nucleotidi e acidi nucleici - · quando un acido nucleico è degradato possono quindi venire...
TRANSCRIPT
16/12/2011
1
Nucleotidi e Acidi Nucleici
Biotec _ 2011
I Nucleotidi Hanno Tre Componenti
Nucleotidi (1)
Un Nucleotide è una molecola costituita da un composto ad anello contenente azoto (N) legato ad uno zucchero con 5 atomi di carbono.Lo zucchero può essere o un riboso o un desossiribosio ed è a sua volta collegato ad uno o più gruppi fosfato.
Ribosio Vs. Desossirbosio
http://www.mun.ca/biology/scarr/Deoxyribose_versus_Ribose.html
Il 2‐Desossi‐Ribosio del DNA viene sostituito dal Ribosio nel RNA.
ll gruppo OH extra del ribosio è molto reattivo ed impedisce la formazione di una doppia elica stabile.
16/12/2011
2
I nucleotidi che contengono deossiribosio sono i deossiribonucleotidi e sono i monomeri del DNA.I nucleotidi che contengono ribosio, ribonucleotidi,
sono i monomeri del RNA.
Nucleotidi (2)
Gli anelli che contengono N sono chiamati “basi” per ragioni storiche: in condizioni acide ciascuno di essi può legare un protone (H+) e quindi aumentare la concentrazione di ioni OH‐ in soluzione acquosa.Vi è una forte somiglianza chimica fra le diverse basi azotate:
La Citosina (C), la Timina (T) e l’Uracile (U) sono chiamate pirimidine in quanto tutte derivano da un anello a sei atomi detto anello pirimidinico.La Guanina (G) e l’Adenina (A) sono composti purinici ed hanno un secondo anello a 5 atomi fuso con l’anello a 6 atomi.
DNA RNA
Basi azotate presenti negli acidi nucleici
Negli acidi nucleici e nei nucleotidi, l’azoto in posizione 9 delle purine e l’azoto in posizione 1 delle pirimidine (rosso) sono legati al carbono 1’ del ribosio o del desossiribosio.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21514/figure/A805/?report=objectonly
16/12/2011
3
Le pirimidine hanno un anello con 6 atomi di carbono
Le purine hanno due anelli collegati con 5 e 6 atomi di carbonio
Nucleotidi (3)
L’insieme zucchero + base azotata è detto NUCLEOSIDE.Il nucleoside può legarsi ad uno, due o tre gruppi fosfato.I gruppi fosfato possono legarsi all’atomo di carbonio 5’ oppure al carbonio 3’ del pentoso.La base azotata è legata al carbonio 1’ dello zucchero.
I nucleosidi e i loro mono‐, di‐ e tri‐fosfati
Base Nucleoside Nucleotidi
DNA
Adenina (A) Deossiadenosina dAMP dADP dATP
Guanina (G) Deossiguanosina dGMP dGDP dGTP
Citosina (C) Deossicitidina dCMP dCDP dCTP
Timina (T) Deossitimidina dTMP dTDP dTTP
RNA
Adenina (A) Adenosina AMP ADP ATP
Guanina (G) Guanosina GMP GDP GTP
Citosina (C) Citosina CMP CDP CTP
Uracile (U) Uridina UMP UDP UTP
16/12/2011
4
A seconda dei casi, i nucleotidi posono avere il loro gruppo fosfato legato sia alla posizione 5’ oppure 3’ del pentoso. Quando un acido nucleico è degradato possono quindi venire rilasciati i nucleoside‐3’‐monofosfato e i nucleosidi‐3’‐monofosfati
Lewin, Genes
Tutti i nucleotidi possono esistere in composti in cui vi è più di un gruppo fosfato legato alla posizione 5’.I legami fra il primo (α) e il secondo (β), e fra il seondo (β) e il terzo (γ) gruppi fosfato sono ricchi di energia e sono usati per fornire energia per numerose attività cellulari.
Lewin, Genes
Nucleotidi (4)
• Oltre ad essere componenti degli acidi nucleici (DNA e RNA) i nucleotidi possono svolgere altre importanti funzioni. Es.– La maggior parte dell’energia utilizzata dagli esseri viventi deriva dall’adenosina trifosfato (ATP)
– La guanosina trifosfato (GTP) è un nucleotide si lega d un gran numero di proteine (“proteine G”) e agisce da interrutore per attivarle.
• Proteine G monomeriche• Proteine G trimeriche
16/12/2011
5
ATP3 Nucleotidi : Altre funzioni
• I nucleotidi possono giocare altri ruoli importanti:
Il ribonucleotide ATP funge da trasduttore di energia in molte reazioni biochimiche.
Il ribonucleotide GTP fornisce l’energia per la sintesi proteica.
Il cAMP (AMP ciclico) è un ribonucleotidespeciale que è essenziale per l’azione ormonalee per il trasferimento di informazione nelsistema nervoso.
“Proteine G”
Funzionano da interrutori molecolari. Quando legano la guanosina trifosfato (GTP) si attivano (“on”) e quando legano la guanosina difosfato si disattivano (“off”).Le proteine G regolano enzimi metabolici, canali ionici, trasportatori di membrana, e altre componenti delle attività cellulari, controllando la trascrizione, motilità, contrattilità e secrezione che, a loro volta, regolano funzioni sistemiche quali lo sviluppo embrionale, l’apprendimento e la memoria e l’omeostasi.
GTP
16/12/2011
6
ACIDI NUCLEICINucleotidfi
Caratteristiche Distintive del DNA e del RNA
3 DNA RNA Proteina• Il DNA è una molecola informativa. L’informazione
è immagazzinata nell’ordine in cui sono disposte le sue quattro basi differenti.
• Questo ordine è trasferito alle molecole di RNA, chesono usate per dirigere l’ordine degli amminoacididelle proteine.
3 Acidi Nucleici : Il RNA può essere catalitico
• Alcune molecole di RNA dette ribozimi possonofungere da catalizzatori.
• La scoperta dei ribozimi ha fornito una soluzioneper la questione su chi è comparso prima quandola vita è iniziata, le proteine o gli acidi nucleici?
• Dato che il RNA può essere sia informazionaleche catalitico, esso potrebbe avere funzionatocome catalizzatore sia per la sua stessareplicazione che per quella delle proteine.
16/12/2011
7
Le cellule contengono istruzioni che:Specificano STRUTTURADettano FUNZIONERegolano ATTIVITA’
Le istruzioni vengono trasmesse fedelmente alle cellule figlieL’informazione ereditaria é trasmessa sotto forma di unità distinte, i GENI costituiti da DNA.L’informazione del DNA passa:
fra generazioni di cellule: REPLICAZIONE DEL DNAall’interno di ogni cellula: TRASCRIZIONE + TRADUZIONE
Nucleotidi (4)
Sia il DNA che l’RNA vengono sintetizzati a partire da nucleosidi trifosfati:Per il DNA: dATP, dCTP, dGTP e dTTPPer il RNA: ATP, CTP, GTP e UTP.In entrambi i casi, dal momento in cui ogni nucleoside viene legato, i secondo e terzo gruppi fosfato vengono rimossi (idrolizzati).
Molecola
riferimento
Molecola
risultante
Nome processo Codice
DNA DNA REPLICAZIONE basi azotate:
A,T,G,C
DNA RNA TRASCRIZIONE basi azotate:
A,U,G,C
RNA Proteine TRADUZIONE amino acidi:
20 tipi
Trascrizione &
Traduzione
16/12/2011
8
I 5’‐trifosfati sono i precursori per la sintesi degli acidi nucleici.
L’estremità 5’ di un trifosfato reagisce con il gruppo 3’‐OH che si trova alla fine della catena polipeptidfica in crescita.Si forma un legame fra il fosfato α con il gruppo 3’‐OH dello zucchero all’estremità della catena polipeptidica e i due gruppi fosfato terminali (βe (γ) del trifosfato sono rilasciati (sotto forma di una singola molecola detta pirofosfato).
DNA (1)In una molecola di DNA da migliaia a milioni di nucleotidi si susseguono in una catena mediante collegamento del gruppo fosfato collegato al carbono 5’ di una molecola di desossiribosio al carbono 3’ di una seconda molecola di desossirbosio (in questo processo viene rilasciata una molecola di acqua).Poichè i nucleotidi sono collegati da legami fra le loro componenti zucchero e fosfato, si dice che il DNA ha una impalcatura («backbone») di zucchero‐fosfato.Il legame (covalente) si chiama fosfodiesterico
Kreuzer & Massey, Biology and Biotechnology
DNA DNA
16/12/2011
9
RNADa un punto di vista chimico, l’RNA è molto simile al DNA. Tuttavia, ci sono alcune differenze principali: o L’RNA usa lo zucchero RIBOSIO invece del Desossiribosionel suo scheletro (“backbone”).
o L’RNA usa la base URACILE (U) invece della Timina (T). Anche U è complementare ad A.
o L’RNA tende ad essere a singolo filamento (“single strand”), ma alcune regioni possono ripiegarsi formando zone a doppio filamento.
Differenze funzionali tra RNA e DNAo Il DNA ha una singola funzione; l’ RNA ha molteplici funzioni
Esempi di tipi di RNA: tRNA, mRNA, rRNA.
Differenze Chimiche fra DNA e RNA (1)
Sia il RNA che il DNA sono composti
da unità che si ripetono:
♦ Nel RNA, queste unità sono
ribonucleotidi monofosfati
♦ Nel DNA, le unità sono 2’‐
deossiribonucleotidi
monofosfati.
Differenze Chimiche fra DNA e RNA (2)
Sia il RNA che il DNA formano lunghe catene polinucleotidiche, non ramificate, in cui diverse basi purinicheo pirimidiniche sono riunite mediante legami N‐glicosidici ad un’impalcatura strutturale di zuccheri‐fosfato.Le catene hanno una polarità. La sequenza di un acido nucleico viene per convenzione letta da 5’ a 3’. Ad esempio, la sequenza della molecola di RNA qui rappresentata é AUGC, mentre quella della molecola di DNA é ATGC.La sequenza di basi porta in se l’informazione, ossia, la sequenza ATGC comporta un’informazione diversa di quella di AGCT nonostante le stesse basi siano coinvolte.
Conseguenze della struttura chimica del RNA/DNA
L’impalcatura strutturale del DNA é più stabile, specialmente in condizione alcalina. Il gruppo OH nella posizione 2’ del RNA può formare intermediari 2’‐3’ fosfodiestere in condizioni basiche, che si rompono, dando una miscela di nucleosidi 2’ e 3’ monofosfati. Perciò il polinucleotide RNA é instabile.Il 2’ desossiribosio permette allo zucchero di assumere una conformazione a minore energia nell’impalcatura del DNA. Ciò aiuta ad aumentare la stabilità dei polinucleotidi.La deaminazione della Citidina a Uridina può essere identificata nel DNA, ma non nel RNA, perchè la deaminazione della citidina nel DNA porta a Uridina non a Timidina. Le basi Uridina nel DNA vengono rimosse da un sottogruppo di enzimi di riparo e sostituita con basi citidina.
16/12/2011
10
DNAAcidi nucleici
La fotografia di diffrazione (di raggi X) della forma B del DNA fatta da Rosalind Franklin nel Maggio del 1952 é stata di lunga la migliore fotografia di questo tipo. Dati ricavati da questa foto furono decisivi per permettere a James Watson e Francis Crick di costruire il modello del DNA che ha fatto vincere ad essi il premio Nobel. (Norman Collection on the History of Molecular Biology in Novato, Calif.)
16/12/2011
11
Regola di Chargaff
James Watson & Francis Crick
http://www.achievement.org/autodoc/photocredit/achievers/wat0-013
16/12/2011
12
Coppie di basi complementari riempiono il centro della doppia elica proposta da Watson e CrickCoppie di basi complementari
nella doppia elica del DNA
La forma e la struttura chimica delle basi permettono che si formino legami di idrogeno efficacientemente soltanto fra A e T e fra G e C, dove gli atomi in grado di formare legami di idrogeno possono essere portati sufficientemente vicini senza dirtorcere la doppia elica. Come indicato, fra A e T si formano due ponti di idrogeno mentre fra G e C se ne formano tre. Le basi si possono appaiare in questo modo soltanto se le catene polinucleotidiche che le contengono sono antiparallele una all’altra.
16/12/2011
13
Conclusioni di Watson & Crick sulla struttura del DNA(1953)
•Tratte dai dati cristallografici di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
Due catene polinucleotidiche elicoidali si avvolgono attorno ad un asse centrale con un diametro di 20 angstroms (10‐10 m).Le due catene sono antiparallele (scorrono in direzioni opposte).Le impalcature di zucchero‐fosfato rimangono all’esterno della struttura.Le basi azotate sono perpendicolari all’asse dell’elica e separate da 3.4 angstroms.La struttura elicoidale si ripete ogni 34 angstroms, e quindi ci sono 10 basi per giro dell’elica.
A. Modello di tipo “space‐filling” di un giro e mezzo della doppia elica del DNA. Ogni giro di DNA è fatto da 10.4 paia di nucleotidi e la distanza da centro a centro fra le coppie adiacenti di nucleotidi è 3.4 nm. L‘avvolgimento dei due filamenti uno attorno all’altro crea due solchi nella doppia elica. Il solco più ampio è detto solco maggiore (“major groove”) e quello meno profondo il solco minore (“minor groove”).
B. Una piccola sezione della doppia elica vista lateralmente, che mostra 4 paia di basi. I nucleotidi sono legati uno all’altro covamentemente mediante legami fosfodiesterici tramite il gruppo 3′ ‐idrossile (‐OH) di uno zucchero e il 5′‐fosfato (P) del successivo. Quindi, ogni filamento polinucleotidico ha una polarità chimica; ossia le loro due estremità sono diverse chimicamente. L’estremità 3’ porta un gruppo –OH non legato collegato alla posizione 3’ dell’anello di zucchero; l’estremità 5’ porta un gruppo fosfato libero legato alla posizione 5’ dell’anello dello zucchero.
Solco maggioreSolco minore
16/12/2011
14
... una modesta proposta...
It has not escaped our notice that the specific pairing we havepostulated immediately suggests a possible copying mechanism for thegenetic material.”
‐Watson & Crick, “A Structure for DeoxyriboseNucleic Acid,” Nature 1953.
“Non è sfuggito alla nostra attenzione che l’appaiamento specifico che abbiamo postulato suggerisce immediatamente un possibile meccanismo di copiatura per il materiale genetico”
I due filamenti parentali del DNA si separano e ognuno serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento “figlio” mediante accoppiamento di basi complementari.
Replicazione semiconservativa del DNA.
16/12/2011
15
Reazione catalizzata dalle DNA polimerasi
Tutte le DNA polimerasi aggiungono un desossiribonucleotide 5’‐trifosfato al gruppo 3’‐idrossilico (‐OH) di una catena in crescita del DNA ((filamento guida).http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/figure/A775/?report=objectonly
DNA polimerasi
Tutti le DNA polimerasi note condividono due proprietà fondamentali che hanno implicazioni critiche per la replicazione del DNA:Tutte le polimerasi sintetizzano il DNA soltanto nel verso 5’ a 3’, aggiungendo un dNTP al gruppo idrossilico della catena in crescita.Le DNA polimerasi possono aggiungere un nuovo desorriribonucleotide soltanto ad un “primer” (innesco) preformato che è legato mediante ponti di idrogeno al templato; non sono in grado di iniziare la sintesi del DNA de novo catalizzando la polimerizzazione di dNTPs liberi.
Da questo punto di vista, le DNA polimerasi differiscono dalle RNA polimerasi, che possono inziare la sintesi di un nuovo filamento di RNA in assenza di un primer.
Replicazione del DNA
16/12/2011
16
DNA polimerasiEnzimi responsabili dalla costruzione di nuovi filamenti di DNA durante la replicazione e il riparo del DNA.
a,. Polimerizzazione di un nucleotide all’estremità 3’ di un filamento primer.L’enzima seleziona i nucleotidi in base alla loro abilità di appai con i nucleotid presenti sul filamento stampo.
Rappresentazione schematica del meccanismo di duplicazione del DNA a livello della forcella di replicazione.
Ad entrambi i filamenti in allungamento, i nucleotidi vengono addizionati dalla DNA polimerasi in direzione 5’ ‐‐‐> 3’ (indicata dalle frecce). La sintesi del filamento guida avviene in modo continuo, a partire da un unico innesco a RNA legato alla sua estremità 5’ (non mostrato). La sintesi dell’altro filamento figlio (il filamento lento), procede in modo discontinuo; all’inizio si formano i frammenti di Okazaki, che si allungano a partire da numerosi inneschi a RNA, che vengono formati, sul filamento parentale man mano che, a livello della forcella di replicazione, viene esposta una nuova porzione di DNA. Gli inneschi a RNA vengono allungati dalla DNA polimerasi. Man mano che ogni frammento si avvicina ad un innesco che lo precede lungo il filamento parentale, l’innesco viene rimosso, da un enzima e i frammenti di DNA vengono uniti dalla DNA ligasi per formare un filamento continuo. La sintesi dell’intero filamento lento viene compiuta attraverso numerose ripetizioni di questo processo.
Ad ogni forcella di replicazione, uno dei due filamenti è sintetizzato mediante più inneschi. (a) La struttura completa della forcella di replicazione. La sintesi del filamento guida, catalizzata dalla DNA polimerasi III, si sttua per aggiunta sequenziale di deossiribonucleotidi nella stressa direzione di spostamento della forcella di replicazione.
(b) Passaggi della sintesi discontinua del filamento tardivo. Questo processo richiede numerosi inneschi, due DNA polimerasi e una ligasi, che unisce l’estremità 3’ idrossile di un frammento (frammento di Okazaki) con l’estremità 5’‐fosfato del frammento adiacente.
(c) Giunzione fra i frammenti di DNA. Durante questa reazione, la ligasi si lega momentaneamente ed in modo covalente all’estremità 5’‐fosfato di un filamento di DNA, attivandone così il gruppo fosfato. La DNA ligasi di E. coli usa come cofattore il NAD+, generando NMN e AMP, mentre la ligasi del batteriofago T4, normalmente usata nel clonaggio del DNA, usa ATP, generando PPi e AMP. Molecular Cell Biology 12. DNA Replication, Repair, and Recombination 12.2. The DNA Replication Machinery
16/12/2011
17
Replicazione del DNA (a)
As depicted in the following drawing, the DNA of a cell is tightly packed into chromosomes. First, the DNA is wrapped around small proteins called histones (colored pink below). These bead-like structures are then further organized and folded into chromatin aggregates that make up the chromosomes. An overall packing efficiency of 7,000 or more is thus achieved. Clearly a sequence of unfolding events must take place before the information encoded in the DNA can be used or replicated.
http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/nucacids.htm
Replicazione del DNA (b)
• Once the double stranded DNA is exposed, a group of enzymes act to accomplish its replication. These are described briefly here:
• Topoisomerase: This enzyme initiates unwinding of the double helix by cutting one of the strands.
• Helicase: This enzyme assists the unwinding. Note that many hydrogen bonds must be broken if the strands are to be separated..
• SSB: A single‐strand binding‐protein stabilizes the separated strands, and prevents them from recombining, so that the polymerization chemistry can function on the individual strands.
• DNA Polymerase: This family of enzymes link together nucleotide triphosphate monomers as they hydrogen bond to complementary bases. These enzymes also check for errors (roughly ten per billion), and make corrections.
• Ligase: Small unattached DNA segments on a strand are united by this enzyme.
Replicazione del DNA (c)
16/12/2011
18
RNAAcidi nucleici
Differenze tra RNA e DNA
Trascrizione: Sintesi dell’RNA a partire dal DNA. I due filamenti di DNA si svolgono ed uno é usato come stampo (“template”) per la sintesi di un filamento complementare di RNA.
TIPI PRINCIPALI DI RNAPRODOTTI NELLE CELLULE
Tipo di RNA Funzione mRNA RNA messaggeri, codificano per
proteine rRNA RNA ribosomiali, formano la
struttura di base dei ribosomi e catalizzano la sintesi proteica
tRNA RNA transfer, fondamentali per la sintesi proteica come adattatori fra mRNA e aminoacidi
snRNA piccoli RNA nucleari, agiscono in una varietà di processi nucleari, compreso lo splicing del pre-mRNA
snoRNA piccoli RNA nucleolari, usati per processare e modificare chimicamente gli rRNA
Altri RNA non codificanti Agiscono in diversi processi cellulari, compreso sintesi dei telomeri, disattivazione del cromosoma X, trasporto di proteine nell’ER, regolazione genica (microRNA)*.
16/12/2011
19
Funzione e struttura del RNA
La struttura terziaria del RNA é simile a quella del DNA, ma ci sono diverse differenze importanti:
Il RNA di solito forma coppie di basi intramolecolariL’informazione trasportata dal RNA non é ridondante perchè queste coppie di basi sono intramolecolari.I solchi maggiore e minore sono molto meno pronunciati.Tutti i ruoli svolti dal RNA (strutturale, adattatore informazionale, trasferimento di informazione) sono coinvolti nella decodificazione trasportata dal DNA.
Trascrizione: Sintesi del RNALa reazione di allungamento della catena catalizzata dall’enzima RNA polimerasi. Ad ogni passo viene selezionato un ribonucleotide trifosfato dalla sua capacità di accoppiarsi con il filamento della doppia elica del DNA esposto che funge da “stampo” (“template”); viene quindi aggiunto un ribonucleotide monofosfatoall’estremità 3’‐OH della catena di RNA (freccia rossa), e viene rilasciato il pirofosfato (Pi‐Pi; atomi rossi). Quindi, la nuova catena di RNA cresce un nucleotide alla volta, in direzione 5’‐3’, ed é complementare alla sequenza del filamento stampo del DNA. La reazione é resa energeticamente favorevole dai cambiamenti di energia libera che accompagnano il rilascio di pirofosfato e dall’ulteriore idrolisi del pirofosfato a fosfato inorganico.
Trascrizione e maturazione del RNAnegli eucarioti (1)
Nelle cellule eucarioti ci sono tre distinti enzimi di trascrizione, ognuno dei quali é responsabile della sintesi di gruppi diversi di RNA:
RNA polimerasi I: sintetizza i grandi RNA ribosomali (28 S, 18S e 5,8 S)RNA polimerasi II: sintetizza gli RNA messaggeri e la maggior parte dei piccoli RNA nucleariRNA polimerasi III: sintetizza gli RNA a basso peso molecolare, compresi gli RNA di transferimento e l’RNA ribosomico 5S.
Nessun procariote possiede più di una RNA polimerasi, mentre gli eucarioti più semplici (lieviti) hanno gli stessi tipi di polimerasi che sono presenti nelle cellule dei mammiferi.
Ulteriore distinzione fra procarioti ed eucarioti.
16/12/2011
20
Trascrizione e maturazione del RNAnegli eucarioti (cont.)
Le polimerasi degli eucarioti sono enzimi estremamente complessi, che contengono da 8 a 14 polipeptidi distinti (subunità) e sono abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio elettronico:
Oltre alle subunità, che costituiscono gli enzimi, ciascuna delle polimerasi é coadiuvata nelle sue funzioni da proteine ausiliarie: fattori di trascrizione:
Fattori generali di trascrizione: necessari alla polimerasi per iniziare la trascrizione;Fattori specifici di trascrizione (“proteine regolatrici dei geni”): determinano la velocità alla quale un particolare gene o gruppo di geni viene trascritto
I geni possono essere espressi con efficienza diversa.
Il gene A é trascritto e tradotto in modo molto più efficiente del gene B. Ciò fa sì che la quantità di proteina A nella cellula sia molto maggiore di quella della proteina B.
RNA POLIMERASI
Le RNA polimerasi sono enzimi che catalizzano la formazione del RNA usando uno stampo (“template”) sul DNAI substrati della reazione sono i nucleotidi‐trifosfatoL’accesso della RNA polimerasi allo stampo è regolato, sia nei procarioti che negli eucariotiI procarioti hanno una singola RNA polimerasiGli eucarioti hanno tre RNA polimerasi
16/12/2011
21
RNA polimerasi nelle cellule eucariotiche Tipo di polimerasi
Geni trascritti
RNA polimerasi I
geni degli rRNA 5.8S, 18S e 28S
RNA polimerasi II
tutti i geni che codificano
proteine, più geni di snoRNA e alcuni geni di snRNA
RNA polimerasi III
geni dei tRNA, geni di rRNA 5S,
alcuni geni di snRNA e geni per altri piccoli RNA
RNA polimerasi mitocondriale* geni mitocondriali RNA polimerasi dei cloroplasti* geni dei cloroplasti *Le RNA polimerasi mitocondriale e dei cloroplasti sono simili agli enzimi batterici
TERMINOLOGIA DEL PROCESSAMENTODEL DNA E DEL RNA
Termine Significato letterale Processo in cui sono
coinvolti gli acidi nucleici
Replicazione Fare un duplicato identico
Usare una molecola di DNA come riferimento per ottenere due copie di molecole figlie identiche
Trascrizione Copiare informazione da un supporto ad un altro, come avviene ad es. quando si passa da un nastro audio ad un testo scritto
Copiare la sequenza di basi di una molecola di DNA sotto forma di sequenza di basi di una molecola di RNA
Traduzione Prendere informazione da una lingua e convertirla in un’altra lingua
Prendere la sequenza di codoni del mRNA e convertirla in una catena di aminoacidi di una proteina
Maturazione del RNA
TRASCRITTO primario: molecola di RNA appena prodotta per trascrizione del DNA.MATURAZIONE: Modificazioni chimiche necessarie per produrre un mRNA funzionale a partire dal trascritto primario (precursore):
RIMOZIONE DI REGIONI DEL TRASCRITTO PRIMARIO (es. splicing del mRNA).AGGIUNTA DI MODIFICAZIONI DI SPECIFICI NUCLEOTIDI (particolarmente negli tRNA).Associazione con proteine.Passaggio dal nucleo al citoplasma
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
16/12/2011
22
RNA MESSAGGERO (mRNA)RNA
STRUTTURA DEI GENI DEGLI EUCARIOTI
La maggior parte dei geni degli eucarioti contiene segmenti di sequenze codificanti (esoni) interrotte da sequenze non‐codificanti (introni).Le sequenze di spaziatura (“spacers”) sono lunghe sequenze di DNA non codificanti che rimangono fra i geni.
Cooper – The Cell, a Molecular Approach (2nd ed.)
mRNA (1)
• Il RNA messaggero o mRNA é una copiadell’informazione trasportata da ungene sul DNA.
• Il ruolo del mRNA é quello di trasportarel’informazione contenuta nel DNA finoall’apparato di traduzione.
• Il mRNA é eterogeneo in dimensioni esequenza.
mRNA (2)• Ha sempre un cappello 5’ composto da un legame trifosfato 5’ a 5’ fra due
nucleotidi modificati: una 7‐metilguanosina e una 2’ O‐metil purina.• Il cappello serve per segnalare questa molecola di RNA come un mRNA
all’apparato di traduzione.• Inoltre, la maggior parte delle molecole di mRNA contengono una coda di poli‐
Adenosina all’estremità 3’.• Sia il cappello 5’ che la coda 3’ vengono aggiunte dopo che il RNA é trascritto e
contribuiscono alla stabilità del mRNA nella cellula.
16/12/2011
23
Cappello del mRNA
mRNA (3)
Il mRNA non viene sintetizzato direttamente nella cellula eucariotica.
Esso é trascritto nel nucleo sotto forma di RNA nucleare eterogeneo (“heterogeneous nuclear“ RNA, hnRNA).
Il hnRNA contiene introni ed esoni.
Gl introni sono rimossi mediante “splicing” del RNA, lasciando gli esoni, che contengono l’informazione, riuniti fra di loro.
In alcuni casi, singoli nucleotidi possono venire aggiunti nel mezzo di una sequenza di mRNA mediante un processo detto di “editting” del RNA.
Quadri complessi di splicing del mRNA
Quadri complessi dello “splicing” del mRNA negli eucarioti. Il pre‐RNA trascritto del gene dell’alfa‐tropomiosina viene “spliced” in modo alternativo in tipi cellulari diversi. Le caselle verde chiaro rappresentano gli introni, gli altri colori gli esoni. I segnali di poliadenilazione sono indicati da una A. Le linee tratteggiate nei mRNA maturi indicano regioni che sono state rimosse dallo splicing. TM: tropomyosin. Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, W.H. Freeman & Co.
16/12/2011
24
Schema generale della maturazione degli mRNA negli eucarioti.
Poco dopo che la RNA polimerasi II ha ha iniziato la trascrizone del primo nucleotide del primo esone di un gene, l’estremità 5’ dell’RNA in formazione viene protetta con una 7‐metilguanina. La trascrizione effettuata dalla RNA polimerasi II ha termine ad uno qualsiasi degli svariati siti di terminazione a valle del sito poli(A), che è localizzato all’estremità 3’ dell’ultimo esone. Dopo che il trascritto primario é stato tagliato in corrispondenza del sito poli(A), viene aggiunta una serie di residui di adenina. La coda poli(A) contiene circa 250 residui di adenina nei mammiferi, circa 1250 negli insetti, e circa 100 nei lieviti. Per trascritti primari brevi, con pochi introni, la poliadenilazione e lo “splicing” generalmente seguono la terminazione, come mostrato nella figura. Per geni lunghi, con molti introni, gli introni sono spesso recisi dall’RNA in formazione, prima che la trascrizione del gene sia completata. Si noti che il cap 5’ permane negli mRNA maturi..
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
16/12/2011
25
rRNA (RNA ribosomiale)
Un ribosoma consiste di due sub‐unità
I ribosomi sono organelli presente nel citoplasma oppure ancorati al reticolo endoplasmatico ruvido.Sono particelle responsabili della sintesi proteica, leggendo le informazioni contenute in una catena di RNA messaggero (mRNA).
Lewis, Genes
16/12/2011
26
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/
In tutte le cellule, ogni ribosoma consiste di una subunità grande e una piccola. Le due subunità contengono rRNAs di diversa lunghezza e un insieme diverso di proteine. Tutti i ribosomi contengono due molecole principali di rRNA (rosso scuro) – 23S e 16S rRNA nei batteri, 28S e 18S rRNA negli eucarioti – e uno o due piccoli rRNA (rosso chiaro). Le proteine sono disegnate L1, L2, ecc e S1, S2, ecc., a seconda che siano presenti nella subunità grande (“large”) o piccola (“small»).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/?report=objectonly
Subunità dei ribosomi
PROCARIOTI EUCARIOTI
16/12/2011
27
Struttura di un rRNA batterico
Lewis, Genes
Geni dell’ RNA ribosomale
Ciascun gene dell’ rRNA è una singola unità di trascrizione contenente gli rRNAs 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rRNA sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Ciascun gene dell’ rRNA è una singola unità di trascrizione contenente gli rRNAs 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rRNA sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Cooper: The Cell III. Cell Structure and Function 8. The Nucleus The Nucleolus
Processamento della molecola del precursore rRNA 45S in tre separati RNA ribosomali
Quasi la metà delle sequenze di nucleotidi dell’RNA trascritto primario sono degradate nel nucleo.Molecular Biology of the Cell 3rd ed. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Walter, Peter. New York
16/12/2011
28
Processazione del pre‐rRNA
Il trascritto 45S del pre‐rRNA contiene spaziatori esterni trascritti (ETS) ad entrambe le estremità e spaziatori interni trascritti (ITS) fra le sequenze degli rRNA 18S, 5.8S e 28S. Il pre‐rRNA è processato mediante una serie di tagli (illustrati per il pre‐rRNA umano) che producono le specie mature di rRNA.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9939/figure/A1369/?report=objectonly
Processamento del pre‐rRNA ed assemblaggio dei ribosomi negli eucarioti.
(a) Principali intermediari e tempi richiesti per i vari passi del processamento del pre‐rRNA negli eucarioti superiori. Le proteine ribosomali e nucleolari si associano con il 45S pre‐rRNA quasi subito dopo la sua trascrizione, formando un 80S pre‐rRNP. La sintesi del 5S rRNA ha luogo fuori dal nucleolo. In questo schema non viene illustrata la complessa struttura secondaria degli rRNA. Notare che il RNA costituisce circa il 2/3 della massa delle subunità ribosomiali, e le proteine circa 1/3. (b) Via di processamento del trascritto primario per il 6.6‐kb (35S) pre‐rRNA nella S. cerevisiae. Le regioni di spaziatura trascritte (tan), che vengono scartate durante il processamento, separano le regioni corrispondenti agli rRNA maturi 18S, 5.8S, and 25S rRNAs. Tutti gli intermediari diagrammati sono stati identificati; le loro dimensioni sono indicate in rosso. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
highlight=ribosomes,rRNA&rid=mcb.figgrp.2981
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
RNA TRANSFER (tRNA)
RNA
16/12/2011
29
Legami di idrogeno nell’RNA (1)Aminoacil‐ tRNA‐ sintasi
http://en.wikipedia.org/wiki/Aminoacyl_tRNA_synthetase
Enzima che catalizzal’esterificazione di un specificoaminoacido o del suo precurosoread uno dei suoi tRNA specifici per formare un aminoacil‐tRNA.Questo processo viene talvoltachiamato “caricamento” del tRNAcon l’amminaocido.Una volta che il tRNAè carico, un ribosoma può trasferire l’AA dal tRNA ad un polipeptide in crescita, secondo il codice genetico.
http://journals.prous.com/journals/dnp/20061906/html/dn190347/images/fig1.gif
16/12/2011
30
La molecola di tRNA viene sintetizzata in due parti, Il corpo del tRNA é trascritto da un gene tRNA. Il braccio accettore (“acceptor stem”) é lo stesso per tutte le molecole di tRNA ed é aggiunto dopo che il corpo é stato sintetizzato. Esso viene sostituito spesso durante il tempo di vita di una molecola di tRNA.Il braccio accettore è il sito che trasporta uno specifico aminoacido, che é stato attaccato da una amino‐acil‐tRNA sintasi.L’anticodone legge l’informazione in una sequenza del mRNA mediante accoppiamento di basi.
Strutture degli tRNAs
E’ illustrata la struttura del fenilalanina‐tRNA del lievito nella forma aperta a “foglia di trigoglio” (A) per mostrare accoppiamenti fra basi complementari. Le basi modificate sono indicate come mG (metilguanosina), mc (metilcitosina), DHU (diidrouridina), T (ribotimidina), Y (una purina modificata, di solito adenosina) e y ( pseudouridina). (B) Forma ripiegata della molecola.
N.B. Gli RNA contengono spesso basi modificate chimicamente rispetto al DNA
STRUTTURA DEGLI RNAA FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA
(es. rRNA, tRNA) (1)
Sia gli rRNA che i tRNA devono la loro attività alle loro complesse strutture secondaria e terziaria.Diversamente dal DNA che ha struttura a doppia elica relativamente definita indipendentemente dalla sua origine, gli RNA si ripiegano in complesse forme tridimensionali, notoriamente diverse da un tipo di RNA all’altro.Perciò, come le proteine, gli RNA sono in grado di svolgere molte funzioni, perchè possono assumere un gran varietà di forme.Come per le proteine, il ripiegamento degli RNA segue certe regole.Durante il ripiegamento delle catene proteiche che lavorano in ambiente acquoso i residui idrofobici vengono portati all’interno‐Nell’RNA il ripiegamento dipende dalla formazione di regioni che hanno coppie di basi complementari.Le regioni di basi appaiate formano tipicamente degli “steli” a doppio filamento (e a doppia elica), connessi ad “anse” a filamento singolo.
16/12/2011
31
STRUTTURA DEGLI RNAA FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA
(es. rRNA, tRNA) (2)
A differenze del DNA, costituito unicamente dalle coppie di basi A‐T e G‐C, il RNA contiene spesso coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate.
Queste regioni peculiari spesso fungono da siti di riconoscimento per proteine ed altri RNAPromuovono il ripiegamento del RNAAiutano a stabilizzare la struttura della molecola.
L’appaiamento delle basi fra le diverse molecole di RNA svolge un ruolo cruciale nella gran parte delle attività in cui sono coinvolti gli RNA.
L’RNA si può ripiegare in strutture specifiche. L’RNA è in gran parte a singolo filamento, ma spesso contiene brevi tratti di nucleotidi che possono formare coppie di basi convenzionali con sequenza complementari presenti altrove sulla stessa molecola. Queste interazioni, insieme ad ulteriori interazioni di appaiamento “non convenzionale” di basi, permettono ad una molecola di RNA di ripiegarsi in una struttura tridimensionale che è determinata dalla sua sequenza di nucleotidi. (A) Diagramma di una struttura ripiegata di RNA che mostra soltanto interazioni di appaiamento convenzionale; (B) struttura con interazioni di accoppiamento convenzionale (rosso) e non convenzionale (verde); (C) struttura di un RNA reale, una porzione di un introne di gruppo 1. Ciascuna interazione di accoppiamento convenzionale é indicata da un “piolo” nella doppia elica. Le basi in altre configurazioni sono indicate da pioli spezzati.
RNA transfer (tRNA)
Il tRNA é la molecola portatrice di informazione con funzione di adattatore.Rappresenta l’interfaccia diretta fra la sequenza di aminoacidi di una proteina e l’informazione sul DNA. Perciò essa decodifica l’informazione sul DNA.Ci sono più di 20 diverse molecole di tRNA. Tutte hanno da 75 a 95 nucleotidi.Tutti i tRNA di tutti gli organismi hanno una struttura similare: in verità, un tRNA umano può funzionare in un lievito.Nelle molecole di tRNA ci sono 4 braccia (accettore, braccio D, braccio T pseudouridina C, braccio anticodone) e 3 “loops.” (loop D, loop T e loop anticodone).Talvolta le molecole di tRNA hannno un loop extra o variabile (uno é illustrato in giallo nella figura).
Struttura dei tRNAStruttura primaria e secondaria (1)
Tutti i tRNA hanno una sequenza simile di 73 a 93 nucleotidi.L’estremità 3’ finisce sempre con la sequenza CCA, in cui il gruppo idrossilico 3’ del ribosio della Aterminale é il punto di legame covalente per l’aminoacido.Essi contengono un certo numero (7‐15%) di basi uniche/ o modificate. Queste vengono modificate post‐trascrizionalmente dopo la sintesi, mediante l’enzima RNA polimerasi.
16/12/2011
32
Struttura dei tRNAStruttura primaria e
secondaria (2)
In particolare, l’adenosina (A) nella prima o 5’ posizione dell’anticodone (corrispondente alla terza o posizione 3’ del codone) é sempre modificata in inosina (I) che manca del gruppo aminico (‐NH2) nell’anello purinico. L’inosina può appaiarsi con A, U o C e perciò spiega molta della degenerazione del Codice Genetico (Teoria di Wobble).
Adenosina
Struttura dei tRNAStruttura primaria e secondaria (2)
Il tRNA ha una struttura secondaria a forma di trifoglio a causa due gambi (“stems”) in cui vi é appaiamento intramolecolare tra basi.Il trifoglio contiene tre loops senza appaiamento di basi: il loop D, l’anticodone e il loop TpsiC.
Struttura dei tRNAStruttura Terziaria del tRNA (1)
La struttura terziaria del tRNA é meglio descritta come una forma compatta a “L”.L’anticodone é un loop a singola elica all’estremità della Figura, che ulteriormente si appaierà con la tripletta codone.L’aminoacido é legato alla A terminale sulla parte superiore destra.I siti attivi (anticodone e aminoacido) sono separati al massimo.
16/12/2011
33
Struttura dei tRNAStruttura Terziaria del tRNA (2)
Come succede con le proteine, la struttura terziaria é dettata dalla sequenza primaria.La struttura terziaria é stabilizzata da appaiamento tra basi e accatastamento di basi.Due aree (braccio anticodone e braccio accettore) formano una doppia elica.
RUOLO DEI LEGAMI DI IDROGENONELLA TRASCRIZIONE DEL RNA
STRUTTURA DEGLI RNA & INTERAZIONE tRNA/mRNA
CODICE GENETICO
Codice mediante il quale la sequenza nucleotidica di una molecola di DNA o di RNA specifica la sequenza amminoacidica di un polipeptide.Consiste di codoni a tre nucleotidi che specificano un particolare amminoacido oppure dicono al ribosoma di fermare la traduzione e rilasciare il polipeptide.Con poche eccezioni, tutti gli organismi viventi utilizzano lo stesso codice.
(Mathews et al., Biochimica)
Codiced Genetico (segue)
Un gene una catena polipeptidicaCorrispondenza lineare solo nei PROCARIOTI.EUCARIOTI: sequenze codificanti (esoni) + sequenza non codificanti (introni)
ATTENZIONE: alcuni geni NON codificano per proteine (mediante un mRNA), codificano per gli altri RNA: tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, ecc.
16/12/2011
34
Codiced Genetico (segue)
CODICE GENETICO detto «DEGENERATO» O «RIDONDANTE»:
Un singolo amminoacido può essere specificato da più di una tripletta di nucleotidi.Non significa malfunzionalità (ambiguità).Aumenta l’adattabilità del sistema di codificazione.
Il codice genetico non è sovrapposto:– Ogni nucleotide è parte di una sola tripletta.
Decodificazione di una molecola di mRNA
Ogni aminoacido addizionato all’estremità crescente della catena polipeptidica viene selezionato mediante appaiamento complementare di basi fra l’anticodone nel tRNA a cui é legato e il codone successivo nella catena del mRNA
16/12/2011
35
One gene ‐‐> one protein
Same language/monomers
Different language/monomers
Genetic code
• Triplet code
Three basepairs specify one amino acid = codon
Genetic code
• Triplet codeDNA Template strand = complementary to mRNACoding strand = nontemplate strand = similar sequence to mRNA
Genetic code
• Triplet codeDNA Template strand = complementary to mRNACoding strand = nontemplate strand = similar sequence to mRNA
Uracil used instead of Thymine
16/12/2011
36
Genetic code
• Triplet code• Nonoverlapping
Genetic code
• Triplet code• Nonoverlapping• Degenerate
‐ 4 nucleotides ‐‐ > 20 amino acids doublet code ‐‐> 42 ‐‐> 16 combinationstriplet code ‐‐> 43 ‐‐> 64 combinations
Genetic code
• Triplet code• Nonoverlapping• Degenerate
Each amino acid specified by more than one nucleotide triplet (codon)
61 codons code for amino acids
triplet code ‐‐> 43
‐‐> 64 combinations
16/12/2011
37
61 codons code for amino acids
• AUG = Met = start• UAG• UAA Stop• UGA
Genetic code
Genetic code
L’uracile forma coppie di basi con adenina. L’assenza di un gruppo metilico in U non ha effetto sull’accoppiamento delle basi; così, le coppie di basi U‐A assomigliano molto alle coppie di basi T‐A.
16/12/2011
38
Aminoacil tRNA sintetasi
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A883/
Aminoacylation of tRNA. Amino acids are covalently linked to tRNAs by aminoacyl‐tRNA synthetasesEach of these enzymes recognizes one kind of amino acid and all the cognate tRNAs that recognize codons for that amino acid. The two‐step aminoacylation reaction requires energy from the hydrolysis of ATP. The equilibrium of the overall reaction favors the indicated products because the pyrophosphate (PPi) released in step 1 is converted to inorganic phosphate (Pi) by a pyrophosphatase. The 3′ end of all tRNAs, to which the amino acid attaches, has the sequence CCA. Class I synthetases (purple) attach the amino acid to the 2′ hydroxyl of the terminal adenylate in tRNA; class II synthetases (green) attach the amino acid to the 3′ hydroxyl. (Ad = adenine; Cyt = cytosine.)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A883/?report=objectonly
«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO(TENTENAMENTO) (1)
D’accordo con il codice genetico, una cellula avrebbe bisogno di tRNA con 61 diversi anticodoni per complementare i 61 codoni disponibili.Tuttavia, dovuto alla degenerazione del codice genetico, la terza base è meno discriminatoria per l’aminoacido delle altre due basi.
«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO(TENTENAMENTO) (2)
Questa terza posizione del codone viene detta posizione di “wobble” (tentenamento).
In questa posizione, gli U e le C possono essere letti come G nell’anticodone.Allo stesso modo, le A e le G possono essere lette come U o Y (pseudouridina) nell’anticodone.
16/12/2011
39
«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO(TENTENAMENTO) (3)
I tRNA inoltre contengono una serie nucleotidi modificati.
Uno di questi nucleotidi è l’inosina (I).Se il tRNA contiene una Inosina nell’anticodone in posizione “wobble”, questo tRNA può leggere codoni che hanno A, U oppure C nella terza posizione.
L’accoppiamento delle basi nella 3°posizione del codone è rilassata, permettendo a G di appaiarsi con U, e all’inosina (I) dell’anticodone di appaiarsi con U, C oppure A. Sono illustrati due esempi di appaiamentp tra basi anomali, che permettono alla Phe-tRNA (tRNA che trasporta la fenilalanina) di riconoscere sia i codoni UUC che UUU, e al Ala-tRNA (tRNA che trasporta l’alanina) di riconoscere GCU, GCC e GCA.
Appaiamento non-standard codone-anticodone (“woobling”; tentenamento).