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Nuevas Tecnologías para el Diagnóstico Genético de las Enfermedades Infecciosas
Roberto Alonso FernándezBilbao, 24 de octubre de 2018
Congreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
Roberto Alonso Fernández:• Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas,
Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid (Spain)• Departamento de Medicina (Sección Microbiología Clínica),
Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid (Spain)
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Travel grants
With:Siemens, Abbott, Roche, DiaSorin, BioRad, Vircell,
Copan, Gilead &ViiV Laboratories
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CONFLICTOS DE INTERÉS
Congreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
200 AÑOS DE MICROBIOLOGÍA TRADICIONAL
LOUIS PASTEUR, 1822-1895
• Cultivo de microorganismos
• Pruebas fenotípicas
• Tinciones
• Serología
• Técnicas fiables, grandes limitacionesCongreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
MICROBIOLOGÍA MODERNA
KARY MULLIS
• 1983 Descubrimiento de la PCR (Nobel 86)
• 1985 alianza Cetus / Perkin Elmer
• 1991 Cetus vende patente PCR a Hoffman-La Roche
• 1995 primeros usos PCR en Microbiología Clínica
• 2000s. Otros hitos:• Automatización
• Espectrometría de masas (MALDI-TOFF)Congreso Nacional Laboratorio Clínico
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VENTAJAS DEL DIAGNÓSTICO GENÉTICO
• Altas sensibilidades y especificidades
• Rapidez
• Seguridad en el laboratorio
• Detección de microorganismos no cultivables(virus, bacterias “fastidiosas”)
• Versatilidad: permite detectar, cuantificar y caracterizar
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Infección por HCV
• Primera aplicación en el Laboratorio de Microbiología Clínica:• PCR + detección geles de agarosa
• AMPLICOR: PCR + Hibridación en MWP
• COBAS AMPLICOR: Sistema automatizado PCR + Hibridación con partículas magnéticas
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Infección por HCV
• Actualmente alta automatización, PCR tiempo real o TMA
• Genotipado: PCR tiempo real o PCR + hibridación
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Antivirales de Acción Directa
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Infección por HIV
• Carga Viral plasmática (1995): copias/ml• Medida por: PCR tiempo real, bDNA, TMA, NASBA
• Indica pronóstico y eficacia de tratamientos
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Infección por HIV
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Meses
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Infección por HIV
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Infección por HIV
• Genotipado de resistencias a antirretrovirales (2002)• Medida por secuenciación (Sanger, UDS)
• Orientación terapeutica
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Infección por HIV
Estudio VIRADAPT, 2002
Estudio GART, 2002
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Otras “Grandes” Cargas Virales
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SISTEMAS TRADICIONALES
• Extracción + Amplificación / Detección
• Preparación de “master mixes”
• Horas de procesamiento
• Necesidad de acumular: “Batches”
• De técnicas manuales a semi-automatizadas
• Normalmente “Single-plex”
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HACIENDO MÁS SENCILLO EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO: MONO-TEST
• Desarrollo de la Biología molecular y de la Ingeniería (equipos y microfluídica)
• Cartuchos mono-test
• Procesamiento sencillo
• Incluyen proceso completo
• Rápidos
• Automatizables
• POC???Congreso Nacio
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Sistema GeneXpert (Cepheid)
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• Desarrollo y lanzamiento 2004-2008
• 2010 OMS: promoción y subvención GeneXpertpara Dx de TB en 88 países endémicos de baja renta (10$ vs. 50$).
• 2015 CDC: “GeneXpert ha revolucionado el Dx de TB”
Sistema GeneXpert (Cepheid)
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Sistema GeneDrive HCV
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• Detección simultanea de varias dianas
• Sistemas: PCRrt con multiples primers y sondas, curvas de melting, microarrays, luminex.
De sistemas “singleplex” a sistemas “multiplex”
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• Máxima capacidad “multiplex”
• No buscamos un microorganismo concreto
• Buscamos conjuntos de microorganismos (heterogéneos) causantes de un síndrome común (baja especificidad de la clínica).• Infección SNC
• Infección respiratoria
• GEA
• ETS
• Sepsis
• Infección osteoarticular / prótesis
• Unfecciones transmitidas por artrópodos
CAMBIO DE PARADIGMA:DIAGNÓSTICO SINDRÓMICO
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Sistemas básicos: Seeplex SNC (Seegene)
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Un paso más: Direct Flow Chip / Fast Track
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La nueva generación: cartuchos mono-test FilmArray (BioMerieux)
• “Sample to result”
• Incluye:• Extracción
• PCR I: PCRs nested genéricas degeneradas
• PCR II: Conjunto de 102 PCRs singleplex específicas
• Detección por curvas de melting
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FILMARRAY (BioMerieux)Panel Respiratorio
20 dianas: virus y bacterias
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FILMARRAY (BioMerieux)Panel Gastrointestinal
22 dianas: virus, bacterias y protozoosCongreso Nacio
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FILMARRAY (BioMerieux)Panel Sepsis
27 dianas: bacterias, levaduras y genes de resistencia
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FILMARRAY (BioMerieux)Panel SNC
14 dianas: bacterias, virus y levadurasCongreso Nacional Laboratorio Clínico
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GenMark“Electrowetting”
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QIA stat-Dx
• Extracción/purificación en columna
• 8 canales de PCRrt, 6-plex c/u
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Verigene (Nanosphere)
Au Au
Au Au
c-Ag
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Curetis (Unyvero)
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Curetis (Unyvero)
50 dianas
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Curetis (Unyvero)
46 dianasCongreso Nacional Laboratorio Clínico
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T2MR (Magnetic Resonance)
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Una nueva forma de cuantificar:PCR digital
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AdvanDX QuickFISH
AdvanDX - QuickFISH®• 30 minutos, 4 ensayos, diana RNA 16S
• Más barato que técnicas de PCR a tiempo real
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Accelerate Pheno (BC)
• Identifica microorganismo en 1.5h vía filtración en gel, FISH
• Genera un fenotipo de sensibilidad cuantitativo 5.5h después por análisis celular morfocinético.
• Adelanta tiempo de diagnóstico con S 88,7-100%, E 97-100%
Marschal et al. JCM 2017
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Utilidad de las secuencias 16S rRNA
• Presente en todas las bacterias (18S rRNA en hongos)
• Muy conservado / muy variable
• “Gold standard” para ID
• Estudios de filogenia
• Descubrimiento de nuevos microorganismos: Tropherymawhipplei (1907-2001)
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Caracterización de microorganismos
• Tipación microbiana: género especie tipo
• Genes de resistencia: mec, van, oxa
• Factores de virulencia, toxinas (Panton Valentine en S. aureus, Toxina Binaria en C. difficile etc.) Congreso Nacio
nal Laboratorio Clínico 2018
Microbiota, Microbioma y Metagenómica
• Flora microbiana, conjunto de sus genes, estudio de esos genes
• Microbiota equilibrio salud/enfermedad
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2018
EVOLUCIÓN TECNOLÓGICA Y SUPERVIVENCIA
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EVOLUCIÓN TECNOLÓGICA Y SUPERVIVENCIA
• Reducción en morbilidad• Menor nº de complicaciones• Control de la infección y
epidemiológico• Ahorro:
• Reducción de nº ingresos• Reducción en días de estancia
hospitalaria (y UCIs)• Tratamientos más dirigidos,
menor tratamiento empírico
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• Detectan DNA, no microorganismos vivos: M. tuberculosis
• Muy alta sensibilidad. No distinguen entre contaminación, colonización e infección: P. jirovecii
• De momento no aportan perfiles complejos de sensibilidad a antimicrobianos
• Falta de “gold standard” adecuados
• Interpretación de nuevos hallazgos
• Oferta comercial (p. ej. baja para micosis y parasitosis). Dificultades con ensayos “home brew”
Limitaciones del Dx genético
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Panther (Hologic) TMA (RNA)
TRANSCRIPTOMICA
PROTEÓMICA (MALDI-TOF) / Cultivos rápidos (turbidimetria)
Algunas soluciones
Establecimiento de PUNTOS DE CORTE
Congreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
¡El futuro es impredecible!
Sensores moleculares: “Cantilevers”
Congreso Nacional Laboratorio Clínico
2018
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