次世代遺伝子組換え技術 または

NPBT (Novel Plant Breeding Technology) 新植物育種技術

とは ・明確な定義はない 従来の「組換えDNA技術を用いた」に 該当するかどうか判断が難しいもの

EU-JRCがまとめた技術 １．シスジェネシス/イントラジェネシス ２．オリゴヌクレオチド指向型変異導入 ３．RNA依存性DNAメチル化 ４．ゲノム編集 ５．GM台木または穂木への接ぎ木 ６．逆育種 ７．アグロインフィルトレーション

次世代組換え技術（NPBT)議論の流れ ・2007年にEUでWGが設置され議論開始 ・EU各国個別でも議論 ・2011, 2012年にEUは報告書まとまる ・2012年にEFSAは 　　ZFNとシス・イントラジェネシス安全性評価 ・2012年　日本学術会議がシンポジウム ・2013年　FSANZ 報告書 ・2014年　日本学術会議が報告書 ・2014年　OECDで会合（主に技術の整理） ・2014年　日本，インドで会議 ・2015年　EU科学界プロダクトベースを提案

１．シスジェネシス/イントラジェネシス (cisgenesis/intragenesis)

交雑可能な近縁種由来の 制御配列を含む遺伝子 を変化させることなく 導入したもの

Plant&1

A

B

美味しいけど病気に弱い病気に強い遺伝子aを導入

遺伝子B

transfec+onbyAgrobacterium

ターミネーター

Rice,japonica

wildRice,IR21(africa)

耐病原菌イネの作出

コメA

コメB

実用例 りんご

りんごカビ病抵抗性 Wageningen University

類似例 りんご

Arctic Fuji (Okanagan Speciality Fruit Inc.)

りんごpolyphenol oxidase (PPO)を抑制すること により黒変を防止する．イントラジェネシス作物 遺伝子抑制するための遺伝子配列が導入されている ため，日本では遺伝子組み換え食品として扱われる．

１．シスジェネシス/イントラジェネシス (cisgenesis/intragenesis)

交雑可能な近縁種由来の 制御配列を含む遺伝子 を導入したもの （変化させても良い）

プロモーター

スペーサー逆位反復配列

遺伝子A

遺伝子B

異なる種からのプロモーター

異なる種からのターミネーター

transfec+onbyAgrobacterium

遺伝子の一部

遺伝子の一部の逆向き配列

ヘアピン構造 または近縁種から逆向き反復配列を作成して遺伝子抑制

実用例 じゃがいも

黒変防止とアクリルアミド生成抑制 Simplot社のInnate Potato

じゃがいも近縁種からの遺伝子導入（逆向き反復 配列）でイントラジェネシスである． 日本では遺伝子組み換え食品として扱われる．

オリゴヌクレオチドによる変異導入（ODM） １塩基ミスマッチになる鋳型オリゴを導入して，１塩基変異導入する．

--------------AGATGGCATCATATCGGC------------

--------------AGATTGCATCATATCGGC------------

AGATTGCATCATATCGGColigo (40 bp)

トリプトファン

ロイシン アミノ酸を変換して除草剤耐性にできる

---------------------------------------------DNA2本鎖

短いオリゴ

実用例：Cibus社のナタネ（１塩基置換で除草剤耐性）

ゲノム上の標的配列にDNA２本鎖切断を誘導 する酵素を用いる方法 MNase, ZFN, TALEN, CRISPRと言う， 人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）を用いる ゲノム編集とよく呼ばれる では，これで何ができるか？

部位特異的変異導入（SDN)

a Zinc-finger motif consensus b CX2-4CX3FLX2HX3H

!Right ZFP

!N

FokI (+)

5′ T C C C C T G C T T G G C T G G G C G C A G T G G C T C A T G C 3′ 3′ A G G G G A C G A A C C G A C C C G C G T C A C C G A G T A C G 5′

FokI (–) N

!Left ZFP

!Spacer (5–7 bp)

Nature Review Genet, advanced online (2014)

FokI

FokI

ZFNZFN

DNA

FokI

ZFNの例 １つのユニットが３塩基を認識する　　　　 　　　（片側で12塩基を認識できる）

標的部位 両側で24塩基認識できるので，ゲノム上に特異的な場所を選定すれば，ここだけを切断できる（理論的に）

ゲノム編集

TALENの例 １つのユニットが1塩基を認識する　　　　 　　（片側で16-18塩基を認識できる） a RVD

LTPEQVVAIAS HD GGKQALETVQRLLPVLCQAHG !

Left TALE !

N

FokI (+) 5′ T G T C A A G T C C A A T C T A T G A C A T C A A T T A T T A T A C A T C G G A G C C C T G C C A A A A 3′ 3′ A C A G T T C A G G T T A G A T A C T G T A G T T A A T A A T A T G T A G C C T C G G G A C G G T T T T 5′

FokI (–) !

Spacer (12–21 bp) N

!Right TALE

!b 2

1 3

90° rotation

!!

0

!!4

G C !

D13 5

!–1 RVD

6 !

9 7 8

H12

L1

!T0

A0′ !

0 repeat !W232

!!!!

–1 repeat Nature Review Genet, advanced online (2014)

DNA

DNA

DNA

DNAFokI

aggccattacgaagcctgc--GCTAACTGGACGCTTAGCTCNGG--cgtgattcaattagaggc

tccggtaatgcttcggacg--CGATTGACCTGCGAATCGAGNCC--gcactaagttaatctccg

(+)

(-)

Double strand DNA

GCTAACTGGACGCTTAGCTCGUUUUAGAGCUAG

A

AA

ACGAU

U

AACGGAAUAAAAUUGU

GCCGUUAUCAACUUG AA

AGCCACGGUGAAAG

CGGUGCUU

sgRNArepeat

標的DNA配列

U

guide

CRISPR/Cas9の例

標的DNA配列を認識するための人工的なRNA分子（＝ガイドRNA）

人工制限酵素による部位特異的変異導入（SDN)

-----AATGCGTGATGGCGTTGCAAGATGGCATCATATCGGC-----------TTACGCACTACCGCAACGTTCTACCGTAGTATAGCCG------

-----AATGCGTGATGGCGTTGCA AGATGGCATCATATCGGC---------TTACGCACTACCGCAACGT TCTACCGTAGTATAGCCG----

DNA2本鎖切断

-----AATGCGTGATGGCGTTGCAAGATGGCATCATATCGGC---------TTACGCACTACCGCAACGTTCTACCGTAGTATAGCCG----

2塩基欠失（灰色部分）　～～～例えば

DNA２本鎖

DNA２本鎖

DNA２本鎖

DNA2本鎖切断で何が起きるか？

DNA修復機構が働く

1.完全に修復される 　元の細胞にもどる

3.修復不可能だと 　　細胞死

２.完全に修復されて元の細胞にもどったものは，再び標的となり切断される 不完全に修復されたもの（１塩基欠失など）は， 標的配列ではなくなるため，生き残る

遺伝子A

DNA２本鎖切断

-ACTGTATAT　　GCCCGACGGA- -TGACATATA　　CGGGCTGCCT-

非相同末端結合により1塩基欠失後結合

-ACTGTATATCCCGACGGA- -TGACATATAGGGCTGCCT-

ThrvalTyrProAspGly

ThrvalTyrAlaArgArgタンパクA

タンパク？

結果として，タンパク質Aは欠失

遺伝子A

遺伝子間領域

DNA２本鎖切断

-ACTGTATAT　　GCCCGACGGA- -TGACATATA　　CGGGCTGCCT-

(B)SDN-3

両側に数kbの相同配列を持つドナーを入れると”X”が導入

-ACTGTATAT　　　　　　　　GCCCGACGGA- -TGACATATA　　　　　　　　CGGGCTGCCT-

遺伝子X

ゲノム編集では望みの位置にDNA2本鎖切断を誘導できる．

１．その位置に小さな欠失/置換/挿入を起こす 　　既存遺伝子の欠失が可能になる ２．ドナーベクターを同時に入れると， 　　外来遺伝子を挿入可能になる いずれも，標的部位でのDNA２本鎖切断以外の位置には切断は起きない（理論的には）