4) và (1→2,4) và Rha bị sulfate hóa ở vị trí

C-3, liên kết glycoside ở GlcA là β-(1→4)-, liên kết glycoside ở Xyl là (1→4)- và

(1→3)- và xylose bị sulfate hóa ở vị trí C-2. Gần đây, những số liệu nghiên cứu

khẳng định lại sự có mặt của 2-sulfate Xyl trong phân tử ulvan và chứng minh là

hầu hết các nhóm sulfate trong phân tử ulvan từ rong lục Ulva đều ở vị trí C-3 hoặc

C-2 của Rha (1→4)-.

Do vậy, nhằm đóng góp và chứng minh về sự đa dạng, phức tạp trong cấu

trúc và nhằm góp phần khẳng định sự phụ thuộc cấu trúc của ulvan từ loài rong lục

này vào phương pháp chiết tách và vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng, chúng tôi đã

chọn ulvan từ rong lục Ulva lactuca thu thập ở vùng biển Nha Trang của Việt Nam

để nghiên cứu cấu trúc.

3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N)

Phổ IR của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca được đưa ra ở Hình

3.26. Trên phổ, ta thấy có các dao động đặc trưng của nhóm sulfate ester và acid

uronic. Băng sóng hấp thụ tại 845 cm 1 là đặc trưng cho dao động của liên kết C-O-

S. Thêm nữa, dải hấp thụ ở 789 cm-1 được cho là dao động điển hình cho liên kết C-

O-S của nhóm sulfate ở vị trí equatorial, băng sóng hấp thụ trong vùng 1599 cm 1 là

83

do dao động của nhóm COO-, xác nhận cho sự có mặt của acid uronic trong phân tử

ulvan. Hơn nữa, dải phổ rộng tại 3361 cm 1 là dao động của nhóm OH hóa trị có

liên kết hydro trong phân tử, ở 2920 cm 1 là dao động của nhóm CH và dải hấp thụ

ở 1026 cm 1 là đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C.

Hình 3.26. Phổ IR của UL-N

Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của ulvan UL-N cho thấy, trên vùng

anomeric của phổ 1H-NMR (Hình 3.27) xuất hiện 4 tín hiệu ứng với độ chuyển dịch

hóa học ở δ5,36; δ4,90; δ4,82 và δ4,64 ppm, được kí hiệu cho 4 gốc A, B, C, và D,

tương ứng. Trên phổ xuất hiện một tín hiệu ở vùng trường cao ứng với độ chuyển

dịch hóa học δ1,3 ppm được cho là proton gắn với C-6 của nhóm methyl của

rhamnose, các tín hiệu cộng hưởng trong vùng δ3,35-4,61 ppm là đặc trưng cho các

proton vòng pyranose (Bảng 3.10). Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của mẫu

polysaccharide chiết nước từ rong lục Ulva lactuca cũng cho thấy, trong vùng

anomeric xuất hiện các tín hiệu carbon anomer ứng với độ chuyển dịch hóa học

δ89,65–103,65 ppm và các tín hiệu ở vùng δ69–80 ppm là của các carbon vòng

pyranose. Tín hiệu cộng hưởng ở độ chuyển dịch hóa học δ17 ppm là đặc trưng cho

carbon của nhóm methyl C-CH3 và tín hiệu ở vùng trường thấp ứng với δ177,76

84

ppm được gán cho carbon của nhóm carboxyl (Bảng 3.10). Trên phổ 13C-NMR

(Hình 3.28), còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng ở δ61,2 ppm đặc trưng cho carbon

C-5 của nhóm CH2 của xylose và/hoặc carbon C-6 của nhóm CH2 của glucose

và/hoặc galactose.

Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của UL-N

Tín hiệu cộng hưởng của năm proton từ H-1 đến H-5 của A lần lượt được

gán thông qua tương tác của các proton thể hiện trên peak đường chéo ở phổ COSY

(Hình 3.29). Proton H-1 (δ5,36 ppm) có tương tác với H-2 (δ3,65 ppm), thể hiện rất

rõ thông qua peak đường chéo; tương tác giữa proton H-2 với proton H-3 có độ

chuyển dịch hóa học δ3,95 ppm; tương tác giữa H-3 và H-4, H-4 và H-5 cũng được

tìm thấy trên phổ COSY. Dựa vào các proton đã xác định được ở trên cùng với

những thông tin thu được từ phổ HSQC (Hình 3.27), các carbon từ C-1 đến C-5

được xác định; carbon C-5 (A) với độ chuyển dịch hóa học 61,2 ppm (Bảng 3.10)

chỉ ra rằng A là xylose. Tín hiệu cộng hưởng proton H-1(A) dịch về phía trường

85

thấp với độ chuyển dịch hóa học δ5,36 ppm cho chúng tôi có thể kết luận rằng A là

xylose, thêm nữa, tín hiệu cộng hưởng của carbon C-2 nằm ở vùng trường thấp

tương ứng với độ dịch chuyển hóa học δ77,92 ppm chứng tỏ A tham gia liên kết

glycoside qua liên kết (12) và/hoặc bị sulfate hóa ở vị trí C-2.

Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của UL-N

Đối với B và C, từ tín hiệu của proton anomer H-1(B) và H-1(C) ở độ

chuyển dịch hóa học δ4,90 ppm và δ4,82 ppm, tương ứng, lần lượt các proton còn

lại từ H-2 đến H-6 của B và C được gán thông qua các peak đường chéo trên phổ

86

COSY (Hình 3.29). Dựa vào thông tin về độ chuyển dịch hóa học của các proton đã

tìm được ở trên, chúng tôi cũng tìm được các carbon từ C-1 đến C-6 tương ứng từ

phổ HSQC (Hình 3.30). Độ chuyển dịch hóa học của các proton và carbon được

tóm tắt ở Bảng 4.10, kết quả gán phổ trên Bảng 3.10 cho thấy B và C là dạng 6-

deoxyhexopyranose điển hình, độ chuyển dịch hóa học của proton anomer H-1(B)

và H-1(C) ở δ4,90 ppm và δ4,82 ppm chỉ ra rằng liên kết glycoside của B và C có

thể là dạng hoặc α-linked. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu trước cho thấy ulvan

tự nhiên có thành phần chính là α-rhamnose [120, 122], do đó, chúng tôi có thể kết

luận rằng B và C là α-rhamnose. Hơn nữa, tín hiệu cộng hưởng của carbon C-2 và

C-4 của B bị đẩy về vùng trường thấp ứng với độ chuyển dịch hóa học δ79,21 ppm

và δ76,88 ppm, gợi ý rằng rhamnose B có liên kết glycoside kiểu (12,4) và/hoặc

bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-2 và C-4. Đối với C, các tín hiệu cộng hưởng của

carbon C-3 (δ78,68 ppm) và C-4 (δ78,68 ppm) cũng bị đẩy về vùng trường thấp,

chứng tỏ C tham gia liên kết glycoside kiểu (13,4) và/hoặc bị sulfate hóa ở các vị

trí carbon C-3 và C-4.

Hình 3.29. Phổ COSY của UL-N

87

Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N

88

Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N

89

Đối với D, từ tín hiệu cộng hưởng của proton anomer H-1(D) ở δ4,64 ppm,

dựa vào phổ COSY và HSQC, chúng tôi gán được các proton H-2(D), H-3(D), H-

4(D) và H-5(D) với độ chuyển dịch hóa học tương ứng là δ3,35; δ3,65; δ3,68 và

δ3,81 ppm, cũng như các carbon C-2(D), C-3(D), C-4(D) vΰ C-5(D) ở δ74,40;

74,58; 79,40 và 76,88 ppm, tương ứng. Trên phổ 13C-NMR, xuất hiện một peak ứng

với độ chuyển dịch hóa học δ177,76 ppm cho thấy sự có mặt của acid uronic trong

phân tử ulvan chiết nước từ rong Ulva lactuca, tín hiệu cộng hưởng của carbon C-2

và C-4 bị đẩy về phía trường thấp cho thấy kiểu liên kết glycoside ở acid uronic D

có thể là dạng (12) và (14). Proton anomer H-1(D) có độ chuyển dịch hóa học

ở 4,64 ppm, vậy D có thể là - acid glucuronic.

Liên kết glycoside trong mạch phân tử polysaccharide UL-N được xác định

dựa vào phổ HMBC (Hình 3.31), trên phổ HMBC, chúng tôi thấy có sự tương tác

giữa proton H-1(C) và carbon C-4(D), proton H-1(D) và carbon C-4(C). Điều này

chỉ ra rằng trong phân tử ulvan mà chúng tôi đang nghiên cứu chứa cả hai dạng liên

kết Rha-(14)-GlcA và GlcA-(14)-Rha. Bên cạnh đó, phân tích phổ HMBC,

chúng tôi còn thấy có mối tương quan giữa carbon C-2(A) và proton H-1(D), carbon

C-2(B) và proton H-1(C), carbon C-2(B) và proton H-1(D), điều này chứng tỏ rằng,

trong phân tử UL-N còn tồn tại 3 dạng liên kết glycoside nữa là GlcA-(12)-Xyl,

Rha-(12)-Rha và GlcA-(12)-Rha.

Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N

Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6

A

→2)-α-D-Xyl-(1→

100,27/

5,36

77,92

3,65

73,82/

3,95

71,87/

3,82

61,20/

3,80;

3,88

B

→2,4)-α-L-Rha-(1→

89,65;

101,50/

4,90

79,21/

4,06

71,74/

3,71

76,88/

3,82

68,40/

4,0

17,12/

1,31

C

→4)-α-L-Rha3S-(1→

100,40/

4,82

69,46/

4,23

78,68/

4,61

78,68/

3,80

68,65/

4,13

17,35/

1,31

D

→4)-β-D-GlcA-(1→

103,65/

4,64

74,40/

3,35

74,58/

3,65

79,40/

3,68

76,88/

3,81

177,76

90

Phổ ESI-MS của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca được đưa ra ở

Hình 3.32, trên phổ, ta thấy xuất hiện tín hiệu ứng với m/z 193 được cho là của acid

uronic, ion mảnh ở m/z 243 là của monosulfate rhamnose [RhaSO3]-. Các ion mảnh

với m/z 325, 339 và 375 được gán cho là của [XylUroA]-, [RhaUroA]- và

[XylRhaSO3]-, tương ứng. Hơn nữa, ta còn thấy tín hiệu với m/z 419 chính là của

disaccharide dạng [UroARhaSO3]- và mảnh ứng với m/z 535 là của monosulfate

trirhamnose [Rha3SO3]-.

[UroA]-

[XylUroA]-

[RhaUroA]-

[RhaSO3]-

[XylRhaSO3]-

[UroARhaSO3]-

[Rha3SO3]-

Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N

Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh với m/z 243 được đưa ra trên Hình 3.33, theo

tác giả của nghiên cứu [99, 113] chỉ ra rằng vị trí nhóm sulfate trong phân tử ulvan

có ảnh hưởng đến phổ MS. Trên phổ MS2 của ion mảnh m/z 243, chúng tôi thấy có

hai peak ion mảnh ứng với m/z 183 và m/z 169 là đặc trưng cho sự có mặt của nhóm

91

sulfate ở vị trí carbon C-4 và C-3 của Rha tương ứng. Như vậy, kết hợp kết quả

phân tích phổ NMR với phổ ESI-MS ở trên, chúng tôi kết luận rằng Rha (B) có thể

bị sulfate ở cả 2 vị trí C-3 và C-4.

Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243

Từ các thông tin thu được qua việc phân tích phổ IR, NMR và MS, chúng tôi

có thể khẳng định rằng, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc mạch

chính chủ yếu là disaccharide dạng [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và

phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của rhamnose. Ngoài ra, trong phân tử ulvan còn có

lượng nhỏ disaccharide ở dạng liên kết GlcA-(12)-Xyl, GlcA-(12)-Rha.

Như vậy, cấu trúc hóa học của phân tử ulvan từ rong lục Ulva lactuca mà

chúng tôi đưa ra giống với các kết quả nghiên cứu trước đó ở mạch chính nhưng

khác nhau ở mạch nhánh và những mạch phụ. Điều này cho phép khẳng định lại

rằng, cấu trúc của ulvan từ rong lục rất đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào nhiều

vào vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng.

92

3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H)

Trên phổ IR của UL-H, ta thấy, có dải hấp thụ với cường độ nhỏ ở 850 cm 1

được gán cho dao động của liên kết C-O-S. Ngoài ra còn có dải hấp thụ tại vùng

786cm-1 được cho là dao động đặc trưng cho liên kết C-O-S của nhóm sulfate ở vị

trí equatorial, dải hấp thụ ở 1014 cm 1 đặc trưng cho liên kết glycoside C-O-C. Dải

hấp thụ ở 1599 cm 1 là do dao động của liên kết COO của acid uronic.

Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của UL-H

Trên vùng anomeric của phổ 1H-NMR (Hình 3.34) xuất hiện 3 cụm tín hiệu

ứng với độ chuyển dịch hóa học ở δ4,823; 4,891 và 4,652 ppm, được kí hiệu là D,

D’ và E, tương ứng. Trên phổ có một tín hiệu ở vùng trường cao ứng với độ chuyển

93

dịch hóa học khoảng δ1,3 ppm đặc trưng cho proton gắn với C-6 của nhóm methyl

của rhamnose và các tín hiệu cộng hưởng trong vùng δ3,35-4,58 ppm là đặc trưng

của các proton vòng pyranose (Bảng 3.11).

Hình 3.35. Phổ 13C-NMR của UL-H

Các kết quả phân tích phổ 13C-NMR (Hình 3.35) của mẫu ulvan chiết acid từ

rong lục Ulva lactuca cũng cho thấy trong vùng anomeric xuất hiện các tín hiệu

carbon anomer ứng với độ chuyển dịch hóa học δ102–105 ppm và các tín hiệu ở

vùng δ70–81 ppm là của carbon vòng pyranose, carbon của nhóm methyl C-CH3 có

tín hiệu ở vùng khoảng δ19 ppm. Trên phổ 13C-NMR không thấy xuất hiện tín hiệu

94

ở δ63 ppm đặc trưng cho sự có mặt của carbon C-6 của nhóm CH2 của galactose và

glucose hoặc carbon C-5 của nhóm CH2 của xylose. Điều này cung cấp cho chúng

ta thông tin rằng trong mẫu ulvan chiết acid từ rong Ulva lactuca chỉ chứa một

lượng rất nhỏ các thành phần đường như galactose, glucose và xylose so với

rhamnose, do đó không thể phát hiện được các đường này trên phổ NMR. Kết quả

này phù hợp với kết quả phân tích hàm lượng đường ở trên.

Hình 3.36. Phổ COSY của UL-H

Tương tác của các proton của D được kiểm tra trên phổ COSY (Hình 3.36),

từ đây các proton từ H-1 đến H-6 của D lần lượt được gán. Proton H-1 (δ4,82 ppm)

có tương tác với H-2 (δ4,22 ppm), thể hiện rõ thông qua peak đường chéo; tương

95

tác giữa proton H-2 với proton H-3 có độ chuyển dịch hóa học δ4,58 ppm; tương tác

giữa H-3 và H-4 ở độ dịch chuyển hóa học δ3,78 ppm, H-4 và H-5 ở δ4,11 ppm

cũng được thể hiện qua peak đường chéo như trên Hình 3.33. Dựa vào các proton

đã xác định được ở trên cùng với những thông tin thu được từ phổ HSQC (Hình

3.37), các carbon từ C-1 đến C-6 được xác định lần lượt tương ứng với độ chuyển

dịch hóa học ở δ102,45 ppm, δ71,62 ppm, δ80,80 ppm, δ80,70 ppm, δ70,79 ppm và

ở khoảng δ19,56 ppm. Trên phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học của proton H-1

của D ở δ4,82 ppm là giá trị liên kết dạng Hα hoặc H anomer.

Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H

Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng ulvan tự nhiên chứa thành

phần là α-rhamnose [96, 97, 107], do đó, chúng tôi có thể kết luận rằng D là α-

96

rhamnose. Trên phổ 13C-NMR, chúng tôi thấy các tín hiệu cộng hưởng của carbon

C-3 và C-4 của D nằm ở vùng trường thấp tương ứng với độ dịch chuyển hóa học

δ80,80 ppm và δ80,70 ppm, chứng tỏ D tham gia liên kết glycoside qua liên kết

(13,4) và/hoặc bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-3 và C-4.

Đối với E, từ tín hiệu của proton anomer H-1 ở δ4,65 ppm trên phổ COSY và

HSQC, chúng tôi gán được các proton H-2, H-3, H-4 và H-5 với độ dịch chuyển

hóa học tương ứng là δ3,35; δ3,60; δ3,65 và δ3,86 ppm, xác định được carbon C-1,

C-2, C-3, C-4 và C-5 ở δ105,69; δ76,44; δ76,72; δ81,52 và δ78,49 ppm, tương ứng.

Độ dịch chuyển hóa học proton H-1 của E tại δ4,652 ppm là đặc trưng cho kiểu liên

kết -linked, kết hợp với kết quả phân tích thành phần hóa học và các nghiên cứu

trước [11, 97, 107] có thể gán E là - acid glucuronic. Trên phổ 13C-NMR của UL-

H, tín hiệu cộng hưởng của carbon C-4 bị đẩy về phía vùng trường thấp, chứng tỏ, E

tham gia liên kết glycoside (14).

Đối với rhamnose D’, từ tín hiệu proton H-1 ở δ4,89 ppm, thông qua các

peak đường chéo trên phổ COSY, các proton còn lại từ H-2 đến H-5 được xác định

tương ứng với độ chuyển dịch hóa học là δ4,22; δ4,05; δ3,86 và δ3,71 ppm. Bằng

phổ HSQC, các carbon từ C-1 đến C-5 của D’ cũng lần lượt được gán ở các độ

chuyển dịch hóa học tương ứng là δ103,6; δ71,62; δ81,34; δ74,10 và δ73,20 ppm.

Các tín hiệu của carbon C-3 và C-4 bị đẩy về phía trường thấp chứng tỏ D’ tham gia

liên kết glycoside qua liên kết (13,4) và/hoặc bị sulfate hóa ở vị trí carbon C-3 và

C-4.

Chuỗi liên kết glycoside được xác định từ phổ HMBC (Hình 3.38), trên phổ

HMBC cho thấy có sự tương tác giữa proton H-1(D) và carbon C-4(E), proton

H-4(D) và carbon C-1(E), điều này một lần nữa khẳng định trong phân tử ulvan mà

chúng tôi chiết tách được chứa cả 2 dạng liên kết glycoside Rha-(14)-GlcA và

GlcA-(14)-Rha. Kết hợp với các thông tin thu được từ phổ COSY, chúng tôi có

được kết luận là rhamnose ở mạch chính tham gia liên kết glycoside (14) và bị

sulfate hóa ở vị trí carbon C-3. Trên phổ HMBC còn xuất hiện tương tác giữa

proton anomer H-1 (D’) với carbon C-3(D ) và C-4(D), chứng tỏ D’ và D liên kết

với nhau qua liên kết glycoside (13, 4). Các kết quả này cho thấy rằng, cấu trúc

của ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca gồm disaccharide [→4)-β-D-GlcA-

97

(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí carbon C-3 của rhamnose, trùng

với các nghiên cứu [96, 97].

Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H

Từ những kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ NMR ở trên, chúng tôi có thể

kết luận rằng ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca có cấu trúc tạo thành từ

disaccharide [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí

carbon C-3 của rhamnose. So sánh với các nghiên cứu trước đây về ulvan từ rong

98

lục Ulva lactuca [97, 125, 131, 158] cho thấy rằng ulvan được chiết tách bằng các

phương pháp khác nhau, đều có cấu trúc với thành phần mạch chính giống nhau,

chúng chỉ khác nhau ở mạch nhánh. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ được đưa

ra ở Bảng 3.11.

Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H

Monosaccharide C-1/H-1 C-2/H-2 C-3/H-3 C-4/H-4 C-5/H-5 C-6/H-6

D

4)--L-Rha3S-(1

102,45/

4,82

71,62/

4,22

80,80/

4,58

80,70/

3,78

70,79/

4,11

~19,56/

~1,3

E

1)--D-GlcA-(4

105,69/

4,65

76,44/

3,35

76,72/

3,60

81,52/

3,65

78,49/

3,86

D’

1)--L-Rha-(3,4)

~103,6/

4,89

71,62/

4,22

81,34/

4,05

~74,10/

3,86

~73,2/

3,71

~19,48/

~1,29

Trên phổ ESI-MS của ulvan có các peak ion mảnh của disaccharide

[RhaUroASO3]- tại m/z 419. Các monosaccharide là monosulfate rhamnose

[RhaSO3]- và acid uronic [UroA] cho các peak m/z 243 và m/z 195, tương ứng. Phổ

ESI-MS/MS của disaccharide với m/z 243 được đưa ra ở Hình 3.39. Các công trình

nghiên cứu [100, 113] chỉ ra rằng, vị trí nhóm sulfate trong phân tử sulfate

polysaccharide có ảnh hưởng đáng kể đến phổ MS. Trên phổ, chúng tôi thấy có

peak ion mảnh với cường độ mạnh tại m/z 169 chỉ ra sự có mặt của nhóm sulfate ở

vị trí carbon C-3 của Rha. Một peak ion mảnh có cường độ yếu tại tại m/z 139 là

minh chứng rằng ulvan bị sulfate hóa một phần tại vị trí số 2 của rhamnose. Như

vậy, ulvan UL-H mà chúng tôi nghiên cứu có rhamnose bị sulfate ở cả 2 vị trí: chủ

yếu ở vị trí carbon C-3 và một phần nhỏ ở vị trí carbon C-2. Điều này cũng phù hợp

với các thông tin thu được qua phân tích phổ IR và NMR ở trên.

99

Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243

Từ các thông tin thu được ở trên, chúng tôi có thể kết luận rằng ulvan phân

lập được từ rong lục Ulva lactuca thu thập từ biển Nha Trang theo phương pháp

chiết acid có cấu trúc chuỗi disaccharide chủ yếu dạng [→4)β-D-GlcA-(1→4)α-L-

Rha3S-(1→] và phân nhánh tại vị trí C-3 của rhamnose.

Kết luận:

Cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học được chiết tách từ 2 loài rong

lục phổ biến ở vùng biển Nha Trang của Việt nam, được tóm tắt lại như sau:

100

- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata

Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-2, C-3 và C-4 của Rha.

Đây là một ulvan có cấu trúc mới, vì đa số các ulvan chỉ có liên kết 1→4 ở

mạch chính, trong khi ulvan này tồn tại liên kết 1→2 ở mạch chính.

- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata

Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha.

- Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca

Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha.

- Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca

Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 và C-4 của Rha.

101

Qua kết quả nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học ở trên,

có thể khẳng định được rằng thành phần và cấu trúc của ulvan không những phụ

thuộc vào loài rong nghiên cứu mà còn phụ thuộc vào phương pháp chiết tách

chúng từ rong. Tổng hợp các kết quả nghiên cứu trên, cho thấy rằng có mối liên hệ

giữa phương pháp chiết tách với thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

ulvan, cụ thể các mẫu ulvan chiết nước với lượng Rha và sulfate cao hơn thể hiện

các hoạt tính nghiên cứu tốt hơn, tiếp đến là ulvan chiết acid và thấp nhất là ulvan

chiết kiềm. Kết quả này có thể được lý giải rằng, khối lượng phân tử là một yếu tố

quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của ulvan.

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính

sinh học của ulvan

Các nghiên cứu trước đây cho thấy nhóm sulfate là yếu tố cấu trúc có ảnh

hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của sulfate polysaccharide, nhất là hoạt tính chống

đông tụ máu [159-163]. Mặt khác, sự acetyl hóa có thể làm tăng hoạt tính chống

oxy hóa hoặc kháng vi sinh vật kiểm định của chúng [154-156]. Nhằm mục đích tìm

hiểu sự thay đổi cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của ulvan khi chúng bị sulfate

hóa hoặc acetyl hóa chúng tôi đã điều chế các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa của

mẫu ulvan tự nhiên UR-N.

3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa

Theo kết quả phân tích cấu trúc ở trên, ulvan chiết nước từ rong lục Ulva

reticulata (UR-N) có cấu trúc mạch chính là disaccharide [→4)-β-D-GlcA(1→4)-α-

L-Rha3S-(1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid glucuronic với Rha bị

sulfate hóa ở vị trí carbon C-3.

Từ cấu trúc của UR-N, chúng tôi thấy rằng có 3 vị trí có thể bị sulfate hóa là

carbon C-2 của rhamnose, carbon C-2 và C-3 của acid glucuronic. Để kiểm tra sự

thay đổi trong cấu trúc của mẫu sulfate hóa UR-S, các phép đo và phân tích phổ IR,

13C-NMR và HSQC đã được sử dụng.

Phổ IR của UR-N và UR-S được đưa ra ở Hình 3.40. So sánh hai phổ này,

cho thấy phổ của UR-S thể hiện sự tăng mạnh cường độ hấp thụ của tín hiệu tại

845-880 cm-1 đặc trưng cho nhóm sulfate ở vị trí axial, đồng thời có sự giảm cường

102

độ hấp thụ của tín hiệu tại ~3261-3370 cm-1 là đặc trưng cho dao động của nhóm

OH.

Hình 3.40. Phổ IR của UR-N (a) và UR-S (b)

Trên phổ 13C-NMR của UR-S (Hình 3.41), xuất hiện tín hiệu mới ứng với độ

chuyển dịch hóa học ở δ77,2 ppm, được gán cho carbon ở vị trí C-2 của rhamnose,

có sự dịch về phía trường thấp hơn so với tín hiệu C-2 của vị trí carbon không thế,

điều đó chứng tỏ mẫu UR-S bị sulfate hóa tại vị trí C-2 của rhamnose.

103

Hình 3.41. Phổ 13C-NMR của UR-N (a) và UR-S (b)

Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b)

104

Trên phổ HSQC của UR-S xuất hiện một số tín hiệu mới và dịch chuyển về

phía trường thấp hơn so với phổ HSQC của UR-N (Hình 3.42), điều này được lý

giải là do có sự tăng thành phần nhóm sulfate trong phân tử ulvan. Quan sát phổ

HSQC của UR-S còn cho thấy, tín hiệu thể hiện sự tương tác giữa C-1/H-1 của

rhamnose bị tách ra; đồng thời có hai tín hiệu mới xuất hiện trên phổ, thể hiện sự

tương tác giữa C-2/H-2 với độ dịch chuyển hóa học δ80,0/3,38 ppm và C-3/H-3 ở

δ76,5/3,67 ppm của acid glucuronic, hơn nữa, cường độ tín hiệu C-2 của rhamnose

tăng lên. Kết hợp với phổ 13C-NMR, chúng tôi có thể kết luận rằng cả 3 vị trí

carbon gồm C-2 của rhamnose và C-2, C-3 của acid glucuronic đã bị sulfate hóa

một phần. Như vậy, kết quả phân tích phổ NMR cũng phù hợp với kết quả phổ IR ở

trên và các nghiên cứu trước [159].

Hình 3.43. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-S (b)

Dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM), có sự khác nhau rất rõ ràng ở cấu trúc

bề mặt giữa mẫu UR-N và UR-S (Hình 3.43). Các phân tử UR-N tạo thành khối có

cấu trúc bề mặt phẳng trong khi UR-S dường như tạo thành các khối tinh thể nhỏ có

hình dạng xác định.

105

Theo kết quả nghiên cứu mà chúng tôi thu được, nhóm sulfate đóng vai trò

quan trọng quyết định dạng cấu trúc của phân tử ulvan. Trong phân tử UR-S, việc

thay thế các nhóm hydroxyl của các đơn vị đường bằng nhóm sulfate có thể dẫn đến

làm thay đổi cấu hình của chuỗi đường do lực đẩy giữa các nhóm sulfate có thể làm

cho cấu trúc phân tử ulvan bị dãn rộng hơn (extended structure) hoặc kém linh động

hơn (rigid structure).

Đánh giá ảnh hưởng của sự sulfate hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan

Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật

kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-S giống như đã thử với mẫu UR-N.

Kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể của 3 hoạt tính gây độc tế bào,

chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định. Trong khi đó hoạt tính chống đông tụ

máu thì tăng đáng kể.

Với mục đích tìm hiểu ảnh hưởng của mức độ sulfate hóa đến hoạt tính

chống đông tụ máu, các dẫn xuất UR-S với hàm lượng sulfate khác nhau đã được

điều chế và được tiến hành đánh giá hoạt tính chống đông tụ máu như được chỉ ra

trong phần Thực nghiệm. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và

UR-S với hàm lượng sulfate khác nhau được đưa ra trên Bảng 3.12, thuốc được

dùng làm chất đối chứng là Aspirin.

Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S

Tên mẫu DS (%) Thời gian đông tụ

máu (phút)

UR-N 17,60 10

UR-S1 21,25 25

UR-S2 25,68 40

UR-S3 30,42 45

UR-S4 33,21 30

UR-S5 35,96 37

Aspirin (đối chứng) 48

106

Kết quả ở bảng trên cho thấy, sự biến tính hóa học bằng cách sulfate hóa mẫu

UR-N đã làm tăng hàm lượng sulfate trong mẫu UR-S đồng thời khả năng chống

đông tụ máu của mẫu ulvan sulfate tăng lên đáng kể so với ulvan tự nhiên, tuy nhiên

chúng tôi không thấy sự phụ thuộc có quy luật của khả năng chống đông tụ máu vào

hàm lượng sulfate. Kết quả này có thể giải thích rằng, còn có những yếu tố khác liên

quan đến khả năng chống đông tụ máu của ulvan như khối lượng phân tử, vị trí

nhóm sulfate… Nghiên cứu [148, 161, 162] đã chỉ ra rằng hoạt tính chống đông tụ

máu của polysaccharide tăng lên khi sulfate hóa là do có sự tăng nhóm mang điện

tích âm và nhóm này có thể liên kết với nhóm mang điện tích dương của chất ức chế

đông tụ máu và do đó làm tăng hoạt tính chống đông tụ máu.

3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa

Sự thay đổi cấu trúc của UR-N sau khi acetyl hóa thành UR-Ac được kiểm

tra bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR.

Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac

107

Phổ 1H- NMR và 13C-NMR của UR-Ac được đưa ra ở Hình 3.44, ta thấy trên

phổ 1H-NMR của UR-Ac xuất hiện píc mới ở độ chuyển dịch hóa học δ2,007 ppm

và phổ 13C-NMR có píc tại δ22,5 ppm, thể hiện sự có mặt của nhóm acetyl CH3-

CO. Như vậy, bằng phổ NMR, chúng tôi khẳng định mẫu UR-N đã bị acetyl hóa.

Hình 3.45. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-Ac (b)

Ảnh SEM (Hình 3.45) cũng thể hiện sự khác nhau rất rõ ràng ở cấu trúc bề

mặt giữa mẫu UR-N và UR-Ac. Cấu trúc bề mặt như các tấm phẳng của UR-N trở

nên xốp hơn với nhiều các lỗ và hốc rỗng lớn.

Đánh giá ảnh hưởng của sự acetyl hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan

Chúng tôi thử 4 hoạt tính gây độc tế bào, chống oxy hóa, kháng vi sinh vật

kiểm định và chống đông tụ máu của mẫu UR-Ac giống như đã thử với mẫu UR-N.

Kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể của cả 4 hoạt tính này. Điều này có

thể được lý giải rằng khi bị acetyl hóa, ulvan được gắn thêm nhóm acetyl là nhóm

không ưa nước, làm phân tử ulvan khó tan trong nước hơn và do vậy không thuận

lợi cho các phản ứng sinh hóa xảy ra.

108

KẾT LUẬN CHUNG

Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả như sau:

1. Đã chiết tách 6 mẫu ulvan từ 2 loài rong lục Ulva lactuca và Ulva

reticulata thu thập ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa bằng 3 quy trình

khác nhau; Đã xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học

của chúng. Kết quả cho thấy, 2 mẫu ulvan có hàm lượng sulfate, acid

uronic và rhamnose cao nhất, có hoạt tính sinh học tốt nhất.

2. Bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý GPC, IR, NMR và MS đã

nghiên cứu thành công cấu trúc hóa học của 4 mẫu ulvan được chiết

tách từ 2 loài rong trên, cụ thể như sau:

Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata: có cấu trúc mạch chính dạng

[→2)--D-GlcA-(1→2)--L-Rha-(1→] và [→2)--L-IdoA-(1→4)--L-

Rha-(1→], phân nhánh ở vị trí C-2 của acid uronic với Rha bị sulfate hóa ở

cả 3 vị trí carbon C-2, C-3 và C-4.

Đây là một ulvan có cấu trúc mới, vì đa số các ulvan chỉ có liên kết 1→4

ở mạch chính, trong khi ulvan này tồn tại liên kết 1→2 ở mạch chính.

Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata: có cấu trúc mạch chính

được cấu thành bởi chuỗi disaccharide dạng A3s [ --D-GlcA-(14)-

-L-Rha3S-(1→] và bị phân nhánh ở vị trí carbon C-2 của acid glucuronic

với nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha.

Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca: có cấu trúc chuỗi disaccharide

chủ yếu dạng A3s [→4)β-D-GlcA-(1→4)α-L-Rha3S-(1→] và phân nhánh

tại vị trí C-3 của rhamnose. Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của Rha.

Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca: có cấu trúc mạch chính chủ

yếu là disaccharide dạng [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và phân

nhánh ở vị trí carbon C-2 của Rha. Ngoài ra, trong phân tử ulvan còn có

lượng nhỏ disaccharide ở dạng liên kết [→4)-β-D-GlcA-(12)-Xyl-(1→],

[→4)-β-D-GlcA-(12)- α-L-Rha-(1→]. Nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3

và C-4 của Rha.

109

Các kết quả nghiên cứu một lần nữa góp phần khẳng định sự phụ thuộc cấu

trúc của ulvan vào vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và phương pháp chiết tách

chúng từ rong.

3. Bằng phương pháp vật lý hiện đại - tán xạ tia X góc nhỏ SAXS, luận

án đã thành công trong việc nghiên cứu cấu trúc không gian của mẫu

ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata UR-N. Kết quả cho thấy

UR-N có cấu trúc không gian dạng hình que với mạch nhánh dài.

4. Đã xây dựng được mô hình cấu trúc phân tử của UR-N dựa trên cấu

trúc hóa học bằng phương pháp mô phỏng.

5. Đã khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến cấu trúc

bề mặt và hoạt tính sinh học của ulvan chiết nước từ rong lục Ulva

reticulata. Kết quả cho thấy:

Sự sulfate hóa làm thay đổi cấu trúc bề mặt của ulvan và không làm tăng

hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính chống oxy hóa và kháng vi sinh vật kiểm

định nhưng làm tăng đáng kể hoạt tính chống đông tụ máu và sự tăng này

không tỷ lệ với mức độ sulfate hóa.

Sự acetyl hóa làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc bề mặt nhưng không làm

tăng các hoạt tính sinh học đã thử nghiệm của ulvan.

110

KIẾN NGHỊ

1. Cấu trúc hóa học của ulvan nói riêng và polysaccharide nói chung là rất phức

tạp, hơn nữa rõ ràng là có mối liên hệ giữa cấu trúc của ulvan và hoạt tính

sinh học của chúng, nhưng cho đến nay mối quan hệ này vẫn chưa được làm

sáng tỏ. Đây là những vấn đề nghiên cứu rất cơ bản, hấp dẫn không chỉ đối với

Việt Nam mà còn ở cả trên thế giới nên cần được tiếp tục nghiên cứu trong thời

gian tới.

2. Ngoài chi Ulva, ở Việt Nam còn có các chi rong lục khác có các đặc điểm cấu

trúc riêng biệt với các hoạt tính sinh học phong phú khác cần tiếp tục được

nghiên cứu để có thể sử dụng nguồn rong biển một cách hiệu quả nhất.

111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Quách Thị Minh Thu, Đặng Vũ Lương, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý và

Thành Thị Thu Thủy (2014). Ulvan từ rong lục ulva reticulata: chiết tách,

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Tạp chí Hóa học, 52 (6A), 158-162.

2. Quach Thi Minh Thu, Nguyen Thi Nu, Đang Vu Luong, Bui Minh Ly, Tran

Thi Thanh Van and Thanh Thi Thu Thuy (2015). Structural characterization of

ulvan from green seaweed Ulva reticulata. Vietnam Journal of Chemistry, 53

(6e1,2), 386-390.

3. Quach Thi Minh Thu, Truong Hai Bang, Nguyen Thi Nu, Đang Vu Luong,

Bui Minh Ly, Tran Thi Thanh Van and Thanh Thi Thu Thuy (2015). Structural

Determination of Ulvan from Green Seaweed Ulva reticulata Collected at

Central Coast of Vietnam. Chemistry Letters, 44 (6), 788-790.

4. Thanh Thi Thu Thuy, Quach Thi Minh Thu, Tran Thi Thanh Van, Dang Vu

Luong, and Nguyen Tien Tai (2015). Ulvan from green seaweed Ulva

reticulata: Extraction and structure. The 13th Japan – Vietnam Joint Seminar,

29-30 October 2015 Kyoto, Japan, 23.

5. Thi Thu Thuy Thanh, Thi Minh Thu Quach, Thi Nu Nguyen, Dang Vu

Luong, Minh Ly Bui and Thi Thanh Van Tran (2016). Structure and cytotoxic

activity of ulvan extracted from green seaweed Ulva lactuca. International

Journal of Biological Macromolecules 93, 695-703.

6. Thanh Thi Thu Thuy, Quach Thi Minh Thu, Nguyen Thi Nu, Dang Vu

Luong, Nguyen Tien Tai, Tran Thi Thanh Van (2016). Structure and biological

activity of sulfated polysaccharide extracted from green seaweed Ulva lactuca.

The 14th Japan-Vietnam Joint Seminar, Hanoi 22th September 2016, 21.

7. Quách Thị Minh Thu, Nguyễn Thị Nụ, Đặng Vũ Lương, Nguyễn Tiến Tài,

Trương Hải Bằng, Trần Thị Thanh Vân, Hồ Đức Cường, Thành Thị Thu Thủy

(2016). Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ulvan chiết tách từ

rong lục Ulva lactuca. Tạp chí Hóa học, 54 (6e2), 75-78.

112

8. Quach Thi Minh Thu, Đang Vu Luong, Nguyen Thi Nu, Tran Thi Thanh Van,

Bui Minh Ly and Thanh Thi Thu Thuy (2016). Effect of sulfation on the

structure and anticoagulant activity of ulvan extracted from green seaweed

Ulva reticulata. Vietnam Journal of Science and Technology, 54 (2C), 373-

379.

9. Thanh T T T, Quach T M T, Nguyen T N, Dang V L, Tran T T V, Bui M L

(2017). Structure and cytotoxicity of the green seaweed originated ulvan. The

17th Asian Chemical Congress, 23-28 July 2017 Melbourne Australia, 332.

10. Thi Thanh Van Tran, Hai Bang Truong, Nguyen Ha Vy Tran, Thi Minh Thu

Quach, Thi Nu Nguyen, Minh Ly Bui, Yoshiaki Yuguchi & Thi Thu Thuy

Thanh (2017). Structure, conformation in aqueous solution and antimicrobial

activity of ulvan extracted from green seaweed Ulva reticulata. Natural Product

Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1408098.

113

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Alves, A.; Sousa, R.A. and Reis, R.L (2013). A practical perspective on ulvan

extracted from green algae. Journal of Applied Phycology, 25 (2), 407-424.

2. Berna Kılınç, Semra Cirik, Gamze Turan, Hatice Tekogul and Edis Koru

(2013). Food Industry, Chapter 31: Seaweeds for Food and Industrial

Applications. Edited by Innocenzo Muzzalupo, published: January 16, 2013

under CC BY 3.0 license.

3. Dennis J. McHugh (2003). A guide to the seaweed industry. Food and

agriculture organization of the united nations. Rome

4. Delattre, C.; Michaud, P.; Keller, C.; Elboutachfaiti, R.; Beven, L.; Courtois,

B.; Courtois, J. (2006). Purification and characterization of a novel

glucuronan lyase from Trichoderma sp. Appl.Microbiol. Biotech., 70, 437–

443.

5. Costa, L.S.; Fidelis, G.P.; Cordeiro, S.L.; Oliveira, R.M.; Sabry, D.A.;

Camara, R.B.G.; Nobre, L.T.D.B.; Costa, M.S.S.P.; Almeida-Lima, J.; Farias,

E.H.C. (2010). Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical

seaweeds. Biomed. Pharmacother., 64, 21–28.

6. Đàm Đức Tiến (2003). Thành phần loài và phân bố của rong biển miền Bắc

Việt Nam. Hội thảo khoa học Đề tài hợp tác Việt Nam-Italia “Bảo tồn đa dạng

sinh học dải ven biển Việt Nam”

7. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2004). Tiềm năng rong biển Việt Nam. Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

8. Gollerbakh, M.M. (1977). Life of Plants in Six Volumes. V.3: Algae. Lichens.

Prosveshchenie, Moscow.

9. Nguyễn Hữu Đại, Nguyễn Thị Đỏ (2007). Thực vật chí Việt Nam. Nhà xuất

bản Khoa học và Kỹ thuật.

10. Ibñez, E.; Cifuentes, A. (2013). Benefits of using algae as natural sources of

functional ingredients. J. Sci.Food Agric., 93, 703–709.

11. Ruperes, P. (2002). Mineral content of edible marine seaweeds. Food

Chemistry, 79, 23-26.

114

12. Hela Yaich, Haikel Garna, Souhail Besbes, Michel Paquot, Christophe

Blecker, Hamadi Attia (2011). Chemical composition and functional

properties of Ulva lactuca seaweed collected in Tunisia. Food Chemistry, 128,

895–901.

13. Lahaye, M.; Robic, A. (2007). Structure and Functional Properties of Ulvan,

a Polysaccharide from Green Seaweeds. Biomacromolecules, 8(6), 1765-

1774.

14. Alves, A.; Caridade, S.G.; Mano, J.F.; Sousa, R.A.; Reis, R.L. (2010).

Extraction and physico-chemical characterization of a versatile

biodegradable polysaccharide obtained from green algae. Carbohydr. Res.,

345, 2194–2200.

15. Harvey, D. J. (2003). Matrix-assisted laser desorption/ionization mass

spectrometry of carbohydrates and glycoconjugates. International Journal of

Mass Spectrometry, 226, 1–35.

16. Alves, A.; Sousa, R.A. and Reis, R.L. (2013). In vitro cytotoxicity assessment

of ulvan, a polysaccharide extracted from green algae. Phytother. Res., 27,

1143–1148.

17. Chiu, Y.H.; Chan, Y.L.; Li, T.L.; Wu, C.J. (2012). Inhibition of Japanese

encephalitis virus infection by the sulfated polysaccharide extracts from Ulva

lactuca. Mar. Biotechnol., 14, 468–478.

18. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung

(2008). Fucoidan từ rong nâu Sargassum swartzii: phương pháp tách, hoạt

tính gây độc tế bào ung thư và nghiên cứu cấu trúc. Tạp chí Hóa học, 46(1),

52-56.

19. Holtkamp A.D.; Kelly S.; Ulber R. and Lang S. (2009). Fucoidan and

fucoidanases-focus on techniques for molecular structure elucidation and

modification of marine polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol, 82, 1-11.

20. Jin W.; Wang J.; Ren S.; Song N. and Zhang Q. (2012). Structural Analysis

of a Heteropolysaccharide from Saccharina japonica by Electrospray Mass

Spectrometry in Tandem with Collision-Induced Dissociation Tandem Mass

Spectrometry (ESI-CID-MS/MS). Mar Drugs., 10(10), 2138-2152.

115

21. Bilan Maria I.; Grachev Alexey A.; Ustuzhanina Nadezhda E. et al (2004). A

highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus

L. Carbonhydr. Res., 339, 511-517.

22. Bilan M.I.; Grachev A.A.; Shashkov A.S.; Kelly M.; Sanderson C.J.;

Nifantiev N.E. and Usov A.I. (2010). Further studies on the composition and

structure of a fucoidan preparation from the brown alga Saccharina

latissima. Carbohydr. Res.,345, 2038–2047.

23. Anastyuk S.D.; Imbs T.I.; Shevchenko N.M.; Dmitrenok P.S. and

Zvyagintseva T.N. (2012). ESI-MS analysis of fucoidan preparations

from Costaria costata, extracted from alga at different life-stages. Carbohydr.

Polym., 90, 993–1002.

24. Anastyuk S.D.; Shevchenko N.M.; Nazarenko E.L.; Imbs T.I.; Dmitrenok P.S.

and Zvyagintseva T.N. (2010). Structural analysis of a highly sulfated fucan

from the brown alga Laminaria cichorioides by tandem MALDI and ESI mass

spectrometry. Carbohydr. Res., 345, 2206–2212.

25. Anastyuk S.D.; Shevchenko N.M.; Nazarenko E.L.; Dmitrenok P.S. and

Zvyagintseva T.N. (2009). Structural analysis of a fucoidan from the brown

alga Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass spectrometry.

Carbohydr. Res., 344, 779–787.

26. Baba M.; Snoeck R.; Pauwels R. and De Clercq E. (1988). Sulfated

polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped

viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis

virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents Chemother.,

32, 1742- 1745

27. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007). Fucoidan – polysaccharide chiết từ

rong nâu, sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, ứng dụng trong y học và nuôi

trồng thủy sản. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45(1), 39-46.

28. Irhimeh M.R.; Fitton J.H. and Lowenthal R.M. (2009). Pilot clinical study to

evaluate the anticoagulant activity of fucoidan. Blood Coagul Fibrinolysis,

20(7), 607-610.

116

29. Maruyama H.; Tamauchi H.; Hashimoto M. and Nakano T. (2003). Antitumor

activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll

of Undaria pinnatifida. In vivo, 17(3), 245-249.

30. Aisa Y.; Miyakawa Y.; Nakazato T.; Shibata H.; Saito K.; Ykeda Y. and

Kizaki M. (2005). Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells

accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK

pathways. Am J. Hematol., 78, 7-14.

31. Nguyễn Xuân Nguyên, Phạm Hồng Hải, Nguyễn Bích Thuỷ, Trần Thị Hồng

và Trần Đình Toại (2003). Nghiên cứu công nghệ chiết tách carrageenan từ

rong đỏ Việt Nam. Tạp chí Khoa học - Công nghệ, 41(5), 6-11.

32. Thanh T.T.T.; Yuguchi Y.; Mimura M.; Yasunaga H.; Takano R.; Urakawa H.

and Kajiwara K. (2002). Molecular characteristics and Gelling Properties of

Carrageenan Family. 1: Preparation of novel carrageenan and dilute solution

properties. Macromolecular Chemistry and Physic, 203, 15-23, ISSN: 0122-

1352.

33. Thanh T.T.T.; Yuguchi Y.; Mimura M.; Yasunaga H.; Takano R.; Urakawa H. and

Kajiwara K. (2010). Structure and Gelling Properties of Carrageenan Family as

Studied by Scattering Techniques. Asian Journal of Chemistry, 22(5), 3989-4002.

34. Tran T.T.V.; Bui M.L. and Ngo Q.B (2002). Infrared spectroscopy of

polysacchrides extracted from some red seaweed species growing in the

central of Viet nam. The 3rd national conference on optics and spectroscopy,

Nhatrang 8.2002.

35. Võ Thị Mai Hương (2003). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, hóa sinh của

một số loại rong đỏ (Rhodophyta) và rong nâu (Phaeophyta) ở vùng đầm phá

và ven biển Thừa Thiên Huế. Luận án tiến sĩ Sinh học

36. Tran T.T.V.; Bui M.L.; Ngo Q.B. and Chu D.K. (2008). Structural

characterization of agar extracted from six red seaweed species growing in

the coast of Viet Nam. Asean J. on Science and Technology for Development,

25(2), 395-403.

37. Mou H.; Jiang X. and Guan H. (2003). A k-carrageenan derived

oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing anti-tumor

activity. J. Appl. Phycol., 15, 297-303.

117

38. Lingchong Wang, Xiangyu Wang, Hao Wu and Rui Liu (2014). Overview on

Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated

Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years. Mar. Drugs., 12,

4984-5020.

39. Tabarsa, M.; Lee, S.J.; You, S.; (2012). Structural analysis of

immunostimulating sulfated polysaccharides from Ulva pertusa. Carbohydr.

Res., 361, 141–147.

40. Quemener, B.; Lahaye, M.; Bobin Dubigeon, C. (1997). Sugar determination

in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion

exchange chromatography. J. Appl. Phycol., 9, 179-188.

41. Chattopadhyay, K.; Mandal, P.; Lerouge, P.; Driouich, A.; Ghosal, P.; Ray,

B.; (2007). Sulphated polysaccharides from Indian samples of Enteromorpha

compressa (Ulvales, Chlorophyta): Isolation and structural features. Food

Chem., 104, 928–935.

42. Ray, B. (2006). Polysaccharides from Enteromorpha compressa: Isolation,

purification and structural features. Carbohydr. Polym., 66, 408–416.

43. Lahaye M.; Jegou J.; and Buleon A. (1994). Chemical characteristics of

insoluble glucans from the cell-wall of the marine green alga Ulva lactuca (L)

Thuret. Carbohydr. Res., 262, 115-125.

44. Ray, B.; Lahaye, M. (1995). Cell-wall polysaccharides from the marine green

alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta): Extraction and chemical

composition. Carbohydr. Res., 274, 251–261.

45. Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Pissoferrato, L.; Liquori, A.M.A. (1999). Physico-

chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the

macroalga Ulva. Int. J. Biol. Macromol., 25, 309–315.

46. Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Chiessi, E.A. (2002). Conformational study on the

algal polysaccharide ulvan. Macromolecules, 35, 6404–6411.

47. Robic, A.; Gaillard, C.; Sassi, J.F.; Lerat, Y.; Lahaye, M. (2009).

Ultrastructure of ulvan: A polysaccharide from green seaweeds. Biopolymers,

91, 652–664.

118

48. Dobrynin A.V. (2008). Theory and simulations of charged polymers: From

solution properties to polymeric nanomaterials. Current Opinion in Colloid &

Interface Science, 13, 376–388.

49. Robic A.; Sassi J.-F.; Lahaye M. (2008). Impact of stabilization treatments of

the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the

physico-chemical and rheological properties of ulvan. Carbohydrate

Polymers, 74, 344–352

50. Sun, H.H.; Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y. (2007). Polysaccharides from

marine green seaweed Ulva species and their characteristics. Agro Food Ind.

Hi-Tech., 18, 28–29.

51. Haug, A., Nilsson, N. H., Romming, C., Schaumburg, K., Vialle, J. &

Anthonsen, T. (1976). The influence of borate and calcium on the gel

formation of a sulfated polysaccharide from Ulva lactuca. Acta Chem

Scand B., 30, 562–566.

52. Wijesekara, I.; Pangestuti, R.; Kim, S.K. (2011). Biological activities and

potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine

algae. Carbohydr. Polym., 84, 14–21.

53. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Hu, R.G.; Zhang, K.; Li, Z. (2006). In

vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of

polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta). Bioorg. Med.

Chem. Lett., 16, 2441–2445.

54. Godard, M.; Decorde, K.; Ventura, E.; Soteras, G.; Baccou, J.C.; Cristol, J.P.;

Rouanet, J.M. (2009). Polysaccharides from the green alga Ulva rigida

improve the antioxidant status and prevent fatty streak lesions in the high

cholesterol fed hamster, an animal model of nutritionally-induced

atherosclerosis. Food Chem., 115, 176–180.

55. Zhang, H.J.; Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y.; Sun, H.H.; Chen, Y.; Qi, X.H.

(2008). Chemical characteristics and anticoagulant activities of a sulfated

polysaccharide and its fragments from Monostroma latissimum. Carbohydrate

Polymers, 71, 428–434.

56. Kaeffer B.; Benard C.; Lahaye M.; Blottiere H. M. and Cherbut C (1999).

Biological Properties of Ulvan, a New Source of Green Seaweed Sulfated

119

Polysaccharides, on Cultured Normal and Cancerous Colonic Epithelial

Cells. Planta Med., 65, 527-531.

57. Leiro, J.M.; Castro, R.; Arranz, J.A.; Lamas, J. (2007). Immunomodulating

activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva

rigida C. Agardh. Int. Immunopharmacol., 7, 879–888.

58. Pengzhan, Y.; Ning, L.; Xiguang, L.; Gefei, Z.; Quanbin, Z.; Pengcheng, L.

(2003). Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated

polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacol. Res. Offic. J.

Ital. Pharmacol. Soc., 48, 543–549.

59. Yu, P.Z.; Zhang, Q.B.; Li, N.; Xu, Z.H.; Wang, Y.M.; Li, Z.E. (2003).

Polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta) and preliminary studies on

their antihyperlipidemia activity. J. Appl. Phycol., 15, 21–27.

60. Yu, P.Z.; Li, N.; Liu, X.G.; Zhou, G.F.; Zhang, Q.B.; Li, P.C. (2003).

Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated

polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacol.Res., 48, 543–

549.

61. Song, H.; Zhang, Q.; Zhang, Z.; Wang, J. (2010). In vitro antioxidant activity

of polysaccharides extracted from Bryopsis plumosa. Carbohydrate Polymers,

80, 1057–1061.

62. Zhang, Z.; Wang, F.; Wang, X.; Liu, X.; Hou, Y.; Zhang, Q. (2010).

Extraction of the polysaccharides from five algae and their potential

antioxidant activity in vitro. Carbohydrate Polymers, 82, 118–121.

63. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Chen, R.; Zhang, H.; Niu, X.Z.; Li, Z.

(2005). Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of

polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro. Int. J.

Biol. Macromol., 37, 195–199.

64. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Hu, R.G.; Zhang, K.; Li, Z. (2006). In

vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of

polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta). Bioorg. Med.

Chem. Lett., 16, 2441–2445.

120

65. Qi, H.M.; Zhao, T.T.; Zhang, Q.B.; Li, Z.; Zhao, Z.Q.; Xing, R. (2005).

Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides

from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta). J. Appl.Phycol., 17, 527–534.

66. Shao, P.; Chen, M.; Pei, Y.; Sun, P. (2013). In intro antioxidant activities of

different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata.

Int. J. Biol. Macromol., 59, 295–300.

67. Shonima Govindan M, JiJi Thomas and G Muraleedhara Kurup (2012). In

vitro antioxidant and antitumor activity of Polysaccharide isolated from Ulva

fasciata. Int J Pharm Bio Sci July., 3(3), 238 – 246.

68. Mezghani, S.; Bourguiba, I.; Hfaiedh, I.; Amri, M. (2013). Antioxidant

potential of Ulva rigida extracts: protection of heLa cells against H2O2

cytotoxicity. Biol. Bull., 225, 1–7.

69. Matsubara, K.; Matsuura, Y.; Bacic, A.; Liao, M.L.; Hori, K.; Miyazawa, K.

(2001). Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a

marine green alga, Codium cylindricum. Int. J.Biol. Macromol., 28, 395–399.

70. Shanmugam, M.; Mody, K.H.; Siddhanta, A.K. (2001). Blood anticoagulant

sulphated polysaccharides of the marine green algae Codium dwarkense

(Boergs.) and C. tomentosum (Huds.) Stackh. Indian J. Exp. Biol., 39, 365–

370.

71. Robic, A.; Rondeau-Mouro, C.; Sassi, J.F.; Lerat, Y.; Lahaye, M. (2009).

Structure and interactions of ulvan in the cell wall of the marine green algae

Ulva rotundata (Ulvales, Chlorophyceae). Carbohydr. Polym., 77, 206–216.

72. Gurgel Rodrigues, J.A.; Lino de Queiroz, I.N.; Gomes Quindere, A.L.; Vairo,

B.C.; Souza Mourao, P.A.; Barros Benevides, N.M. (2011). An antithrombin-

dependent sulfated polysaccharide isolated from the green alga Caulerpa

cupressoides has in vivo anti- and prothrombotic effects. Cienc. Rural., 41,

634–639.

73. Qi, X.; Mao, W.; Chen, Y.; Chen, Y.; Zhao, C.; Li, N.; Wang, C. (2013).

Chemical characteristics and anticoagulant activities of two sulfated

polysaccharides from Enteromorpha linza (Chlorophyta). J. Ocean Univ.

China., 12, 175–182.

121

74. Qi, X.; Mao, W.; Gao, Y.; Chen, Y.; Chen, Y.; Zhao, C.; Li, N.; Wang, C.;

Yan, M.; Lin, C.; et al (2012). Chemical characteristic of an anticoagulant-

active sulfated polysaccharide from Enteromorpha clathrata. Carbohydrate

Polymers, 90, 1804–1810.

75. Gurgel Rodrigues, J.A.; Oliveira Vanderlei, E.D.S.; Bessa, E.F.; Magalhaes,

F.D.A.; Monteiro de Paula, R.C.; Lima, V.; Barros Benevides, N.M. (2011).

Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide isolated from the green

seaweed Caulerpa cupressoides. Braz. Arch. Biol. Technol., 54, 691–700.

76. Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y.; Qi, X.H.; Sun, H.H.; Chen, Y.; Guo, S.D.

(2008). Heparinoid-active two sulfated polysaccharides isolated from marine

green algae Monostroma nitidum. Carbohydrate Polymers, 74, 834–839.

77. Maeda, R.; Ida, T.; Inara, H.; Sakamoto, T. (2012). Immunostimulatory

activity of polysaccharides isolated from Caulerpa lentillifera on macrophage

cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 501–505.

78. Shao, P.; Chen, X.; Sun, P. (2013). In vitro antioxidant and antitumor

activities of different sulfated polysaccharides isolated from three algae. Int. J.

Biol. Macromol., 62, 155–161.

79. Ahmed, O.M. and Ahmed, R.R. (2014). Anti-proliferative and apoptotic

efficacies of ulvan polysaccharides against different types of carcinoma cells

In Vitro and In Vivo. Cancer Science & Therapy, 6(6), 202-208.

80. Gurgel Rodrigues, J.A.; Oliveira Vanderlei, E.D.S.; Silva, L.M.; de Araujo,

I.W.; de Queiroz, I.N.; de Paula, G.A.; Abreu, T.M.; Ribeiro, N.A.; Bezerra,

M.M.; Chaves, H.V.; et al (2012). Antinociceptive and anti-inflammatory

activities of a sulfated polysaccharide isolated from the green seaweed

Caulerpa cupressoides. Pharmacol. Rep., 64, 282–292.

81. Kim, J.K.; Cho, M.L.; Karnjanapratum, S.; Shin, I.S.; You, S.G. (2011). In

vitro and in vivo immunomodulatory activity of sulfated polysaccharides from

Enteromorpha prolifera. Int. J. Biol.Macromol., 49, 1051–1058.

82. Hassan, S.; Abd El-Twab, S.; Hetta, M.; Mahmoud, B. (2011). Improvement of

lipid profile and antioxidant of hypercholesterolemic albino rats by

polysaccharides extracted from the green alga Ulva lactuca Linnaeus. Saudi J.

Biologic. Sci., 18, 333–340.

122

83. Qi, H.; Huang, L.; Liu, X.; Liu, D.; Zhang, Q.; Liu, S. (2012).

Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of

polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta).

Carbohydr.Polym., 87, 1637–1640.

84. Qi, H.; Liu, X.; Zhang, J.; Duan, Y.; Wang, X.; Zhang, Q. (2012). Synthesis

and antihyperlipidemic activity of acetylated derivative of ulvan from Ulva

pertusa. Int. J. Biol. Macromol., 50, 270–272.

85. Sathivel, A.; Raghavendran, H.R.B.; Srinivasan, P.; Devaki, T. (2008). Anti-

peroxidative and anti-hyperlipidemic nature of Ulva lactuca crude

polysaccharide on D-Galactosamine induced hepatitis in rats. Food Chem.

Toxicol., 46, 3262–3267.

86. Komatsu, T.; Kido, N.; Sugiyama, T.; Yokochi, T. (2013). Antiviral activity of

acidic polysaccharides from Coccomyxa gloeobotrydiformi, a green alga,

against an in vitro human influenza A virus infection. Immunopharmacol.

Immunotoxicol, 35, 1–7.

87. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Hayashi, T.; Sankawa, U.; Maeda, M. (1999). Antiviral

activities against HSV-1, HCMV, and HIV-1 of rhamnan sulfate from

Monostroma latissimum. Planta Med., 65, 439–441.

88. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Maeda, M.; Hayashi, T. (2004). Antiherpetic activities

of sulfated polysaccharides from green algae. Planta Med., 70, 813–817.

89. Lee, J.B.; Koizumi, S.; Hayashi, K.; Hayashi, T. (2010). Structure of rhamnan

sulfate from the green alga Monostroma nitidum and its anti-herpetic effect.

Carbohydrate Polymers, 81, 572–577.

90. Ghosh, P.; Adhikari, U.; Ghosal, P.K.; Pujol, C.A.; Carlucci, M.J.; Damonte,

E.B.; Ray, B. (2004). In vitro anti-herpetic activity of sulfated polysaccharide

fractions from Caulerpa racemosa. Phytochemistry, 65, 3151–3157.

91. Pujol, C.A.; Ray, S.; Ray, B.; Damonte, E.B. (2012). Antiviral activity against

dengue virus of diverse classes of algal sulfated polysaccharides. Int. J. Biol.

Macromol., 51, 412–416.

92. Margret, R.J.; Kumaresan, S.; Ravikumar, S. (2009). A preliminary study on

the anti-inflammatory activity of methanol extract of Ulva lactuca in rat. J.

Environ. Biol., 30, 899–902.

123

93. Pires, C.L.; Rodrigues, S.D.; Bristot, D.; Gaeta, H.H.; Toyama, D.d.O.; Lobo

Farias, W.R.; Toyama, M.H. (2013). Sulfated polysaccharide extracted of the

green algae Caulerpa racemosa increase the enzymatic activity and paw

edema induced by sPLA2 from Crotalus durissus terrificus venom. Rev. Bra.

Farm. Braz. J. Pharm., 23, 635–643.

94. Pusey P. N. (1974). In Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy,

(H. Z. Cummings and E. R. Pike, eds.). Plenum Press, New York, 387-428.

95. Robic A.D.; Bertrand J.F.; Sassi Y.; Lerat M.; Lahaye J. (2009).

Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall

polysaccharide from Ulva spp. (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and

chemometrics. J. Appl. Phycol., 21, 451-456.

96. Masakuni Tako, Makie Tamanaha, Yoshiyuki Tamashiro, Shuntoku Uechi

(2015). Structure of Ulvan Isolated from the Edible Green Seaweed, Ulva

pertusa. Advances in Bioscience and Biotechnology, 6, 645-655

97. Lahaye Marc, Brunel Magali, Bonnin Estelle (1997). Fine chemical structure

analysis of oligosaccharides produced by an ulvan-lyase degradation of the

water-soluble cell-wall polysaccharides from Ulva sp. (Ulvales,

Chlorophyta). Carbohydrate Research, 304, 325-333.

98. Nguyễn Duy Nhứt (2008). Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của polysacharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa. Luận án

tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

99. Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Bilan M.I. và Usov

A.I. (2012). Nghiên cứu cấu trúc của Fucoidan tách chiết từ tảo nâu

Sargassum Polycystumn. Tạp chí hóa học, 50(4A), 215 – 218.

100. Hồ Đức Cường (2014). Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học

của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và

Sargassum swartzii của Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Hóa học – Trường Đại học

Bách khoa Hà Nội.

101. Nguyễn Đình Triệu (2001). Các phương pháp phân tích Vật lý và Hóa lý. Nhà

xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

102. Steve W . Cui (2005). Food Carbohydrate: Chemistry, Physical Properties and

Applications, CRC Press.

124

103. Edwin D. Becker (1969). High Resolution NMR. Theory and Chemical

Applications. Academic press, INC.

104. Sanders J.K.M.; Constable E.C.; Hunter B.K. and Pearce C.M (1995). Modern

NMR spectroscopy. Oxford University Press, 78-79.

105. Lahaye M. and Ray B. (1996). Cell-wall polysaccharides from the marine

green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta) - NMR analysis of ulvan

oligosaccharides. Carbohydrate Research, 283, 161-173.

106. Lahaye M.; Inizan F.; Vigouroux J. (1998). NMR analysis of the chemical

structure of ulvan and of ulvan-boron complex formation. Carbohydrate

Polymers, 36, 239-249.

107. Lahaye Marc (1998). NMR spectroscopic characterisation of oligosaccharides

from two Ulva rigida ulvan samples (Ulvales, Chlorophyta) degraded by a

lyase. Carbohydrate Research, 314, 1–12.

108. Dell, A.; Reason, A. J.; Khoo, K.; Panico, M.; McDowell, R. A.; and Morris,

H.R. (1994). Mass spectrometry of carbohydrate-containing biopolymers.

Methods in Enzymology, 230, 108–132.

109. Tissot B.; Salpin J.-Y.; Martinez M.; Gaigeot M.P. and Daniel R. (2006).

Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE-

ESIMS and molecular modeling. Carbohydrate Research, 341(5), 598– 609.

110. Nanditha Billa, Dylan Hubin-Barrows, Tylor Lahren, Lawrence P. Burkhard,

(2014). Evaluation of micro-colorimetric lipid determination method with

samples prepared using sonication and accelerated solvent extraction

methods. Talanta, 119, 620–622.

111. Domon, B.; & Costello, C. E. (1988). A systematic nomenclature for

carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates.

Glycoconjugate Journal, 5(4), 397–409

112. Yoshi aki Yuguchi, Bui Minh Ly, Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van and

Thanh Thi Thu Thuy (2016). Study on Branched Structure Physiological

Activity Relationship of Fucoidan. Chemistry Letter, 45(7), 840–842.

113. Thanh T.T.T.; Tran T.T.V.; Yuguchi Y.; Bui M.L. and Nguyen T.T. (2013).

Structure of Fucoidan from Brown Seaweed Turbinaria ornata as Studied by

125

Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESIMS) and Small Angle X-ray

Scattering (SAXS) Techniques. Mar. Drugs., 11, 2431-2443.

114. Ngô Đăng Nghĩa (1999). Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất

alginate từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng vào một số lĩnh vực sản xuất.

Luận án tiến sĩ - Đại học Thủy Sản Nha Trang.

115. Nguyễn Kim Đức (1991). Biến động hàm lượng acid alginic và chất lượng

natri alginate của loài rong mơ (Sargassum) vùng biển Hn Chồng-Nha Trang.

Tuyển tập Nghiên cứu biển, Viện Nghiên cứu biển, VII, 208-216

116. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung

(2007). Phân lập và đặc điểm của fucoidan từ 5 loài rong mơ Miền Trung.

Tạp chí Hóa học, 45(3), 339-345.

117. Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Nguyễn

Tiến Tài, Đặng Vũ Lương, Chu Đình Kính (2011). Isolation and structure of

alginate extracted from brown seaweed Sargassum swartzii collected at Nha

Trang. Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ 5, 142-143.

118. Phạm Đức Thịnh (2015). Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học

của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang.

Luận án Tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

119. Yoshiaki Yuguchi, Van Thi Thanh Tran, Ly Minh Bui, Shizuka Takebe, Shiho

Suzuki, Nobukazu Nakajima, Shinichi Kitamura, Thuy Thi Thu Thanh

(2016). Primary structure, conformation in aqueous solution, and intestinal

immunomodulating activity of fucoidan from two brown seaweed

species Sargassum crassifolium and Padina australis. Carbohydrate Polymers,

147, 69–78.

120. Thanh T.T.T.; Bui M.L.; Tran T.T.V.; Ngo V.Q.; Ho C.T.; Yue Z.; Carole

S.D.; Bilan M.I.; Usov A.I. (2015). Anti-HIV activity of fucoidans from three

brown seaweed species. Carbohydrate Polymers, 115, 122–128.

121. Trần Vĩnh Thiện (2009). Điều chế khảo sát cấu trúc và tính chất của alginate

và oligosaccharide tách từ rong biển khu vực Bắc Hải Vân và ứng dụng của

chúng. Luận án Tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

126

122. Đặng Ngọc Thanh (chủ biên) và nhiều tác giả (2003). Biển Đông Sinh vật và

sinh thái Biển, Tập IV. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

123. Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Pham Ngoc Son (2007). Use of

Vietnamese seaweed for functional food, medicine and biofertilizer. Journal

Applied Phycology, 19(6), 817-826.

124. Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Hoang Thi Lan Anh (2011). Studies on

the Analgesic and Anti-inflammatory Activities of Sargassum swartzii (Turner)

C. Agardh (Phaeophyta) and Ulva reticulata Forsskal (Chlorophyta) in

Experiment Animal Models. African Journal of Biotechnology, 10(12), 2308-

2313.

125. Brading, J. E.; Georg-Plant, M.T; Hardy, D. (1954). The polysaccharide from

the alga Ulva lactuca. Purification, hydrolysis, and methylation of the

polysaccharide. J. Chem. Soc., 319-324.

126. Percival, E.; Wold, J. K. (1963). The acid polysaccharide from the green

seaweed Ulva lactuca. Part II. The site of the ester sulphate. J. Chem. Soc.,

5459-5468.

127. Costa C.; Alves A.; Pinto P.R.; Sousa R.A.; Silva E.A.; Reis, R.L.; Rodrigues

A.E. (2012). Characterization of ulvan extracts to assess the effect of different

steps in the extraction procedure. Carbohydrate Polymers, 88, 537–546.

128. Wenjun Mao, Xiaoxue Zang, Yi Li, Huijuan Zhang (2006). Sulfated

polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their

anticoagulant activity. Journal of Applied Phycology, 18(1), 9-14.

129. Dalia F. Abd Elmegeed, Doa A. Gharee, Muhammed Elsayed and Muhammad

El-Saadani (2014). Phytochemical constituents and bioscreening activities of

green algae (Ulva lactuca). International Journal of Agricultural Policy and

Research, 2(11), 373-378.

130. Quanbin Zhang, Zhongshan Zhang, FengWang, Xiaomei Wanga, Xiaolei

Liud, Yun Houb, (2010). Extraction of the polysaccharides from ve algae

and their potential antioxidant activity in vitro. Carbohydrate Polymers, 82,

118–121.

131. Hela Yaich, Haikel Garna, Souhail Besbes, Jean-Paul Barthélemy, Michel

Paquot, Christophe Blecker, Hamadi Attia (2014). Impact of extraction

127

procedures on the chemical, rheological and textural properties of ulvan from

Ulva lactuca of Tunisia coast. Food Hydrocolloids, 40, 53-63.

132. Mao, W.; Zang, X.; Li, Y.; Zhang, H. (2006). Sulfated polysaccharides from

marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity. J. Appl.

Phycol., 18, 9–14.

133. Qi, H.; Liu, X.; Ma, J.; Zhang, Q.; Li, Z. (2010). In intro antioxidant activity

of acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa

(Cholorophta). J. Med. Plants Res., 4, 2445–2451.

134. Qi, H.; Liu, X.; Wang, K.; Liu, D.; Huang, L.; Liu, S.; Zhang, Q. (2013).

Subchronic toxicity study of ulvan from Ulva pertusa (Chlorophyta) in Wistar

rats. Food Chem Toxicol., 62, 573–578.

135. You, S.G.; Tabarsa, M.; Han, J.H.; Kim, C.Y. (2012). Molecular

characteristics and immunomodulatory activities of water-soluble sulfated

polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Medicinal Food, 15(2), 135–

144.

136. Hanaa H.; Baky A.El.; Baz K.F.El and Batory G. S.El. (2009). Potential

biological properties of sulfated polysaccharides extracted from macroalgae

Ulva lactuca L. Academic Journal of Cancer Research, 2(1), 1-11.

137. AOAC International (1996). Official Methods of Analysis of the Association of

Official Analytical Chemists. 16th edition, Gaithersburg, USA.

138. Blig, EB.; Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and

purification. Can. J. Biochem., 37, 911-917.

139. Michel Dubois, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers P.A, and Fred Smith,

(1956). Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related

Substances. Anal. Chem., 28, 350-356.

140. Fujiwara-Arasaki T.; Mino N.; Kuroda M. (1984). The protein value in human

nutrition of edible marine algae in Japan. Hydrobiologia, 116-117(1), 513-

516

141. Tang Yu-Qing, Kaiser Mahmood, Ruqyia Shehzadi, Muhammad Furqan

Ashraf (2016). Ulva Lactuca and Its Polysaccharides: Food and Biomedical

Aspects. Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 6(1), 140-151.

128

142. Monks A.; Scudiero D.; Skehan P.; Shoemake R.; Paull K.; Vistica D.; Hose

C.; Langley J.; Cronise P.; Campbell H.; Mayo J.; Boyd M. (1991). Feasibility

of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human

tumor cell lines. Journal of National Cancer Institute, 83(11), 757-766.

143. Anderson, L.O.; Barrowcliffe, T.W.; Holmer, E.; Johnson, E.A.; and Sims,

G.E.C. (1976). Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity

chromatography on matrix-bound antithrombin-3 and by gel-filtration.

Thromb. Res., 9, 575–580.

144. Vanden B.D.A. and Vlietinck A.J. (1991). Methods in plant Biochemistry:

Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants.

Academic Press, London., 6, 47-69.

145. Prieto, P.; Pineda, M.; Anguilar, M. (1999). Spectrophotometric quantitation

of antioxidant capacity through the formation of a Phosphomolybdenum

Complex: Specific application to the determination of Vitamin E. Anal.

Biochem., 269, 337-341

146. Zhu, Q.Y.; Hackman, R.M.; Ensunsa, J.L.; Holt, R.R.; Keen, C.L. (2002).

Antioxidative activities of oolong tea. J. Agric Food Chem., 50, 6929–6934.

147. Phạm Thành Hổ (2006). Di truyền học, NXB Giáo dục.

148. Dodgson K.S. (1961). Determination of inorganic sulphate in studies on the

enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate

esters. Biochem J., 78, 312-319.

149. Bitter, T.; Muir H.M. (1962). A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction.

Anal Biochem., 4, 330-334.

150. Bilan, M.I.; Vinogradova, E.V.; Shashkov, A.S.; Usov, A.I. (2007). Structure

of a highly pyruvylated galactan sulfate from the pacific green alga Codium

yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta). Carbohydrate Research, 342, 586–596.

151. Thanh Thi Thu Thuy (2002). Structure of sulfated polysaccharide in aquarius

solution. Doctoral Thesis.

152. Lihong Fan, Lan Jiang, Yongmei Xu, Yue Zhou, Yuan Shen, Weiguo Xie,

Zhongheng Long, Jinping Zhou (2011). Synthesis and anticoagulant activity

of sodium alginate sulfates. Carbohydrate Polymers, 83(4), 1797–1803.

129

153. Xiao-xiao Liu, Zhen-jiang Wan, Lin Shi, Xiao-xia Lu (2011). Preparation and

antiherpetic activities of chemically modified polysaccharides from

Polygonatum cyrtonema Hua. Carbohydrate Polymers, 83, 737–742.

154. Zhang Zhongshan, Wang Xiaomei, Yu Shuchi, Yin Li, Zhao Mingxing, Han

Zhiping (2011). Synthesized oversulfated and acetylated derivatives of

polysaccharide extractedfrom Enteromorpha linza and their potential

antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules, 49,

1012– 1015.

155. Luis A. Bello-Pérez, Edith Agama-Acevedo, Paul B. Zamudio-Flores,

Guadalupe Mendez-Montealvo, Sandra L. Rodriguez-Ambriz (2010). Effect of

low and high acetylation degree in the morphological, physicochemical and

structural characteristics of barley starch. Food Science and Technology, 43,

1434-1440.

156. Ciancia, M.; Alberghina, J.; Ximena Arata, P.; Benavides, H.; Leliaert, F.;

Verbruggen, H.; Manuel Estevez, J. (2012). Characterization of cell wall

polysaccharides of the coencocytic green seaweed Byropsis plumose

(Bropsidaceae, Chlorophyta) from the Argentine cost. J. Phycol., 48, 326–335.

157. Ciancia, M; Quintana, I; Vizcarguenaga, M.I.; Kasulin, L.; de Dios, A.;

Estevez, J.M.; Cerezo, A.S. (2007). Polysaccharides from the green seaweeds

Codium fragile and C. vermilara with controversial effects on hemostasis. Int.

J. Biol. Macromol., 41, 641–649.

158. Yaich H, Garna H, Besbes S, Barthélemy J P, Paquot M, Blecker C, Attia H.

(2014). Impact of extraction procedures on the chemical, rheological and

textural properties of ulvan from Ulva lactuca of Tunisia coast. Food

Hydrocolloids, 40, 53-63.

159. Wang, X.; Zhang, Z.; Yao, Z.; Zhao, M.; Qi, H. (2013). Sulfation,

anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algae

Enteromorpha linza. Int. J. Biol. Macromol., 58, 225–230.

160. Camila F. B., Jorge A. G., Paulo A. S. M., Hugo V. (2007). Conformation of

sulfated galactan and sulfated fucan in aqueous solutions. Implications to

their anticoagulant activities. Journal of Molecular Graphics and Modelling,

6, 391-399.

130

161. Melo F.R, Pereira M.S, Foguel D, Mour P.A. (2004). Antithrombin-mediated

anticoagulant activity of sulfated polysaccharides different mechanisms for

heparin and sulfated galactans. J Biol Chem., 279, 20824–20835.

162. Santos Pereira Costa, M.S.; Costa, L.S.; Cordeiro, S.L.; Almeida-Lima, J.;

Dantas-Santos, N.; Magalhaes, K.D.; Sabry, D.A.; Lopes Albuquerque, I.R.;

Pereira, M.R.; et al (2012). Evaluating the possible anticoagulant and

antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga

Caulerpa cupressoides var. flabellata. J. Appl. Phycol., 24, 1159–1167.

163. Mao, W.; Li, H.; Li, Y.; Zhang, H.; Qi, X.; Sun, H.; Chen, Y.; Guo, S. (2009).

Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated

polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorophyta). Int. J.

Biol. Macromol., 44, 70–74.

164. Debye, P. (1915). Scattering from non-crystalline substances. Annalen der

Physik, 46, 809-823.

131

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UR-N

Phụ lục 2. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-H

Phụ lục 3. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-N

Phụ lục 4. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-K

Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của UR-H

Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của UR-H

Phụ lục 7. Phổ COSY-NMR của UR-H

Phụ lục 8. Phổ HMBC-NMR của UR-H

Phụ lục 9. Phổ HSQC-NMR của UR-H

Phụ lục 10. Phổ ESI-MS của UR-H

Phụ lục 11. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 của UR-H

Phụ lục 12. Phổ COSY-NMR của UR-N

Phụ lục 13. Phổ HSQC-NMR của UR-H

Phụ lục 14. Phổ HMBC-NMR của UR-N

Phụ lục 15. Phổ ESI-MS của UR-N

Phụ lục 16. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 của UR-N

Phụ lục 17. Phổ 1H-NMR của UL-N

Phụ lục 18. Phổ 13C-NMR của UL-N

Phụ lục 19. Phổ COSY-NMR của UL-N

Phụ lục 20. Phổ HSQC-NMR của UL-N

Phụ lục 21. Phổ HMBC-NMR của UL-N

Phụ lục 22. Phổ ESI-MS của UL-N

Phụ lục 23. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3]- với m/z 243 của UL-N

Phụ lục 24. Sắc ký đồ GPC của UL-H

Phụ lục 25. Phổ COSY-NMR của UL-H

Phụ lục 26. Phổ HSQC-NMR của UL-H

Phụ lục 27. Phổ HMBC-NMR của UL-H

Phụ lục 28. Phổ 13C-NMR của UR-S3

Phụ lục 29. Phổ COSY-NMR của UR-S

Phụ lục 30. Phổ 1H-NMR của UR-Ac

Phụ lục 31. Phổ 13C-NMR của UR-Ac

Phụ lục 32. Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư a) HepG2, b)

MCF7 và c) Hela của ulvan UL-N với các nồng độ khác nhau.