Nitrogen fixation

Como se forman los nódulos

Flavonoides se liberan de las raíces

Se establece comunicación con bacterias

Activación de expresión de genes nod

Los factores nod se liberan de la bacteria e interaccionan con la raíz

GENES DEL PROCESO SIMBIÓTICO

GENES NOD DE RHIZOBIUM LOCALIZADOS DENTRO DE UN ADN CIRCULAR (PLÁSMIDO) CONOCIDO COMO SYM (PARA SIMBIOSIS)

nodD = su expresión es diferencialmente afectada por los exudados de la raíz lo cual activa a:

nodA, nodB y nodC = genes de nodulación comunes a todos los Rhizobium y a:

nodE, nodF, nodG, nodH = genes hospedero-específico

Como se forman los nódulos

Flavonoides se liberan de las raíces

Se establece comunicación con bacterias

Activación de expresión de genes nod

Los factores nod se liberan de la bacteria e interaccionan con la raíz

Activación de expresión de genes de nodulina

Infección de la raíz

Formación del bacterioide/crecimiento del nódulo

NODULINAS TEMPRANAS

GENES DE NODULINAS TEMPRANAS

INVOLUCRADOSEN LA INFECCIÓN DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA Y FORMACIÓN DEL PRIMORDIO DEL NÓDULO

Condiciones para la fijación de N

• Requiere nitrogenasa,

• Un reductor (ferredoxina reducida),

• ATP,

• Condiciones libres de oxígeno

•Controles regulatorios (ADP inhibe la reacción y el NH4

+ inhibe la expresión de genes nif)

¿Porque la nitrogenasa requiere de ATP?

• La barrera de activación para el rompimiento del triple enlace de la

molécula de N2 enorme, necesitandose de 16 ATP

To break the triple bond, energy input in To break the triple bond, energy input in necessarynecessary

Genes nif estructurales y reguladores

nif D y nif K MoFe-proteína

nif H Fe-proteína

nif F Ferredoxina

Otros genes nif involucrados en la inserción del cofactor FeMo y la activación y procesamiento del complejo enzimático

Síntesis de nitrogenasa Genes nif

NITROGENASA

Dos proteínas de diferente tamaño.

Un dímero (24-36 kD) llamada Fe-proteína por contener un cluster de 4 iones Fe unidos a 4 azufres (Fe4S4)

Nitrogenasa

Heterotetramero de 220 kDa

Llamado MoFe-proteína

• Cada molécula de enzima contiene cofactores Fe-Mo-S (clusters Fe4S4)

MoFe-proteína - Fe-proteína

Rendimiento Neto: N2 + 6H+ + 6e- 2NH3

N2 + 8H+ + 16MgATP + 8e- 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

Nitrogenasa

MoFe-proteína - Fe-proteína

Rendimiento Neto: N2 + 6H+ + 6e- 2NH3

N2 + 8H+ + 16MgATP + 8e- 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

Nitrogenasa

The nitrogenase reactionThe nitrogenase reaction

Accumulation

of electrons

Nitrogenasa Nitrogenasa reductasareductasa

Complejo entre Complejo entre nitrogenasa reductasa y nitrogenasa reductasa y nitrogenasanitrogenasa

Condiciones para la fijación de N

• Requiere nitrogenasa,

• Un reductor (ferredoxina reducida),

• ATP,

• Condiciones libres de oxígeno

•Controles regulatorios (ADP inhibe la reacción y el NH4

+ inhibe la expresión de genes nif)

La nitrogenasa es muy sensible al O2

La Fe-proteína como la MoFe-Proteína son rápidamente inactivadas por el oxígeno reduciendo su vida media de la Fe-proteína de 30 – 45 segundos y la MoFe-Proteína de 10 minutos

Sin embargo el elevado requerimiento de ATP que son producidas vía respiración celular la cual solo opera eficientemente si el Oxígeno esta presente

Ello plantea un conflicto por la sensibilidad de la nitrogenasa al O2

O2 Problem and Diversity

• Aerobes: uses O2

• Cyanobacteria: O2-resistant heterocysts

• Methanogens: extremely anoxic environments

• Symbionts: co-produce O2-binding "leghemoglobin”

Hay especies de Bacterias de vida libre han retenido un estilo de vida anaeróbicas y fijan N2 en estas condiciones por lo que la producción de ATP y reductores es marcadamente menos eficiente

Las cianobacterias presentan estructuras denominadas heterocistos donde aislan el aparato metabólico de fijación de Nitrógeno y por medio de paredes celulares multicapas restringen la difusión de oxígeno y compartamentalizan la generación de ATP al interior del heterocisto.

En los nódulos de leguminosas el aporte de oxígeno es regulado en gran medida por una proteína que enlaza el oxígeno (Leghemoglobina) sintetizada por la planta hospedera. La leghemoglobina controla la liberación de O2 en la región del bacteroide

•El componente heme de la leghemoglobina es suministrado por el bacteroide

GENES DE NODULINAS TARDÍAS

INICIO DE FIJACIÓN DE NITRÓGENO Y MANTENIMIENTO Y FUNCIONAMIENTO DEL NÓDULO.

LEGHEMOGLOBINA EJEMPLO DE NODULINA TARDÍA

. . Controles regulatorios

ADP inhibe la reacción

NH4+ inhibe la

expresión de genes nif)

• Nitrato reductasa

• Los electrones son transferidos desde el NADH al nitrato

• Nitrato reductasa

• Los electrones son transferidos desde el NADH al nitrato

• Los complejos Mo-proteína se requieren tanto para la actividad reductasa como para el ensamblaje de las unidades de la enzima (nitrato reductasa) al dímero activo

Enzimas que contienen MoEnzimas que contienen Mo

Molibdopterina

Dos clases de molibdoenzimas

Enzimas dependientes de Molibdopterina

Nitrato reductasa

Nitrogenasa

Nitrito Reductasa• La luz regula la reducción de ferredexina y

flujo electrónico hacia 4Fe-4S y siroheme y de ahí hacía el nitrito

•El nitrito es reducido a amonio

Nitrogen fixation

•En las plantas superiores, la nitrito reductasa se ubica en cloroplastos y la nitrato reductasa en citosol

• La Nitrogenasa es lenta

•Solo 12 e- pares por segundo i.e., tres moleculas de N2 por segundo

No-leguminosas –fijadoras de nitrógeno

•Azolla

•Anabaena

•Alnus

•Frankia

Ademas de Rhizobium

The Fate of AmmoniumThe Fate of AmmoniumTwo major reactions in all cells

Glutamate dehydrogenase – reductive amination of alpha-ketoglutarate to

form glutamate Glutamine synthetase

– ATP-dependent amidation of gamma-carboxyl of glutamate to glutamine

The glutamate dehydrogenase reactionThe glutamate dehydrogenase reaction

The glutamine synthetase reactionThe glutamine synthetase reaction

Ammonium AssimilationAmmonium AssimilationTwo principal pathways

Principal route: GDH/GS in organisms rich in N both steps assimilate N Secondary route: GS/GOGAT in organisms

confronting N limitation GOGAT is glutamate synthase or glutamate:oxo-

glutarate amino transferase

The glutamate dehydrogenase/glutamine The glutamate dehydrogenase/glutamine synthase pathwaysynthase pathway

One each

Two N fixing steps - one inefficient

The glutamate synthase reactionThe glutamate synthase reaction

The glutamine synthase/GOGAT pathwayThe glutamine synthase/GOGAT pathway

One NADPH

Two ATP

One N fixing step - inefficient but expensive