Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của

một số loài thực vật

Nguyễn Thị Thúy Anh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quang Huy

Năm báo vệ: 2011

Abstract. Tổng quan về Bệnh sâu răng và cơ chế gây bệnh sâu răng; Vi khuẩn

Streptococcus mutans và khả năng gây bệnh sâu răng; Các biện pháp phòng ngừa sâu

răng; Hợp chất thứ cấp trong thực vật. Trình bày nguyên liệu và phương pháp nghiên

cứu: Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị mẫu tế bào; Chiết rút các hợp chất tự nhiên trong

dịch chiết thực vật; Nghiên cứu định tính các thành phần một số hợp chất tự nhiên có

trong dịch chiết thực vật; Phân tách các thành phần các chất trong dịch chiết thực vật;

Xác định tính kháng khuẩn sâu răng bằng phương pháp đục lỗ; Xác định mức độ sinh axit

của vi khuẩn bằng thí nghiệm giảm pH; Xác định mức độ sống sót của vi khuẩn… Đưa ra

kết quả nghiên cứu: Nghiên cứu sàng lọc một số cây thuốc có khả năng kháng khuẩn sâu

răng; Phân tích một số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Lấu Ba

Vì và cây xoài

Keywords. Khả năng kháng khuẩn; Sâu răng; Thực vật; Vi khuẩn; Dịch chiết thực vật

Content

Mở đầu

Sâu răng là bệnh rất phổ biến trên thế giới, ở mọi lứa tuổi, mọi tầng lớp xã hội. Bệnh

sâu răng có tỷ lệ mắc cao trong cộng đồng, việc điều trị sâu răng tốn kém cho cá nhân và

xã hội cả về kinh phí cũng như thời gian. Bệnh sâu răng được Tổ chức Y tế thế giới

(WHO) và nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm.

Bệnh sâu răng từng được xem là một trong ba mối nguy hại cho sức khỏe con

người sau bệnh tim mạch và ung thư, chính vì thế cho đến nay, bệnh sâu săng vẫn là nỗi

lo mà bất cứ ai cũng không thể xem thường. Theo số liệu điều tra của Viện Răng Hàm

Mặt Trung Ương năm 2003, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng,

trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng. Nguyên nhân chính gây bệnh sâu

răng là do các vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn nhóm Streptococci có mặt trong mảng bám

răng sinh axit gây ăn mòn men răng.

Cách tốt nhất để phòng chống bệnh sâu răng là vệ sinh răng miệng thường xuyên

và đúng cách cùng với hạn chế các đồ ăn có nhiều đường. Các sản phẩm bảo vệ răng

miệng sử dụng thường được bổ sung các chất kháng khuẩn như fluor, axit yếu, peroxit

hydro, muối kim loại. Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các chất kháng khuẩn như fluor,

axit yếu… đều mang lại những hậu quả không mong muốn. Hiện nay, việc tìm kiếm các

hợp chất mới có tác dụng bảo vệ răng, đặc biệt là những hợp chất từ thiên nhiên đang thu

hút được sự quan tâm của cả các nhà khoa học và các doanh nghiệp.

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú và đa dạng,

trong đó có nhiều loài có chứa các hợp chất có hoạt tính cao, đã được sử dụng trong việc

chữa bệnh. Ở Việt Nam, việc tìm kiếm các hợp chất từ thiên nhiên đã được chú ý, tuy

nhiên chưa mang lại hiệu quả như mong đợi, nhiều nghiên cứu được ứng dụng thực tiễn

còn hạn chế. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về

răng, đặc biệt là sâu răng, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả

năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật”.

Với đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn sâu răng S. mutans, ở Việt Nam cũng có một

số công trình nghiên cứu về cây Sao Đen, Sắn thuyền, Kim ngân, Sài đất [9, 10]. Để bổ

sung nguồn dữ liệu khoa học về cây thuốc Việt Nam, chúng tôi lựa chọn một số cây

thuốc khác có tính kháng khuẩn trên cơ sở tài liệu Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam

của Đỗ Tất Lợi [11]. Đồng thời, lựa chọn thêm một số cây thuốc chưa được nghiên cứu

nhưng thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian để chữa bệnh sâu răng. Các cây

thuốc trong đề tài này gồm có: Duối (Streblus asper); Húng quế (Ocimum basilicum L.);

Lấu Ba Vì (Psychotria baviensis); Lược vàng (Callisi fragrans L.); Xoan (Melia

azedarach L.); Xoài (Mangifera indica L.).

2. Nguyên liệu và phương pháp

2.1. Nguyên liệu

2.1.1. Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS5, là quà tặng của giáo sư Robert

Marquis, Đại học Rochester, Mỹ.

Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans 74, phân lập từ các mẫu bệnh phẩm người

Việt Nam lấy tại Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội. Chủng S. mutans

74 hiện đang được giữ và bảo quản tại phòng thí nghiệm Enzym học và Phân tích hoạt

tính Sinh học, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein.

2.1.2. Mẫu thực vật trong nghiên cứu

Các mẫu thực vật Cau, Ruối, Xoan, Xoài được thu thập từ tỉnh Hải Phòng.

Mẫu Lược vàng, Húng quế được thu thập ở tỉnh Hưng Yên.

Mẫu Chè, Ngũ sắc, Lấu Ba Vì được thu thập ở Chương Mỹ, Hà Nội.

Các mẫu thực vật được xác định tên bởi TS. Nguyễn Trung Thành, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội.

Nguyên liệu thực vật sau khi thu thập về, được rửa sạch, sấy khô, sau đó được

nghiền thành bột mịn và ngâm chiết trong các dung môi nghiên cứu với tỷ lệ 1g nguyên

liệu: 10 thể tích dung môi.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị mẫu tế bào

Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên môi thạch tryptic soy agar (TSA) và cấy

chuyển 2 tuần một lần, giữ ở 4oC.

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 37oC trong môi trường TY (tryptone 3%, cao nấm

men 0,5%) có bổ sung glucose 1%; thời gian nuôi cấy từ 12-14 giờ. Tế bào vi khuẩn

được thu lại bằng ly tâm, sau đó hòa tan lại trong muối khoáng (KCl 50mM, MgCl2

1mM).

Mẫu vi khuẩn được lưu giữ lâu dài ở -80oC trong glycerol 50%.

2.2.2. Chiết rút các hợp chất tự nhiên trong dịch chiết thực vật

Các mẫu được chuẩn bị theo phương pháp chiết ngâm. Các mẫu thực vật được rửa

sạch sấy khô, nghiền nhỏ, sau đó chiết trong nước hay dung môi ethanol 96o

theo tỷ lệ

1:10 (1g nguyên liệu: 10ml dung môi). Sau khi chiết xong được ly tâm bỏ cặn.

2.2.3. Phân tách các thành phần các chất trong dịch chiết thực vật

Phương pháp sắc kí bản mỏng được sử dụng để phân tách các thành phần trong

dịch chiết. Sắc ký lớp mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck). Dịch chiết thực vật được tiến hành chạy sắc ký bản mỏng 1 chiều

(7x13cm) với hệ dung môi TEAF (Toluen: ethylacetat: axeton: axit formic 5:3:1:1), phát

hiện sắc ký đồ trong điều kiện ánh sáng thường khi không phun thuốc thử và có phun

thuốc thử đặc trưng là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi

hơ nóng trên bề mặt bếp điện từ từ đến khi hiện màu. Từ màu sắc của sắc ký đồ cho phép

xác định sự có mặt của các chất trong dịch chiết.

2.2.4. Xác định tính kháng khuẩn sâu răng bằng phương pháp đục lỗ

Dịch chiết, sau khi được phân tách bằng sắc kí sẽ được thu lại một số băng vạch,

hòa tan trong methanol, ly tâm thu dịch trong, loại bỏ cặn. Vi khuẩn S.mutans được cấy

trải trên môi trường thạch TSA. Sau đó, các đĩa thạch được đục lỗ, mỗi lỗ bổ sung vào

0,25ml dịch chiết. Nuôi vi khuẩn trong tủ ấm 37oC qua đêm. Quan sát vòng kháng khuẩn.

2.2.5. Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng thí nghiệm giảm pH

Tế bào vi khuẩn sau khi nuôi cấy được hòa lại trong dung dịch muối khoáng 1x

sao cho mật độ cuối cùng tương đương A700 = 10. pH của huyền dịch tế bào được chỉnh

đến 7,2 bằng NaOH 0,1N. Glucose được bổ sung sao cho nồng độ cuối cùng là 1%, đảm

bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân. Sự giảm pH của môi trường

được theo dõi bằng máy pH meter tại những thời điểm nhất định. Độ giảm pH của môi

trường phản ánh khả năng sinh axit của tế bào.

2.2.6. Xác định mức độ sống sót của vi khuẩn

Xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn được tiến hành theo phương pháp

của Phan và cộng sự [15]. Tế bào vi khuẩn được rửa và hòa tan trong dung dịch peptone

1% sao cho mật độ tế bào cuối cùng tương đương A700 = 1 (khoảng 109

tế bào/ml). Các

chất được bổ sung để đạt nồng độ cuối cùng mong muốn. Hút 100l dịch tế bào ra pha

loãng trong peptone 1% theo các nồng độ nhỏ dần 10 lần và được cấy trải trên đĩa thạch

TSA. Các đĩa thạch được cất ở 37oC cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt và có thể

đếm bằng mắt thường.

Tác dụng gây chết của dịch chiết được đánh giá bằng giá trị D, là thời gian cần

thiết để 50% quần thể vi khuẩn bị giết chết. Tác dụng này được đánh giá bằng giá trị

LogN/N0 với N0 là số vi khuẩn ban đầu, N là số vi khuẩn tại thời điểm nghiên cứu. Giá trị

D tương ứng với LogN/N0 = -1/2.

2.2.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của dịch chiết lên khả năng hình thành

biofilm của vi khuẩn

Nguyên tắc: trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và môi trường nuôi cấy tĩnh trên một

bề mặt giá thể các chủng vi sinh vật hình thành biofilm trên bề mặt giá thể. Phát hiện,

quan sát biofilm bằng cách nhuộm với tím kết tinh – là chất có khả năng bắt màu với tế

bào vi khuẩn.

Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [50].

Các chủng vi khuẩn được lắc kích hoạt trong bình tam giác chứa môi trường TYG

trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào đo ở bước sóng 620nm ở vào khoảng 0,2- 0,3.

Hút 100µl dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung vào 700µl TYG lỏng trong các ống effendorf

đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC trong 24 giờ.

Ống đối chứng được bổ sung thêm H2O cùng lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Đối với các ống effendorf nghiên cứu tác dụng của dịch chiết thì dịch chiết được

bổ sung cùng lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn.

Sau 48 giờ các màng nổi và dịch nuôi cấy được loại bỏ cẩn thận ra khỏi các ống

effendorf. Quan sát khả năng hình thành biofilm: Mỗi ống effendorf được rửa sạch 2 lần

bằng nước cất khử trùng. Bổ sung vào mỗi ống effendorf 1ml dung dịch tím tinh thể 1%

và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm và quan sát sự bắt màu

của các tế bào bám trên trên thành ống với tím kết tinh.

Định lượng mức độ tạo biofilm: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng

các tinh thể tím bám trên thành effendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế

bào trong biofilm được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 570nm.

2.2.8. Phương pháp xác định hoạt độ một số enzym quan trọng của vi khuẩn gây

bệnh sâu răng

2.2.8.1. Chuẩn bị tế bào thấm

Tế bào được nuôi qua đêm được rửa 1 lần bằng dung dịch muối khoáng 1x (50mM

KCl, 1mM MgCl2) và được hòa lại trong đệm Tris– HCl 50mM, pH 7,5 có bổ sung 1mM

MgCl2, 50mM KCl sao cho mật độ tế bào tương đương OD700 = 14. Dung dịch tế bào này

được chia đều vào các ống falcon (5ml/ống), bổ sung thêm 10% toluen, trộn mạnh bằng

máy Vortex. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37oC bằng bể ổn nhiệt trong 5 phút rồi chuyển

sang làm đông đá bằng nitơ lỏng trong 1 phút. Lặp lại pha làm ấm và đông đá tế bào 2

lần. Cuối cùng, dung dịch tế bào được ủ ở 37oC cho tới khi tan đá hoàn toàn. Loại bỏ

toluen dư bằng ly tâm và rửa lại 2 lần với dung dịch muối khoáng 1x. Hòa kết tủa tế bào

trở lại trong đệm Tris– HCl pH 7,5 với thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu.

Việc xử lý tế bào với toluen kết hợp với việc chuyển tế bào qua các pha ấm và pha

đông đá có tác dụng làm tổn thương cục bộ màng tế bào, làm cho tế bào có thể thấm được

các chất có khối lượng phân tử lớn hơn nhưng không làm tổn thương các enzym trên

màng. Vì vậy, dịch tế bào được chuẩn bị theo phương pháp này gọi là dịch tế bào thấm,

được sử dụng trong các thiết bị thí nghiệm với enzym.

2.2.9. Phương pháp xác định phổ hồng ngoại của hợp chất

Các dịch chiết nghiên cứu được phân tách bằng sắc ký bản mỏng để phân tách

thành các phân đoạn khác nhau. Sau đó những phân đoạn nào có hoạt tính mạnh nhất

được xác định phổ hấp thụ hồng ngoại.

Sử dụng máy quang phổ hồng ngoại, máy làm việc ở miền bức xạ hồng ngoại, vê

nguyên lý cũng giống như máy quang phổ hấp thụ khác.

Phân đoạn dịch chiết sau khi chạy sắc ký bản mỏng, được cạo, hòa tan trở lại trong

methanol. Ly tâm 2 lần thu dịch trong, thấm đều phân đoạn dịch chiết lên chất nền KBr

rồi đưa vào máy xác định phổ hấp thụ. Phổ hồng ngoại được đo trên máy quang phổ hồng

ngoại FTIR, khoa Công nghệ Hóa học và Môi trường, Đại học Sư Phạm Kỹ thuật Hưng

Yên.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số cây thuốc có khả năng kháng khuẩn sâu răng

3.1.1. Khả năng ức chế sự sinh axit từ dịch chiết một số cây thuốc

Bảng 1. So sánh tác dụng của dịch chiết thực vật chiết trong H2O hoặc ethanol lên

sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 với nồng độ 10% (v/v)

STT

Tên dịch chiết

Giá trị pH cuối cùng

Chiết bằng ethanol Chiết bằng nước

1 LVL 5,51 4,80

2 HUN 5,42 4,98

3 LAU 6,12 4,45

4 DUL 5,06 4,87

5 LVT 4,94 4,88

6 XOA 5,08 5,19

7 Lx 5,87 4,45

8 Tx 5,78 5,17

Kết quả bảng 1 cho thấy dịch chiết trong các cây thuốc trong ethanol có tác dụng

ức chế sự sinh axit của vi khuẩn mạnh hơn so với mẫu cùng loại được chiết trong nước.

Điều này chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 hòa

tan tốt trong ethanol, mặt khác dịch chiết ethanol cũng thuận lợi hơn cho việc tách chiết

[10]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn ethanol cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các dịch chiết cây thuốc lên sự sinh axit

của vi khuẩn S. mutans 74 được trình bày trong hình 4.

Hình 4. Ảnh hưởng dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của vi khuẩn S.mutans 74

Trong môi trường không bổ sung dịch chiết các cây thuốc, pH của huyền dịch tế

bào giảm nhanh (mẫu đối chứng trong ethanol và trong nước), trong khi ở các mẫu có bổ

sung dịch chiết vào huyền dịch tế bào làm cho sản xuất axit của vi khuẩn S. mutans 74 đã

bị ức chế thể hiện qua sự giảm pH chậm lại. Sau 90 phút thí nghiệm, kết quả cho thấy ở

mẫu đối chứng (ĐC), pH cuối cùng đều nằm trong khoảng 4,0 - 4,6 và ít có sự khác biệt

giữa mẫu đối chứng nước hay ethanol. Trong khi ở các mẫu có bổ sung dịch chiết thực

vật thì pH cuối cùng cao hơn, với giá trị tương ứng là từ 4,9 đến 6,2.

Trong các mẫu dịch chiết thực vật được làm thí nghiệm, dịch chiết cây Lấu Ba Vì

(LAU) và cây Xoài (Tx, Lx) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất. Giá trị pH

giảm của hai mẫu này cho thấy dịch chiết từ xoài và Lấu Ba Vì đã làm chậm tốc độ giảm

pH của môi trường, giá trị pH cuối cùng sau 90 phút thí nghiệm là đối với dịch chiết thân

xoài là 5,78, dịch chiết lá xoài là 5,87 và đối với dịch chiết lá cây Lấu Ba Vì là 6,12. Vì

vậy, chúng tôi lựa chọn dịch chiết lá xoài, thân xoài và dịch chiết cây Lấu Ba Vì để tiếp

tục nghiên cứu.

3.1.2. Khả năng diệt S. mutans bởi dịch chiết một số thực vật

3.1.2.1. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 4,0

Thí nghiệm được tiến hành ở pH 4,0, giá trị pH bắt đầu gây mòn men răng. Đây là

môi trường mà vi khuẩn S. mutans có khả năng sinh trưởng tốt, trong khi các chủng vi

khuẩn khác kém phát triển [23].

Hình 6. Khả năng giết vi khuẩn S.mutans của các dịch chiết tại pH 4,0

Kết quả ở hình 6 cho thấy, với nồng độ 15%, thời gian 90% quần thể tế bào vi

khuẩn bị giết chết tương ứng với giá trị logN/No= -1 lần lượt là hơn 13 phút đối với dịch

chiết thân xoài và với dịch chiết lá xoài là 19 phút. Đối với dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì

(LAU), 50% quần thể tế bào bị giết sau khoảng 20 phút xử lý. So sánh với các kết quả

nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố về dịch chiết một số nguồn thực vật

khác như từ vỏ quả măng cụt [18], vỏ sao đen và lá sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn của dịch chiết thân xoài và lá xoài là cao hơn.

3.1.2.2. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 7,0

Giá trị pH 7,0 là giá trị pH trung tính trong khoang miệng và được chúng tôi tiến

hành thử nghiệm với các dịch chiết. Kết quả cho thấy ở pH 7,0, các dịch chiết cũng có tác

dụng diệt vi khuẩn S. mutans. Tuy nhiên, so với khả năng diệt khuẩn ở pH 4,0 thì khả

năng giết vi khuẩn ở pH 7,0 thấp hơn với cùng một nồng độ dịch chiết. Thời gian để diệt

50% số lượng tế bào trong quần thể vi khuẩn S. mutans 74 đối với dịch chiết từ lá cây

Lấu Ba Vì từ 23 đến 25 phút. Còn với dịch chiết thân xoài, lá xoài lần lượt là 23 phút và

25 phút thì 90% số lượng tế bào trong quần thể bị tiêu diệt (Hình 7).

So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự

[10, 11] cho thấy dịch chiết ethanol từ lá xoài, thân xoài và lá cây Lấu Ba Vì đều có khả

năng giết S. mutans 74 thấp hơn so với dịch chiết từ cây Sao đen hay sắn thuyền. Tuy

nhiên, đây là kết quả nghiên cứu trên đối tượng là vi khuẩn S. mutans 74, chủng vi khuẩn

được phân lập từ người Việt Nam.

Hình 7. Khả năng giết vi khuẩn S. mutans 74 của các dịch chiết tại pH 7,0

3.1.3. Khả năng kết hợp dịch chiết với một số chất bảo vệ răng miệng thông qua khả

năng ức chế sự sinh axit

3.1.3.1. Kết hợp với NaF

Dịch chiết được sử dụng ở nồng độ có tác dụng mạnh nhất là 15% (v/v) phối hợp

với NaF nồng độ cuối cùng 0,25mM (Theo nghiên cứu trước đây của Phan và cộng sự)

[15]. Nồng độ này thấp hơn nhiều lần so với nồng độ fluor được sử dụng trong các sản

phẩm bảo vệ răng miệng thông thường. Khả năng kết hợp giữa dịch chiết với NaF lên vi

khuẩn S. mutans phân lập từ người Việt Nam được đánh giá qua khả năng ức chế sinh

sinh axit của chủng vi khuẩn.

Hình 8. Tác dụng của dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với NaF lên sự

sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74

Sau 90 phút thí nghiệm được trình bày ở hình 8, pH ở mẫu đối chứng giảm xuống

còn 4,08. NaF ở nồng độ 0,25mM có tác dụng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn

nghiên cứu nhưng ở mức độ thấp, đạt 5,05. Trong khi đó, khi phối hợp dịch chiết cây

xoài với NaF, hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của vi khuẩn cao hơn khi sử dụng dịch

chiết ở dạng riêng lẻ, giá trị pH ở hai mẫu nghiên cứu (thân và lá xoài kết hợp với NaF)

đều đạt trên 7, với cây Lấu Ba Vì đạt 6,75. Điều này chứng tỏ tác dụng của NaF và dịch

chiết có tác dụng cộng gộp, làm tăng khả năng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn S.

mutans.

3.1.3.2. Kết hợp với H2O2

Trong nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy H2O2 có tác dụng mạnh lên nhiều quá

trình sinh lý của vi khuẩn sâu răng, mặt khác H2O2 cũng được sử dụng trong các sản

phẩm nước súc miệng, do vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính của các dịch chiết

cây thuốc kết hợp với H2O2 với nồng độ cuối cùng trong dịch nuôi cấy là 0,3mM. Kết

quả được thể hiện trong hình 9.

Hình 9. Tác dụng của dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với H2O2 lên sự

sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74

Kết quả trình bày ở hình 9 cho thấy sau 90 phút đối với mẫu đối chứng H2O có pH

là 4,09, mẫu bổ sung H2O2 có pH cuối cùng là 4,37. Các mẫu có bổ sung dịch lá xoài,

thân xoài và Lấu Ba Vì với H2O2 thì giá trị pH cuối cùng của các mẫu thí nghiệm lần lượt

là 6,28; 6,49; và 6,58. Như vậy, các mẫu có bổ sung dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì với

H2O2 thì hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn so với mẫu chỉ có dịch

chiết riêng lẻ.

3.1.4. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết

Tiến hành nhuộm màng biofilm bằng dung dịch tím kết tinh, có thể dễ dàng quan

sát được khả năng hình thành biofilm của chủng vi khuẩn khi không có tác dụng của dịch

nghiên cứu so với mẫu thí nghiệm có bổ sung dịch chiết thân và lá xoài. Các tế bào trên

biofilm sẽ bắt màu tím với thuốc nhuộm, sự bắt màu càng đậm chứng tỏ mật độ tế bào ở

biofilm càng nhiều.

(a) (b)

Hình 10. Sự hình thành biofilm của chủng S.mutans 74

(a) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài

1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ

sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài

(b) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì

1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung

dịch chiết Lấu Ba Vì

1 2 3

Hình 11. Sự hình thành biofilm cuả chủng S. mutans GS-5

(a) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài

1.Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ

sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài

(b) Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì

1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung

dịch chiết Lấu Ba Vì

Quan sát kết quả nhuộm biofilm trên hình 10 và hình 11, bước đầu chúng ta có thể

rút ra nhận xét rằng dịch chiết thân xoài, lá xoài và Lấu Ba Vì đã có tác dụng làm giảm

khả năng hình thành biofilm của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu thể hiện ở việc ống

effendorf có bổ sung dịch chiết có sự bắt màu với thuốc nhuộm ít hơn so với ống đối

chứng chỉ bổ sung dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, đây mới chỉ là các kết quả

nghiên cứu bước đầu về khả năng tạo thành và ức chế sự tạo thành biofilm của các chủng

vi khuẩn gây sâu răng trên giá thể là ống nhựa (ống effendorf).

Để định lượng được mật độ tế bào trong biofilm hình thành, chúng tôi tiến hành đo

độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 570nm. Giá trị OD570 phản ánh mật độ tế bào tồn tại

trong biofilm, thông qua giá trị này chúng ta có thể đánh giá được khả năng hình thành

biofilm của các chủng vi khuẩn cũng như việc ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch

chiết nghiên cứu.

1 2 3

(a) (b)

Hình 12. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans 74 của

dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b)

Kết quả trên cho chúng ta thấy dịch chiết của các mẫu nghiên cứu đã có tác dụng

ức chế sự hình thành biofilm đối với chủng S. mutans 74 thể hiện ở giá trị OD570 giảm so

với giá trị OD570 đối chứng (hình 12).

Đối với chủng S. mutans GS-5, kết quả cho thấy sự hình thành biofilm có phần

yếu hơn so với chủng S. mutans 74. Tuy nhiên, đối với các mẫu có bổ sung dịch chiết vẫn

cho thấy có sự ức chế hình thành biofilm (hình 13).

(a) (b)

Hình 13. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans GS-5 của

dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b).

3.1.5. Phân tách các hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng

Bước tiếp theo, chúng tôi phân tách các hợp chất bằng phương pháp sắc kí lớp

mỏng. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [10] cho thấy hệ

dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho khả năng tách chiết các hợp chất thứ cấp trong dịch

chiết thực vật là tốt. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho

thí nghiệm sắc kí bản mỏng với các dịch chiết.

Từ dịch chiết bằng ethanol qua sắc ký bản mỏng với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) chúng

tôi nhận thấy lá xoài có 7 phân đoạn (hình 14c), nhiều phân đoạn hơn dịch chiết thân xoài

4 phân đoạn (hình 14b). Trong các băng vạch xuất hiện trong dịch chiết lá và thân xoài

băng có hệ số Rf = 0,57 thấy xuất hiện ở cả lá và thân xoài, ký hiệu là M5.

(a) (b) (c)

Hình 14. Ảnh sắc ký bản mỏng từ dịch chiết Lấu Ba Vì (a), thân xoài (b), lá xoài (c).

Từ các phân đoạn sắc ký bản mỏng thu được, chúng tôi tiến hành đánh giá kiểm

tra hoạt tính ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci từ các phân đoạn tách từ bản

sắc ký (hình 14). Các phân đoạn tách từ bản sắc ký lá, vỏ xoài và Lấu Ba Vì đều có tác

dụng ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci ở các mức độ khác nhau. Trong đó

thấy phân đoạn M5 (có hệ số Rf = 0,57) có hoạt tính mạnh nhất ức chế sự phát triển của

cả chủng vi khuẩn S. mutans GS-5, cũng như chủng S. mutans 74 phân lập từ người Việt

Nam (hình 15). Tuy nhiên, vì lượng tách chiết chưa nhiều nên việc đánh giá mới là bước

đầu, cần có các thí nghiệm để thu hồi được lượng mẫu từ các phân đoạn lớn hơn.

(a) (b)

Hình 15. Khả năng ức chế sự phát triển của S. mutans GS-5 (a), S. mutans 74

(b) cuả dịch chiết lá xoài

(a) (b)

Hình 16. Khả năng ức chế sự phát triển của S. mutans GS-5 (a), S. mutans 74 (b) cuả

dịch chiết Lấu Ba Vì

Kết quả trên cũng cho thấy dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì có 2 phân đoạn có hoạt

tính kháng khuẩn mạnh nhất đối với chủng S. mutans từ người Việt Nam đó là phân đoạn

2 và 5 tương ứng với Rf là 0,78 và 0,98; Các phân đoạn này cũng có tác dụng đối với

chủng chuẩn S. mutans GS5.

Kết quả này sẽ là cơ sở để tiến hành xác định các hợp chất có tác dụng diệt vi

khuẩn sâu răng S. mutans trong dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài cho các nghiên

cứu tiếp theo.

3.1.6. Nghiên cứu tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết lên một số enzym của S.

mutans

Các phân đoạn thu được từ sắc lý lớp mỏng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất

được sử dụng cho nghiên cứu sự ảnh hưởng lên các enzym của vi khuẩn S. mutans. Với

dịch chiết cây Lấu Ba Vì, phân đoạn có hoạt tính mạnh nhất là phân đoạn có Rf= 0,98,

dịch chiết lá xoài và thân xoài đều có phân đoạn có Rf= 0,57 có hoạt tính mạnh nhất.

3.1.6.1. Ảnh hưởng lên enzym ATPase

ATPase là enzym trên màng tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình vận

chuyển proton qua màng, do đó đây là enzym có vai trò quyết định khả năng chịu axit

của vi khuẩn sâu răng.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phân đoạn M5 có tác dụng ức chế hoạt tính của

enzym ATPase. Ngay tại nồng độ thấp là 2,5%, khoảng gần 50% hoạt tính enzym đã bị

ức chế đối với chủng S. mutans 74. Tác dụng ức chế enzym ATPase của phân đoạn này

giải thích được một phần tác dụng diệt vi khuẩn S.mutans tại giá trị pH axit của dịch

chiết thân và lá xoài.

(a) (b)

Hình 17. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch

chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ ATPase của S. mutans 74

3.1.6.2. Ảnh hưởng lên enzym NADH oxidase

NADH oxidase chịu trách nhiệm chính cho quá trình hô hấp của vi khuẩn gây sâu

răng. Kết quả thu được về sự ức chế enzyme dưới hình 18.

(a) (b)

Hình 18. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch

chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ NADH oxidase của S. mutans 74

So sánh về khả năng ức chế enzyme NADH oxidase, dịch chiết cây xoài ở nồng độ

2% đã ức chế 50% hoạt độ enzyme, dịch chiết lấu Ba Vì nồng độ 1% ức chế hơn 50%

hoạt độ enzym, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy dịch chiết lá sắn thuyền

và sao đen ở nồng độ 3% ức chế được 50% hoạt độ enzyme này. Như vậy khả năng ức

chế enzyme NADH oxidase của hai dịch chiết nghiên cứu cao hơn kết quả nghiên cứu

trước đây.

Điều này bước đầu giải thích tại sao quá trình sinh axit của tế bào vi khuẩn S.

mutans bị ức chế bởi dịch chiết thân và lá xoài, và dịch chiết cây Lấu Ba Vì.

3.1.6.2. Ảnh hưởng lên enzym phosphoryl hóa đường (PTS)

Hệ thống enzym PTS đóng vai trò chủ yếu trong việc phosphoryl hóa đường từ bên

ngoài vào tế bào chất. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của phân đoạn số 5 dịch chiết lá xoài

và Lấu Ba Vì lên hoạt tính của enzym PTS. Kết quả trên hình 19 cho thấy hợp chất này

với nồng độ dịch chiết lá xoài là 1%, dịch chiết Lấu Ba Vì là 2% đã ức chế 50% hoạt độ

enzyme vận chuyển đường.

(a) (b)

Hình 19. Ảnh hưởng phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài (a), phân đoạn 5 dịch chiết

Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ enzym PTS của S. mutans 74

3.1.7. Phổ hấp thụ hồng ngoại của một số phân đoạn dịch chiết

Để bước đầu tìm hiểu về cấu trúc của những phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn sâu

răng Streptococcus mutans mạnh từ dịch chiết của Lấu Ba Vì và thân, lá xoài, chúng tôi

đã đánh giá qua khả năng hấp thụ bước sóng hồng ngoại.

Hình 20. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài

Nhìn trên kết quả hình 20 ta thấy xuất hiện một số đỉnh hấp thụ hồng ngoại của

phân đoạn 5 dịch chiết lá xoài. Đỉnh hấp thụ bước sóng ở mức độ vừa phải trong khoảng

3200- 3700 cm-1

là vùng hấp thụ của liên kết –OH. Ngoài ra còn xuất hiện đỉnh hấp thụ

mạnh bước sóng trong khoảng 1000- 1500 cm-1

, hấp thụ thấp bước sóng trong khoảng

600 – 1000 cm-1

là vùng hấp thụ của liên kết C=C mạch vòng. Từ những kết quả này có

thể thấy rằng dịch chiết phân đoạn 5 có thể là hợp chất mangiferin, là một loại

polyphenol.

Cấu trúc Mangiferin [66]

Mangiferin [66] được sử dụng trong y học ở nhiều nước trên thế giới như chống

oxy hóa, kháng viêm, kháng virus, tăng cưỡng miễn dịch. Thân xoài chứa mangiferin tới

3%, lá xoài chứa khoảng 1,6% mangiferin. Chất này trong lá xoài là chất chống viêm, nó

còn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương rất mạnh, bảo vệ răng miêng, chống bựa răng

và các mảng phủ quanh chân răng. Mangiferin dễ tan trong nước nóng, để chiết xuất có

thể dùng các dung môi như metylic, etylic, axeton, chloroform, n-butanol [14].

Hình 21. Phổ hấp thụ hồng ngoại của phân đoạn 5 dịch chiết Lấu Ba Vì

Kết quả trên hình 21 cho thấy, phổ hấp thụ của phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì xuất

hiện nhiều đỉnh hấp thụ, chứng tỏ phân tách các phân đoạn chưa sạch, trong phân đoạn 5

còn lẫn một số phân đoạn khác. Tuy nhiên, trong số các đỉnh hấp thụ, có đỉnh hấp thụ

trong khoảng 3200-3600, vùng chứa liên kết – OH, ta cũng có thể kết luận bước đầu phân

đoạn 5 chứa hợp chất polyphenol, để khẳng định cần phải có thêm các kết quả nghiên cứu

sâu hơn.

References :

Tài liệu tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích, (2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (2 tập),

NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

2. Lê Tự Hải, Phạm Thị Thùy Trang, Dương Ngọc Cầm, Trần Văn Thắm, (2010).

“Nghiên cứu tách chiết, xác định thành phần hóa học của hợp chất tanin từ lá

chè xanh và khảo sát tính ức chế ăn mòn kim loại của nó”.

3. Trịnh Đình Hải (2004), “Giáo trình dự phòng sâu răng”, Nhà xuất bản Y học.

4. Trịnh Đình Hải, (2005). “Sâu răng ở người trưởng thành”. Tạp chí Y học Việt

Nam số 1/2005: 7-11.

5. Nguyễn Dương Hồng (1997), “Sâu răng-Răng Hàm Mặt”, Tập 1 Nxb Y học,

pp. 102-199.

6. Lê Thị Thu Hiền, (2010). “Khảo sát tính kháng sinh của chất chiết hành, tỏi,

hẹ, lá móng tay trên vi khuẩn E. coli”, LV-NLN-NN02, Đại học Nông lâm Tp.

Hồ Chí Minh.

7. Nguyễn Như Hiền, Chu Văn Mẫn, (2004), Cơ sở sinh học người, NXB Đại học

Quốc gia Hà Nội.

8. Nguyễn Quang Huy (2008), “Nghiên cứu tác dụng của một số hợp chất thực

vật thứ sinh lên vi khuẩn gây sâu răng”, Luận án tiến sĩ khoa học, pp. 51-52.

9. Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa (2005), “Tìm hiểu

tác dụng chống sâu răng của dịch chiết vỏ cây Sao Đen (Hopea odorata

Roxb)”, Tạp chí Dược học, 45 (350), pp. 13-19.

10. Nguyễn Quang Huy, Ngô Văn Quang, Phạm Văn Kiệm, Phan Tuấn Nghĩa

(2007), “Axít asiatic phân lập từ cây sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep

và tác dụng của nó lên vi khuẩn Streptococcus mutans”, Tạp chí Dược học 47,

pp. 19-22.

11. Đỗ Tất Lợi (1986), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nxb Khoa học

kĩ thuật, Hà Nội.

12. Nguyễn Hoàng Lộc, “Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực

vật”, Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ Sinh học, Đại Học Huế.

13. Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi, (2007), “Điều tra

hợp chất carotenoit trong một số thực vật của Việt Nam”. Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23: 130-134.

14. Đoàn Suy Nghĩ, Nguyễn Thị Thu Thủy, (2009). “Nghiên cứu một số chỉ số

sinh hóa và khả năng kháng khuẩn của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum”.

Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 55: 25 – 32.

15. Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Mai Phương, Robert E. Marquis, (2003), “Cơ

chế tác dụng của peroxithydro lên vi khuẩn gây bệnh sâu răng Streptococcus

mutans”, Tạp chí Sinh học, 25(2A): 104-110.

16. Nguyễn Thị Mai Phương, Bùi Tuyết Ánh (2007), “Điều tra tác dụng kháng vi

khuẩn sâu răng Streptococcus mutans của một số thực vật Việt Nam”, Tạp chí

Dược liệu 12, pp. 19-23.

17. Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Phan Tuấn Nghĩa, Đặng

Minh Phương (2003), “Tác dụng của polyphenol của dịch chiết vỏ măng cụt

(Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans”,

Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, pp. 983-986.

18. Nguyễn Thị Mai Phương, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Thị Ngọc Dao, (2003),

“Tìm hiểu thành phần mảng bám răng của người Việt Nam”, Tap chí Y học

Việt Nam, 8, trang 11-17.

19. “Sinh lý học của răng ”, Nhà xuất bản Trường đại học y Hà Nội, pp. 1-13.

20. Trần Thị Thanh (2006), “Nghiên cứu sự đáp ứng stress ở Streptococcus

mutans”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, pp. 6-14.

21. Trần Thu Thủy (2005), “Sâu răng-bệnh do màng sinh học”, Tài liệu dịch, cập

nhật nha khoa. , Nhà xuất bản Y học thành phố Hồ Chí Minh, pp. 22-26.

22. Trần Văn Trường, Trịnh Đình Hải, Spencer, J. A., Thomson R. K. (2002).

“Điều tra sức khỏe răng miệng toàn quốc ở Việt Nam 1999-2000”. Tạp chí Y

học Việt Nam. 240: 24-28.

Tài liệu Tiếng Anh

23. Aeba T., Fejerskkov Q., (2002), “Dental fluorosis: chemistry and biology”,

Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 13(2), pp.155-170.

24. Beegum, S.J.G.R.J. (2007), “In vitro susceptibility of viridans streptococci to

leaf extracts of Mangifera Indica”, Indian J. Microbiol, 47, pp. 160-163.

25. Belli, W. A., and Marquis, R. E. (1991), “Adaptation of Streptococcus mutans

and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture”, Appl. Environ.

Microbiol. 57: 785-791.

26. Belli W.A., Buckley D.H., Marquis R.E., (1995), “Week acid effects and

fluorid inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5”, Can. J.

Microbiol., 41, pp.785-791.

27. Bender, G.R., Marquis, R. E. (1987), “Membrane ATPase and acid tolerance

of Actinomyces viscosus and Lactobacillus casei”, Appl. Environ. Microbiol.,

53, pp. 2124-2128.

28. Bender, G.R., Sutton, S. V. W., Marquis, R. E. (1986), “Acid tolerance, proton

permeabilities, and membrane ATPase of oral streptococci”, Infect. Immun.,

53, pp. 331-338.

29. Berow, L., Sage, H., Fridovich, I. (1997), “The copper and zinc-containing

superoxise dismutases from E. coli: molecullar and weight stability”, Arch.

Biochem. Biophys. 340: 305-310.

30. Bowen W. H., (1972), “Dental caries”, Archives of Disease in Childhood, 47,

849.

31. Burne, R. A. (1998), “Oral streptococci-products of their environment”, J.

Dent. Res. 77:445–452.

32. Burne, R. A., Marquis, R. E. (2001), “Alkali production by oral bacteria and

protection against dental caries”, FEMS Microbiol. Lett. 193: 1-6.

33. Cabisco, E., Tamart, J., Ros, J. (2000), “Oxidative stress in bacteria and

protein damage by reactive oxygen species”, Inter. Microbiol. 3: 3-8.

34. Cvitkovitch D.G., Boyd D.A., Thevenot T., Hamilton I.R., (1995), “Glucose

transport by a mutant of Streptococcus mutans unable to accumulate sugars via

the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system’, J. Bacteriol, 177, pp.

2251-2258.

35. Cvitkovitch, D. G., Boyd, D. A., Hamilton, I. R. (1995), “Regulation of sugar

transport via the multiple sugar metabolism operon of Streptococcus mutans by

the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system”, J. Bacteriol. 177: 5704–

5706.

36. Dashper, S. G., Reynolds, E. C. (1992), “pH regulation by Streptococcus

mutans”, J. Dent. Res. 71:1159–1165.

37. Frostell G., Keyes P.H., Larson A.H., (1967), “Effect of various sugars and

sugar substitutes on dental caries in Hamsters and Rats”, The journal of

nutrition, 93: pp. 65-76.

38. Griswold, R. A., Chen, M. Y. Y., Burne, R. A. (2004), “Analysis of an

deiminase gene cluster in Streptococcus mutnas UA159”, J. Bacteriol. 186:

1902-1904.

39. Hamilton-Miller, J.M.T. (2001), “Anti-cariogenic properties of tea (Camellia

sinnensis)”, J. Med. Microbiol, 50, pp. 299-302.

40. Hamilton, I. R., Svensater, G. (1998), “Acid-regulated proteins induced by

Streptococcus mutans and other oral bacteria during acid shock”, Oral

Microbiol. Immunol. 13: 292–300.

41. Iwami Y., Abbe K., Takahashi-Abbe S., Yamada T., (1992), “Acid production

by streptococci growing at low pH in a chemostat under anaerobic conditions”,

Oral Microbiol. Immunol, 7, pp. 304-308.

42. Jayaraman, G. C., Burne, R. A. (1995), “DnaK expression in response to heat

shock of Streptococcus mutans”, FEMS Microbiol. Lett. 131: 255–261.

43. Jayaraman, G. C., Penders, J. E., Burne, R. A. (1997), “Transcriptional

analysis of the Streptococcus mutans hrcA, grpE, and dnaK genes and

regulation of expression in response to heat shock and environmental

acidification”, Mol. Microbiol. 25: 329–341.

44. Loesche, W. J. (1985), “Nutrition and dental decay in infants”, Am. J. Clin.

Nutr. 44: 423-435.

45. Loesche, W.J. (1986), “Role of Streptococcus mutans in human dental decay”,

Microbiol. Rev. 50, 353–380.

46. Makimura M., Kobayashi K., Indi J., Sakanaka S., Taguchi T., Otake S.

(1993), “Inhibitory effects of tea catechins on collagenase activity”, J.

Periodontol, 74, pp. 630-636.

47. Marquis R.E., Clock S.A., Mota-Meira M., (2003), “Fluoride and organic

acids as modulators of microbial physiology”, FEMS Microbiol. Rev, 26, pp

493-510.

48. Mormann J.E, Muhlemann H.R., (1981), “Oral starch degradation and its

influence on acid production in human dental plaque”, Caries Res, 15, pp 166-

175.

49. Murchison H., Larrimore S., Hull S., Curtiss R., (1982), “Isolation and

characterization of Streptococcus mutans with altered cellular morphology or

chain length”, Infect Immun, 38(1): pp. 282–291.

50. Paul, D., Cotter, P. D., Hill, C. (2003), “Surviving the Acid Test: Responses of

Gram-Positive Bacteria to Low pH”, Microbiol Mol Biol Rev 67(3): 429–453.

51. Postma, P. W., Lengeler, J. W., Jacobson, G. R. (1993),

“Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria’,

Microbiol. Rev. 57: 543-594.

52. Poole, L.B., Claibome, A. (1986), “Interactions of pyrimidine nucleotide with

redox forms of the flavin-containing NADH peroxidase form from

streptococcus faecalis”, J. Biol. Chem, 261, pp. 14525 – 14533.

53. Smith D. J., Taubman M.A., (1974), “Effects of local immunization with

Streptococcus induction of salivary immunoglobulin a antib experimental

dental caries in Rats”, Infect. Immun, pp. 1079-1091.

54. Sturr, M. G., Marquis, R. E. (1992), “Comparative acid tolerances and

inhibitor sensitivities of isolated F-ATPases of oral lactic acid bacteria’, Appl.

Environ. Microbiol. 58: 2287–2291.

55. Svensater, G., Sjogreen, B., and Hamilton, I. R. (2000), “Multiple stress

responses in Streptococcus mutans and the induction of general and

stressspecific proteins”, Microbiology 146: 107–117.

56. Takami, H., Nakasone, K., Hamad, S., Slade, H. D. (1980), “Biology,

immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans”, Microbiol. Rev. 44:

331–384.

57. Trahan L. (1995), “Xylitol: a review of its action on mutans streptococci and

dental plaque – its clinical significane”, Int. Dent. J., , 45, pp. 77-92.

58. Quivey R.G., Kuhnert W.L., Hahn K., (2000), “Adaptation of oral streptococci

to low pH”, Adv. Microb. Physiol, 42, pp. 240-272.

59. Vadeboncoeur, C., Pelletier, M. (1997), “The phosphoenolpyruvate: sugar

phosphotransferase system of oral streptococci and its role in the control of

sugar metabolism”, FEMS Microbiol. Rev. 19: 187–207.

60. Van Houte, J. (1994), “Role of micro-organisms in caries etiology”, J Dent

Res, 73 (3), pp. 672-681.

61. Wilson, M. (1996), “Susceptibility of oral bacterial biofilms to antimicrobial

agents”, J. Med. Microbiol, 44, pp. 79-87.

62. Wilkins J. C., Homer, K.A., Beighton, D. (2002), “Analysis of Streptococcus

mutans proteins modulated by culture under acidic conditions”, Appl. Environ.

Microbiol. 68: 2382–2390.

63. Wilkins, J. C., Homer, K., Beighton D. (2001), “Altered protein expression of

Streptococcus oralis cultured at low pH revealed by two dimensional gel

electrophoresis”, Appl. Environ. Microbiol. 67: 3396–3405.

64. Xiao J., Z.Y., Liu Y., Li J., Hao Y., Zhou X. (2007), “Effects of Nidus Vespae

extract and chemical fraction on glucosyltranferases, adherence and biofilm

formation of Streptococcus mutans”, Arch. Oral. Biol., 52, pp. 869-875.

Website

65. http://www.nhakhoacongdong.vn

66. http://www.wilipedia.com