Nuevos desarrollos en

la preparación de

muestras

Tecnologías que mejoran el

rendimiento y la productividad

Julián de la Mata

Innovation Tour 2015

1

Preparación de muestras en análisis de alimentos

2

SPE/SPME(Bond Elut)

•Límites de

detección

•Automatización

QuEChERSQuECherS Lípidos

•Fácil de usar

•Ideal para muestras

alimenticias

Extracción Líquido-

líquido.(SLE , en soporte sólido

ChemElut)

•Separación de fases

•A menudo lleva mucho tiempo

Filtration/Captiva

•Retirada de partículas

•Retirada de lípidos

SPME

Solid Phase Micro-Extraction

(MicroExtracción en Fase Sólida)

3

La SPME elimina las desventajas de la Técnicas

clásicasVolatiles

• Purge and Trap

• Headspace

Semi-/No-Volatiles

• Extracción Líquido/Líquido (LLE, SLE)

• Solid Phase Extraction (SPE)

• Supercritical Fluid Extraction (SFE)

4

SPME

SPME elimina la mayoría de los inconvenientes de las Técnicas Clásicas,

puede usarse con muestras gaseosas y líquidas, para GC, LC, GC/MS, LC/MS

con y sin automuestreadores

12

4

6

35

7

8

10

9

11

12

13

14

1516

17 18

1. -HCH

2. -HCH

3. -HCH

4. Heptachlor

5. -HCH

6. Aldrin

7. Heptachlor epoxide

8. Endosulfan I

9. 4,4’-DDE

10. Dieldrin

11. Endrin

12. 4,4’-DDD

13. Endosulfan II

14. 4,4’-DDT

15. Endrin aldehyde

16. Endosulfan sulfate

17. Methoxychlor

18.

En

Endrin ketone

Con agitación

Sin agitación

2 ppb de pesticidas en agua

Análisis de pesticidas en agua

Preparación de la Muestra por SPE Offline

SPE Offline

• 1000 mL transportados al laboratorio

• Concentración de Trazas en cartucho

o disco

• Elución con pocos ml de disolvente, secado, reconstitución en disolvente adecuado paraseparación por LC o GC

• 1 mL muestra se carga en un vial del autosampler

• 2-20 µL se inyectan en el cromatógrafo

6

Ventajas de SPE Offline

7

Múltiples métodos publicados disponibles con esta técnica

Amplia Variedad de tipos de sorbente disponibles en función de las propiedades de los distintos analitos y de las distintas matrices

Concentración de analitos para conseguir menores límites de detección a la vez que eliminan interferencias que originan ruido

Adecuado para una amplia variedad de equipos instrumentales

La preparación Offline no bloquea al equipo durante la preparación, manteniendo la flexibilidad

Preparación de Muestras Online para análisis por

LC-MS/MS

SPE Online (enriquecimiento de trazas)

• 100% muestra preparada se carga en el equipo

• Volumen puede ser <5 mL

• Combinado con detectores más sensibles (MS/MS)

• Se simplifica la logística de hacer llegar las muestras al laboratorio

8

Ventajas de la SPE online

9

Aproveche la sensibilidad de los sistemas LC-MS/MS con SPE online

Utiliza la muestra completa para lograr bajos límites de detección

Se necesitan pequeños volúmenes de muestra– menores costos de almacenamiento y transporte

Reduce las posibilidades de error causadas por el manejo de muestras.

Ahorro en costes de disolventes – tanto en la compra como en los desechos

No require pasos de evaporación.

No require reconstitución

Los sistemas integrados aumentan la productividad

QuEChERS : Una

innovadora preparación

de muestras para el

análisis alimentario y

medioambiental

¿Qué es QuEChERS (pronunciado “Catchers”)• Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust and Safe , QuEChERS

(Rápido, Fácil,Barato,Efectivo, Robusto y Seguro, RaFaBERS)

• Metodología para una extracción simplificada de un gran número de

residuos de pesticidas multiclase y multiresiduo en frutas y vegetales

• Desarrollado conjuntamente por la USDA (2003) y por las Agencias

Reguladoras de Alimentos Europeas (método prEn 15662: 2007)

• QuEChERS es un método de preparación de muestra rápido para hacer

screening de analitos de interés, no para concentrar muestra.

Page 11

Método Luke o SPE tradicional QuEChERS Beneficio

Tiempo estimado para

procesar 6 muestras (min)

120 30 4x más rápido

Solvente usado (mL) 90 mL 10mL 9 x menos solvent

Desechos clorados (mL) 30 mL Ninguno Más seguro, más

ecológico, menos costo

Equipo especializado, material

de vidrio

Embudo, baño de agua,

contenedores de 200mL ,

evaporador, etc.

Ninguno No se necesitan

consumibles adicionales

La última tecnología en la extracción de Lípidos

EMR-Lipid

Enhanced Matrix Removal

EMR: Tan fácil de usar como QuEChERS; tan límpio

como la SPE

EMR se adapta perfectamente en los actuales flujos de trabajo.

Tubos EMR-Lipid (p/n 5982-1010)

Tubos EMR-Polish (p/n 5982-0101)Tubos de Extracción

QueChERS

Los productos EMR

Sorbent EMR - ¿Qué es?

Cuando se active con agua…

- Las interacciones hidrofóbicasselectivas entre los materialesaumentan.

- Suspensión de nano particulas (altaarea superficial).

- Interacciona rápidamente con los grupos funcionales “tipo-Lípidos” de cadena recta.

Mecanismo EMR-Lipid –

Exclusión molecular e interacción hidrofóbica combinadas

1.0 g EMR en tubo de15 mL

… ¿ y qué hace?

El sorbente EMR retira los Lípidos

¿qué son los lipidos?

Un tipo de hidrocarburos naturales que contienen compuestosconcocidos como grasas y aceites

Acidos Grados Libres

Trigliceridos

Colesterol Fosfolípidos

¿Con qué no interaccióna EMR?

EMR NO elemina los analitos de interés

¿Excepciones?

Compuestos que contengan grupos funcionales con largascadenas alifáticas (e.g. prostaglandinas)

Fluoroquinolonas Tetracyclines

Vitamina DPAHsPesticidas organoclorados

Pesticidas Imidazoles

Protocolos EMR para Aplicaciones

EMR se adapta perfectamente en flujos de trabajo existentes

QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)

• Preparación de muestra fácil de usar para análisis de alimentos, muestras sólidas (e.g. vegetales, frutas, carnes, pescados, etc.)

Aplicaciones EMR :- Residuos de plaguicidas en Aguacate,

Extracción líquida modificada (Precipitación Protéica)

• Las proteinas se eliminan con una precipitación antes de la inyección o cleanup (e.g. leche, carne, pescado, etc.)

Aplicaciones EMR :- PAHs en Salmon,- Fármacos veterinarios en hígado

bovino

Pros

• Fast and inexpensive

• Takes minimal experience

• Doesn’t require special equipment

• Accommodates multiple matrices

• Accommodates large analyte groups

Cons

• Large amount of coextractives

Mejorando la dSPE en QuEChERS

1. Extraction 2. Dispersive SPE

Pros

• Same as extraction

Cons

• Minimal cleanup provided

• Can remove analytes

• Lipids are challenging to remove selectively

19

ExtracciónSPE Dispersiva

Pros

• Rápido y barato

• No se requiere experiencia

• No se requiere equipamiento

especial

• Aplicable a múltiples matrices

• Aplicable a gran grupo de analitos

Contras

• Gran cantidad de interferencias

Pesar muestra Añadir agua,

QC std y std

interno

Añadir

Acetonitrilo

Agitar o Vortex

Añadir paquete de sales Agitar 1 minuto Centrifugar a

4000 rpm, 5 min

Separar fase de

acetonitrilo

Elegir el kit de dispersiva y

añadir el extracto de acetonitrilo

Vortex 1 minuto Centrifugar a

4000 rpm, 5 min

Tomar una aliquota de

sobrenadante y secar o diluir

Poner en vial del

automuestrador para análisis

por GC o LC

Pros

• Las mismas que la extracción

Contras

• Proporciona una mínima limpieza

• Puede eliminar analitos

• Es difícil eliminar los lípidos

selectivamente

QuEChERS Tradicional versus QuEChERS EMR-

Lipid

Transferir al Vial de análisis Transferir al Vial de análisis

Standard QuEChERS EMR QuEChERS

Extracción/Partición (6 pasos) Extracción/Partición (6 pasos)

↓ ↓

Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar

↓ ↓

Transferir Muestra a dSPE(sorbentes)

Transferir Muestra a dSPE(sorbentes & H20)

↓ ↓

Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar

↓ ↓

Evaporar y reconstituir o diluir Tubo Polish

↓ ↓

Filtrar Precipitado Evaporar y reconstituir o diluir

20

(SI se usan sales de extracción)

Mejorando los flujos de Trabajo de las

Extracciones Líquidas

2. Añadir la muestra de

alimento

1. Añadir solvente de

precipitación.

(ACN)

Sal

Proteinas

Lipidos

Analitos3. Mezclar para precipitar proteinas.

4a. EMR dSPE y Polish. 4b. SPE y/o GPC.

Transferir para analiisis

21

Centrifuge

Extracción Líquida Tradicional versus EMR-Lipid

Transferir al Vial de análisis Transferir al Vial de análisis

Extracción Líquida con SPE/GPC Extracción Líquida EMR

Añadir Muestra y Acetonitrilo Añadir Muestra y Acetonitrilo

↓ ↓

Mezclar y Centrifugar Mezclar y Centrifugar

↓ ↓

Pretratamiento de Muestra Transferir Muestra y H2O a EMR dSPE

↓ ↓

SPE y/o GPC Mezclar y Centrifugar

↓ ↓

Evaporar y reconstituir o diluir Tubo Polish

↓ ↓

Filtrar Precipitado Evaporar y reconstituir o diluir

22

(No se usan sales de extracción)

EMR – Lipid – dSPE Cleanup

A B C D

E

A. QuEChERS o Extracto Líquido

B. Añadir H2O al tubo EMR (“activación”)

C. Transferir extracto

D. Vortex y centrifugación

E. Sobrenandante (1:1; extracto: H2O)

23

EMR – Polish – Separación de fase ACN/H2O

A B C D

E

A. Añadir sobrenadante al tubo EMR – Polish

B. Vortex inmediatamente

C. Separacion de fases después de centrifugación

D. Transferir la capa superior para análisis

E. División final de la muestra para analisis por

GC y LC.

24

GC-MS Fullscan de Aguacate

Aguacate – sin tratar

25

GC-MS Fullscan de Aguacate

Aguacate – sin tratar

Aguacate – tratado con EMR

26

GC-MS Fullscan de alimento para animales

Muestra– sin tratar

27

GC-MS Fullscan de alimento para animales

Muestra – sin tratar

Muestra – tratado con EMR

28

GC-MS Full Scan– Aceite de Aguacate

Extracto Crudo Aceite

Aguacate

Extracto EMR – Lipid

29

GC-MS Fullscan de Espinacas- Eliminación de

pigmentos

30

Blanco de matriz de espinacas con EMR cleanup

Blanco de matriz de espinacas sin cleanup

Blanco de matriz de espinacas con Q-Pigment dSPE cleanup

Blanco de matriz de espinacas con Q-Universal dSPE cleanup

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

Time-->

Abundance

Conclusiones

• EMR-Lipid proporciona la retirada de lípidos más completa de todos los sorbentes que hay en el mercado.

• Alcanza el nivel de limpieza del SPE con la simplicidad de la dSPE.

• EMR es un procedimiento universal para una gran variedad de tipos de muestra y analítos.

• Se han validado aplicaciones clave con EMR y se ha demostradomejor recuperación, mayor precisión, y una gran disminución del efecto matriz en los instrumentos y resultados.

• EMR se puede implementar inmediamente como dSPE en flujosde trabajo existentes como son QuEChERS y Extracción Líquidamodificada.

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