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NRL - AO: METODI ANALITICI PER
LA DETERMINAZIONE DEI RESIDUI
DI FITOFARMACI NEI PRODDOTTI
DI ORIGINE ANIMALE
VIII Convegno Attività dell’Amministrazione Pubblica in
materia di controllo dei Residui di Fitofarmaci negli alimenti
-17 novembre 2010-
GRAZIELLA AMENDOLAISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
NRL-AO: Laboratorio Nazionale di Riferimento per gli alimenti di origine
animale e alimenti ad elevato contenuto di grasso
Indice
Introduzione:
- Come arrivano i residui negli alimenti
- Scopo dell’analisi
- Cenni normativa sui pesticidi / piani di controllo
Metodi di analisi per alimenti di origine animale:
- Reg. 882/2004 Metodi ufficiali e/o metodi validati
- Metodo EN/ EURL-AO
- Metodi NLR-AO:
•Uovo
•Carne
•Olio
•Burro
•Miele
Determinazione della sostanza grassa
Metodo QuEChERS
- Applicazione a matrice a basso contenuto di grassi
-Applicazione a matrici ad alto contenuto di grassi
Metodo per il latte, carne e fegato
Conclusioni
agricoltura
Farmaci
Veterinari
Contaminazione
ambientale
Residui di fitofarmaci in prodotti di origine animale
Scopo dell’analisi
SICUREZZA DEGLI
ALIMENTI
RISPETTO DEI
LIMITI MASSIMI
RESIDUI
Reg.
396/2005
Normativa pesticidi
Reg.
882/2004
SANCO 1067/2010 rev3
piano di controllo dell’Unione Europea per il 2011- 2013
Quali matrici e quali principi attivi ?
2011
•33 residui di pesticidi
•Carne di pollame
•Fegato (suini, pollame,bovini e altri ruminanti)
Numero di campioni per Stato Membro
Italia:
65 campioni combinazioni prodotto/residuo di pesticida
Reg. 882/2004
Articolo 11 Metodi di campionamento e di analisi.
1. I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei
controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie
oppure:
a) se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciuti
internazionalmente, ad esempio quelli accettati dal Comitato Europeo
di Normalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione
nazionale; oppure
b) in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o
sviluppati conformemente a protocolli scientifici.
2. Allorquando il paragrafo 1 non è d'applicazione, i metodi di analisi
possono essere convalidati in un unico laboratorio conformemente
ad un protocollo riconosciuto internazionalmente.
3. I metodi di analisi devono essere caratterizzati, quando possibile,
dai criteri opportuni elencati nell'allegato III
Allegato III
Caratterizzazione dei metodi di analisi
1. I metodi di analisi devono essere caratterizzati dai
seguenti criteri:
a) esattezza;
b) applicabilità (matrice e gamma di concentrazione);
c) limite di rilevazione;
d) limite di determinazione;
e) precisione;
f) ripetibilita;
g) riproducibilita;
h) recupero;
i) selettivita;
j) sensibilita;
k) linearita;
l) incertezza delle misurazioni
Reg. 882/2004
METODO CEN 1528
WG 3 "Pesticides in fatty foods“
- EN 1528-1:1996 Fatty food - Determination of pesticides and
polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 1: General
- EN 1528-2:1996 Fatty food - Determination of pesticides and
polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 2: Extraction of fat,
pesticides and PCBs, and determination of fat content
- EN 1528-3:1996 Fatty food - Determination of pesticides and
polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 3: Clean-up methods
- EN 1528-4:1996 Fatty food - Determination of pesticides and
polychlorinated biphenyls (PCBs) – Part 4: Determination,
confirmatory tests, miscellaneous-
LIQUIDI
Latte
POLVERI
Latte in polvere
e derivati
SOLIDI
Formaggi,
Carne,
Pesce, Uova
Centrifugazione
Separazione crema
ESTRAZIONE
con etere di petrolio
Omogeneizzazione
ESTRAZIONE
con Soxtherm
esano-acetone 1:1 v,v
Ricostituzione
ESTRAZIONE
imbuto separatore
metanolo,
dietiletere
etere di petrolio.
Residuo grasso
Metodo di analisi dei residui di pesticidi in prodotti di
origine animale usato dal EURL basato su EN 1528
Residuo grasso
GPC
(Gel Permeation Chromatography)
Cicloesano-etile acetato
1:1 v,v
Colonna
di Gel di silice
toluene
toluene-acetone 95:5 v,v
toluene acetone 80:20 v,v
GC-ECD (2 colonne)
GC-MSD
SPE C18 (5g)
60 mL acetonitrile
GC-MSD
GC-FPD
10 g uova
Omogeneizzazione
100 mL acetonitrile
Filtrazione
Sottovuoto
MgSO4 anidro
evaporazione
evaporazione
UOVANRL-AO ITALIA
UOVANRL-AO ITALIA
Estrazione:
acetonitrile (solvente apolare)
Ridotta estrazione di grasso
Ampio range di principi attivi estratti,
inclusi i composti lipofili (es HCB)
UOVA contenuto di grasso = 10%
Grasso residuo:
dopo estrazione = 115 22 mg (n=31)
dopo purificazione = 2 0.7 mg (n=31)
Rimozione del grasso finale è del 98%
UOVANRL-AO ITALIA
16 ORGANOFOSFORATI
LOQ = 0.005mg/Kg
Spiking level: 0.005 mg/Kg
REC% = 76-100%, CV=5-13 %
Spiking level: 0.01-0.05 mg/Kg
REC% = 72-96%, CV = 4-17 %
Azinphos Metile non recuperato
Pirimifos metile Rec = 35%
29 ORGANOCLORURATI
LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg
Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg
REC% = 80-98%, CV = 5-21 %
Spiking level: 0.005-0.5 mg/Kg
REC% = 79-99%, CV = 3-22 %
CV = 22%
Metossicloro
Resmetrina
7 PIRETROIDI
LOQ = 0.005-0.01 mg/Kg
Spiking level: 0.005-0.01 mg/Kg REC% =89-100%, CV = 6-15 %
Spiking level: 0.01-0.05 mg/Kg REC% = 92-99%, CV = 3-10 %
CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA
Estrazione
con100 mL
acetonitrile
Filtrazione
Sottovuoto
MgSO4 anidro
evaporazione
evapoarzione
SPE
C18(2g)+Florisil(2g)
30 mL acetonitrile
GC-FPD
GC-MSD
10 g carne
Omogeneizzata
CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA
Estrazione:
acetonitrile (solvente apolare)
Ridotta estrazione di grasso
Ampio intervallo di principi attivi estratti
(scarso recupero dei composti lipofili es. HCB)
Carne suino analizzata = 15% di grasso
Grasso residuo:
dopo estrazione = 125 ± 28 mg (n=7)
dopo purificazione = 1.6 ± 0.5 mg (n=8)
Rimozione del grasso finale è del 99.9%
CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA
16 ORGANOFOSFORATI
LOQ = 0.007-0.02 mg/Kg
Spiking level: 0.007-0.02 mg/Kg
REC% = 70-99%, CV = 3-22 %
Spiking level: 0.06-0.6 mg/Kg
REC% = 84-128%, CV = 1-16 %
Azinphos Metile non recuperato
Metacrifos Rec = 65-67%
23 ORGANOCLORURATI
LOQ = 0.006-0.035 mg/Kg
Spiking level: 0.006-0.035 mg/Kg
REC% = 70-120%, CV = 2-26 %
Spiking level: 0.2-0.7 mg/Kg
REC% = 74-120%, CV = 3-13 %
Quintozene Rec = 69-62 %
23 ORGANOCLORURATI
LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg
Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg
REC% = 68-99%, CV = 2-11 %
Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg
REC% = 67-92%, CV = 2-10 %
Aldrin Rec = 57 %
Chlorobenzilato Rec = 60 %
HCB Rec =42%
8 PIRETROIDI
LOQ = 0.016-0.035 mg/Kg
Spiking level: 0.016-0.035 mg/Kg REC% =71-114%, CV = 5-15 %
Spiking level: 0.05-0.9 mg/Kg REC% = 94-120%, CV = 1-12 %
10 g Burro
fuso
Estrazione
con acetonitrile
70 mL
SPE
C18(5g)
100 mL acetonitrile
evaporazione
evaporazione
Organoclorurati
Piretroidi
GC-MSD
BURRONRL-AO ITALIA
Purificazione
congelamento
15 mLacetonitrile
Organofosforati
GC-FPD Florisil (2 g)Esano:toluene
80:20 v,v
50:50 v,v
Estrazione:
acetonitrile (solvente apolare)
Ridotta estrazione di grasso
Ampio intervallo di principi attivi estratti
(scarso recupero dei composti lipofili es. HCB)
Burro = 80-84 % di grasso
Dopo estrazione = 800 mg di grasso
Dopo congelamento = 72 mg di grasso
Dopo C18/Florisil= 2 mg di grasso
BURRONRL-AO ITALIA
17 ORGANOFOSFORATI
LOQ = 0.005mg/Kg
Spiking level: 0.01 mg/Kg
REC% = 81-103%, CV = 2-9 %
Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg
REC% = 78-100%, CV = 2-8 %
Azinphos Metile non recuperato
Profenofos Rec = 58 %
Pirimifos Metile Rec = 45 %
BURRONRL-AO ITALIA
24 ORGANOCLORURATI
LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg
Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg
REC% = 68-99%, CV = 2-11 %
Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg
REC% = 67-92%, CV = 2-10 %
Aldrin Rec = 57 %
Chlorobenzilato Rec = 60 %
HCB Rec =42%
7 PIRETROIDI
LOQ = 0.01-0.025 mg/Kg
Spiking level: 0.01-0.025 mg/Kg REC% =75-99%, CV = 3-14 %
Spiking level: 0.023-0.25 mg/Kg REC% = 97-117%, CV = 5-12 %
Resmetrina Rec=57% a livello del LOD
5 g olio di oliva
in 16 mL esano
SPE
Extrelut 20
(rimozione dell’esano)
SepPakSilice
C18(2g)
100 mL
acetonitrile
GC-FPD
GC-MSD
evaporazione
OLIO NRL-AO ITALIA
Contenuto di grasso
nell’olio di oliva:
80%
Residuo di grasso nell’estratto
Finale = 20-30 mg
1) Atti del Convegno “ XII Symposium Pesticide
Chemistry” – Università Cattolica di Piacenza
3-6 set. 2007
2) Rivista Italiana Sostanze Grasse
“Validation of a method for the determination
of pesticide residues in olive oil by GC-MS”
30 Pesticidi: organoclorurati, organofosforati,
piretroidi e erbicidi
LOQ = 0.01- 0.15mg/Kg
Spiking level: 0.01- 0.15 mg/Kg
REC% = 83-111 %, CV= 2-12 %
Spiking level: 0.1- 0.5mg/Kg
REC% = 94-112 %, CV=1- 6%
Testato anche il buprofezin con scarso successo
OLIO
NRL-AO ITALIA
10 g Miele
disciolto in
Acetone + acqua
1:1 v,v
SPE
Extrelut 20
Diclorometano (DCM)
100 mL
evapoarzione
GC-FPD
GC-MSD
LC/DD/Fl
MIELENRL-AO ITALIA
Miele:
99.6% carboidrati, 0.3% proteine,
zero grassi.
Estrazione in acetone:acqua 1:1 v,v
•Consente di solubilizzare il miele
•Estrae un ampio range di composti
SPE con Exrtelut 20/DCM
•Rimozione dei coestrattivi idrofili
•Recupero ottimo dei composti
•Residuo finale = 6 mg (n=120)
52 composti:15 organofosforati, 17organoclorurati,
8 piretroidi e 12 N-metilcarbammati
Per tutti i composti testati i Rec =70-103 %
Con eccezione di:Aldrin, Cipermetrina e fenvalerate
Rec= 61-69 % a livello del LOD
Recuperi Anomali: Aldicarb degrada in Aldicarb sulfoxide
MIELENRL-AO ITALIA
Journal of Environmental Science and Health, Part B - Vol. 45, issue 8, 789
G.Amendola, P. Pelosi and R. Dommaro
“Solid-phase extraction for multi-residue analysis of pesticides in honey”
Espressione del LMR
(EC) Reg. 396/2005
Annex I
Note 5, 6, 7
Pesticida e/o metabolita
lipofili (log Pow ≥ 3)
il LMR è espresso come
mg/kg di grasso o di prodotto,
in funzione del contenuto di
grasso nel prodotto
Pesticida e/o il metabolita
solubile in acqua
(log Pow < 3)
il LMR è espresso come
mg/kg di prodotto.
DETERMINAZIONE DELLA SOSTANZA GRASSA
Weibull-Stoldt ESTRAZIONE
A FREDDO
SOXHLET
ASE
ESTRATTORI
AUTOMATIZZATI
(Soxtherm,
Soxtec..)
SOXHLET ESTRATTORE AUTOMATIZZATO
Campione + sabbia
Essiccare a 130°C 1h
Estrazione: 70°C, etere di petrolio
Evaporazione fase organica
Determinazione gravimetrica
Estrattore
SER 148
VELP scientifica
Il metodo è stato confrontato con
con il Soxhlet:
risultati comparabili
Riproducibile
Consumo di solvente
Tempi lunghi
Weibull-Stoldt
•Digestione del campione
con HCL diluito
•Filtrazione del grasso
•Essiccamento del filtro
•Estrazione del grasso
con Soxhlet e Etere di petrolio
•Evaporazione fase organica
•Determinazione gravimetrica
Riproducibile
Rapido
ESTRAZIONE A FREDDO
Secondo EN 1528 Cold extraction
Campione + Na2SO4
Estrazione a freddo con esano (2 min. agitazione
con vortex, poi 10 min. in bagno ad ultrasuoni)
•Evaporazione fase organica
• Determinazione gravimetrica
Più rapido del Soxhlet
Consumo di solventi
Meno riproducibile
ASE
Accelerated Solvent Extraction
Ridotto consumo di solventi
Riproducibile
Alti costi
Estrazione con solvente
a temperatura e pressioni
elevate, in presenza
di gel di silice
QuEChERS
Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe
15 g campione
(grasso tra 2-20%)
Uova, carne,
pesce, latte ecc.
GC/MS
LC/MS/MS
Estrazione
15 mL di acetonitrile
1% acido acetico
6 g MgSO4
1.5 g acetato di sodio
Purificazione
d-SPE
(dispersive solid-phase extraction)
+50 mg C18
+50 mg PSA
(primary secondary
amine sorbents)
+ 150 mg MgSO4
centrifugazione
QuEChERS
Estrazione: acetonitrile + acido acetico
migliora il recupero di composti ph dipendenti
come folpet, captan, diclofuanid e clortalonil
Purificazione:
la d-SPE è facile, economica, rapida,
usa minori quantità di materiali rispetto alla SPE
in colonna, ma un po’meno efficace in termini di
purificazione. Tuttavia poiché migliora i recuperi
di composti a carattere acido/basico come acefate,
carbendazim, imazalil, metamidofos, pimetrozine
e tiabendazolo è stata scelta nel QuEChERS
Pesticidi: 32 composti con ampio range di
proprietà chimico-fisiche.
Composti polari e semipolari: Rec%= 70-120%
Composti apolari: Rec%<70% (diminuisce con
l’aumentare del tenore di grasso)
Esempio:
HCB nel latte Rec. 62% (grasso 3.5%)
HCB nell’uovo Rec. 45% (grasso 10%)
HCB nell’avocado Rec. 27% (grasso 15%)
QuEChERS
QuEChERS
10 g olive
grasso >20%
Estrazione
10 mL di acetonitrile
4 g MgSO
1 g NaCl
Centrifugare
Purificazione
d-SPE
50 mg C18
50 mg PSA
50 mg GCB
(graphitized carbon black)
+ 150 mg MgSO4
GC/MS
LC/MS/MS
2 g olio
+ 7 g di acqua
grasso >20%
QuEChERS
Estrazione: Acetonitrile, non idoneo per l’estrazione dei
composti lipofili. Non considerati
Purificazione: migliore con GCB, ma questo sorbente
ritiene alcuni pesticidi planari (HCB, tiabendazolo
e clortalonil). Non considerati
TESTATI 19 PESTICIDI
Recuperi: 70-120% con CV= 1-17%
eccezione p,p’ DDE, pyriproxifen e deltametrina
METODO PER ORGANOFOSFORATI E CARBAMMATI
NEL LATTE, FEGATO E CARNE
5 g campione
(+ 1mL di acqua
per carne/fegato)
in tubo da centrifuga
Estrazione
15 mL acetonitrile/
1% acido formico
Agitare e centrifugare
LC/MS/MS
Investigati 50 composti
nel latte, nella carne e nel fegato.
Rec= 70-120% CV< 20%
Ecetto per:
Amitraz, fention, cyromazine
paraoxon metile in tutte le matrici,
diclorvos solo nella carne.
LC/MS/MS non è una tecnica
idonea per alcuni OP.
RIKILT – Institute of food Safety
CONCLUSIONI
Si possono utilizzare metodi diversi purché
adeguati allo scopo e validati.
Ideale lo sviluppo di metodi che siano anche:
economici, rapidi, sicuri (ridotto uso di solventi),
riproducibili, multi-residui e con un ampio
campo di applicazione.
LA SFIDA CONTINUA …..