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Nuevas tendencias en Preparación de Muestras
David de la Serna. Jefe de Ventas de Columnas y Fungibles
22 de Febrero de 2011
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De lo clásico a lo moderno
Técnicas: • - Filtración • - Extracción
– Extacción Líquido / Líquido - Extracción en Fase Sólida
Hardware • Cartuchos • Placas de pocillos • Discos
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Extracción en Fase Sólida (SPE)
Revisión de Terminología
Mecanismos Básicos de SPE
Tipos de Sorbentes
1. Acondicionamiento del Cartucho, disco o Placa 2. Carga: Introducción de la Muestra 3. Lavado: Eliminación del material no deseado 4. Elución: Elución selectiva de los compuestos de interés
Los 4 pasos de SPE
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Objetivo de la Preparación de Muestras
Pre-purificación: Eliminar interferencias y la matriz
Pre-separación: Mejorar la separación de los compuestos de interés de forma selectiva
Pre-concentración: Mejorar su detección
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Objetivos de la Preparación de Muestras
Clean-up y concentración
0 Minutos 10 0 Minutos 10
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SPP Formatos Formatos y accessorios
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Cartucho SPE de Alta Presión(on-line) Cuerpo de PVDF (I.D. 1-3mm), que contiene 20-40mg de sorbente entre dos fritados de acero
Fritados (polietileno poroso)
Masa de Sorbente (30-200um partículas de sorbente)
Placas de 96 Pocillos
Cartucho o Placas de Pocillos
96 columnas individuales en un único soporte
Cartuchos con masa empaquetada o disco
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SPE Formatos masa empaquetada - cartuchos Straight barrel – 1mL to 60mL, 50mg – 10g bed masses
LRC – Large Reservoir Capacity 100 – 500 mg, 10mL
Bond Elut Jr. 500mg – 1g
Particles: 40 or 120um (HF, high flow)
Mega Bond Elut 12 – 150 mL, 2g – 70g
April 30, 2012 8 Agilent Confidential
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Formatos SPE Masa Empaquetada – Placas de 96 Pocillos
Estandar 96-well: varias masas empaquetadas, 1mL volumens
Placas redondeadas: 2 mL volumen placa ,10 – 100mg
Versaplate: 25 – 100mg, 1.8 mL
April 30, 2012 9 Agilent Confidential
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Formatos SPE – Disco Monolítico Disco Monolítico SPE SPEC • Cartuchos – 3mL con un disco de 15 o 30mg (2x15mg superpuestos),
10mL con un disco de 35 o 70mg • Placas de 96 pocillos – placas de 1mL 15mg (C18 also in 30mg wells) • Discos de 47 y 90mm para aplicaciones medioambientales (C18 y 18AR)
Disco Empore SPE • Discos de 4mm /1mL, 7mm/3mL, 10mm/6mL • Placas de gran capacidad (2.5mL) y estandar (1.2mL) • Discos de 47 y 90mm para aplicaciones mediambientales • Alta densidad (partículas de 12um en PTFE ) y densidad estandar
(partículas de 50um)
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Formatos SPE – OMIX OMIX SPE Monolítico • Puntas o cama cónica en miniatura – masas/volúmenes reducidos
al mínimo • Placas de microextracción OMIX – Placas de 96 pocillos
Versaplate • Puntas OMIX para Tomtec Quadra y Hamilton Star Series –
gradilla de 96-puntas , puntas individuales • OMIX 10µL, 10µL MB (minibed), y 100µL puntas indiciduales–
8pack, 96 rack de puntas
OMIX microextraction plate OMIX tips for Tomtec Quadra
OMIX tips (for standard pipettors/robotic liquid handlers)
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Formatos SPE para automatización
Además de las placas de 96 pocillos, hay formatos disponibles para automatización con los siguientes instrumentos:
Hamilton (Omix)
Tomtec (Omix)
Gilson ASPEC
Gerstel
Spark Holland Prospekt
CTC combiPal
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Plataformas de Automatización
Spark Holland Pharma Symbiosis
Hamiton Star Plus
Tomtec Quadra 3
Gerstel Multi purpose Sampler (MPS)
Gilson Aspect
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Formatos SPE – SPE Online Cartuchos Prospekt • 1mm o 2mm • Empaquetado con fase Bondesil • Encajan en Spark Holland Prospekt y Symbiosis on-
line SPE instruments
Columnas Metaguard para SPE on-line (cambio de columna) • Material de 10 o 25um en 4.6mm i.d. HPLC guard
column utilizado como sistema de SPE on-line
Columnas Alexa para SPE on-line (cambio de columna) • Material Metasil básico 25-30µm en hardware de columna
HPLC, 1 y 2mm i.d’s, 30 y 50mm longitud
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Valvula Posición A
Bomba de Carga
Carga columna 1
Elución columna 2
Bomba de Elución por Gradiente
Q3
Q2
Q1
ALexa® Plumbing
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Valvula Posición B
Bomba de Carga
Bomba de Elución por Gradiente
Carga de columna 2
Elución columna 1
ALexa® Plumbing
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Formatos SLLE
Chem Elut • Tierra de diatomeas, Hydromatrix en 0.3 – 300 mL cartuchos de volumen de
muestra • Flujo por Gravedad
Combilute • Tierra de diatomeas, Hydromatrix en cartuchos de 96 pocillos. Material
sellador • Flujo por Gravedad • 200 mg
Hydromatrix en Versaplate • 260 mg
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Manifolds de vacío - Versaplate
Manifold para Versaplate
• Para uso solo con los productos Versaplate : – Productos Versaplate
(empaquetados con Bondesil/Bond Elut )
– TOP • Específicamente diseñado para
que el versaplate se pueda utililzar con los instrumentos Tomtec instruments (Versaplate es demasiado alto para que se puede utilizar con el manifold Tomtec )
Bomba de Vacío
Manomentro de vacío
Aguja de ventilación Manifold de Vacío con top
y base
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Manifold de Vacío para placas de 96 pocillos SampliQ y Bond Elut Square
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Manifolds de Vacío - Captivac
Collares Captivac • Utilizados con:
– Captiva – Placas SPEC
• O utilizar el adaptador de Placas de 96 pocillos SPEC con la mayoría de los manifolds del mercado
– Bond Elut 96 • O utilizar el adaptador de Placas de 96
pocillos SPEC con la mayoría de los manifolds del mercado
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Manifolds de Vacío – Vac Elut, Vac Elut 24
Vac Elut • Para usar con:
– Todos los cartuchos con conexión luer que requieran vacío
– Vac Elut SPS 24 tiene 24 posiciones y un embudo de eliminación
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Presión Positiva y accesorios
Manifold de Presión Positiva • Para utilizar con:
– Cartuchos Bond Elut o SPEC (1, 3, 6mL y LRC)
Adaptadores Bond Elut • Conectan Cartuchos en
Serie • Permiten conectar jeringas
para presión positiva Llaves de paso Luer
• Paran el flujo en todos los cartuchos con conexión luer
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SPE Monolítico SPEC y OMIX
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Tecnología Disco Monolítico: SPEC y Omix
Pre-Filtro
SPEC•Disc
SPEC® Masa Empaquetada
Frit soporte
Lecho de Part
Frit soporte
• Disco Monolitico, bajo masa • Masa Empaquetada 40um partícula
• Void volume 120 uL/100mg • Capacidad ~10% de masa
• Volumen Muerto~1 - 3ul/mg de masa
• Capacidad ~1- 5% de masa empquetada
• Volumen Muerto ~120ul/100mg de masa empaquetada
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Monolitica
• Masa sólida con poros
• Mayor area superficial que las masas empaquetadas lo que proporciona:
– Mayor capacidad (con lo que son masas empaquetadas de menor tamaño)
– Menores Volúmenes de elución – Sirven para tamaños de Muestras muy pequeñas
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SPEC: Menores Volúmenes de Elución
60
70
80
90
100
1000uL
500 uL 250uL 150uL 100uL 75uL
SPECPolymeric
% Rec.
Elution Volume
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Cama Monolítica
Masa Empaquetada
Monolitica
SPEC es sílica monolítica SPEC estructura del poro: • Macro partículas (7µm) forman un
laberinto complejo
• Acelerar el flujo • Minimiza el atasco • Promuve el contacto
superficial • Poros estandar (70Å) forman un área
superficial expandida
• Máxima interacción con el analito objetivo
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Características Especiales de las camas Monolíticas
Monolitos tienen mayor capacidad por unidad de masa • Útil para formatos de SPE más pequeños • Debido a la disminución de cantidad de masa, los monolitos dan:
– Volúmenes de Elución más bajos que la masa empquetada de SPE (silica)
– Esto da lugar a menor uso de disolventes y – Sensibilidad MS incrementada
Monolitos permiten flujo birideccional • Se pueden empaquetar en formato de puntas
– Se puede automatizar. También se puede usar por gravedad – Se mejora la facilidad de uso, los tiempos de poroceso y la
reproducibilidad
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Fases SPEC
Fase Reversa – C2, C8, C18, C18AR, PH
Fase Normal e Intercambio Iónico NH2, CN, Si, PSA, SAX, SCX Modo Mixto
– MP1, MP3 (SCX y no polar)
Cartuchos de 3 mL y 10mL (15 o 30 mg) 15 y 30mg placas de 96 pocillos (~ 1mL) Discos de 47mm para extracciones medioambientales
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OMIX vs SPEC
Omix se basa en material SPEC. Las diferencias son las siguientes:
• SPEC es un formatos en cartuchos/disco, mientras que OMIX
tiene un formato de punta de pipeta • En OMIX no hay prefiltros • OMIX tiene masa de material más pequeña • La densidad del material de Omix se ha optimizado para un
contacto optimo con el analito y flujo de la muestra a través de la punta.
•puntas 10 µL y 100 µL , 0.25mg - 1mg de fase, C18, C4, SCX
April 30, 2012 30 Agilent Confidential
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Si el analito está bien retenido . . .
. . . Solo una pequeña masa de sorbente es necesaria
• La masa empaquetada retiene las impurezas
• Se requiren mayor volumen de elución • El extracto se enriquecerá de impurezas
impurezas
Masas empaquetadas pequeñas SPE OMIX
April 30, 2012 31 Agilent Confidential
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Recomendaciones de Muestra y volúmenes de elución
Máximo Volumen de Elución – Dependiente del tipo de muestra (viscosidad, partículas en
suspensión, etc). – Para puntas Tomtec , 150 µL plasma es elmáximo de “Seguridad·
recomendado (antes del pretratamiento de la muestra) – Par puntas Hamilton, se han probado volúmenes de plasma hasta
100ul (2000 ng/mL)
Volumen de Elución – También dependiente del analito. – Unos analitos muestran recuperación suficiente con 2 x 25ul,
mientras que otros pueden requerir hasta 2 x 150ul
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Puntas de Microextracción Omix. Ventajas y Limitaciones
Ventajas
• Permite Volúmenes extremadamente bajos – 20 uL de muestra – 25-50 uL de elución
• Manual con un pipeteador de canal único o multipes
• Puntas Tomtec y Hamilton para conseguir una automatización total
Limitaciones
• Fases no altamente
especialozadas • Opciones de masa limitadas • Capacidad Limitada
(usualmente no es un problema en Pharma)
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Características Productos Monolíticos y beneficios
• Los Productos SPEC SPE tienen una alta capacidad lo que da lugar a mayores recuperaciones utilizando volúmenes de elución más bajos que las fases empaquetadas de SPE.
– Reduce el tiempo de secado, mejora la sensibilidad, y se minimiza el uso de disolventes.
• Puntas de SPE Omix, tecnología monolítica SPEC, aplicada a una gran variedad de formatos de puntas.
– Reduce el consumo de tiempo del operario y permite incrementar la productividad con una automatización completa.
– Capacidad para bajos volúmenes, lo que tiene mucha relevancia en el bioanálisis en Pharma
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Ventajas de las Técnicas Modernas
- Reducción del tiempo
- Reducción de Disolventes
- Automatización
- Mejor Rendimiento: • Mayor Factor de Concentración, • Mejor Selecividad, • Purificación Mejorada
- Menos dependiente del Operario
- Menores Costes de Operación
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FASES NO POLARES
C18 Octadecyl C2 Ethyl CH Cyclohexyl PH Phenyl
FASES POLARES
CN Cyanopropyl 2OH Diol NH2 Aminopropyl SI Silica
FASES DE INTERCAMBIO IÓNICO
SCX Strong cation exchanger CBA Weak cation exchanger SAX Strong anion exchanger NH2 Weak anion exchanger
FASES ESPECIALES
PBA CERTIFY ENVIRELUT ACCUCAT
Incr
emen
to d
e la
Pol
arid
ad
Clases de Fases Enlazadas a base de Silica
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Por qué predominan los sorbentes a base de Silica?
Tamaño de Partícula Controlada (e.g. 40 y 120 µm)
Tamaño de Poro Controlado (e.g. 60 A)
Área Superficial Controlada (hasta 600 m2 /g)
Fortaleza Mecánica / rigidez
Estabilidad Química / Amplia compatibilidad con Disolventes
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Fortaleza del Disolvente
SORBENTE Incremento de la fortaleza de elución
Silica Hexano Metanol, AcCN
Agua
Styrene Divinyl Benzene
Agua Etilo acetate
Hexano
Sílica Enlazada
Agua/ Metanol, AcCN
Aquí se ignoran aspectos cinéticos y termodinámicos de la solubilidad del analito
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Bond Elut Plexa Un nueva clase de Material
Polimérico SPE
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Como funciona Bond Elut Plexa
Aplicación de Muestra Lavado
Largas Proteínas endógenas no pueden
acceder a los poros
Los analitos permanecen enlazados fuertemente
con el núcleo hidrofóbico del polímero
La estructura del poro está diseñada especialmente
para permitir un elución excelente
El analito es transferido
dentro del polímero
con una cinética
excelente
Componente hidrofílico del polímero
permitiendo una excelente transferencia
de fase Las Proteínas endógenas
son eliminadas
Se obtiene un extracto limpio
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Plexa – Una nueva clase de Polímero
Las drogas polares y no polares enlazan con la parte hidrofóbica del final del poro en la estructura de SDVB
Hay un ligando hidroxilado en la superficie de y en las zonas superficiales de los poros. En el interior de los poros hay material hidrofóbico. A diferencia de otros materiales poliméricos del mercado, no hay grupos amida derivados de la n-vinyl pyrrolidona que contribuyen al mantenimiento en la superficie de interferencias de la matriz.
Proteínas excluidas La frecuencia de los grupos OH se reduce
Grupos OH Hidrofílicos DVB Hidrofóbico
Cambio en polaridad
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Como se compara con sus rivales ?
• Grupos Amida permite interacciones proteina-polímero
• Lípidos se pueden también unir a los grupos polares poliméricos
• Durante la elución, las proteínas y los analitos pueden co-eluir
Lider del Mercado tiene un esqueleto de N-vinilpirolidinona
Bond Elut Plexa no contiene nitrógeno!
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Como funciona Bond Elut Plexa PCX
CARGA Superficie hidrofílica permite una excelente transferencia de fase de los analitos básicos a los lugares de intercambio catiónico del polímero
LAVADO Los analitos se mantienen fuertemente enlazados al polímero mediante interacciones iónicas fuertes
ELUCIÓN El cambio de pH permite la elución de los analitos de los sitios de intercambio catiónico
Las largas Proteínas endógenas no pueden acceder a los poros
Interferencias como lípidos se pueden lavar sin perder analitos básicos
Analitos limpios con una recuperación elevada
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Metodología Plexa Sencilla
Bases/Neutros
Acondicionamiento: 500 μL MeOH 500 μL water
Aplicación muestra: 100 μL plasma dil 1:3 w/ 2% NH4OH
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH
Acidos
Acondicionamiento: 500 μL MeOH 500 μL water
Aplicación muestra: 100 μL plasma dil 1:3 w/ 1% formic acid
Lavado: 500 μL 5% MeOH
Elución: 500 μL MeOH Métodos para 10 mg Plexa en placa de 96 pocillos
Bond Elut Plexa Bases Acondicionamiento: 500 μL MeOH 500 μL water Aplicación muestra: 100 μL plasma dil 1:3 w/ 2% phosphoric acid Lavado Ácido: 500 µL 2% aqueous formic acid Lavado Neutro: 500 µL MeOH:ACN (1:1 v/v) Elución: 500 µL MeOH:ACN (1:1 v/v) + 5% NH3 (28-30%).
Bond Elut Plexa PCX
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45
Plexa - Resultados
Analito Plexa
Albuterol 97.9
Atenolol 97.0
Loratadine 71.0
Metoprolol 92.0
Naltrexone 85.7
Zolpidem 93.0
pKa LogP
10.3 1.3
9.6 1.3
4.9 5.2
10.8 1.3
9.2 1.8
6.2 3.9
•Condiciones: Recuperación Absoluta a partir de plasma humano (vs. patrón postextracción.)
•Condiciones básicas de carga, n=6, 200 ng/ml
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Precisión mejorada - Supresión iónica reducida
PCX
Otro Polimero La superioridad del Bond Elut PLexa PCX es evidente en la eliminación de la supresión iónica
inducida por la matriz.
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Cómo identificar la Supresión Iónica. Experimento de Infusión post-columna
47
Bomba Masas
Muestra (matriz) inyectada
Columna
Jeringa de Infusión Señal MS
Tiempo
Muestra (matriz) (SPE) Gradiente. Solo analito Isocrático. Solo analito
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Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa Recuperación Absoluta (AR)
1 - Plasma + ISTD + fármaco
2 - Extracción
3 - Inyección
Comparado con:
Fase Móvil+ ISTD + fármaco
– No extracción, no hay pérdidas en las recuperaciones
– No plasma, no hay efectos de matriz
Recuperación Relativa (RR)
1 - Plasma + ISTD + fármaco
2 - Extracción
3 – Inyección
Comparado con:
Un gráfico de farmacos de control extraidos (curva de calibración)
– Los fármacos son los mismos y se deberían extraer con las mismas eficiencias
– Si las curvas de calibración se hacen con datos de recuperación del 80%, y los desconocidos se recupern al 80%, las recuperaciones relativas mostrarán un 100%!!
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Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa
• Recuperaciones relativas – Se añaden concentraciones conocidas de patrón en la matriz, extraen(SPE),
y luego se crea una curva de calibración – Se usa la curva de calibración para calcular las concentraciones del
compuesto desconocido – Se puede enmascarar los efectos de la supresión iónica
• SI el patrón se extrae al 80% de recuperción, y el desconocido también, se mostrarán resultados de recuperación del 100%.
• Las recuperaciones Absolutas no “suprimen” estos efectos – Se compara un desconocido con el patrón inyectado directamente
• Pequeñas diferencias entre las recuperaciones absolutas vs. relativas es indicativo de la mayor limpieza del extracto o de características de extracción superiores
April 30, 2012 Confidentiality Label
49
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Recuperación Absoluta vs. Recuperación Relativa
Recuperación Absoluta
Recuperación Relativa
Pequeñas diferencias entre AR y RR indican mayor eficiencia de extracción y menor périda de señal debidoa la supresión iónica.
Diferencias mayores indican problemas de sensibilidad debidas a baja eficiencia de extracción o supresión iónica
Catálogo Plexa
April 30, 2012 50 Confidentiality Label
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Sumario
Bond Elut Plexa es un material Polimérico nuevo.
•Métodos simples de usar
• Extractos limpios
• Exclusión de la albúmina sérica
• Supresión Iónica reducida
• Tolera el secado
•Volúmenes de elución bajos
• Excelentes características de flujo
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Extracción Líquido-Líquido sin embudo de decantación
Extracción Líquido / Líquido
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53
Fase Orgánica
Matriz Acuosa
Extracción L/L clásica
Como mejorar el área de contacto entre la fase acuosa/fase orgánica?
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54
Chem Elut
Fase Acuosa Alta área superficial
x
x
x x x
x x
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x
x
x
x x
x
Extracción L/L sobre soporte sólido
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Manual de uso de Chem Elut
55
PASO 1: Aplicar la muestra acuosa sobre el cartucho seco de Chem Elut
Flujo por Gravedad! No se necesita vacío !
Hydromatrix Dry sorbent
Selección del tamaño adecuado del cartucho ChemElut/ToxElut o material de hidromatrix basado en el volumen de muestra acuosa. Regla general para la capcidad de adsorción: 1 g Hydromatrix para 1 ml de muestra.
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Manual de uso de Chem Elut
56
Fase Acuosa
PASO 2: Esperar 5-15 minutos
Que ocurre en la superficie de Chem Elut?
Las muestras adsorbidas son estables y no necesitan ser extraidas inmediatamente. Esta es una ventaja de los cartuchos chem elut, donde la muestra está protegida de la evaporación y se puede utilzar como almacenamiento de la muestra y medio de transporte. Para trabajar al pH óptimo de los analitos, se puede cambiar el pH de la muestra acuosa dentro del cartucho. Esto permite la elución fraccionada de los compuestos ácidos, básicos y neutros.
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Manual de uso de Chem Elut
57
Fase Orgánica
PASO 3: Añadir disolvente orgánico de extracción
Que ocurre en la superficie de Chem Elut ?
La Elución se lleva a cabo utilizando disolventes orgánicos que son inmiscibles con el agua. En general, la extracción con 2-3 veces volumen de muestra es suficiente.
Flujo por Gravedad No se necesita vacío
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“Sorbentes” y Productos
Los productos Agilent para la extracción líquido/líquido están basados en tierra de diatomeas ultralimpia con un alto volumen de poro. (Hydromatrix TM)
•ChemElut pretamponado: cartuchos (pH 4.5 y pH 9) eliminan la necesidad de ajustar el pH de la muestra previo a la extracción
•ChemElut Plus: tierra de diatomeas sintético. Es muy limpio y tiene una alta resitencia a la rotura.
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• CombiLute: Placa de 96 pocillos de SPE con material Hydromatrix. Cada placa está rellena de 200 mg de Hydromatrix y sellado con un material sellante.
• Combilute es efectivo, fácil, automatizable, y ofrece un sistema de clean-up con reducción de consumo de disolvente
Productos Liq/Liq en placas de Pocillos
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Aplicaciones Casi todas las extracciones, que se han llevado a cabo utilizando el embudo de decantación, se pueden transefir a ChemElut.
Especialmente para la preparación de muestras de orina, sangre total, plasma, suero y otros fluidos biológicos, se recomiendan los cartuchos ChemElut .
El producto Combilute juega un papel importante para purificación rápida y simple bibliotecas combinatorias sintetizadas por la técnica de síntesis paralela.
Otras aplicaciones son en el campo medioambiental y análisis de residuos, e.j. El análisis de agua de bebida y agua residual.
Hydromatrix ha probado ser una herramienta útil en extracciones de fluidos supercríticos (SFE) y extracciones de disolvente acelerada(ASETM). Las propiedades adsorbentes de Hydromatrix la hace ideal para usarse con soporte sólido en SFE y ASE.
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•Placas de 96 pocillos de filtración
•Cartuchos de Filtración
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Muestras más claras y limpias en menos de 15 minutos
•Más rápido que la centrifugación • Proporciona muestras más limpias • Fácilmente automatizable • No hay interferencias • Permite una vida media más larga
Ventajas de las Técnicas de Filtración Modernas
0 20 40 60 80
Captiva vs. Centrifugation
Tiempo total
Tiempo de Procesamiento
Tiempo de Puesta en Marcha
Tiempo de pretratamiento de la Muestra
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Filtración General
Captiva está listo
Pipetear la muestra
Introducir la pipeta dentro de Captiva y filtrar
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Aplicaciones de Filtración Captiva
Filtración y Almacenamiento de Plasma
Precipitación de proteína plasmática Filtración
Filtración General de la Muestra
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Resumen: Preparación de Muestras Moderna
-Reducción del tiempo de preparación
- Reducción uso de disolventes
-Automatizable
- mejor rendimiento:
• Mayor factor de concentración, • Mejor selectividad, • Purificación mejorada • Menos dependiente del operario
• Menos costes de operación
• Extracción en Fase Sólida • Extracción Liquido / Liquido • Filtración
Beneficios: • Hardware
• Cartuchos • Placas de Pocillos • Discos
Seleccione el material apropiado para:
BBDD ScanView para aplicaciones
GC, HPLC y SPE