BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐

Trần Thị Nhã Uyên

NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT.

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. TRẦN THANH THỦY

TP. Hồ Chí Minh , tháng 7 – năm 2010

MỞ ĐẦU

Lí do chọn đề tài.

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản

của sinh vật mà còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân

tích, công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

mà ngành công nghiệp enzyme đã đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước. Ở Việt Nam, ngành

công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự phát triển. Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn các

enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải quyết ô nhiễm MT…

Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất. Năm 1995, tổng doanh

thu từ enzyme này ở các nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao nhất trong các loại enzyme.

Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược

phẩm, nông nghiệp…Nguồn protease chủ yếu hiện nay thu được từ VSV, đặc biệt là các chủng NS

thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor.

Việc nghiên cứu và phân lập các chủng NS trong tự nhiên để thu nguồn protease mới có giá

trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu. Để thu được nguồn protease mới có giá trị

cần phải phân lập các chủng mới có trong tự nhiên. Một trong những hướng nghiên cứu mà khoa

học đang quan tâm là tìm các chủng VSV mới có đặc tính ưu việt từ RNM. Chính điều kiện sống

khắc nghiệt ở RNM tạo ra nhiều cơ hội tìm thấy các nguồn gen VSV quí hiếm, trong đó có NS sinh

protease.

Ở nước ta, RNM Cần Giờ là nơi HST phong phú, đa dạng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về

đa dạng sinh thái của RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành ở hệ động thực vật. VSV, trong đó NS là

một đối tượng được phân bố rộng rãi và có giá trị kinh tế chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong

thời gian gần đây. NS ở RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu như khả năng chịu đựng được điều

kiện sống khắc nghiệt, khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease. Do RNM Cần

Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn cơ chất cho các chủng NS

sinh các enzyme ngoại bào.

Cho đến hiện nay, các công trình nghiên cứu về NS ở RNM Cần Giờ vẫn còn thưa thớt, trong

đó vẫn chưa có công trình nghiên cứu về khả năng sinh protease của các chủng NS.

Chính vì những lí do trên mà tôi chọn đề tài “Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ

các chủng NS ở RNM Cần Giờ”.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn,

Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ.

Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần

Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease.

Nhiệm vụ của đề tài:

Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.

Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng NS tuyển

chọn.

Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng

NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.

Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. RNM Cần Giờ.

1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ.

1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên.

Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’

kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi

4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43].

Hình 1.1. RNM Cần Giờ [43]

Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Giờ giáp tỉnh Đồng

Nai ở phía Bắc, giáp biển Đông ở phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Tây, giáp tỉnh

Bà Rịa-Vũng Tàu ở phía Đông [43].

RNM Cần Giờ phát triển trên một nền đất đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng

đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn

hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất

nền rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao với một lượng muối cao không có lợi cho

nông nghiệp[17].

Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, không bằng phẳng, phân cắt bởi mạng lưới

sông ngòi uốn khúc. Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có 6 dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng chỉ

ngập vào những tháng có nước lớn (tháng 11, 12) trong năm và 4 dạng còn lại đều ngập triều ở các

mức độ khác nhau [9].

Cần Giờ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió chính là Tây Nam, mùa mưa

bắt đầu muộn và kết thúc sớm hơn so với các địa phương khác trong vùng (từ tháng 5 đến tháng 10),

mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [30]. Nhiệt độ trung bình khoảng 250C - 290C, nhiệt độ

thấp nhất là 18,8oC, cao nhất là 35oC. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7oC [30]. Độ ẩm trung

bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao

động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào

mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói

riêng.

Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển

Đông. Mỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối

tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8.

Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9].

Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo

mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa nằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất

thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của

đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ,

mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường

xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão lẫn xác hữu cơ bán

phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66].

1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ.

RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và

HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng

của biển kế cận và các đợt thủy triều nhờ đó hệ TV nơi đây rất phong phú với trên 150 loài và trở

thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, cá cùng với các ĐV có

xương sống khác. Hệ ĐV cũng rất đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 loài, ĐV thủy sinh

không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có 9 loài

lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú [44].

Chính hệ động thực vật đa dạng ở RNM Cần Giờ trở thành nguồn thức ăn phong phú cho

các VSV bao gồm nấm men, NS, VK và xạ khuẩn. Nhờ vào khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào

như amylase, protease, kitinase, cellulase,…chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,…. có trong xác

động thực vật và giáp xác làm nguồn thức ăn. Và bản thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành

nguồn mùn là lượng thức ăn dồi dào cho hệ TV và các SV phù du.

Trung tâm MERD đã nghiên cứu khu hệ VSV ở RNM thuộc các tỉnh Nam Định và Thái

Bình (2001). Kết quả phân lập được 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn. Nhiều chủng có hoạt

tính enzyme ngoại bào cao, có khả năng sinh KS và phân giải dầu mạnh [13].

Riêng ở RNM Cần Giờ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và xạ khuẩn. Qua

phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ, các nhà khoa học đã phát hiện có vi khuẩn Bacillus

thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi rất cao. Kết quả thí

nghiệm của nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy các chủng VSV này có

khả năng diệt các loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt được 100% ấu trùng

muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex

quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61].

NS ở RNM chiếm số lượng lớn, rất phong phú và đa dạng. Khi lá còn ở trên cây đã có một số

loài nấm sống trên đó, một số chui sâu vào biểu bì, một số sống trên mặt lá. Khi lá rụng xuống, sau

24 giờ ngập nước triều đầu tiên, lá đã bị các VSV phân hủy, lúc đầu là chi Phytophora thuộc lớp

Nấm tảo, rồi đến Fusarium và Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn. Sau tuần thứ 2 và thứ 3, các

nấm tảo nhường chỗ cho các loài VSV khác. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các

hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các

mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid

amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên

bề mặt lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α –

aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine,

cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51].

Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã

chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân

giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm

MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13].

Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó

bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả

Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và

Penicillium (2009) [32].

1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ.

RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong

điều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được

đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven

biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy cacbon, giảm khí CO2,... [51].

RNM có vai trò trong vấn đề giảm ô nhiễm từ chất thải rắn. Trong những năm qua, Trung

tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM đã phát hiện nhiều VSV có khả năng phân giải các chất thải khó

phân hủy có trong nước, làm sạch nước và biến thành thức ăn cho tôm cá. Nhờ đó phát hiện thêm

khả năng ngăn ngừa ô nhiễm môi trường của RNM. Khi có rừng, dưới tán rừng nhiệt độ thấp, lá cây

rụng tạo thành mùn, vi sinh vật hoạt động rất tốt, quá trình phân giải chất hữu cơ diễn ra hiệu quả.

Nhưng khi rừng mất đi thì ánh nắng chiếu thẳng vào, nhiệt độ sẽ tăng cao và thiếu nước vào mùa

khô, làm cho đất phèn tiềm tàng trước được ém sẽ hoạt động trở lại, làm cho đất chua, nhiều acid

[53].

Bên cạnh đó, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, công nghiệp, nông nghiệp cùng với

các hóa chất dư thừa từ nội địa theo sông ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng

thành thức ăn cho hệ SV ở đây và làm trong sạch nước biển [51].

RNM Cần Giờ có vai trò nhất định đối với nền kinh tế. Theo Giáo sư Phan Nguyên Hồng,

hiện nay người dân Việt Nam mới chỉ biết tận dụng một phần rất nhỏ lợi ích từ RNM mang lại. Nếu

biết cách khai thác hợp lý đi đôi với bảo vệ rừng, đây quả thực là một nguồn tài nguyên không phải

quốc gia nào cũng có được [54].

1.2. Đặc điểm của NS sinh protease.

1.2.1. Đặc điểm hình thái.

NS là VSV nhân thực, tế bào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng, vách tế bào cấu tạo chủ

yếu là kitin, có hay không có cellulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp [55].

Sợi nấm có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm thường là một

ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-

5µm, có khi đến 10µm thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi

nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh

có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm khí sinh xù xì như bông. Trên MT đặc và trên

một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển

thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là KL nấm [55].

Hình 1.2. Sợi nấm có vách ngăn [55] Hình 1.3. Sợi nấm không có vách ngăn [55]

Hệ sợi của NS một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng,

một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Những khuẩn ty khí sinh là những lông

tơ màu trắng, mọc thành lớp sợi mềm và dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản

đặc biệt mang bào tử. Màu sắc bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc NS khi già [23].

1.2.2. Cấu tạo của tế bào NS

Thành tế bào NS

Thành tế bào NS có cấu tạo bản mỏng và cấu tạo sợi [7].

Thành tế bào NS dày khoảng 2 μm, nhưng rất chắc chắn [7].

Thành sợi nấm gồm nhiều bản mỏng chồng chất lên nhau nhờ đó mà vững và chịu được sức

ép các chất lỏng và rắn ở bên trong mà không bị rách hay nứt vỡ [7].

Mỗi bản mỏng gồm có phần nền không có cấu tạo đặc biệt, trên phần nền có các sợi nhỏ xếp

sát vào nhau và song song nhau. Điều đặc biệt là các sợi ở một bản mỏng song song với nhau nhưng

các sợi trên hai bản mỏng liên tiếp lại xếp chéo nhau, do đó làm cho vách sợi nấm rất mỏng nhưng

rất vững chắc [7].

Về thành phần hóa học, các hợp chất hóa học có chủ yếu ở vách sợi nấm cũng là những phân

tử có dạng sợi. Thảnh phần quan trọng ở vách sợi nấm là kitin. Một hợp chất gluxit khác cũng phổ

biến ở nhiều NS là glucan. Có thể coi kitin và glucan là khung của vách sợi nấm [7].

Vách sợi nấm không những che chở và bảo vệ, mà còn đảm đương một loạt các chức năng

khác: nhận thức ăn, chế biến thức ăn, thải chất bã, trao đổi khí,….

Để hoàn thành nhiệm vụ đó, ngoài kitin, glucan, còn có hàng rào lipit, protit và một loạt các

enzyme. Ngay trong vách sợi nấm còn có các sản phẩm trao đổi chất khác nhau của sợi nấm, các

chất thải như acid oxalit, acid xitric, các chất độc hại đối với các VSV khác ở xung quanh như các

KS, các độc tố. Mặt ngoài của vách sợi vi nấm còn có phủ chất dính, chất dính này sẵn sàng dính

chặt vào những con amip, những con giun tròn bé tẹo, sau đó các vi nấm này ăn thịt con mồi bằng

cách mọc ra các sợi nấm đặc biệt xuyên qua vỏ con mồi và hút dần các chất dinh dưỡng trong con

mồi [7].

Màng nguyên sinh, chất nguyên sinh.

Chất nguyên sinh là một dung dịch keo, thường trong suốt không màu, luôn chuyển động từ

phần sợi nấm già đến phần non, hoặc từ sợi nấm sinh dưỡng đến các sợi nấm phân hóa làm nhiệm

vụ sinh sản [6].

Chất nguyên sinh được bao bọc bởi màng nguyên sinh. Màng dày trung bình 7.10-3 μm, cấu

tạo chủ yếu bởi các phân tử lipit và protein. Thành phần lipit có thể chiếm tới 40% và protein chiếm

38% trọng lượng khô của màng [6].

Các bào quan.

Mạng lưới nội chất.

Có dạng bọng đài nối liền với màng nhân của tế bào. Người ta cũng tìm thấy mạng nội sinh

chất có dạng bản mỏng đồng tâm dính vào màng chất nguyên sinh hay tự do trong chất nguyên sinh

hoặc dính vào bộ máy Golgi [7].

Bộ máy Golgi

Bộ máy Golgi có dạng một cái túi nhỏ gấp nếp với các bọng nhỏ hình cầu ở xung quang

thành túi. Kiểu cấu tạo bộ máy Golgi này giống như ở các TV bậc cao[7].

Ty thể

Ty thể của tế bào vi nấm tương tự như ty thể của TV và ĐV. Tuy nhiên, số lượng ty thể ở

nấm ít hơn, ty thể dẹt hơn và gồ ghề hơn ở TV [7].

Không bào và các thể ẩn nhập.

Không bào thường có hình cầu, hình trứng. Ở ngọn các sợi nấm hầu như không có không

bào, càng xa phần ngọn, số lượng không bào càng giảm nhưng kích thước càng lớn, ép chặt chất

nguyên sinh và nhân tế bào vào sát thành tế bào.

Dịch không bào thay đổi tùy theo tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào. Dịch không bào chứa

các chất điện giải hòa tan: Na, K…một số chất hữu cơ ở trạng thái hòa tan hoặc trạng thái keo

(protein, glucid,….), các sắc tố và một số vật thể ẩn nhập [7].

Nhân tế bào NS

Nhân tế bào NS nói chung có kích thước rất nhỏ, phần lớn có đường kính 2-3 μm, hình cầu

hoặc hình trứng [6].

Số lượng nhân trong tế bào không ổn định. Ở các sợi nấm ngăn vách số lượng nhân ở mỗi

đoạn sợi nấm giữa 2 vách ngăn có thể là 1,2 hoặc nhiều hơn. Số lượng nhân ở mỗi tế bào còn thay

đổi tùy điều kiện sống [7].

Nhân của tế bào NS là nhân thực. Nhân có vai trò chủ yếu là mang thông tin di truyền chứa

trong ADN, điều khiển tổng hợp các protein đặc trưng ở mỗi loài, điều khiển tổng hợp enzyme, các

hoạt động của enzyme và nhiều hoạt động khác của tế bào [7].

1.2.3. Các hình thức sinh sản.

NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính.

Sinh sản vô tính

Hình thức sinh sản vô tính đơn giản nhất là bằng mẩu sợi: một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất

mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới [23].

Ngoài sinh sản vô tính bằng mẩu sợi, NS còn sinh sản bằng bào tử (bào tử kín, bào tử trần).

Đây là hình thức sinh sản vô tính phổ biến ở NS [23].

Có hai dạng bào tử vô tính là bào tử kín và bào tử trần [23].

Sinh sản hữu tính

Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái có trải qua giai đoạn

giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:

• Tiếp hợp tế bào chất với sự hòa hợp 2 tế bào trần của 2 giao tử.

• Tiếp hợp nhân với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội.

• Giảm phân: giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội)

thành n NST (đơn bội) [55].

1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến ST và hoạt độ protease của NS.

1.2.4.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy, MT lên men và hoạt

động xúc tác các phản ứng sinh hóa trong mỗi tế bào VSV, các phản ứng này chỉ xảy ra ở nhiệt độ

nhất định [18].

Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của NS là từ 2oC đến 5oC, tối ưu từ 22oC đến 27oC và

nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số loài có thể sống

sót ở 0oC và ở 60oC [55].

Để thu protease từ NS, nhiệt độ nuôi cấy được giữ ở 29-31oC trong khoảng thời gian 10-18

giờ, sau đó giảm nhiệt độ xuống 24 -25oC [21].

Với nhiệt độ trung bình là 25,8 oC, RNM Cần Giờ có điều kiện nhiệt độ thuận lợi cho sự phát

triển của NS.

1.2.4.2. Độ ẩm.

Hình 1.4. Bào tử kín [57]

Hình 1.5. Bào tử trần Hình 1.6. Quá trình

tiếp hợp [57]

Mỗi loài NS thích ứng với một khoảng độ ẩm tương đối [6].

Độ ẩm tối ưu để nuôi cấy NS là 50-60%, nếu độ ẩm < 60%, hoạt tính enzyme sẽ giảm [6].

Độ ẩm môi trường cần duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao làm giảm độ thoáng khí

của MT, độ ẩm thấp kìm hãm sự phát triển và sự tạo enzyme của VSV [19], [23].

Trong sản xuất protease, độ ẩm của MT nuôi cấy được duy trì khoảng 50-55% [21].

1.2.4.3. pH

pH ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và khả năng hoạt hóa của VSV, mỗi loài VSV chỉ

thích hợp ở một khoảng pH nhất định [20].

Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở MT acid (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loài

phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967) [57].

pH của MT có ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Nếu giữ pH luôn có giá

trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, VSV sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định

chiếm ưu thế trong MT.

pH của nước biển ở RNM Cần Giờ vào thời điểm thu mẫu là 7,02. pH đất trung bình 5,8-6,5.

Ở tầng mặt, do ảnh hưởng của nước biển, pH có thể cao hơn giá trị trung bình. Nhìn chung pH ở

đây thuận lợi cho sự phát triển của NS.

1.2.4.4. Nguồn dinh dưỡng

NS không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị

dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể ĐV hay TV)

hay hoại sinh trên xác bã hữu cơ. Cũng có một số nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm

TV nhất định [55].

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp

theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Nếu các nguyên tố này hiện

diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn

hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các

đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào [55].

+Ảnh hưởng của nguồn C.

Nguồn C có vai trò quan trọng đối với VSV và là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất

sơ cấp và thứ cấp [18].

NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ,

lipit…Nhiều loại NS còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều

SV khác [6].

Các loài NS thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy

nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác.

Nhiều loài NS thuộc bộ Mucorales chỉ đồng hóa được sacarose sau khi đã thủy phân nó

thành glucose. Trong khi đó, Chaethocladium hesseltinum lại có thể đồng hóa trực tiếp sacarose mà

không cần thủy phân trước [6].

Nguồn C tự nhiên thường được dùng trong nuôi cấy NS là bột mì, bột đậu tương, cám và

nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình tổng hợp protease cũng thay đổi tùy

loài VSV.

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn C thích hợp đối với NS sinh

protease có hoạt lực cao [64]. Các nguồn C có tác dụng đến sự tổng hợp protease của NS có thể theo

thứ tự:

Đối với A. flavus: fructose→ glucose→ sacarose→ ramnose→ manose→ galactose→

arabinora→ lactose.

Đối với A. awamori: fructose→ manit→ sacarose→ arabinose→ manose→ galactose→

lactose.

Đối với A. oryzae: fructose→ sacarose→ maltose→ glucose→ manit→ arabinose→

galactose.

Thảm thực vật dày đặc là nguồn cacbon chủ yếu cho khu hệ NS ở RNM Cần Giờ. Theo

Snedaker (1978), lượng lá rơi của cây RNM ở nam Florida là 10.000 – 14.000 kg khô/ha/năm. Kết

quả nghiên cứu ở rừng đước Cà Mau cho thấy lượng rơi là 9.719,9 kg/ha/năm, riêng lá chiếm

79,71%. Hàng năm rừng đước Cà Mau cung cấp cho hệ sinh thái RNM ở đây 8.400 – 12.000 kg

lá/ha/năm (tính theo trọng lượng khô) (Trí, Hồng, 1984) [13].

+Ảnh hưởng của nguồn N.

Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình ST và ảnh hưởng đặc biệt đến quá trình sinh

protease vì nguồn N đóng vai trò là chất cảm ứng của enzyme này.

NS có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường dùng là pepton,

casein, bột đậu nành, cao nấm men…Trong các nguyên liệu này đều có chứa acid amin tự do. Các

acid amin làm tăng hoặc giảm quá trình tổng hợp protease như cystein kìm hãm khả năng sinh

protease acid của Aspergillus. Khi sử dụng phối hợp nguồn N vô cơ và hữu cơ làm tăng đáng kể quá

trình tổng hợp protease [27].

Đối với một số loài NS như A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus trên MT có các nguồn

N hữu cơ hoạt độ protease acid cao. Trên môi trường Czapek (trong đó NaNO3 được thay bằng

casein) thì hoạt lực protease của NS được tăng lên 3,5 lần. Khi thay tinh bột bằng glucose và bổ

sung pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ enzyme được

nâng cao khi trong MT có đồng thời cả nguồn N hữu cơ và N vô cơ. Cho thêm vào MT có cám mì,

bột đậu tương đã tách chất béo các nguồn N vô cơ và hữu cơ thì hoạt lực protease tăng 22- 74%.

Còn trường hợp dùng các nguồn N vô cơ duy nhất trong MT sẽ dẫn đến ngừng hoạt độ protease nói

chung [64].

Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới hoạt độ enzyme của VSV. Glyxin, alanin, metionin và

lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 từ 6- 9% và

nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Nhiều acid amin có tác dụng ức chế hoạt độ enzyme

như acid glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium tới 60% [62].

RNM Cần Giờ có nguồn N dồi dào từ các xác động thực vật bị phân hủy. Tất cả các mô xốp

được phân huỷ nhanh nhất, còn các hợp chất cellulose và lignin bị phân huỷ cuối cùng. Trong quá

trình phân huỷ, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971).

Năm 1977, Untawale ở Viện Hải dương học Ấn Độ đã nghiên cứu sự biến đổi của các thành phần

hoá học của lá mấm lưỡi đòng (Avicennia officilalis) từ khi còn non cho tới khi lá bị phân huỷ, thấy

hàm lượng protein tăng lên rất cao [13].

+Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng [6].

Photpho: thường chiếm tỉ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của NS. Nguyên tố photpho

tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong tế bào NS: nucleotit,

nucleoprotein…..Photpho còn có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NAD,

FAD…

Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin (cystin, cystein….), lưu huỳnh cũng

có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như CoA, biotin…

Kali: tham gia vào quá trình trao đổi glucid và ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi khác.

Magie: mang tính chất là một cofacto đối với nhiều enzyme. Magie tham gia vào quá trình

hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong tế bào.

Canxi: đóng vai trò là cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào.

Canxi còn ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc không gian ổn định của ribosom, nhân.

Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin của các hệ thống enzyme chuyển vận electron.

1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận protease [19, 25, 64]

1.2.5.1. Nuôi cấy bề mặt.

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại NS thu nhận enzyme do khả năng phát

triển nhanh, mạnh của NS nên ít bị tạp nhiễm. Trong MT này, NS phát triển bao phủ bề mặt hạt chất

dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng MT đã được tiệt trùng, làm ẩm.

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có

bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát

triển của NS. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu

không được thấp hơn 20%. Có thể bổ sung thêm nguồn N vô cơ, N hữu cơ và các chất kích thích ST

như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu.

+ Ưu điểm: chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế

phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và

làm sạch enzyme.

Tốn ít năng lượng. Thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện qui mô gia đình,

trang trại cũng như ở qui mô lớn.

Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng

phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó.

+ Nhược điểm: phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện

tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.

1.2.5.2. Nuôi cấy chìm.

VSV được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh

bột. Chỉ có một số ít giống VSV dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose. Thực tế,

trong một số trường hợp đường hóa sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng. Khi đó đường maltoza

được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt nên dễ dàng cho quá trình

khuấy trộn và sục khí.

Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu: MT dinh

dưỡng, thao tác nuôi cấy…

+ Ưu điểm: dễ cơ khí hóa, tự động hóa, năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất.

Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng VSV đột biến có hoạt độ enzyme cao, lựa chọn tối ưu

thành phần MT, các điều kiện nuôi cấy tối ưu, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện

vệ sinh, vô trùng.

+ Nhược điểm: do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi

enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị

nhiễm hàng loạt gây thiệt hại lớn.

1.2.5.3.Thu nhận protease.

Cho canh trường sau nuôi cấy vào dung dịch muối hoặc dung môi hữu cơ theo tỉ lệ thích hợp,

khuấy đều, lắc trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc ly tâm thu lấy dịch trong. Trong

sản xuất thường dung nước máy để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích MT, tiến hành chiết rút

enzyme trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.

Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV

hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzyme. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng

nhất và khó nhất trong kĩ thuật sản xuất chế phẩm enzyme.

1.3. Protein và protease

1.3.1. Protein.

1.3.1.1. Khái niệm.

Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít

amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide. Các chuỗi này có thể

xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

[63].

Hình 1.7. Hình mô phỏng cấu trúc không gian của myoglobin [63]

1.3.1.2. Cấu trúc của protein

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid

amin. Acid amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl

(-COOH) và cuối cùng là nhóm R quyết định tính chất của acid amin [15].

Hình 1.8. Cấu trúc chung của acid amin.

Có 4 bậc cấu trúc của protein

Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi

polypetide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm

cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của

các acid amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình

tự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide,

từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của

protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và

tính chất của protein [15, 63].

Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi

polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β,

được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những acid amin ở gần nhau [15, 63].

Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phiến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có

hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối

với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -

R trong các mạch polypeptide. Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-),

nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay

những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong

phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện

tích trái dấu [15, 63].

Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu

trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết

hyđro [15].

1.3.1.3. Sự biến tính của protein [29, 63]

Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ học... hay tác

nhân hóa học như acid, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của

protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính

chất của protein so với ban đầu. Đó là hiện tượng biến tính protein. Sau khi bị biến tính, protein

thường có các tính chất sau:

- Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bên trong phân tử protein

- Khả năng giữ nước giảm

- Mất hoạt tính sinh học ban đầu

- Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết

peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease.

- Tăng độ nhớt nội tại

- Mất khả năng kết tinh.

1.3.2. Protease.

1.3.2.1. Khái niệm.

Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit ngắn và cuối cùng

tạo các acid amin và NH3 [20].

protease

Hình 1.9. Sơ đồ cơ chế tác động của protease

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin

[57].

1.3.2.2 Cấu trúc và cơ chế hoạt động của protease.

a. Trung tâm hoạt động của protease [20, 64].

Trong trung tâm hoạt động của protease VSV ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm

còn có một số gốc amino acid khác.

+ Serin protease: chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc

biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.

+ Cysteine protease: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.

+ Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động

mạnh ở pH trung tính.

Trung tâm hoạt động của các protease VSV bao gồm một số gốc amino acid và trong một số

trường hợp còn có cả cofactơ kim loại.

Nhiều tác giả đã nghiên cứu trung tâm hoạt động của các tinh thể protease acid của Rhizopus

chinenis cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở khoảng 20oA. Khe

hở này là phần xúc tác của enzyme. Các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.

Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo

hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide.

Hình 1.10.Cấu trúc một số loại protease [58]

H2N- CH- CO- NH- CH- CO- …- NH- CH- COOH

R1 R2 RX

H2N- CH- COOH + H2N- CH- CO … NH- CH- COOH + H2O

R1 R2 RX

b. Cơ chế hoạt động của protease [20, 64].

Các protease xúc tác phản ứng theo cơ chế chung:

E + S → E-S →E-S’ + P1 → E+P2

E: enzyme, S: cơ chất, E-S: phức chất enzyme-cơ chất, P: sản phẩm.

Theo các tác giả, cơ chế tác dụng của protease của VSV cũng giống với protease serine động

vật, đều tiến hành theo kiểu xúc tác acid- bazơ.

Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ

chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):

Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử

C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.

Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều

ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm

amine để tái sinh lại enzyme.

1.3.2.3. Phân loại protease [19,21].

Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như

cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme.

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để

giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải

phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt

động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease

thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

+ Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Các cystein

protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.

+ Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease

có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

+ Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở VK, NS cũng như các

VSV bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính.

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid : pH 2-4

- Protease trung tính : pH 7-8

- Protease kiềm : pH 9-11

1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng protease từ NS ở RNM.

a. Tình hình nghiên cứu.

Hầu như tất cả phản ứng trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của các enzyme -

chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các nhà

hóa sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các

nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau,

nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng

dụng enzyme trong thực tế [64].

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về protease của NS. Các tác giả M. Kalpana Devi, A.

Rasheedha Banu, G.R. Gnanaprabhal, B.V. Pradeep và M. Palaniswamy đã xác định đặc điểm

protease của Aspergillus niger (2008), Hajji M, Kanoun S, Nasri M và Gharsallah N khảo sát

protease của Aspergillus clavatus (2007), Agarwal D, Patidar P, Banerjee T nghiên cứu khả năng

sinh protease của Penicillium sp.

Từ 1950, khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu NS ở RNM. Ở Macau và Hồng Kông tìm

được 45 loài nấm mới từ RNM (1994). D. M. Alongi, B. F. Clough, A. I. Robertson đã khảo sát khu

hệ NS ở RNM miền Tây Úc (2005).

Chưa có nhiều nghiên cứu về protease từ NS ở RNM. Trên thế giới có công trình nghiên cứu

của G.L. Maria, K.R. Sridhar và N.S. Raviraja về khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số loại

NS (Aspergillus sp, Fusarium sp, Penicillium sp, Trichoderma sp) ở RNM vùng Tây Nam Ấn Độ

(2005), công trình nghiên cứu của K. Kathiresan cũng chứng tỏ khu hệ VSV ở RNM Pichavaram

(thuộc miền Đông Nam Ấn Độ) có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào như kitinase, L-

asparaginase, cellulase, protease, phosphatase (2000).

Ở Việt Nam, nghiên cứu và thu nhận protease từ NS ở RNM là một vấn đề còn bỏ ngỏ. Theo

các công trình nghiên cứu của MERD về các chủng NS ở RNM Nam Định và Thái Bình cho thấy

60% các chủng NS có khả năng sinh protease, trong đó có 21 chủng có hoạt tính protease rất mạnh

được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng [13].

Riêng ở RNM Cần Giờ, kết quả nghiên cứu trên hai chủng Penicillium và Aspergillus của tác

giả Võ Thị Bích Viên cho thấy trong cả ba đợt thu mẫu vào ba thời điểm khác nhau, trên 80% số NS

có khả năng sinh protease [32].

b. Ứng dụng. [21, 25, 64].

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm,

công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…

Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một

phần protein trong thịt. Kết quả làm cho thịt có độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn.

Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong

nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng

rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của VK, NS, TV với tỷ lệ tổng

cộng 1- 2% khối lượng protein cần thủy phân. Ưu điểm của việc thủy phân protein bởi enzyme là

bảo toàn được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch

thủy phân.

Trong chế biến thủy sản: hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn

thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme TV (bromelain và papain) và VSV để rút ngắn thời gian

làm và cải thiện hương vị của nước mắm.

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ

sữa của chúng. Protease từ một số VSV như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng

trong sản xuất phomat . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời

gian trộn, tăng độ dẻo, độ nhuyễn của bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn cho sản phẩm.

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của

bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ

cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn .

Trong công nghiệp da, protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần

protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da

các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc

da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của ĐV.

Hiện nay, việc đưa các protease tách từ VK (B. mesentericus, B. subtilis), NS (A. oryzae, A. flavus)

và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả

và dần dần chiếm một vị trí quan trọng .

Trong công nghiệp dệt: protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để

sợi được được bóng, dễ nhuộm. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều

ngành khác như:

- Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và

sản xuất một số thức ăn kiêng.

- Protease của NS và VK phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn

gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.

- Điều chế MT dinh dưỡng của VSV để sản xuất vacxin, KS,…

- Sản xuất chất giặt tổng hợp, sản xuất mỹ phẩm,…

1.3.2.5. Một số chế phẩm của protease [19,21, 23].

Pepsin

Pepsin được thu nhận từ màng nhầy dạ con của heo và bê. Pepsin thường được sử dụng

chung với rennet trong sản xuất phomai và làm thuốc tiêu hóa. Hỗn hợp này hoạt động mạnh ở pH

2-4 và nhiệt độ 50oC.

Rennet

Thường được sản xuất từ bao tử của cừu, bê, người ta thường phối hợp với pepsin để sử dụng

trong công nghiệp chế biến sữa.

Papain

Papain được thu nhận bằng cách sấy khô mủ cây đu đủ carica papaya. Trong mủ cây đu đủ

có chứa papain, chymopapain, và một lượng nhỏ protease khác.

Papain được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh và công nghiệp chế biến thịt. Ngoài ra,

papain còn ứng dụng trong y học để làm lành các vết thương ngoài da.

Ficin

Ficin có nhiều trong nhựa cây sung, được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến sữa.

Protease của VK

Có hai loại protease từ VK được bán trên thị trường thế giới. Hai loại này khác nhau về pH

hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc của trung tâm hoạt động.

+Protease kiềm

Chế phẩm này có tên thương mại là subtilisin, có khoảng pH hoạt động 7-11, trung tâm hoạt

động có chứa serin. Chế phẩm này còn được gọi là enzyme tẩy rửa vì được ứng dụng nhiều trong

sản xuất các chất tẩy rửa.

+Protease trung tính

Protease trung tính là metalloenzyme, hoạt động ở pH 6-9. Chế phẩm này được ứng dụng

trong công nghiệp da, bia và công nghiệp sản xuất protein thủy phân.

Protease từ NS.

Nhiều chủng NS có khả năng sinh protease mạnh. Một số protease từ NS đã được sản xuất

trên qui mô công nghiệp.

Bảng 1.1. Một số loại NS có khả năng tổng hợp protease mạnh [21]

Chủng nấm sợi Loại protease

A. oryzae

A. awamori

A. niger

A. fumigatus

P. chrysogenum

P. cyaneo fulvum

R. nodous

Protease trung tính, acid và kiềm

Protease acid

Protease acid và kiềm

Nhiều loại nấm sợi có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công

nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium

chysogenum… Các loại NS này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.

Các loại NS đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.

Một số NS khác như A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp

protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát.

Protease từ NS gồm cả protease acid, kiềm và trung tính. Các protease acid và trung tính

được ứng dụng để sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công

nghệ thuộc da.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu.

- Các chủng NS được phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lý Nhơn, Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông,

Bình Khánh ở RNM Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh.

- Các chủng VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur.

- Nguyên liệu làm MT thu protease: cám gạo, trấu, bột đậu nành mua từ chợ.

2.2. Hoá chất.

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4, KH2PO4, KCl, NaCl, NaOH,

NaNO3…

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Việt Nam: dầu DO, glucose, pepton, casein, agar, tinh bột,

cồn, nước cất…

- Các hóa chất có nguồn gốc từ Đức: Yeast extract, malt extract…

- Các hoá chất có nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối seignet…

2.3. Thiết bị, dụng cụ.

Thiết bị máy móc.

Nồi hấp vô trùng Huxlex (Đài Loan).

Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam).

Tủ sấy Memmert (Đức).

Tủ ấm Binder (Đức)

Kính hiển vi Olympus CHL (Nhật Bản).

Tủ lạnh Hytachi (Nhật Bản).

Máy đo pH Hana (Nhật Bản).

Máy ly tâm Heraeus (Nhật Bản).

Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ).

Máy đo quang phổ UV (Đức).

Máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản).

Dụng cụ thí nghiệm: que cấy móc, qua cấy vòng, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đèn

cồn, que trang, đĩa petri, thước đo, giấy lọc, bông mỡ, bông thấm nước, giấy lọc, khăn lọc, lame,

lammel,…..

2.4. Các MT sử dụng trong thí nghiệm.

- MT phân lập, nuôi cấy, giữ giống và định danh NS

MT1-MT Czapek_Dox cải tiến [19]

NaNO3: 3,5g.

K2HPO4: 1,5g.

MgSO4.7H2O: 0.5g.

KCl: 0.5g.

FeSO4.7H2O: 0.01g.

Glucoza: 20g.

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 6.5.

Khử trùng 1atm/30phút

MT2- MT Zea [19]

Cao nấm men: 4g.

Glucoza: 20g.

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 5,5-6.

Khử trùng 1atm trong 30 phút.

MT3-MT Malt Extra Agar (MEA) [4]

Cao malt: 20g.

Pepton: 1g.

Glucoza: 20g.

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 5,5-6,0.

Khử trùng 1atm trong 30 phút.

- MT nuôi cấy VK kiểm định.

MT4- MT Meat Pepton Agar (MEA) [20]

Pepton: 5g.

NaCl: 5g.

Cao thịt: 5g.

Agar: 20g.

Nước cất: 1000ml.

pH: 7,5.

Khử trùng 1atm, 30 phút.

- MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào.

MT5- MT thử hoạt tính amylase [5]

NaNO3: 3,5g.

K2HPO4: 1,5g.

MgSO4.7H2O: 0.5g.

KCl: 0.5g.

FeSO4.7H2O: 0.01g.

Tinh bột tan: 15g.

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 6.5.

Khử trùng 1atm/30phút

MT6- MT thử hoạt tính protease [5]

K2HPO4: 1,5g.

MgSO4.7H2O: 0.5g.

KCl: 0.5g.

FeSO4.7H2O: 0.01g.

Casein: 15g

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 6.5.

Khử trùng 1atm/30phút

MT7- MT thử hoạt tính cellulase [5]

NaNO3: 3,5g.

K2HPO4: 1,5g.

MgSO4.7H2O: 0.5g.

KCl: 0.5g.

FeSO4.7H2O: 0.01g.

CMC: 10g.

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 6.5.

Khử trùng 1atm/30phút

MT8- MT thử hoạt tính kitinase [5]

NaNO3: 3,5g.

K2HPO4: 1,5g.

MgSO4.7H2O: 0.5g.

KCl: 0.5g.

FeSO4.7H2O: 0.01g.

Bột kitin: 10g

Agar: 20g.

Nước biển: 1000ml.

pH: 6.5.

Khử trùng 1atm/30phút

MT9- MT bán rắn khảo sát hoạt độ protease [20].

Cám gạo: 7g.(70%)

Trấu: 2.5g.(25%)

Bột đậu nành: 0.5g. (5%)

Độ ẩm :60%.

pH 5-5,5. Khử trùng 1atm/30 phút.

2.5. Phương pháp nghiên cứu.

2.5.1. Phương pháp phân lập mẫu từ RNM (theo Fazzani 1975, Kuthubuthen, 1981, 1984)

[32].

Thu mẫu tại 5 xã: An Thới Đông, Lý Nhơn, Bình Khánh, Long Hòa, Tam Thôn Hiệp. Mỗi xã

thu mẫu ở 5 địa điểm khác nhau, các địa điểm cách nhau khoảng 200m. Tại mỗi địa điểm thu mẫu ở

đất mặt, đất sâu, lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục.

Cách thu mẫu: dùng kéo, dao cắt khoảng 20g cành, lá cho vào túi nilon, cho vào thùng đá,

chuyển về PTN, giữ lạnh ở 4o C. Các mẫu phân lập ngay, không giữ quá 24h.

Các mẫu thu từ đất thì dùng muỗng xúc khoảng 20g đất và tiến hành tương tự trên.

2.5.2. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu (theo Uyenco, 1988) [28].

Lấy 10g mẫu, cho vào túi lọc có 90 ml nước biển Cần Giờ vô trùng.

Dập mẫu bằng máy dập trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/phút. Thu dịch lọc ta được dung

dịch pha loãng 10-1.

Tiếp tục pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5.

Nhỏ hai giọt dung dịch của mỗi nồng độ lên đĩa petri có MT 1, 2, 3. Dùng que trang dàn đều

dung dịch khắp bề mặt đĩa.

Lật ngược đĩa petri, gói giấy báo, để ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy vào

ống thạch nghiêng.

Làm thuần [6]

Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hòa với nước biển vô trùng, cấy trang lên đĩa

petri. Ủ mẫu ở 30oC cho đến khi xuất hiện KL. Nếu thấy các dạng KL đồng đều về hình dạng, màu

sắc thì giống phân lập đã thuần khiết.

Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống thạch nghiêng. Nuôi cấy ở 30oC trong 7 ngày, sau đó

bảo quản ở 4oC. Sau thời gian 2 tháng cấy truyền lại một lần.

2.5.3. Phương pháp bảo quản NS trên MT thạch có dầu khoáng.

Chuẩn bị các ống thạch nghiêng nuôi NS đạt độ trưởng thành.

Dầu khoáng chứa trong eppendoff đã hấp vô trùng ở 121oC trong 2 giờ rồi sấy khô ở 170oC

trong 1-2 giờ, để nguội.

Dùng que cấy lấy một ít bào tử NS cho vào eppendoff chứa dầu khoáng vô trùng.

Hàn kín eppendoff bằng keo paraphin, bảo quản ở 4oC.

Phương pháp này có thể bảo quản từ 1-3 năm.

2.5.4. Phương pháp quan sát đại thể NS [6]

Cho vào ống nghiệm 5ml nước biển vô trùng.

Dùng que cấy cho một ít bào tử từ ống giống vào ống nước biển, lắc đều tạo dung dịch huyền

phù.

Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi cấy chấm điểm vào giữa hộp petri.

Ủ trong tủ ấm 1 tuần, mỗi ngày lấy ra quan sát các đặc điểm hình thái, sinh lý (kích thước

KL, màu sắc KL mặt phải, mặt trái, hình dạng KL, đặc điểm mép khuẩn lạc, màu sắc MT, ….)

2.5.5. Phương pháp quan sát vi thể NS [4]

Đổ một lớp mỏng MT nuôi cấy vào đĩa petri.

Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch.

Chuẩn bị đĩa petri sạch, đặt vào giữa đĩa một ít bông có thấm nước để làm ẩm, đặt trên lớp

bông một phiến kính, đem hấp vô trùng 121oC, 30 phút.

Đặt một hoặc hai khối thạch lên phiến kính, cấy bào tử xung quanh mép khối thạch, đặt các

lá kính vô trùng lên bề mặt khối thạch.

Để các hộp petri này ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày.

Gỡ lá kính ra, úp một phiến kính sạch có nhỏ một giọt lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất.

Gỡ bỏ lớp thạch để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ vào một giọt lactophenol, đậy lá

kính lên, ta được tiêu bản thứ hai.

Quan sát dưới kính hiển vi và mô tả các đặc điểm: Hình dạng cuống sinh bào tử, hình dạng

thể bình, sợi nấm có phân nhánh và có vách ngăn hay không, đặc điểm bào tử đính, màu sắc, kích

thước bào tử….

2.5.6. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ngoại bào bằng đo đường kính vòng thủy

phân

Nguyên tắc.

Cho enzyme tác động với cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong

suốt xung quanh KL. Độ lớn MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme.

2.5.6.1. Phương pháp cấy chấm điểm.

Chuẩn bị các chủng NS cần nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzyme ngoại bào.

Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT.

Ủ ấm trong 30oC, để 3-4 ngày. Đo đường kính vòng phân giải.

Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu.

2.5.6.2. Phương pháp khoan lỗ thạch.

Thu dịch nuôi cấy: Nuôi cấy NS trên MT xốp, ủ ba ngày ở 30oC, hòa 10g MT vào nước cất,

đem lắc trong 1h tốc độ 200 vòng/phút.

Đem lọc qua vải để thu dịch lọc.

Ly tâm dịch lọc 15 phút, tốc độ 5000 vòng/phút. Thu được dịch enzyme thô.

Chuẩn bị các đĩa petri có MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào cần nghiên cứu. Dùng

khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzyme ngoại bào. Dùng pipet

vô trùng nhỏ 0,1ml vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri trong tủ lạnh 4oC trong 8h, sau đó chuyển ra

nhiệt độ phòng 24h.

Dùng thuốc thử nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải.

Kiểm tra kết quả.

Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase, dùng thuốc thử là lugol.

NS có hoạt tính của các enzyme này sẽ tạo nên vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan.

Kiểm tra hoạt tính của protease: thuốc thử là dung dịch HgCl2. Nếu NS có sinh protease sẽ

tạo ra một vòng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan do protease đã phân huỷ chất cảm ứng casein,

phần còn lại có màu trắng đục do phản ứng của casein với HgCl2.

Cách pha dung dịch HgCl2: hòa 30g HgCl2 vào 100ml nước có pha với 15ml HCl.

Cách đánh giá khả năng tạo enzyme:

Dùng thước đo đường kính vòng phân giải tại mặt sau đĩa petri.

D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh.

D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh.

D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình.

D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu.

Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính KL hoặc là đường kính của

khoan khối thạch (8mm) nếu làm bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch.

2.5.7. Phương pháp xác định hoạt độ protease (phương pháp Anson cải tiến).

Nguyên tắc.

Cho protease tác dụng với cơ chất casein, sản phẩm tạo thành là các peptit ngắn hay các acid

amin. Trong các loại acid amin, tyrosin chiếm đa số. Xác định tyrosin bằng phản ứng màu với thuốc

thử folin, từ đó xác định hoạt tính protease theo định nghĩa: hoạt tính protease được biểu thị là số

micromol tyrosin sinh ra do thuỷ phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease

trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5oC, pH 7,6).

Hoá chất.

Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hoà tan 5,96g Na2HPO4 trong nước thành 250ml.

Dung dịch KH2PO41/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml.

Dung dịch đệm sorensen 1/15 M, pH 7,6: trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml

dung dịch KH2PO4, đo và chỉnh lại pH cho đúng.

Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm sorence đến tan hoàn toàn rồi

sau đó định mức bằng sorense cho đủ 100ml.

Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml.

Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml.

Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 100ml.

Dung dịch tyrosin 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N cho vừa

đủ 50ml.

Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosin 20mM/l trong HCl 0,2N thành

100ml.

Tiến hành thí nghiệm.

Dựng đường chuẩn tyrosin.

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dung dịch tyrosin chuẩn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Dung dịch HCl 0,2N 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2

Thuốc thử folin 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

Lượng tyrosin (micromol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm.

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo lượng tyrosin ở các ống.

Xác định lượng tyrosin trong dung dịch nghiên cứu.

Cách tính:

Hoạt tính protease:

HT (UI) =X.V.K

t.v (UI/ml)

X: số micromol tyrosin suy ra từ đường chuẩn.

V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11ml).

V: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml).

K: độ pha loãng mẫu.

t: thời gian phản ứng.

1UI (Anson) = 1 micromol tyrosin/ml/phút hoặc 1 micromol/mg/phút.

Dung dịch hóa chất Ống nghiệm

Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống)

Casein 1% (ml) 5 5

TCA 10% (ml) 0 5

Dịch enzyme mẫu (ml ) 1 0

Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 30 phút

TCA 10% (ml) 5 0

Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1

Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu

Dịch lọc (ml) 1 1

Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2

Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6

Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm

2.5.8. Phương pháp kiểm tra hoạt tính KS.

Nguyên tắc.

Chất KS do nấm tiết ra ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV không phát

triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch tạo thành vòng vô khuẩn trong suốt.

Cách tiến hành.

Cấy NS trên môi trường MEA, nuôi 3 ngày. Dùng khoan nút chai đường kính 8mm khoan

các khối KL nấm.

Môi trường MPA sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 45-50 độ, dùng que cấy vòng lấy

một vòng VK kiểm định (B. subtilis hoặc E. coli) hòa vào MT, đổ MT vào đĩa petri.

Khi môi trường MPA trong đĩa petri đã đông cứng lại, dùng kim mũi mác đặt khối thạch có

KL nấm vào.

Để vào tủ lạnh 4oC trong 8h để dịch KS khuyết tán vào trong thạch, sau đó chuyển sang nhiệt

độ phòng để trong 24h.

Kiểm tra kết quả.

Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số D-d (D: đường kính vòng vô khuẩn, d=8mm:

đường kính của lỗ khoan nút chai.

D-d ≥ 25mm: hoạt tính KS rất mạnh.

D-d ≤ 20mm: mạnh.

D-d ≥ 10: trung bình.

D-d < 15mm: yếu.

2.5.9. Phương pháp xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố MT lên khả năng ST của NS.

Đánh giá khả năng ST của NS bằng cách đo đường kính KL

Qui ước:

d = 0mm: không mọc.

d = 1-2mm: mọc yếu.

d = 2,1-5: mọc trung bình.

d = 5,5-10: mọc tốt.

d = 11-30mm: mọc rất tốt.

2.5.9.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian lên ST của NS.

Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL, đo

trong 7 ngày.

2.5.9.2. Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ mặn lên ST của NS.

Chuẩn bị MT1 có pha NaCl để tạo các nồng độ muối: 1%, 3%, 5%, 10%, 20%.

Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu lên MT.

Nuôi nấm trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính KL.

2.5.9.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên ST của NS.

Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC,

35oC, 40oC trong 3 ngày. Đo đường kính KL.

2.5.9.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH lên ST của NS.

Chuẩn bị MT1 được điều chỉnh pH bằng NaOH 10% và HCl 10% để tạo các giá trị pH =

3,4,5,6,7,8.

Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính

KL.

2.5.9.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nguồn N lên ST của NS.

Sử dụng MT1. Nguồn NaNO3 lần lượt được thay thế bằng cao thịt, cao nấm men, casein, bột

ĐN, (NH4)2SO4. Mẫu đối chứng là MT1.

Cấy chấm điểm các chủng NS cần nghiên cứu. Nuôi trong 3 ngày ở 30oC. Đo đường kính

KL.

2.5.10. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận protease. [6]

Chuẩn bị MT lên men: cho vào bình tam giác 250ml 15g MT bán rắn, hấp khử trùng

121oC trong 30 phút.

Chuẩn bị giống bào tử: Chuẩn bị ống nghiệm chứa 15ml nước cất vô trùng. Hoà lượng

nước cất vô trùng này vào ống giống. Dùng que cấy mốc cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy bào tử,

đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù. Tiến hành đếm bào tử bằng phòng đếm hồng cầu.

Nuôi cấy: Cho vào các erlen chứa MT một thể tích huyền phù sao cho mật độ bào tử là 105-

106 bào tử/gam MT (2ml). Nuôi cấy ở 30oC. Canh trường nuôi cấy được thu nhận sau 1 khoảng thời

gian xác định.

Thu dịch enzyme thô: Sau thời gian nuôi cấy NS, cho vào mỗi bình tam giác 100ml nước

cất. Lắc 1h, sau đó lọc qua vải lọc thu lấy dịch lọc. Đem dịch lọc ly tâm 5000 vòng trong 10 phút.

Thu lấy dịch ly tâm rồi định mức 100ml, ta được dung dịch enzyme thô.

2.5.11. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các yếu tố MT đến hoạt độ protease của NS.

2.5.11.1. Ảnh hưởng của độ mặn.

Chuẩn bị MT9.

Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử, dùng NaCl để thay đổi độ mặn:

0%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%.

Nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong ba ngày.

Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định độ mặn tối ưu.

2.5.11.2. Ảnh hưởng của nguồn N.

- Chuẩn bị MT9, thay 5% bột ĐN bằng các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao nấm men,

casein, (NH4)2SO4. Nuôi cấy ở độ mặn tối ưu, nhiệt độ phòng, thời gian 3 ngày.

Thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease để xác định nguồn N thích hợp nhất.

-Sau khi chọn được nguồn N thích hợp, tiến hành chọn tỉ lệ N tối ưu cho hoạt độ protease của

các chủng NS nghiên cứu. Các tỉ lệ khảo sát: 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 10%.

2.5.11.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy.

Chuẩn bị MT nuôi cấy thích hợp, độ mặn tối ưu.

Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử.

Nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC. Sau ba ngày thu enzyme

thô và xác định hoạt độ protease. Từ đó xác định giá trị nhiệt độ tối ưu để thu protease.

2.5.11.4. Ảnh hưởng của độ ẩm.

Chuẩn bị MT thích hợp, độ mặn và nhiệt độ nuôi cấy tối ưu.

Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử.

Độ ẩm thay đổi 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Sau ba ngày, thu dịch enzyme thô và đo

hoạt độ protease từ đó xác định độ ẩm tối ưu.

2.5.11.5. Ảnh hưởng của pH. [1]

Chuẩn bị MT thích hợp, độ mặn, nhiệt độ và độ ẩm nuôi cấy tối ưu.

Dùng NaOH và HCl để thay đổi pH của MT ở các giá trị khác nhau: 3,4,5,6,7,8.

Sau ba ngày, thu dịch enzyme thô và đo hoạt độ protease từ đó xác định pH tối ưu.

2.5.11.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.

Nguyên tắc:

Mỗi loài VSV có đường cong tăng trưởng khác nhau. Tại mỗi thời điểm khác nhau của quá

trình tăng trưởng, chúng sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau của MT nuôi cấy bằng cách tiết ra hệ

enzyme thuỷ phân đặc hiệu với các hoạt độ khác nhau.

Cách tiến hành.

Chuẩn bị MT xốp nuôi cấy.

Cho vào MT nuôi cấy 2 ml thể tích dịch huyền phù bào tử. Nuôi cấy ở độ mặn, độ ẩm, pH tối

ưu.

Thu dịch enzyme thô sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: 24h, 36h, 48h, 60h, 72h,

84h, 96h. Tiến hành khảo sát hoạt độ protease tại mỗi thời điểm. Từ đó xác định thời gian nuôi cấy

để hoạt độ protease cao nhất.

2.5.12. Thu nhận enzyme bán tinh khiết [21].

Chế phẩm enzyme thô từ canh trường nuôi cấy được giã bằng cối sứ với sự trợ giúp của cát,

thạch anh hoặc bột thuỷ tinh. Sau đó, cho vào 1 lượng nước gấp 4-5 lần khối lượng canh trường để

hòa tan enzyme từ canh trường. Tiến hành lọc và thu dịch lọc ở 4oC.

Phương pháp kết tủa bằng muối (amonium sulfat)

Nguyên tắc: nồng độ muối cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và

làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.

Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ (cồn, axeton)

Nguyên tắc: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh

hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các

phân tử sẽ tăng lên.

Cách tiến hành:

Lấy cồn (hoặc aceton hoặc các muối trung tính…) đã làm lạnh đổ từ từ vào dịch lọc enzyme,

khuấy nhẹ để cồn hòa đều với dịch enzyme. Để hỗn hợp này vào tủ lạnh. Sau 15-24 giờ hỗn hợp này

sẽ phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hoặc lọc để thu enzyme dạng tủa. Sấy tủa này ở nhiệt độ < 40oC ta

được chế phẩm enzyme bán tinh khiết.

2.5.13. Định danh hai chủng NS bằng phương pháp di truyền phân tử

Bước 1. Chạy PCR.

Nguyên tắc.

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều

cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ

sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.

Phương pháp PCR được hình thành dựa vào những đặc tính đó của các DNA polymerase.

Qui trình.

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho

sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là

94-95oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.

- Giai đoạn lai: Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi (40-70oC), cho phép các mồi

bắt cặp với khuôn, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.

- Giai đoạn tổng hợp: Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động

tổng hợp tốt nhất. Thời gian này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại .

Một chu kì gồm 3 bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng mẫu

gấp đôi của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân.

Cách tiến hành.

Lấy mẫu nấm nuôi cấy một lượng khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf.

Cho thêm 180µl TE1X vào 20 µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm.

Thêm 500 µl phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sôi ở 100oC

trong 15 phút.

Sấy nhẹ rồi thêm vào 250 µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều. Ly tâm 14000

vòng/ phút trong 10 phút.

Hút 450 µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500 µl Isopropanol. Giữ

tube ở nhiệt độ -20oC trong 1 đến 2 giờ.

Ly tâm 14000 vòng /phút trong 15 phút ở 4 oC. Đổ bỏ dịch nổi.

Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500 µl Ethanol 70% vào, úp ngửa tube 3-4 lần. Ly tâm

14000 vòng/ phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi.

Làm khô cặn DNA ở 56oC trong 10-15 phút.

Hòa tan cặn DNA trong 50 µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích này để thực hiện kĩ thuật PCR.

Lấy 5µl DNA của vi nấm sau ly trích cho vào PCR mix.

Bước 2. Điện di kiểm tra trên gel agarose.

Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer.

Bước 3. Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEXII của Qiagen.

Bước 4. Giải trình tự đoạn RNA 28s.

Sản phẩm PCR được giải trình tự trên hệ thống ABI 3130 hoặc CEQ 8000.

Sau khi giải trình tự gen của NS nghiên cứu, tiến hành so sánh với trình tự gen trong hệ

thống ngân hang gen của Mỹ để xác định chi và loài của chúng.

2.5.14. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm.

Dùng xác suất thống kê để xử lý các số liệu thu được .

Tính giá trị trung bình.

Giá trị trung bình bằng tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo.

N: số lần đo

xi: giá trị của một lần đo

:giá trị trung bình

Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn.

Độ lệch mẫu: là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình.

Độ lệch mẫu = xi –

Trong đó: xi: giá trị của một lần đo

:giá trị trung bình

Độ lệch chuẩn: Là sai số có thể có trong một lần đo.

Với s: độ lệch chuẩn

xi: giá trị của một lần đo

:giátrị trung bình

N: số lần đo

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN.

3.1. Phân lập và tuyển chọn.

3.1.1. Phân lập.

Tiến hành lấy mẫu từ đất mặt, đất sâu, lá mục, lá vàng, cành khô, cành mục tại 5 xã An Thới

Đông, Lí Nhơn, Tam Thôn Hiệp, Long Hòa, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ theo phương pháp 2.5.1,

phân lập mẫu theo phương pháp 2.5.2.

Kết quả thu được 409 chủng NS với sự phân bố như sau.

Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng NS theo nguồn cơ chất ở RNM Cần Giờ

Cơ chất phân lập Số lượng chủng NS Tỉ lệ (%)

Đất mặt 64 15,64

Đất sâu 53 12,96

Cành khô 59 14,43

Cành mục 81 19,8

Lá vàng 71 17,36

Lá mục 81 19,8

Biểu đồ 3.1. Sự phân bố các chủng NS theo nguồn cơ chất ở RNM Cần Giờ

Từ kết quả trên cho thấy NS phân bố trên tất cả các nguồn cơ chất đã phân lập ở RNM. Tuy

nhiên, trên các nguồn cơ chất khác nhau, sự phân bố của NS không như nhau. Ở đất sâu, do điều

kiện yếm khí và chất dinh dưỡng ít nên có số lượng NS ít nhất. Ở thân và lá mục, số lượng NS nhiều

hơn cả do ngoài chức năng cung cấp chất dinh dưỡng, thân và lá cây còn là giá thể vững chắc giúp

cho NS không bị sóng triều cuốn ra biển cả [12].

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh khi nghiên cứu khu

hệ NS ở RNM Cần Giờ (2007) và Mai Thị Hằng khi nghiên cứu khu hệ NS ở Nam Định, Thái Bình

(2002).

3.1.2. Tuyển chọn sơ bộ các chủng có hoạt tính protease

Để đánh giá sơ bộ khả năng sinh protease của NS ở RNM Cần Giờ chúng tôi tiến hành tuyển

chọn các chủng NS có hoạt tính protease theo phương pháp 2.5.7

Kết quả thu được ở bảng 3.2

Như vậy, trong 409 chủng NS phân lập, có 257 chủng có khả năng sinh protease, chiếm tỉ lệ

62,84%, cao hơn so với khả năng sinh cellulase (58,65%) (Khưu Phương Yến Anh, 2007) và

amylase (51,04%) (Nguyễn Thị Lan Hương, 2009). Điều đó chứng tỏ rằng ngoài nguồn cơ chất phổ

biến là cellulose thì nguồn cơ chất protein ở RNM cũng khá phong phú, đó là xác của các ĐV thủy

sinh, kể cả lá cây khi phân hủy cũng trở thành nguồn protein dồi dào cho NS. Trong quá trình phân

huỷ, lượng đạm trên các mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971) [46], và trở

thành nguồn cơ chất cảm ứng sinh protease cho các chủng NS.

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Mai Thị Hằng về khu hệ NS ở RNM thuộc

Nam Định và Thái Bình (2002) [12].

Từ kết quả này cộng với các công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương, Võ Thị Bích

Viên (2009), Khưu Phương Yến Anh (2007) chứng tỏ NS là tác nhân tích cực phân giải các cơ chất

tinh bột, xelluloza, protein ở RNM Cần Giờ. Do đó, chúng là tác nhân góp phần giải quyết sự ô

nhiễm ở RNM, đồng thời, giữ vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn vật chất. Chúng là nguồn gen

quí đặc thù cho hệ sinh thái và hứa hẹn tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn.

Bảng 3.2. Vòng phân giải casein của 257 chủng NS có hoạt tính protease

Stt Kí hiệu chủng

D-d (mm)

Stt

Kí hiệu chủng

D-d

(mm) Stt

Kí hiệu chủng

D-d

(mm) Stt

Kí hiệu chủng

D-d

(mm)

1 295CK5.1 3 36 298CM2 19 71 291ĐM5.1 15 106 281LM 16

2 296CK5.2 11 37 303CM5.3 18 72 300ĐM4.1 16 107 284LM 15

3 315CK2.3 19 38 310CM3.2 5 73 338ĐM1.3 27 108 292LM1 7

4 342CK2 10 39 313CM3.1 7 74 359ĐM2 19 109 301LM2.3 17

5 343CK4.1 7 40 332CM2 18 75 381ĐM4.1 17 110 316LM1 23

6 360CK3.2 8.5 41 336CM2 21.5 76 389ĐM5.1 23 111 317LM1.5 4

7 373CK1.2 10 42 337CM1 17 77 460ĐM3.2 7 112 319LM1.1 5

8 375CK3.3 7 43 365CM1 14 78 464ĐM3.1 18 113 322LM5.3 9

9 376CK2.5 12 44 372CM3.3 12 79 472ĐM1.6 4 114 341LM3 22

10 377CK1.3 5 45 383CM5.5 11 80 475ĐM5.1 16 115 345LM3 20.5

11 378CK2.3 22 46 384CM5.4 7.5 81 483ĐM5.4 3 116 346LM1.1 7

12 396CK2.1 20.5 47 391CM4.2 10 82 486ĐM3.2 10 117 348LM4.3 26

13 450CK5.2 2 48 407CM1.1 20 83 493ĐM1.3 6.5 118 353LM3 2

14 499CK3.3 10 49 408CM1.2 20 84 496ĐM2.3 4 119 354LM2 8

15 518CK4.2 4 50 409CM4.3 14 85 500ĐM2.2 3 120 355LM4 4.5

16 564CK1.3 8 51 411CM2.2 20 86 501ĐM1.2 9.5 121 382LM3.4 9

17 737CK4 4 52 413CM3.2 20 87 507ĐM2.4 4 122 390LM5.4 8

18 738CK1 4 53 414CM3.3 17 88 530ĐM1.1 11 123 400LM2.4 10

19 740CK4.2 4 54 415CM3.4 20 89 534ĐM2.1 2 124 401LM2.5 6

20 741CK3.1 4 55 416CM5.1 6 90 567ĐM1.1 7 125 402LM2.5 6

21 742CK5.2 11 56 433CM4.3 7 91 571ĐM1 11 126 404LM4.1 2.5

22 801CK4.2 8 57 442C5.3 10 92 573ĐM5.3 11 127 417LM5.2 5

23 802CK5.1 8 58 443CM4.4 20 93 574ĐM1.3 15 128 423LM4.3 10

24 803CK1.1 12 59 497CM3.2 4 94 579ĐM3.2 12 129 424LM1.1 2

25 804CK1 13 60 512CM4.1 10 95 582ĐM.2 10 130 425LM3.5 3

26 805CK5.3 4 61 517CM5.8 15 96 607ĐM1.2 12 131 434LM3.1 21

27 807CK1.1 15 62 522CM5.1 5 97 728ĐM3.2 4 132 436LM3.2 4

28 808CK3.1 8 63 525CM3.4 12 98 729ĐM5.1 2 133 438LM4.4 10

29 35CK2.2 8.5 64 526CM3.3 6 99 732ĐM2 4 134 444LM3.6 15

30 42CK2.2 3 65 531CM1.3 6 100 733ĐM3.1 4 135 463LM2.1 15

31 43CK3.1 4 66 533CM2.4 5 101 735ĐM3.1 4 136 515LM5.5 17

32 326LV2.1 4 67 548CM4.5 12 102 603ĐM2.3 4 137 538LM5.4 7

33 327LV4 10 68 558CM3.6 14 103 611ĐM3 4 138 551LM3 24

34 331LV1 20 69 559CM3.5 5 104 770ĐM1 8 139 587LM2.2 6

35 339LV2 18 70 561CM5.2 22 105 771ĐM1.4 2.5 140 597LM1 4

Bảng 3.2. Vòng phân giải casein của 257 chủng NS có hoạt tính protease (tt)

Stt Kí hiệu chủng

D-d (mm)

Stt

Kí hiệu chủng

D-d (mm)

Stt

Kí hiệu chủng

D-d

(mm) Stt

Kí hiệu chủng

D-d

(mm)

141 350LV2 12 171 562CM5.2 7 200 772ĐM4 2 229 601LM3 4

142 351LV4 20 172 583CM5.5 8 201 817ĐM1.4 3.5 230 608LM1.3 15

143 385LV1.2 10 173 599CM5.6 6 202 819ĐM5.4 10 231 715LM1 2

144 386LV3.2 14 174 602CM5.7 7 203 820ĐM5.1 14 232 716LM1.2 2

145 387LV1.1 14 175 745CM5 5 204 39ĐM3.3 10 233 717LM5 2

146 388LV4.3 14 176 746CM1 5 205 45ĐM3.1 5 234 718LM3.2 4

147 428LV2.1 2 177 749CM5.2 5 206 60ĐS1.2 13 235 719LM3.1 4

148 431LV4.1 13 178 750CM2.1 4 207 77ĐM3.2 10 236 720LM3.1 7

149 432LV5.1 5 179 751CM5.3 5.5 208 28ĐM3.2 8.5 237 721LM1.1 4

150 447LV4.5 14 180 752CM3.1 5 209 335ĐS5 16 238 723LM2.2 3

151 449LV2.2 9 181 753CM3.2 5 210 362ĐS2 2 239 727LM2 18

152 461LV5.1 5 182 754CM4 4.5 211 363ĐS3 16 240 730LM4 4

153 476LV3.2 4 183 755CM3.1 11 212 364ĐS2 2 241 739LM1.2 4

154 578LV5.3 17 184 765CM1.3 11 213 370ĐS7 2 242 790LM3.2 13

155 591LV3.3 4 185 809CM5.1 3.5 214 371ĐS5 20 243 5LM3 20

156 606LV1.3 4 186 811CM3.3 2 215 374ĐS6.2 2 244 7LM4.2 7

157 702LV3.3 5 187 812CM1.2 2.5 216 380ĐS1.1 5 245 8LM2.2 14

158 705LV3.1 4 188 814CM1.1 5 217 397ĐS2 20 246 9LM4.1 7

159 709LV2 4 189 815CM1.4 4.5 218 421ĐS1.2 2 247 11LM3 8

160 714LV2 3 190 12CM3.4 24 219 435ĐS5.3 6 248 13LM5.1 20

161 787LV3.2 4 191 18CM3.2 10 220 454ĐS5 5 249 16LM5.2 12

162 793LV1.2 16 192 19CM5.1 17 221 455ĐS4 2 250 17LM3.3 3

163 795LV4.5 24 193 21CM3.4 10 222 456ĐS3 12 251 20LM4.2 22

164 30LV3.3 3 194 32CM2.1 12 223 457ĐS5 7 252 23LM2.2 15

165 65LV2.1 5 195 33CM1.3 4 224 469ĐS3.1 10 253 27LM2 12

166 74LV4 8 196 36CM1.1 6.5 225 509ĐS3 7 254 31LM2.2 18

167 290ĐS2 16 197 41CM4.2 14 226 777ĐS5.2 6 255 38LM3.1 6

168 302ĐS1 20 198 46CM3.3 16 227 782ĐS2.1 5 256 56LM3.4 8

Từ kết quả trên, có thể tóm tắt được khả năng sinh protease của các chủng NS phân lập được

qua bảng 3.3, bảng 3.4 và biểu đồ 3.2

Bảng 3.3. Tóm tắt khả năng sinh protease của các chủng NS phân lập

Không có

hoạt tính

Rất mạnh

Mạnh

Trung bình

Yếu

Số

chủng

Tỉ lệ

(%)

Số

chủng

Tỉ lệ

(%)

Số

chủng

Tỉ lệ

(%)

Số

chủng

Tỉ lệ

(%)

Số

chủng

Tỉ lệ

(%)

210 44.97 2 0.43 26 5.57 88 18,84 94 20.13

Biểu đồ 3.2. Khả năng sinh protease của các chủng NS ở RNM Cần Giờ

Bảng 3.4. Sự phân bố các chủng NS có hoạt tính protease

theo nguồn cơ chất

Cơ chất phân lập

Số chủng có hoạt tính

protease/ tổng số

Tỉ lệ

(%)

Đất mặt 43/63 67,18

Đất sâu 25/53 47,17

Cành khô 31/59 52,54

Cành mục 65/81 80,25

Lá vàng 30/71 42,25

Lá mục 63/81 77,78

169 308ĐS4.1 3 199 48CM4 4 228 53ĐS5.1 4 257 289ĐS 10

170 78CM2.2 5

Từ kết quả trên cho thấy số chủng NS có khả năng sinh protease khá nhiều, nhưng đa số có

hoạt tính protease trung bình và yếu, chỉ có một số ít chủng có hoạt tính protease rất mạnh và mạnh

(6%). Trên các nguồn cơ chất khác nhau, khả năng sinh protease cũng khác nhau do khả năng sinh

enzyme này phụ thuộc rất nhiều vào chất cảm ứng protein. Nguồn cơ chất lá vàng có số chủng sinh

protease thấp nhất do đây không phải là nguồn cơ chất phù hợp cho sinh tổng hợp protease của NS.

Ngược lại, trên thân mục, cành mục và đất mặt số chủng có khả năng sinh protease lại rất cao.

Nguyên nhân là ở các cơ chất này có nguồn protein phong phú hơn từ xác các SV bị phân hủy.

Trong tổng số 28 chủng có hoạt tính protease mạnh, chúng tôi chọn 10 chủng có hoạt tính

protease cao nhất tiếp tục nghiên cứu.

Hình 3.1. Vòng phân giải casein của 10 chủng NS có hoạt tính protease cao nhất.

12CM3.4 551LM3 348LM4

341LM3 338ĐM1.3 795LV4.5

389ĐM5. 336CM2316LM1

378CK2.

3.1.3. Tuyển chọn lần 2.

Để đánh giá chính xác khả năng sinh protease của các chủng NS tuyển chọn, chúng tôi tiến

hành xác định hoạt độ protease theo phương pháp 2.5.7 của 10 chủng NS có đường kính vòng phân

giải lớn nhất.

Bảng 3.5. Hoạt độ protease của 10 chủng NS tuyển chọn.

Stt

Kí hiệu chủng

NS

D-d

(mm)

Hoạt độ

protease (UI/ml) Sai số

1 338Đ1.3. 27 1.929 0.009

2 341LM3 22 1.306 0.006

3 348LM4.3 26 1.889 0.012

4 795LV4.5 24 1.603 0.010

5 378CK2.3 22 1.646 0.012

6 551LM3 23 1.918 0.003

7 12CM3.4 24 2.054 0.012

8 336CM2 21 1.611 0.002

9 389Đ5.1 23 1.733 0.001

10 316LM1 23 1.754 0.019

Kết quả cho thấy 4 chủng NS có hoạt độ protease cao nhất là:

338Đ1.3 (1.929UI/ml)

348LM4.3 (1.889UI/ml)

551LM3 (1.918 UI/ml)

12CM3.4 (2.054 UI/ml).

Kết quả được minh họa ở biểu đồ 3.3.

Biểu đồ 3.3. Hoạt độ protease của 10 chủng NS có đường kính

vòng phân giải lớn nhất.

- Khả năng chịu mặn là một đặc trưng quan trọng của các chủng NS có nguồn gốc RNM. Đặc

trưng của điều kiện sống ở RNM Cần Giờ là độ mặn cao, dao động khoảng từ 1.8% - 3%. Các

chủng NS ở đây phát triển tốt ở MT có độ mặn khá cao. Hơn nữa, khả năng chịu mặn còn ảnh

hưởng rất lớn đến phạm vi ứng dụng của các chủng NS. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn bằng

cách nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng ST của 4 chủng NS trên.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và biểu đồ 3.4.

Bảng 3.6. Khả năng chịu mặn của bốn chủng NS

Độ mặn (%)

Khả năng sinh trưởng (mm)

12CM3.4 338Đ1.3 348LM4.3 551LM3

0 5 2.5 5 8

1 6.5 6 7 9

3 12.5 5.5 4.5 8

5 8 2 1 5.5

10 5 0 0 1

20 0 0 0 0

Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số 4 chủng NS được tuyển chọn, 2 chủng có khả năng

chịu mặn tốt hơn là 12CM3.4 và 551LM3. Ở nồng độ muối 5%, hai chủng này vẫn có khả năng ST

tốt. Ở nồng độ muối rất cao là 10%, hai chủng này vẫn có khả năng ST. Chủng có khả năng chịu

mặn cao nhất là 12CM3.4.

Hai chủng 338ĐM1.3 và 348LM4.3 chịu mặn kém hơn, mọc yếu ở nồng độ muối 5%, và

không mọc ở nồng độ muối 10%.

Tử kết quả trên chúng tôi quyết định chọn hai chủng NS có khả năng chịu mặn cao nhất là

12CM3.4 và 551LM3 để đi sâu nghiên cứu.

Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của độ mặn đến ST của bốn chủng NS

3.2. Phân loại hai chủng NS.

3.2.1. Phân loại đến chi.

Tiến hành cấy 2 chủng NS đã tuyển chọn vào MT1 theo phương pháp 2.5.5 và 2.5.6 để xác

định các đặc điểm hình thái đại thể và vi thể của chúng. Sau đó định danh đến chi hai chủng này

dựa trên khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng. (2003)

Hình 3.2. Mặt phải KL của hai chủng 551LM3 và 12CM3.4

12CM3.4551LM3

Hình 3.3. Mặt trái KL của hai chủng 551LM3 và 12CM3.4

Hình 3.4. Cơ quan sinh bào tử của hai chủng 551LM3 và 12CM3.4

Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể và phân loại đến chi hai chủng NS

Kí hiệu

chủng

Đặc điểm hình thái Đặc điểm phân loại tương ứng

theo Bùi Xuân Đồng (2003)

12CM3.4 551LM

12CM3.4 551LM3

12CM3.4

KL: Mặt phải tròn, nhung

mịn, màu xanh lục, không có

vết khía xuyên tâm, có vòng

đồng tâm, mép viền trắng. Mặt

trái màu hơi nâu, không tiết sắc

tố.

Hình thái vi thể: Sợi nấm

ngăn vách, phân nhánh, bộ

máy mang bào tử trần dạng

chổi, bào tử trần hình elip, gần

cầu.

Chi Penicillium

- Hình thái đại thể: KL màu

lục,vàng lục, xanh lục, lục xám.

Mặt trái không màu hoặc có màu

sắc khác nhau. KL có hoặc không

có vết khía xuyên tâm hay đồng

tâm.

- Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn

vách, phân nhánh. Bộ máy mang

bào tử trần dạng chổi. Bào tử trần

không có vách ngăn, hình cầu,

gần cầu, hình trứng, elip, đôi khi

hình trụ.

551LM3

KL: Mặt phải tròn, dạng

bột xốp bông nhẹ, màu tím

nhạt, có vòng đồng tâm, mép

viền trắng. Mặt trái không

màu, không tiết sắc tố.

Hình thái vi thể: Sợi nấm

ngăn vách, phân nhánh, bộ

máy mang bào tử trần dạng

chổi, thể bình có phần gốc hình

trụ, phần ngọn thon nhỏ đột

ngột tạo thành cổ dài, bào tử

trần hình elip.

Chi Paecilomyces

-Hình thái đại thể: KL màu trắng,

lục, tím nhạt hoặc vàng nâu.

- Hình thái vi thể: Giá bào tử trần

đơn độc hoặc thành bó giá, phân

nhánh không đều hoặc thành

vòng. Thể bình gồm phần gốc

hình trụ hoặc hình gần trứng,

phần ngọn thon nhỏ đột ngột tạo

thành một cổ dài. Bào tử không

ngăn vách, không có màu hoặc

màu nhạt.

Kết luận: chủng 12CM3.4 thuộc chi Penicillium.

chủng 551LM3 thuộc chi Paecilomyces

3.2.2. Phân loại đến loài bằng di truyền học phân tử.

Chúng tôi tiến hành định danh tới loài 2 chủng NS trên tại Công ty Nam Khoa bằng phương

pháp giải trình tự gen 28s rRNA, kết quả như sau:

Kết quả giải trình tự gen 28s rRNA của chủng NS kí hiệu 12CM3.4

AGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGG

CGGCCGGTCAAAGGCCCCTGGAATGTAACGCCTCTCGGGGCGTCTTATAGCCAGGGGT

GCCATGCGGCCTGCCCGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGT

CGAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC

Trình tự này đối chiếu với trình tự 28s rRNA của các chủng NS đã được định loại trong ngân

hàng gen Blast. Kết quả đối chiếu cho thấy chủng 12CM3.4 là Penicillium paxilli. Sự trùng khớp

206/207. Độ chính xác 99%.

Kết quả giải trình tự gen 28s rRNA của chủng NS kí hiệu 551LM3

GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCCCGGTGGATCCA

GCGTTCTCGCTGGTTGCACTCCGCCGGGTTCAGGCCAGCATCAGTTCGCCGCGGGGGAA

AAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTACGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCATAATACCCTG

GGGCGGACTGAGGTTCGCGCTCCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCG

TCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC

Kết quả đối chiếu cho thấy chủng NS kí hiệu 551LM3 là Paecilomyces lilacinus. Sự trùng

khớp 255/255. Độ chính xác 100%.

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của hai chủng NS

tuyển chọn.

3.3.1. Ảnh hưởng của độ mặn.

3.3.1.1. Ảnh hưởng của độ mặn đến ST

Nuôi cấy các chủng NS ở MT1. Thay đổi độ mặn bằng NaCl để tạo các nồng độ muối khác

nhau ở MT nuôi cấy: 1%, 3%, 5%, 10%, 20%

MT đối chứng là MT không có NaCl (0%)

Kết quả ở bảng 3.8 và minh họa trong biểu đồ 3.4.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của độ mặn đến ST của hai chủng NS

Độ mặn

(%)

Khả năng sinh trưởng (mm). Penicillium

paxalli Paecilomyces

lilacinus

0 5 8 1 6.5 9 3 12.5 8 5 8 5.510 5 1 20 0 0

Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của độ mặn đến ST của hai chủng NS

Chủng Paecilomyces lilacinus phát triển ngang nhau ở MT có độ mặn dao động từ 1%-3% và

tương đương với MT đối chứng (8mm). Độ mặn thích hợp nhất cho ST của chủng này là 1%

(9mm).

Sự ST của chủng Penicillium paxalli tăng tỉ lệ thuận với độ mặn của MT và đạt cực đại ở 3%

(12,5mm), mạnh hơn hẳn so với đối chứng (5mm), sau đó ST giảm hẳn ở nồng độ 5%-10%.

Đặc điểm chung của cả hai chủng NS là chúng đều phát triển tốt ở MT nước ngọt lẫn nước

lợ. Điều đó cho thấy hai chủng NS được du nhập từ đất liền và thích nghi lâu dài với điều kiện sống

ở RNM. Chúng là những VSV chịu mặn tuỳ tiện. Tuy nhiên, khi độ mặn của MT quá cao (>5%)

không phù hợp cho ST của cả hai chủng NS.

Penicillium paxilli

0% 1% 3%

5% 10%

Paecilomyces lilacinus

Hình 3.5. Ảnh hưởng của độ mặn đến ST của hai chủng NS.

Ở MT 1% và 3% cả hai chủng NS đều phát triển bằng hoặc tốt hơn MT đối chứng (0%).

Điều này chứng tỏ hai chủng NS đã có quá trình thích nghi lâu dài với điều kiện sống ở RNM Cần

Giờ.

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu khả năng chịu mặn của Mai Thị Hằng (2002)

về khả năng chịu mặn của các chủng NS ở RNM Nam Định và Thái Bình đã xác định được 122/137

chủng NS phát triển tốt trên MT có độ mặn 3%-5% [12]

3.3.1.2. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ protease.

Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra được độ mặn tối ưu cho hoạt độ protease của hai

chủng NS nghiên cứu.

Tiến hành nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9. Thay đổi độ mặn bằng NaCl tạo độ mặn khác

nhau ở MT nuôi cấy: 0%, 1%, 3%, 5%, 10%. Sau ba ngày nuôi cấy, thu dịch enzyme thô, xác định

hoạt tính protease theo phương pháp Anson.

Kết quả thu được ở bảng 3.9 và minh họa bằng đồ thị 3.2.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt độ protease của

hai chủng NS.

Độ mặn

(%)

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium

paxilli Sai số

Paecilomyces

lilacinus Sai số

0 0.985 0.047 0.690 0.005

1 1.443 0.006 1.874 0.001

0% 1% 3%

5% 10%

3 2.158 0.004 1.939 0.004

5 1.824 0.005 1.661 0.019

10 0.550 0.005 0.057 0.001

Ở MT có độ mặn 0%, hai chủng NS vẫn có khả năng ST khá tốt (chủng Penicillium paxilli

đạt 5mm, chủng Paecilomyces lilacinus đạt 8mm), nhưng khả năng sinh protease rất thấp (hoạt độ

protease của chủng Penicillium paxalli là 0.985 UI/ml, của chủng Paecilomyces lilacinus

0.690UI/ml). Trong khi đó, ở độ mặn từ 1% đến 3%, khả năng ST và hoạt độ protease của chúng

đều rất cao, đạt cực đại ở 3%. Đây cũng chính là độ mặn trung bình ở RNM Cần Giờ.

Kết quả nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh về cellulase (2007) và Nguyễn Thị Lan

Hương và amylase (2007) đều xác định hoạt độ của các enzyme này mạnh nhất ở MT có độ mặn từ

1-3%. Điều đó chứng tỏ rằng hoạt độ protease nói riêng và các enzyme ngoại bào nói chung của

nấm sợi RNM ở MT nước lợ cao hơn MT nước ngọt. Đây là điểm đặc trưng của NS rừng ngập mặn.

Như vậy độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh protease của NS ở RNM. Nhờ khả

năng sinh protease cao ở MT nước lợ mà các chủng NS đã góp phần tham gia vào giải quyết vấn đề

ô nhiễm MT.

Đồ thị 3.2.

Ảnh hưởng của độ

mặn đến hoạt độ

protease

của hai

chủng NS.

3.3.2. Ảnh

hưởng của nguồn

N.

3.3.2.1.

Ảnh hưởng của

nguồn N đến ST.

Dùng MT1 làm đối chứng, bổ sung các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao nấm men, casein,

bột đậu nành, (NH4)2SO4.

Kết quả ở bảng 3.10 và minh họa ở biểu đồ 3.5.

Từ kết quả trên cho thấy cả hai chủng NS đều có khả năng ST tốt trên các nguồn N khác

nhau. Sự ST của hai chủng NS ở các nguồn N khác nhau tương đương hoặc thấp hơn MT đối chứng

(nguồn N là NaNO3). Trong MT cao thịt, casein và bột ĐN, chủng Penicillium paxilli ST mạnh hơn

chủng Paecilomyces lilacinus, trong MT có nguồn N là cao nấm men thì ngược lại, Paecilomyces

lilacinus ST mạnh hơn. Cả hai chủng NS đều có khả năng đồng hóa tốt nguồn N vô cơ. Hai chủng

NS đều phát triển ở MT casein tốt hơn bột ĐN vì so với bột ĐN casein là nguồn N dễ tiêu hơn.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn N đến ST của hai chủng NS.

Nguồn nitơ Khả năng sinh trưởng (mm)

Penicilliumpaxalli

Sai số Paecilomyces lilacinus

Sai số

Đối chứng 10.0 0.000 11.7 0.333 (NH4)2SO4 9.3 0.167 10.5 0.000 Cao thịt 5.8 0.167 10.0 0.000 Cao nấm men 8.7 0.333 6.7 0.167 Casein 11.0 0.000 12.2 0.167 Bột đậu nành 9.0 0.000 10.5 0.000

Biểu đồ 3.5.

Ảnh hưởng của nguồn N đến ST của hai chủng NS

3.3.2.2.Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ protease.

Nuôi cấy NS vào MT9 trong đó thay 5% bột ĐN bằng các nguồn N khác nhau: cao thịt, cao

nấm men, casein, (NH4)2SO4 để tìm ra nguồn N tối ưu cho hoạt độ protease. Độ mặn MT là 3%.

Kết quả thu đuợc thể hiện ở bảng 3.11 và biểu đồ 3.6.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ protease của

hai chủng NS

Nguồn nitơ Hoạt độ protease (UI/ ml)

Penicillium paxalli Sai số

Paecilomyces lilacinus Sai số

Cao thịt 1.729 0.016 1.876 0.008 Cao nấm men 1.710 0.053 1.809 0.015

Casein 2.151 0.008 1.918 0.010 Bột đậu nành 2.187 0.029 1.928 0.017

(NH4)2SO4 1.344 0.149 1.237 0.177

Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nguồn N đến hoạt độ protease

của hai chủng NS

Từ kết quả khảo sát cho thấy trong các nguồn N khác nhau, hai chủng NS đều có khả năng

tổng hợp protease khá cao. Trong môi trường có nguồn N là (NH4)2SO4 thì hoạt độ protease thấp

nhất ở cả hai chủng vì đây không phải là chất cảm ứng sinh protease. Tuy nhiên, trong thành phần

dinh dưỡng của cám đã có 10-12.2% protein thô đóng vai trò là chất cảm ứng nên 2 chủng NS vẫn

có khả năng sinh protease nhưng hoạt độ kém hơn hẳn ở MT có bổ sung nguồn N hữu cơ.

Cả 4 nguồn N cao thịt, cao men, casein và bột ĐN đều là nguồn chất cảm ứng tốt cho sinh

tổng hợp protease. Casein và bột ĐN là nguồn N mà hai chủng NS hoạt độ protease cao nhất.

Nguyên nhân bột ĐN cho hoạt độ protease cao so với các chất cảm ứng khác có thể liên quan

đến thành phần phần acid amin. Hàm lượng cystein trong cao thịt (2.5%) và cao nấm men (1.3%)

cao hơn hẳn trong bột ĐN (0.3%). Cystein có thể kiềm hãm khả năng sinh protease của một số

chủng NS.

Dù cả casein và bột ĐN đều cho hoạt lực protease cao. Tuy nhiên, xét về tính kinh tế, bột ĐN

có giá thành rẻ hơn nhiều so với casein, nên chúng tôi chọn bột đậu nành làm nguồn N để tiếp tục

nghiên cứu.

Đối với protease, bột ĐN đóng vai trò là cơ chất cảm ứng. Hàm lượng chất cảm ứng cũng

ảnh hưởng lớn đến hoạt độ protease nên chúng tôi tiếp tục nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ bột

ĐN đến hoạt độ protease.

Kết quả trình bày ở bảng 3.12 và biểu đồ 3.7.

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của hàm lượng ĐN đến hoạt độ protease

của hai chủng NS.

Hàm lượng đậu nành (%)

Hoạt độ protease (UI/ ml) Penicillium

paxalli Sai sốPaecilomyces

lilacinus Sai số

0 0.850 0.028 1.229 0.005 1 1.783 0.015 1.857 0.015 3 2.173 0.012 1.954 0.012 5 2.191 0.023 1.922 0.006 7 1.434 0.005 1.232 0.004 10 1.356 0.021 1.129 0.011

Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng ĐN đến hoạt độ protease

của hai chủng NS.

Từ kết quả trên cho thấy khi MT không có ĐN, hai chủng NS vẫn có khả năng tổng hợp

protease nhưng hoạt độ rất yếu. Hoạt độ protease tăng tỉ lệ thuận với sự tăng tỉ lệ bột ĐN cho tới giá

trị cực đại thì bắt đầu giảm xuống. Đối với chủng Penicillium paxalli thì ở hàm lượng ĐN 3-5%

hoạt tính protease rất mạnh, nhưng cực đại là ở 5%. Chủng Paecilomyces lilacinus thì hoạt tính

protease cao ở tỉ lệ ĐN 1-5%, nhưng cực đại ở 3%.

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ.

3.3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến ST

Cấy các chủng NS vào MT1, nuôi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC,

35oC, 40oC . Đo đường kính vòng ST sau 3 ngày nuôi cấy.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.13 và biểu đồ 3.8.

Nhiệt độ tốt nhất cho sự ST của hai chủng NS trên là 30oC. Nhiều nghiên cứu cũng chứng

minh rằng nhiệt độ thích hợp cho đa số NS là 28-32oC[ 19].

Ở 20oC và 40oC, hai chủng NS đều ST rất yếu do nhiệt độ quá thấp hay quá cao làm ảnh

hưởng đến nồng độ các chất hòa tan trong MT nuôi cấy và các phản ứng xúc tác trong tế bào NS, từ

đó ức chế ST của chúng.

Khoảng nhiệt độ thích hợp cho ST của hai chủng NS là 25oC-30oC. Khoảng nhiệt độ này phù

hợp với nhiệt độ trung bình ở RNM là 25,8oC.

Ở 40oC, hai chủng NS này đều ST yếu, điều đó cho thấy đây không phải là hai chủng ưa

nhiệt và chúng đều thích nghi với điều kiện nhiệt độ ở RNM Cần Giờ.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến ST của hai chủng NS.

Nhiệt độ (oC) Khả năng sinh trưởng (mm)

Penicillium paxalli Paecylomyces lilacinus

20 2.5 3.8

25 10.7 10.2

30 12.0 12.3

35 2.2 4.0

40 1.0 1.0

Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến ST của hai chủng NS.

3.3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease

Để xác định nhiệt độ nuôi cấy cho hoạt độ protease cao nhất, chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2

chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% đối với chủng Paecilomyces lilacinus, 5%

đối với Penicillium paxilli. Khảo sát ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Sau 3

ngày, ly trích dịch enzyme thô và tiến hành xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson.

Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.14 và minh họa trong đồ thị 3.3.

Nhiệt độ (oC)

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của hai chủng NS

Nhiệt độ (oC)

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium

paxalli Sai số

Paecilomyces

lilacinus Sai số

20 0.014 0.000 0.581 0.020

25 1.903 0.002 1.195 0.007

30 2.206 0.005 1.963 0.004

35 0.195 0.016 1.508 0.015

40 0.062 0.007 0.129 0.007

Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease của hai chủng NS.

Từ kết quả trên cho thấy, hoạt độ protease của hai chủng NS tăng nhanh từ 20oC đến 30oC,

đạt cực đại ở 30oC và giảm nhanh từ 30oC đến 40oC. Khoảng nhiệt độ để hai chủng NS có hoạt độ

protease cao là 25-30oC, phù hợp với nhiệt độ thích hợp cho ST của hai chủng NS này.

Ở nhiệt độ quá thấp hay quá cao, khả năng sinh protease của hai chủng NS giảm vì các phản

ứng sinh hóa trong các tế bào bị ức chế. Theo Nguyễn Đức Lượng, nhiệt độ MT thích hợp trong

nuôi cấy NS thu protease là khoảng từ 29oC-31oC [21].

Như vậy, kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng NS đều ST tốt và hoạt độ protease cao

trong khoảng nhiệt độ từ 25oC -30oC, đây cũng là khoảng nhiệt độ trung bình ở RNM Cần Giờ.

Điều đó chứng tỏ rằng cả 2 chủng NS này đều thích nghi với điều kiện nhiệt độ ở RNM Cần Giờ.

3.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9, độ mặn 3%, hàm lượng bột ĐN 3% đối

với chủng Paecilomyces lilacinus, 5% đối với Penicillium paxilli. Nuôi cấy ở 30oC. Điều chỉnh các

Nhiệt độ (oC)

Nhiệt độ (oC)

giá trị độ ẩm khác nhau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. Sau ba ngày nuôi cấy, thu dịch enzyme

thô và xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson.

Kêt quả thu ở bảng 3.15 và minh họa ở đồ thị 3.4.

Từ kết quả trên cho thấy tác động của độ ẩm lên hoạt độ protease của hai chủng NS khác

nhau. Chủng Penicillium paxalli có hoạt độ protease cao trong khoảng độ ẩm dao động từ 50% đến

60%, cao nhất ở ở 55% (2,337UI/ml). Ở độ ẩm 60-75%, hoạt độ protease của chủng này giảm.

Trong khi đó, chủng Paecilomyces lilacinus cho hoạt độ protease tốt ở khoảng độ ẩm từ 60%-65%,

độ ẩm tối ưu là 65% (2,053UI/ml). Ở các điều kiện độ ẩm khác, chủng này có hoạt độ protease kém.

Độ ẩm là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men bề mặt. Khi độ ẩm thấp quá thì

sẽ kéo dài thời gian ST và từ đó kéo dài thời gian tạo enzyme của NS. Ngược lại, độ ẩm quá cao làm

cho MT bị kết dính làm cho nấm sợi ST và tạo enzyme yếu.

RNM Cần Giờ có độ ẩm trung bình tương đối cao, dao động từ 73%-85%. Tuy nhiên, độ ẩm

này thay đổi phụ thuộc vào mùa và địa điểm. Vào mùa mưa độ ẩm cao hơn mùa khô. Mẫu được thu

vào giao điểm giữa mùa khô và mùa mưa (tháng 11), ở địa điểm tương đối khô ráo, nên độ ẩm thấp

hơn so với độ ẩm tương đối trong năm. Do đó có thể nói hai chủng NS nghiên cứu thích nghi được

với điều kiện sống ở RNM.

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ protease của hai chủng NS

Độ ẩm (%)

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium

paxalli Sai số

Paecilomyces

lilacinus Sai số

50 2.039 0.005 0.463 0.000

55 2.337 0.005 1.676 0.001

60 2.255 0.019 1.937 0.008

65 1.424 0.001 2.053 0.014

70 1.420 0.005 1.095 0.007

75 1.325 0.027 0.957 0.010

Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm đến hoạt độ protease của hai chủng NS

3.3.5. Ảnh hưởng của pH.

3.3.5.1. Ảnh hưởng của pH đến ST.

pH ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của NS. Mục đích của thí nghiệm này là xác định

điều kiện pH tối ưu cho ST của hai chủng NS.

Dùng MT1 làm đối chứng (pH 6,5).

Điều chỉnh bằng NaOH 10% và HCl 10% để tạo MT có pH 3,4,5,6,7, 8.

Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.16 và biểu đồ 3.9.

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH đến ST của hai chủng NS

pH

Khả năng sinh trưởng (mm)

Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus

Đối chứng 10 12

3 2.5 3.0

4 10.0 12.7

5 13.2 15.0

6 9.3 14.7

7 8.8 12.3

8 5.0 10.2

Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của pH đến ST của hai chủng NS.

Kết quả cho thấy khi pH quá acid (3-4) hoặc quá kiềm (pH=8) đều không thích hợp cho ST

của hai chủng NS. Ở các giá trị này, hai chủng NS đều sinh trưởng kém hơn nhiều trên MT đối

chứng (pH 6.5). Nhiều nghiên cứu đều xác định pH quá thấp hoặc quá cao sẽ không thích hợp cho

ST của đa số NS [6].

Hai chủng NS có thể ST tốt trong khoảng pH rất rộng dao động từ 4-7. Ở các giá trị pH này,

chúng đều ST không chênh lệch nhiều so với MT đối chứng. pH tối ưu cho ST của cả hai chủng NS

là 5. Đặc biệt, chủng Paecilomyces lilacinus có mức ST tương đương trong khoảng pH từ 4-8.

Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Ingold (1967) đã xác định pH tối ưu cho NS sinh

trưởng dao động trong khoảng 5-6.5. Mặt khác cũng chứng tỏ hai chủng NS thích hợp với môi

trường sống ở RNM Cần Giờ, pH trung bình ở đây dao động trong khoảng 5.8-6.5 [61].

3.3.5.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease.

Nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9, nhiệt độ 30oC, độ mặn 3%. Hàm lượng ĐN 5%, độ ẩm 55%

đối với Penicillium paxalli; hàm lượng ĐN 3%, độ ẩm 65% đối với Paecilomyces lilacinus .Thay

đổi pH của MT từ 3-8.

Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.17 và đồ thị 3.5.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của hai chủng NS.

pH

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium

paxalli Sai số

Paecilomyces

lilacinus Sai số

3 0.305 0.022 0.192 0.009

4 1.423 0.003 2.026 0.043

Điểm khác biệt của hai chủng này là ở pH =8, chủng Paecilomyces lilacinus vẫn có khả năng

tổng hợp protease khá cao, trong khi đó, chủng Penicillium paxilli tổng hợp protease rất yếu.

Nguyên nhân là do điểm pH này, chủng Paecilomyces lilacinus vẫn phát triển tốt, trong khi đó,

chủng Penicillium paxilli phát triển rất kém.

Khoảng pH mà hai chủng NS có hoạt độ protease mạnh dao động từ 5-7, phù hợp với điều

kiện pH ở RNM. Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy pH thích hợp để nuôi cấy NS thu protease là 5.6-

6.2 [19]. pH tối ưu của cả hai chủng là 5, phù hợp với pH tối ưu cho sinh trưởng của hai chủng NS.

Khi pH quá cao hoặc quá thấp làm ức chế quá trình trao đổi chất của và khả năng hoạt hóa của NS,

do đó sự ST và hoạt độ protease giảm.

Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của hai chủng NS

3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian .

5 2.377 0.011 2.101 0.018

6 2.250 0.003 1.986 0.020

7 2.250 0.005 1.941 0.006

8 0.151 0.023 1.703 0.007

3.3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian đến ST

Cấy các chủng NS vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL, đo trong 7 ngày liên tiếp.

Kết quả trình bày ở bảng 3.18 và biểu đồ 3.10.

Kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng NS có tốc độ ST tương đối bằng nhau. Thời gian ST

mạnh nhất của chủng Penicillium paxalli là từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 5, đường kính vòng ST từ

ngày 4 đến ngày 5 tăng 6,7mm, trong khi đó, từ ngày 1 đến ngày 4, sự tăng trưởng tương đối đồng

đều, mỗi ngày đường kính vòng tăng trưởng tăng khoảng 4mm. Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, tốc

độ tăng trưởng giảm rõ rệt.

Chủng Paecilomyces lilacinus có thời gian tăng trưởng mạnh nhất là từ ngày 2 đến ngày 3,

đường kính vòng tăng trưởng tăng 5,7mm. Từ ngày 3 trở đi, sự tăng trưởng giảm lại, mỗi ngày tăng

từ 2-3mm.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của thời gian đến ST của hai chủng NS.

Thời gian (ngày)

Khả năng sinh trưởng (mm)

Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus

1 2.0 1.7

2 6.2 6.3

3 10.0 12.0

4 14.0 15.2

5 20.7 18.7

6 22.3 22.8

7 22.8 25.0

Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đến sự ST

Theo nghiên cứu của S. S. Tzean và S. C. Chiu (1988) xác định rằng chủng Penicillium

paxilli sau 7 ngày nuôi cấy đường kính ST đạt 52mm [67], gấp đôi so với kết quả chúng tôi nghiên

cứu. Như vậy, so với các chủng NS ở đất liền, khả năng ST của NS ở RNM là chậm hơn. Đây là

điểm đặc trưng về sinh trưởng của NS ở RNM. Kết quả này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của

Khưu Phương Yến Anh (2007) và Nguyễn Thị Lan Hương (2009).

3.3.6.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease.

Nuôi cấy các chủng NS vào MT9 ở độ mặn 3%, pH 5, hàm lượng ĐN 5%, độ ẩm 55% đối

với Penicillium paxalli; hàm lượng ĐN 3%, độ ẩm 65% đối với Paecilomyces lilacinus. Thời gian

nuôi cấy khác nhau: 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h. Sau khi nuôi cấy, ly trích enzyme và xác

định hoạt độ protease theo phương pháp Anson.

Kết quả thu được như sau trình bày ở bảng 3.19 và minh họa ở đồ thị 3.6.

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease của hai chủng NS

Thời gian

(h)

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium

paxalli Sai số

Paecilomyces

lilacinus Sai số

24 0.099 0.002 0.198 0.001

36 0.421 0.007 0.454 0.004

48 0.639 0.011 0.972 0.012

60 1.555 0.004 2.310 0.004

72 2.342 0.013 2.024 0.009

84 2.432 0.008 1.242 0.003

96 1.261 0.010 0.697 0.001

Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đối với khả năng sinh enzyme ngoại bào. Khả năng

tổng hợp enzyme ngoại bào của NS tăng dần và đạt tối ra lúc bắt đầu sinh bào tử và sau đó bắt đầu

giảm dần. Từ kết quả trên cho thấy thời để hai chủng Penicillium paxalli và Paecilomyces lilacinus

cho hoạt độ protease cao nhất lần lượt là 84h và 60h. Thời gian này phù hợp với khoảng thời gian có

tốc độ ST mạnh nhất của hai chủng NS.

Có thể thấy thời gian nuôi cấy NS thu protease của hai chủng NS ở RNM (60-84h) dài hơn

các chủng NS từ đất liền (32-42h). Kết quả nghiên cứu của G.L. Maria, K.R. Sridhar và N.S.

Raviraja cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu để thu protease của các chủng NS ở RNM ở Tây Nam

Ấn Độ lên đến 144h [34]. Sở dĩ thời gian tối ưu để thu protease của hai chủng NS ở RNM dài hơn

so với các chủng NS ở đất liền là do sự ST của các chủng NS ở RNM chậm hơn sự ST của các

chủng NS ở đất liền.

Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease của hai chủng NS

- Như vậy, từ kết quả nghiên cứu trên, ta có thể rút ra một số điều kiện MT thích hợp cho

sinh tổng hợp protease của hai chủng NS như sau:

+ Chủng Penicillium paxilli: chất cảm ứng là bột ĐN, hàm lượng 5%, nhiệt độ 30oC, độ mặn

3%, độ ẩm 55%, pH 5, thời gian 84h.

+ Chủng Paecilomyces lilacinus: chất cảm ứng là bột ĐN, hàm lượng 3%, nhiệt độ 30oC, độ

mặn 3%, độ ẩm 65%, pH 5, thời gian 60h.

- Hoạt độ protease của Penicillium paxalli sau tối ưu hóa là là 2.432 UI/ml, trước tối ưu hóa

là 2.054 UI/ml (tăng 18%), của Paecilomyces lilacinus sau tối ưu hóa là 2.310 UI/ml, trước tối ưu

hóa là 1.918UI/ml (tăng 20%).

(a) ( b)

Hình 3.6. Vòng phân giải casein của Penicillium paxalli trước (a)

và sau khi tối ưu (b)

3.4. Nghiên cứu tách chiết protease bán tinh khiết từ dịch MT.

Để tìm ra tác nhân kết tủa để thu được protease bán tinh khiết có hoạt tính cao nhất, chúng tôi

tiến hành nuôi cấy 2 chủng NS vào MT9với các điều kiện tối ưu như đã trình bày. Sau đó ly trích

dịch enzyme và tiến hành tủa enzyme bằng 3 tác nhân khác nhau: cồn 90o, axeton và (NH4)2SO4.

Sau khi sấy khô, ta thu được enzyme bán tinh khiết.

Tiến hành đo OD để xác định hoạt độ protease của enzyme thu được, kết quả được trình bày

ở bảng 3.20, biểu đồ 3.11 và hình 3.6.

Bảng 3.20. Hoạt độ protease theo các tác nhân kết tủa khác nhau

Tác nhân kết tủa

Hoạt độ protease (UI/ml)

Penicillium paxalli

Sai số Paecilomyces lilacinus

Sai số

Axêton 58.462 0.208 52.782 0.269 Cồn 53.503 0.219 41.078 0.243

(NH4)2SO4 43.152 0.079 37.459 0.016

Biểu đồ 3.11. Hoạt độ protease theo các tác nhân kết tủa khác nhau

Axeton Cồn (NH4)2SO4

Paecilomyces lilacinus

Tác nhân kết tủa

Axeton Cồn (NH4)2SO4

Penicillium paxalli

Hình 3.6. Vòng phân giải casein của hai chủng NS với các

tác nhân kết tủa khác nhau

Từ kết quả trên cho thấy trong ba tác nhân kết tủa trên, axeton là tác nhân kết tủa cho hoạt độ

protease bán tinh khiết cao nhất ở cả hai chủng NS. Đối với chủng Penicillium paxalli, cồn cũng là

tác nhân kết tủa tốt. Riêng ( NH4)2SO4 cho kết quả yếu hơn hẳn hai tác nhân kết tủa còn lại.

Như vậy, axeton là tác nhân kết tủa cho hoạt độ protease bán tinh khiết cao nhất đối với cả 2

chủng NS.

3.5. Một số đặc điểm sinh học khác của hai chủng NS.

Để hiểu rõ hơn về đặc điểm và vai trò của hai chủng NS, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng

sinh KS và một số enzyme ngoại bào như amylase, cellulase, kitinase của chúng.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.21 .

Bảng 3.21. Một số đặc điểm sinh học của hai chủng NS.

Đặc điểm sinh học Đặc điểm sinh học (D-d) ( mm)

Penicillium paxalli Paecilomyces lilacinus

Hoạt tính kháng E. coli 3 7

Hoạt tính kháng B. Subtilis 13 3

Hoạt tính amylase 2.5 8

Hoạt tính cellulase 7 8

Hoạt tính kitinase 10 12

Chúng tôi nhận thấy hai chủng NS đều có khả năng đối kháng với 2 loại VK kiểm định

nhưng ở mức trung bình và yếu.

Ngoài khả năng sinh protease mạnh, hai chủng NS trên cũng có khả năng sinh được cả ba

loại enzyme amylase, cellulase, kitinase, trong đó hoạt tính kitinase là cao hơn cả. Chính các

enzyme ngoại bào này giữ vai trò quan trọng trong quá trình phân giải nguồn cơ chất tự nhiên ở

RNM Cần Giờ. Vì vậy mà NS giữ một vai trò quan trọng trong HST ở RNM, chúng góp phần khép

kín chu trình sinh địa hóa các chất trong HST.

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Hình 3.7. Hoạt tính kháng E. coli của hai chủng NS.

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Hình 3.8. Hoạt tính kháng B. subtilis của hai chủng NS

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Hình 3.9. Hoạt tính amylase của hai chủng NS.

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Hình 3.10.Hoạt tính kitinase của hai chủng NS.

Penicillium paxilli Paecilomyces lilacinus

Hình 3.11.Hoạt tính cellulase của hai chủng NS.

CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Như vậy qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thu được một số kết quả như sau:

1. Từ 5 xã ở RNM Cần Giờ, chúng tôi phân lập được 409 chủng NS trong đó có 64 chủng từ

đất mặt (15,64%), 53 chủng từ đất sâu (12,96%), 59 chủng từ cành khô (14,43%), 81 chủng từ cành

mục (19.8%), 71 chủng từ lá vàng (17,36%), 81 chủng từ lá mục (19,8%).

2. Đã xác định được 257/409 chủng NS có hoạt tính protease (62,84%). Trong đó số chủng

NS có hoạt tính protease thay đổi theo thứ tự: cành mục > lá mục > đất mặt > cành khô > lá vàng >

đất sâu.

Căn cứ vào hoạt độ protease và khả năng chịu mặn của các chủng NS chúng tôi chọn 2 chủng

12CM3.4 và 551LM3 để đi sâu nghiên cứu.

3. Tiến hành định danh đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử xác định chủng

12CM3.4 là Penicillium paxilli, độ trùng khớp 99%, chủng 551LM3 là Paecilomyces lilacinus, độ

trùng khớp 100%.

4. Xác định điều kiện tối ưu cho ST và hoạt độ protease của mỗi chủng NS như sau:

- Chủng Penicillium paxilli:

+ Điều kiện ST: nguồn N casein, độ mặn 3%, nhiệt độ 30oC, pH 5

+ Điều kiện cho hoạt độ protease: chất cảm ứng là bột ĐN, hàm lượng 5%, nhiệt độ 30oC, độ

mặn 3%, độ ẩm 55%, pH 5, thời gian 84h.

- Chủng Paecilomyces lilacinus:

+ Điều kiện sinh trưởng: nguồn N casein, độ mặn 1%, nhiệt độ 30oC, pH 5

+ Điều kiện cho hoạt độ protease: chất cảm ứng là bột ĐN, hàm lượng 3%, nhiệt độ 30oC, độ

mặn 3%, độ ẩm 65%, pH 5, thời gian 60h.

5. Cả 2 chủng NS đều có khả năng đối kháng với 2 loại VK kiểm định (B. subtilis và E. coli),

khả năng sinh được cả ba loại enzyme amylase, cellulase, kitinase, trong đó hoạt tính kitinase cao

hơn cả.

6. Để thu nhận protease bán tinh khiết từ 2 chủng NS có hoạt độ cao nhất có thể sử dụng tác

nhân kết tủa axeton là thích hợp.

4.2. Đề nghị

Trên đây là kết quả nghiên cứu bước đầu để có thể sớm đưa 2 chủng NS này vào ứng dụng.

Chúng tôi đề nghị tiếp tục nghiên cứu một số các chỉ tiêu sau:

- Nghiên cứu một số tính chất của chế phẩm protease thu được.

- Thử nghiệm tác dụng của protease trong thực tiễn chăn nuôi.