Nowoczesne metody diagnostyczneNowoczesne metody diagnostyczneDiagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod Diagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod 

diagnostycznychdiagnostycznych

dr hab. Beata Krawczykdr hab. Beata Krawczyk

Katedra Mikrobiologii PGKatedra Mikrobiologii PG

Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Laboratoria rządowe i prywatne

L b t i kli iLaboratoria kliniczne 

‐ naukowe

Laboratoria kliniczne‐ diagnostyka w szpitalach Laboratoria referencyjne

22

Diagnostyka molekularna w medycynie

Zastosowanie Specjalności

Diagnostyka molekularna w medycynie

p j

Diagnostyka:•chorób dziedzicznych•niektórych typów Genetyka, onkologianiektórych typów nowotworów•chorób infekcyjnych•chorób inwazyjnych

Genetyka, onkologia

Wirusologia, bakteriologia, mikologia, parazytologiayj y g , p y g

Badania prognostyczne, monitorowanie terapii

Choroby genetycznie uwarunkowane, farmako-p ,genetyka, choroby infekcyjne i inwazyjne

Ustalanie pokrewieństwa Transplantologia medycynaUstalanie pokrewieństwa, badanie śladów biologicznych

Transplantologia, medycyna sądowa

33

Materiał klinicznyBarwienie metodą Grama

i mikroskopia Hodowle

Mikrobiologia klasyczna Mikrobiologia klasyczna 

i mikroskopia

Pożywki płynnePodłoża stałeTesty na obecnośćHybrydyzacja Hybrydyzacja 

„i„in situ”n situ” y p y

Proste testy biochemiczne (katalaza, indol)

Testy na obecność przeciwciał

Testy na obecnośćantygenu:‐ ELISA, 

przeciwciała monoklonalne

„i„in situn situdiagnostyka DNAdiagnostyka DNA

barwienie otoczek, badanie ruchliwości itp.

Identyfikacja gatunkowasystemy automatyczne: enzymologia i biochemia; 

‐ przeciwciała monoklonalne

Kwasy nukleinowe: Kwasy nukleinowe: sondy DNA,sondy DNA,

amplifikacja DNAamplifikacja DNA y y y y g ;

Testy wrażliwości na antybiotyki

Analiza epidemiczna:

amplifikacja DNA,amplifikacja DNA,sekwencjonowaniesekwencjonowanie DNADNA

Klasyczne:fagotypowanie

Racjonalna terapiai nadzór epidemiologiczny

Prewencja 

fagotypowanie, serologia, antybiogramy

MolekularneMolekularne::

BIOFIZYKA, BIOCHEMIA

I TECHNOLOGIE„OMICS” MolekularneMolekularne::techniki amplifikacji, analiza RFLPtechniki amplifikacji, analiza RFLP

detekcja SNPdetekcja SNPsekwencjonowaniesekwencjonowanieMetody biologiczne Metody biologiczne 

44

Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej znajdują Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej znajdują zastosowanie klasyczne metody zastosowanie klasyczne metody badania drobnoustrojów badania drobnoustrojów 

oparte na analizie ich cech fenotypowychoparte na analizie ich cech fenotypowychoparte na analizie ich cech fenotypowych oparte na analizie ich cech fenotypowych ((metody fenotypowemetody fenotypowe) ) 

oraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznegooraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznegooraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznego, oraz metody oparte na analizie ich materiału genetycznego, wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej 

((metody genotypowemetody genotypowe). ). 

55

D t Odk i

Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnej.Data Odkrycia

1953 poznanie struktury helikalnej dwuniciowego DNA

1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli

1960 pierwsza technika hybrydyzacji

1969 hybrydyzacja in situ

1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych i odwrotnej transkryptazy1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych i odwrotnej transkryptazy

1975 Southern blotting

1977 sekwencjonowanie DNA, (genom φ174)

1983 pierwsza synteza oligonukleotydów

1985 analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych

1985 wynalezienie PCR

1986 zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ (FISH)

1988-1991 Chipy DNA

1988 dk i t t bil j li DNA t li j PCR1988 odkrycie termostabilnej polimerazy DNA - optymalizacja PCR

1995 sekwencjonowanie bakterii

1992 koncepcja real-time PCR

1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA

2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu 66

środowisko

Genotyp

genom

Ekspresja genu Fenotypgenom

Metody genotypowe

☺Metodywykorzystujące

Metody fenotypowe

Klasyczne Molekularnewykorzystujące właściwości kwasów nukleinowych

☺Metody oparte na ó

Klasyczne

Biotypowanie

Typowanie bakteriofagowe

Molekularne

Analiza białek-PAGE, MLEE

Immunodiagnostykaanalizie kwasów nukleinowych

-analizie genu

li i f t

bakteriofagowe

Typowanie bakteriocynowe

Antybiogramy

Immunodiagnostyka

-analizie fragmentu genu

-analizie genomu

Antybiogramy

77

Laboratoria na świecie wykorzystujące nowoczesne metody diagnostyczne (dane z 2008 roku)

7,8 %3,7 %

diagnostyczne (dane z 2008 roku) 

Laboratoria kliniczne39,9 %8,2 %

Uniwersytety  

Instytuty badawcze

Ośrodki Referencyjne

11 9 % Instytuty badawcze

inne

Laboratoria zdrowia publicznego

11,9 %

28,4 %

Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp. 222‐226  88

Diagnostyka molekularnaDiagnostyka molekularna ‐‐ celcel badawczybadawczyDiagnostyka molekularna Diagnostyka molekularna ‐‐ cel cel badawczybadawczy

30,1%

20,9%

analiza zakażeń szpitalnych  

nadzór epidemiologiczny

analiza molekularna markerów2,8%

narodowe badania referencyjne

poznawcze

kontrola jakości

7,3%

25,6%

13,3%

Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp. 222‐226  99

Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:Wprowadzanie nowych metod diagnostycznych:

1 powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację1 powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację1. powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację, 1. powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację, komputerowe opracowanie danych ( szybkość uzyskiwania wyników); komputerowe opracowanie danych ( szybkość uzyskiwania wyników); 2. ograniczyć czynności (manipulacje z próbką); 2. ograniczyć czynności (manipulacje z próbką); 3 granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod3 granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod3. granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod 3. granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod już stosowanych lub niższe; już stosowanych lub niższe; 4. zapewnić odpowiednią powtarzalność i odtwarzalność wyników;4. zapewnić odpowiednią powtarzalność i odtwarzalność wyników;5 zapewnić precyzję i dokładność testu;5 zapewnić precyzję i dokładność testu;5. zapewnić precyzję i dokładność testu; 5. zapewnić precyzję i dokładność testu; 6. powinny być łatwe w aplikacji;6. powinny być łatwe w aplikacji;7. nie powinny wymagać drogiego i wysoce specjalistycznego sprzętu; 7. nie powinny wymagać drogiego i wysoce specjalistycznego sprzętu; 8 l d i ć k t t i j j d t ść8 l d i ć k t t i j j d t ść8. uwzględniać koszty aparatury i jej dostępność; 8. uwzględniać koszty aparatury i jej dostępność; 9. koszt analizy pojedynczej próbki; 9. koszt analizy pojedynczej próbki; 10. nowe metody powinny uwzględniać takie 10. nowe metody powinny uwzględniać takie aspekty aspekty analizy jak analizy jak możliwość wykrywania takich drobnoustrojów które są trudne w hodowlimożliwość wykrywania takich drobnoustrojów które są trudne w hodowlimożliwość wykrywania takich drobnoustrojów, które są trudne w hodowli możliwość wykrywania takich drobnoustrojów, które są trudne w hodowli lub nie dają się hodować, bądź są wolno rosnące. lub nie dają się hodować, bądź są wolno rosnące. 

1010

Clinical and Laboratory StandardsInstitute – CLSI

International Organization for Standarizationg(ISO)/Technical Committee 212

wytyczne do walidacji nowych, nie farmakopealnych, szybkich testów mikrobiologicznych 

[PDA J l f

PDA – Parenteral Drug Association

[PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology; Technical Report: Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing

ICH (The International Conferencer on Harmonisation of Technical Requirementsfor Registration of Pharmaceuticals forMethods. 2000,33].

tworzenie testów l b t j h

for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) oraz monografii EP (European

Pharmacopeia)

Clinical LaboratoryImprovement Act (CLIA) 

w USA

laboratoryjnych i regulacja ich kontroli 

jakości; 

wytyczne walidacji metod molekularnychmetod molekularnych

1111

Fazy procesu kontroli nowych testów w diagnostyceFazy procesu kontroli nowych testów w diagnostyce

• Projekt i weryfikacja metody

•Walidacja metody

•Wdrożenie i kontrola jakości

1212

Projekt metodyZałożenia projektu, specyfikacja (opis,

Projekt i weryfikacja metodyProjekt metody specyfikacja (opis, 

dokumentacja)  

weryfikacja

Czy test spełnia nasze oczekiwaniai uwzględnia przedstawione przez nas 

kryteria ?

weryfikacja

Walidacja metodWalidacja metodyCzy nowy test można porównać do innych równoważnych testów, czy spełnia kliniczne 

wymagania specyfikacji w stosunku do i i j h ó di h ?

walidacja

Równorzędna metoda

Udoskonalona istniejących testów diagnostycznych ?  jakościowo

wdrożenie (realizacja)

Wdrożenie 

i kontrola jakości

Utrzymanie metody

testowanie raportkontrola jakościtestowanie raportkontrola jakości

1313

Etapy ewaluacji nowych systemów Etapy ewaluacji nowych systemów diagnostycznychdiagnostycznych

Dokumentacja (opis) metody i procedury techniki, która będzie wykorzystana w badaniach

Wyróżnienie akceptowanych kryteriów

Wybór populacji pacjentów (dobrze udokumentowanych klinicznie)Wybór populacji pacjentów (dobrze udokumentowanych klinicznie)

Przygotowanie dwóch identycznych kolekcji szczepów i rozdzielenie pomiędzy dwie metody (badaną i referencyjną)

Przeprowadzenie badania nowym i referencyjnym testem

Badanie wpływu substancji interferujących

Analiza każdej próbki dwukrotnie z wykorzystaniem nowej i referencyjnej metody –porównanie wyników

Określenie stosunku wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnych

Pomiar dokładności i precyzji w stosunku do metody referencyjnej (walidacja metody)Pomiar dokładności i precyzji w stosunku do metody referencyjnej (walidacja metody)

1414

Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki metody badawczej zależy od możliwości:metody badawczej zależy od możliwości:

wykorzystania wzorców i materiałów odniesieniawykorzystania wzorców i materiałów odniesienia

zastosowania metody porównawczejzastosowania metody porównawczej

wykorzystania badań wykorzystania badań międzymiędzy‐‐laboratoryjnychlaboratoryjnychy yy y ę yę y yj yyj y

1515

Dana metoda może zostać poddana walidacjiDana metoda może zostać poddana walidacjiDana metoda może zostać poddana walidacji Dana metoda może zostać poddana walidacji dopiero wówczas, gdy została poddana dopiero wówczas, gdy została poddana 

procesowi optymalizacjiprocesowi optymalizacjiprocesowi optymalizacji.procesowi optymalizacji.

Proces optymalizacji metody Proces optymalizacji metody polega na badaniu wpływu polega na badaniu wpływu zmian każdego z wybranych czynników poszczególnych zmian każdego z wybranych czynników poszczególnych etapów procedury na efektywność metody. etapów procedury na efektywność metody. 

Analizie podlegają czynniki wpływające na:Analizie podlegają czynniki wpływające na:

1) 1) jakośćjakość otrzymanych wyników;otrzymanych wyników;

2) 2) czas trwaniaczas trwania procedury;procedury;

3) 3) kosztkoszt. . 

1616

Proces Proces optymalizacjioptymalizacji metody diagnostycznej polega metody diagnostycznej polega na określeniu  parametrów krytycznych metodyna określeniu  parametrów krytycznych metody

Weryfikacja zoptymalizowanej procedury Weryfikacja zoptymalizowanej procedury –– jest to jest to kompleksowy efekt jednoczesnej zmiany wszystkich kompleksowy efekt jednoczesnej zmiany wszystkich 

parametrów na ostateczny wynik analizy parametrów na ostateczny wynik analizy 

RównocennośćRównocennośćmetod metod ‐‐ jest to ocena podobieństwa jest to ocena podobieństwa ó oce ośćó oce ość e ode od jes o oce a podob e s ajes o oce a podob e s awyników testów przeprowadzonych nową metodą, w wyników testów przeprowadzonych nową metodą, w 

porównaniu z wynikami testów prowadzonych porównaniu z wynikami testów prowadzonych p y p yp y p ymetodą stosowaną dotychczas. metodą stosowaną dotychczas. 

1717

K żd d d iK żd d d iKażda nowo wprowadzana metoda powinna Każda nowo wprowadzana metoda powinna być walidowanabyć walidowana

Walidacji należy dokonywać także wówczas, gdy Walidacji należy dokonywać także wówczas, gdy kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła zmienność jej parametrów w czasie oraz gdy planuje zmienność jej parametrów w czasie oraz gdy planuje się rozszerzenie stosowania danej metody. się rozszerzenie stosowania danej metody. 

Odpowiada na pytanie, czy nowy test można Odpowiada na pytanie, czy nowy test można Odpo ada a py a e, c y o y es o aOdpo ada a py a e, c y o y es o aporównać do innych równoważnych testów; czy porównać do innych równoważnych testów; czy spełnia kliniczne wymagania specyfikacji, w stosunku spełnia kliniczne wymagania specyfikacji, w stosunku p y g p y j ,p y g p y j ,do istniejących testów diagnostycznychdo istniejących testów diagnostycznych

1818

Kryteria walidacji metod mikrobiologicznych można Kryteria walidacji metod mikrobiologicznych można podzielić na dwie grupy:podzielić na dwie grupy:

testy jakościowe testy jakościowe –– pozwalają na stwierdzenie czy w pozwalają na stwierdzenie czy w badanej próbce są drobnoustroje badanej próbce są drobnoustroje 

(i jakie?), lub że ich nie ma(i jakie?), lub że ich nie ma

testy ilościowetesty ilościowe –– pozwalają określić liczbępozwalają określić liczbętesty ilościowe testy ilościowe  pozwalają określić liczbę pozwalają określić liczbę drobnoustrojów w badanej próbcedrobnoustrojów w badanej próbce

1919

Do walidowanych parametrów metody badawczej zgodnie Do walidowanych parametrów metody badawczej zgodnie z wytycznymi ICH (z wytycznymi ICH (angang. . TheThe International International ConferenceConference on on 

HarmonizationHarmonization ofof TechnicalTechnical RequirementsRequirements forfor RegistrationRegistration ofofHarmonizationHarmonization of of TechnicalTechnical RequirementsRequirements for for RegistrationRegistration of of PharmaceuticalsPharmaceuticals for for HumanHuman UseUse) należą: ) należą: 

specyficzność, specyficzność, dokładność, dokładność, precyzja, precyzja, granica wykrywalności i oznaczalności, granica wykrywalności i oznaczalności, liniowość, liniowość, zakres pomiarowy zakres pomiarowy 

śćśćelastyczność danej metody badawczej elastyczność danej metody badawczej 

CLIA różniaCLIA różniaCLIA wyróżniaCLIA wyróżnia

specyficzność analitycznąspecyficzność analityczną

specyficzność kliniczną specyficzność kliniczną ––przewidywane wartości przewidywane wartości negatywnenegatywne

czułośćczułość klinicznąkliniczną ‐‐ przewidywane wartościprzewidywane wartościczułośćczułość klinicznąkliniczną przewidywane wartości przewidywane wartości pozytywne pozytywne 

2121

Czułość testu = próby prawdziwie pozytywne/próby prawdziwie pozytywne + fałszywie negatywne x 100%; gdy liczba fałszywie negatywnych prób będzie równa zero, to test ma czułość 100% 

Specyficzność testu = prawdziwie negatywne/prawdziwieSpecyficzność testu  prawdziwie negatywne/prawdziwie negatywne +fałszywie pozytywne x 100%; gdy liczba fałszywie pozytywnych prób będzie równa zero,  to  test jest specyficzny w 100%.

2222

Z k ( i ) i liZ k ( i ) i li ddZakres (zasięg) pomiaru analitycznego Zakres (zasięg) pomiaru analitycznego ‐‐metoda metoda może dokonywać pomiaru próbki bezpośrednio bez może dokonywać pomiaru próbki bezpośrednio bez konieczności jej rozcieńczania bez względu nakonieczności jej rozcieńczania bez względu nakonieczności jej rozcieńczania, bez względu na konieczności jej rozcieńczania, bez względu na stężenie. stężenie. Zakres (zasięg) pomiaru klinicznegoZakres (zasięg) pomiaru klinicznegoZakres (zasięg) pomiaru klinicznego Zakres (zasięg) pomiaru klinicznego (zasięg kliniczny)(zasięg kliniczny) –– dotyczy możliwości pomiaru dotyczy możliwości pomiaru próbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczeniapróbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczeniapróbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczenia. próbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczenia. 

2323

Wdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakościWdrożenie i kontrola jakości

Systematyczne badanie czynników wpływających na wynik badaniaSystematyczne badanie czynników wpływających na wynik badania

ó d łó d łPorównanie z wzorcami odniesienia połączone z systematycznym Porównanie z wzorcami odniesienia połączone z systematycznym badaniem czynników wpływających na wynik badaniem czynników wpływających na wynik 

Porównawcze badania międzyPorównawcze badania między‐‐laboratoryjne przy użyciu tej samej metody laboratoryjne przy użyciu tej samej metody ę yę y yj p y y j j yyj p y y j j ybadawczejbadawczej

Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami badawczymibadawczymi

2424

Czynniki które decydują o wyborze metodyCzynniki które decydują o wyborze metodyCzynniki, które decydują o wyborze metody Czynniki, które decydują o wyborze metody diagnostycznejdiagnostycznej

a.a. Właściwości próbkiWłaściwości próbkiaśc ośc p óbaśc ośc p ób

b.b. Właściwości mikroorganizmuWłaściwości mikroorganizmu

c.c. Charakterystyka celu molekularnegoCharakterystyka celu molekularnego

d.d. Czułość i specyficzność metodyCzułość i specyficzność metody

e.e. PowtarzalnośćPowtarzalność

ff Potencjał różnicujący metodyPotencjał różnicujący metodyf.f. Potencjał różnicujący metodyPotencjał różnicujący metody

g.g. Stopień trudności metody (doświadczenia personelu)Stopień trudności metody (doświadczenia personelu)

h.h. Zaplecze badawcze (sprzęt jakim dysponujemy)Zaplecze badawcze (sprzęt jakim dysponujemy)p ( p ę j y p j y)p ( p ę j y p j y)

i.i. Łatwość interpretacji wynikówŁatwość interpretacji wyników

j.j. Czas wymagany do analizyCzas wymagany do analizy

k.k. Całkowity koszty stosowanej metodyCałkowity koszty stosowanej metody

l.l. Koszty pojedynczej próbkiKoszty pojedynczej próbki

2525

Podział technik molekularnych ze względu charakter procedury 

METODYCHARAKTERYSTYKA PROCEDURY

SYSTEM DETEKCJI WIELKOŚĆFRAGMENTÓW

ENDONUKLEAZYRESTRYKCYJNE

RODZAJ MATERIAŁUGENETYCZNEGOFRAGMENTÓW RESTRYKCYJNE GENETYCZNEGO

ELEKTROFOREZA

NIE OPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH

mienn m polREA‐PFGE

w zmiennym polu elektrycznym

10‐800 kpz jedna genomowe DNA

analiza profili plazmidowych i REAP (ang. Restriction Enzyme Analysis of Plazmid)

konwencjonalna 1,5‐150 kpz jedna lub kilka plazmidowe DNA

rybotypowanie oparte na hybrydyzacji konwencjonalna 1,1‐14 kpz kilkatotalne RNA

genomowe DNAOPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH

RAPD k j l 100 1000 DNARAPD  konwencjonalna 100‐1000 pz ‐ genomowe DNA

rep‐PCR konwencjonalna 80‐600 pz ‐ genomowe DNAPCR‐RFLP konwencjonalna 1000‐2000 pz jedna/dwie genomowe DNAAFLP konwencjonalna 100‐5000 pz jedna/dwie genomowe DNAAFLP konwencjonalna 100 5000 pz jedna/dwie genomowe DNA

PCR‐MP konwencjonalna50‐1300 pz

jedna genomowe DNAADSRRS konwencjonalna dwie genomowe DNA

2626