nhÓm 8_ĐỊnh tÍnh vibrio cholerae trong thỰc phẨm.pptx

7/16/2019 NHÓM 8_ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM.pptx

http://slidepdf.com/reader/full/nhom-8dinh-tinh-vibrio-cholerae-trong-thuc-phampptx 1/44

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

SVTH: NHÓM 8



NỘI

DUNG



Hình ảnh về Vibrio cholerae dƣới kính hiển vi sau khi

đƣợc nhuộm màu

1

Giới thiệu về Vibrio Cholerae 1



Phân loại khoa học Giới (regnum): Bacteria

Ngành (phylum): Proteobactreia

Lớp (class): Gamma proteobacteria

Bộ (ordo): Vibrionales

Họ (familia): Vibrionaceae

Chi (genus): Vibrio

Loài (species): V.cholerae



Giới thiệu về Vibrio Cholerae 1

- Thuộc giống Vibrio

- Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộng

- Phát triển ở nhiệt độ 420

C, có thể tồn tại cả ở nước mặn vànước ngọt

- Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và

trong thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh nhưng ở điều kiệnkhô không sống quá 48h

- R ất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu.

V. cholerae gây bệnh dịch tả do vệ sinh kém, nguồn nước ô

nhiễm, nhưng cũng có thể gây ngộ độc thực phẩm.

Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc 2 nhóm huyết

thanh O1 và O139



Cholerae lên men không sinh khí,

có khả năng làm dịch hóa gelatin

Có khả năng khử nitrat thành nitrit

và phân giải trytophan thành indol

Vibrio cholerae phát triển đƣợc ở

vùng có nồng độ muối cao 3%

Có khả năng lên men đƣờng glucose,

sucrose,mannose, khử lysine

Cách thức

sinh trƣởng

của Vibrio

cholerae

Cách thức sinh trƣởng:



Quy trình phân tích2



Bƣớc 1: Đồng nhất mẫu

Cân vô trùng 25g mẫu hải sản vào túi PE đã vô trùng. Cắt cácmẫu lớn thành các mảnh nhỏ rời rồi thêm 225ml nước pepton

kiềm APW trong túi, nghiền bằng máy nghiền đồng thể trong 2

phút. Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 370C ±1,00C và 420C ±0,20Ctrong 6 – 24h

Tiến hành phân tích



Bƣớc 2: Tăng sinh

a. Đối với mẫu thông thƣờng

Ủ các bình chứa đã chuẩn bị ở nhiệt độ 370C ±1,00C trong 6 – 8h.Sau đó, phân lập như qui định, phần còn lại ủ tiếp 16 – 24h rồi

phân lập lại.

b. Đối với mẫu hàu

Ủ một dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 370C ±1,00C trong 6 – 8h và 16 – 24h.Ủ một dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 420C ±0,20C trong 6

– 8h.




Bƣớc 3: Phân lập và đọc kết quả trên đĩa

- Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên,

không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào

môi trường TCBS thạch. Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 370C

±1,00C trong 18 – 24h.

- Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng (tròn, hơi dẹt, bóng vàng, ở giữa

đậm và có viền mờ xung quanh).

- cấy ria lên môi trường không chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm

ở 370C để thu sinh khối cho các thử nghiệm hóa sinh.


V. Cholerae trên TCBS



www.themegallery.com

Thử nghiệm

sinh hóa

TN sinh hóa sơ bộ

TN sinh hóa

khẳng định

Kháng huyết thanh

Bƣớc 4




- Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS để cấy

sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl.- Ủ ở nhiệt độ 370C trong 18 – 24h.

- Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để

thực hiện các thử nghiệm sinh hóa.




TN trên môi trƣờng TSI/KIA

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSAvào ống thạch nghiêng TSI(hoặc KIA).

Nới lỏng cácnắp ống để

tạo điều kiện hiếu khí

Ủ ở nhiệt độ 370C±1,00C trong 18 –

24h.

Kết quả

Trên môi trường TSI ( phải), môi trường KIA(trái)



TN với các canh thang trypton muối

Nuôi ủ ở nhiệt độ 370C ±1,00C trong 18 – 24h, rồi ủ lại

các ống âm tính sau 18 – 24h

V. cholera phát triển được trong ống canh thang có nồng

độ NaCl là 0%, 1%, 3% và làm đục môi trường.

Cấy khuẩn lạc từ TSA vào các ống canh thang muối

trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10%.




TN lên men – oxy hóa

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán

lỏng Hugh – Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 –

2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống. Ủ các ống

nghiệm ở nhiệt độ 370C trong 1 – 2 ngày.

V. cholerae lên men glucoza làm môi

trường Hugh – Leifson từ màu tím

chuyển thành vàng Môi trường O/F từ màu xanh thành vàng




Đặt giấy lọc lên một nắp đĩa

petri, nhỏ 2 -3 giọt thuốc thử

oxidaza. Dùng que cấy vô

trùng lấy các khuẩn lạc từ môi

trường TSA ria lên vị trí đã

nhỏ thuốc thử oxidaza. V.

cholera làm vết ria có màu tím

thẫm hoặc xanh thẫm sau 10

giây.

TN oxidaza




Nhuộm gram

V. Cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.




TN sinh hóa khẳng định

TN phát triển ở nhiệt độ

Cấy vi khuẩn từ TSA vào

một ống canh thang trypton

1% NaCL. Ủ ở nhiệt độ

420C trong 18 – 24h. V.

cholera phát triển được ở

nhiệt độ 420C làm môi

trường đục.

Mt đục Mt đầu




TN cacbonhydrat

Phản ứng dương tính khi

môi trường có màu vàng, âm tính

khi môi trường giữ nguyên màuđỏ.

V. Cholerae cho phản ứng

sacaroza, manniton, mannoza

dương tính và lactoza, cellobiza,

arabinoza âm tính.Lên men đƣờng manniton(+) vàng hoặc vàng với bong bóng khí,

(-) đỏ



TN decacboxylaza/ dehydrolaza

Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithine,

lysine, arginine và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống

được phủ 1 – 2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 370

C± 1,00C trong 18 – 24h

→ lysine (+), arginine (-), ornithine (+), control (-)





TN ure

Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang ure, ủ ở nhiệt độ 370C ±1,00C

trong 18 – 24h. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường

giữ nguyên màu tím hồng



Có thể dùng đĩa ONPQ thay cho thuốc thử ONPQ. Hòa tan

khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối

sinh lý. Đặt đĩa ONPQ vào đáy ống rồi ủ ẩm và đọc kết quả

như trên V. cholera cho phản ứng ONPQ dương tính khi dung

dịch có màu vàng

Thử nghiệm ONPG


Lactose agar

Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (-)

ủ qua đêm

37o

C

Pứ (+)

Màu vàng



Thử nghiệm Oxidase (a) +

Thử nghiệm indole(b)

+

Lên men Glucose +

Lên men Frutose +

Lên men Mannose +

Lên men Lactose -

Lên men Arabinose -

H2S -

Thử nghiệm Urease(c) -

Enzyme (Catalase, Lysine và Orithine

decarboxylase)

+

Enzyme (Arginine dihydrolase) -

ONPG +



TN kháng huyết thanh

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một

giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùngque cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên

hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận

dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối.



Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V.

cholerae theo bảng 1 và bảng 2.

Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1

Dung dịch

muối sinh lý

Kết luận

Chủng có kết quả sinh hóa

tương tự V.

cholera

+ - V. Cholerae O1


tương tự V.cholera

- - V. Cholerae non

– O1


tương tự

V.cholera

+ + Chủng không

đặc hiệu với kháng nguyên O

nhóm 1

Bảng 1 – Phân biệt V. cholerea O1 và V. cholerae non – O1



Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh

V. cholerae theo bảng 1 và bảng 2.

Bảng 2 – Phân biệt các kiểu chủng huyết thanh chủng V. cholerea O1

Kháng

nguyên

Kháng

huyết thanh

Inada

Kháng

huyết thanh

Ogawa

Dung dịch

muối sinh

lý

Kết luận

V. Cholerae

O1

+ - - Chủng

Inaba

V. Cholerae

O1

- + - Chủng

Ogawa

V. Cholerae

O1

+ + - Chủng

Hikojima

V.Cholerae

O1

- - - Chủng

không đặc

hiệu

Đọc kêt quả

Phát hiện hoặc không phát hiện được V.cholera trong

25 g mẫu.



3 Ví dụ 3



Chuẩn bị mẫu

Mẫu hải sản

Vô trùng, cắt nhuyễn

Tăng sinh

Ủ 41,5 trong 8-12giờ

Dịch tăng sinh.

Môi trường ASPW (môi trường nước pepton

muối kiềm)

Môi trường ASPW bổ sung 3% NaCl và

polymycin B 50UI



Phương pháp nghiên cứu

Xác định V. cholerae bằng phản ứng hóa sinh

Dịch tăng sinh

Cấy lên mt TCBS ủ 37

, 18-24h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Cấy lên mt TSI ủ 37, 24h

Chọn mt chuyển màu vàng, không sinhhơi và để thử hóa sinh khẳng định




Thử nghiệm Oxidase +

Thử nghiệm indole +

Lên men Glucose +

Lên men Frutose +

Lên men Mannose +

Lên men Lactose -

Lên men Arabinose -

H2S -

Thử nghiệm Urease(c) -

Enzyme (Catalase, Lysine vàOrithine decarboxylase)

+

Enzyme (Arginine dihydrolase) -

NaCl 3%+




Bảo quản gốc ở BHI bổ sung 20% glycerol, giữ ở −20

Chuyển vào canh BHI ủ 37, 18-24h

Cấy lên thạch TCBS




Xác định V. cholerae bằng kỹ thuật m-PCR

Dịch tăng sinh

Ly tríchDNA

Chạy mPCR Điện di Kết quả



Ly trích DNA

Lấy 1ml dịch tăng sinh, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút, phần

cặn được hòa tan trong 100 TE 0,5X để ly trích DNA



Nguyên tắc PCR

1

2

3

4

n

2n

DNA đích

1 Biến tính (94oC )

2 Bắt cặp (55-65o C)

3 Kéo dài (72o C)

5’ 3’

3’ 5’



Thành phần phản ứng mPCR gồm:• 13,5 hỗn hợp master mix (2 UI Ampli Taq gold; 0,2mM

dNTP; buffer 10X; 1,5mM )

• 0,5 mỗi đoạn mồi (nồng độ 0,625 )• 0,5 DNA khuôn mẫu

• 25 nước cất hai lần

Quy trình nhiệt: 95 trong 30 giây; 95 trong 30 giây,50 trong 30 giây, 72 trong 1 phút lặp lại chu kỳ 40 lần;

72 trong 6 phút

Chạy mPCR



Điện di

Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 1X trên gel

agarose 1,5%, thời gian điện di là 50V/45 phút.

Sau khi điện di, bảng gel agarose dược nhuộm bằng dung dịch

ethium bromide 1/10.000 và nhận diện nhờ máy chiếu tia UV



Kết quả

Bảng So sánh tỷ lệ phát hiện V cholerae giữa phương pháp sinh hóa và



Dung dịch pepton muối kiềm (Môi trƣờng 1)

Địa điểm

Phƣơngpháp

Loại mẫu

Đồng Nai (n=127) Tp. Hồ Chí Minh

(n=113)

Tổng công (N=240)

Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR

n % n % n % n % n % n %

Tôm 13 34,2 13 34,2 14 42,4 14 42,4 27 38,0 27 38,0

Nhuyễn thể 34 38,2 40 44,9 38 47,5 39 48,7 72 42,6 79 46,7Chung 47 37,0 53 41,7 52 46,0 53 46,9 99 41,3 106 44,2

Dung dịch nƣớc pepton muối kiềm bổ sung polymycin B 50UI và 3% NaCl (Môi trƣờng 2)

Địa điểm

Phƣơngpháp

Loại mẫu

Đồng Nai (n=127) Tp. Hồ Chí Minh

(n=113)

Tổng công (N=240)

Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR Sinh hóa m-PCR

n % n % n % n % n % n %

Tôm 0 0,00 4 10,5 5 15,2 12 36,4 6 8,4 17 23,9

Nhuyễn thể 8 8,9 50 56,2 12 15,0 43 53,7 18 10,7 93 55,0Chung 8 6,3 54 42,5 17 15,0 55 48,7 24 10,0 110 45,8

Bảng . So sánh tỷ lệ phát hiện V.cholerae giữa phương pháp sinh hóa và

m-PCR DNA ly trích từ dung dịch tăng sinh



Kết quả

Ghi chú: Tôm: n = 71 (Đồng Nai: 38 mẫu; Tp. Hồ ChíMinh: 33 mẫu) Nhuyễn thể: n = 169 (Đồng Nai: 89 mẫu; Tp. Hồ Chí

Minh: 80 mẫu)

V. Cholerae dịnh danh được bằng phương pháp m-PCR

cao hơn phương pháp sinh hóa ở cả 2 môi trường tăng

sinh (44,2% so với 41,3% ở môi trường 1 và 45,8% so

với 19,0% ở môi trường 2)



L/O/G/O

nhÓm 8_ĐỊnh tÍnh vibrio cholerae trong thỰc phẨm.pptx

Documents