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19 ottobre 2011 Alessio Branchini
NMD-
Nonsense-Mediated Decay
Università degli studi di FerraraCorso di Laurea in Scienze Biomolecolari e CellulariMacromolecole Biologiche
PREMATURE vs NORMAL TERMINATION
mRNA
PTC Ter
AUG UGA/UAG/UAA UGA/UAG/UAA
7mG A(n)
???? Stable RNA
…PTC? Ter?....
Truncated polypeptideProtein metabolism
RNA metabolism
Full-length polypeptide
Processamento e maturazione del mRNA negli eucarioti
Trasporto attraverso il complesso del poro nucleare
Il ciclo vitale del mRNA nel citoplasma
Terminazione della traduzione
Stop codon
Forma stabilizzata
Circolarizzazione e traduzione del mRNA negli eucarioti
1. Codone di stop in frame
2. Riconoscimento da parte dei fattori di rilascio
3. Idrolisi legame peptidico
12
3
Citoplasma eIF4E sostituisce CBC all’estremità 5’-cap
Trasporto del mRNA negli eucarioti
Meccanismi di controllo di qualità per assicurare fedeltà all’intero percorso cui è sottoposto il messaggero
Quality Control mRNA Surveillance
Nucleo Citoplasma
Esosoma
(Idrolisi 3’ 5’ introni excisi)
Difetti di splicingo poliadenilazione
La concentrazione di un mRNA dipende dal bilancio tra la quota di messaggero sintetizzata e la quota di messaggero degradata
mRNA con codoni di stop prematuri
Nonsense-mediated decay (NMD)
Poro Nucleare
NO a pre-mRNA da splicing incompleto e
associati allo spliceosoma
IL COMPLESSO DI GIUNZIONE ESONICA
EJC(Exon-junction
complex)
Complesso multiproteico depositato durante lo splicing circa 20-24 nucleotidi a monte di ogni giunzione esone-esone
Dipendenza dallo splicing!!
Evento chiave Il PIONEER ROUND della traduzione
CBC
Passaggio del ribosoma sul trascritto contenente EJCs
Spiazzamento degli EJCs
Sostituzione CBC (CBP80/CBP20) eIF4E
Codone di stop stallo del
ribosoma
Se la distanza tra stop codon e la giunzione esone-esone successiva è ≥ 55 nt Stop codon = PTC
Dipendenza dalla traduzione!!
Passaggio del ribosoma
Il PIONEER ROUND della traduzione
Stopcodon
Ribosoma in stallo a livello del codone di stop
Gli EJC sono piattaforme di legame per le proteine UPF
UPF3
UPF2
UPF1
Nucleo
Zona perinucleare
Citoplasma
SMG1
SMG7
SMG5
SMG6
Sequenza di legame
Fattori addizionali
Protein chinasiProteine con dominio14-3-3-like per legare
residui fosforilati
Legati agli EJC in TUTTI i trascritti
Fattore reclutatoindispensabile
SURF Complex(SMG1-UPF1-eRF1-eRF3)
Codone di stop stallo del ribosoma
Se > 55 nt da EJ Stop codon = PTC
NMD Il PIONEER ROUND della traduzione
CBCPassaggio del ribosoma sul trascritto contenente EJCs
Dipendenza dalla traduzione!!
Il complesso di giunzione esonica si localizza suimRNA legati a CBC ma NON sui mRNA legati a eIF4E
EJC Proteins
UPF1 è regolato da cicli di fosforilazione/defosforilazione
Il complesso UPF1:UPF2:UPF3 induce lafosforilazione di UPF1
La fosforilazione di UPF1 recluta il complesso
SMG7/SMG5
mRNA decay(degradazione
del messaggero)+
Riciclo di UPF1 e dei fattori
coinvolti
?
RIASSUNTO: Terminazione normale vs NMDTerminazione normale Codone di stop NMD
Legenda
EJC
Esperimento in cui viene dimostrato come gli EJC siano localizzati solo sugli mRNA legati a CBP80 (proteina che fa parte del cap-binding complex) ma non a eIF4E.L’esperimento prevede una co-immunoprecipitazione che ha lo scopo di vedere quali proteine siano legate a CBC o a eIF4E. Estratti nucleari (N) e citoplasmatici (C) vengono in un primo momento messi in contatti con anticorpi diretti contro CBC e eIF4E per avere l’immunoprecipitato di queste proteine. Successivamente viene eseguito un western blot in cui si utilizzano anticorpi contro le altre proteine che si pensa possano interagire o comunque essere presenti insieme a CBC o eIF4E.Quindi dall’utilizzo incrociato degli anticorpi si può vedere come le proteine costituenti gli EJC siano presenti negli immunoprecipitati di CBC sia nel nucleo che nel citoplasma (fila di mezzo nelle due serie), mentre nessuna proteina degli EJC co-immunoprecipita con eIF4E (fila a destra).
IMMUNOPRECIPITAZIONE ASSOCIATA A WESTERN BLOT
EJC components
mRNA with PTCmRNA wild-typeEJC components
no CBCeIF4E exchangeNMD
CBCeIF4E exchangemRNA translation by ribosomes