nvp « á poljoprivredni fakultet univerzitet u … u... · piroliza interni standard nvp nvp....

UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET

Institut za prehrambenu tehnologiju i biohemiju

Vesna V. Antić Mališa P. Antić

Beograd, 2014.

Industrijska otpadna voda, Pančevo, Srbija

Komunalna otpadna voda,

Ahen, Nemačka

Rel

ativ

na

ob

iln

ost

Rel

ativ

na

ob

iln

ost

Vreme, min.

m/z

Piroliza

Internistandard

NVP

NVP

Odlukom Odbora za izdavačku delatnost Poljoprivrednog fakulteta u Zemunu,

br. 45-II-2/4 od 30.06.2014. godine, odobreno je izdavanje udžbenika Hromatografija u

analizi hrane – I izdanje.

Autori

Dr Vesna Antić i Dr Mališa Antić

HROMATOGRAFIJA U ANALIZI HRANE

I izdanje

Recenzenti:

Dr Biljana Vucelić-Radović, redovni profesor Poljoprivrednog fakulteta

Univerziteta u Beogradu

Dr Ljiljana Damjanović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju


Dr Ljubiša Ignjatović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju


Izdavač:

Univerzitet u Beogradu – Poljoprivredni fakultet

Nemanjina 6, Zemun

Za izdavača:

Prof. Dr Dušan Radivojević

Naslovna strana:

Dr Vesna Antić

Tiraž: 100 primeraka

ISBN 978-86-7834-200-4

Predgovor

Udžbenik Hromatografija u analizi hrane namenjen je studentima diplomskih,

specijalističkih i doktorskih akademskih studija Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu,

kao i svima koji se bave analitikom organskih jedinjenja, a naročito analitikom

jedinjenja iz prehrambenih proizvoda. Tekst udžbenika se zasniva na nastavnom

programu predmeta Hromatografske metode u analitici hrane (diplomske akademske

studije), a pokriva i delove drugih predmeta različitih nivo studija, kao što su: Hemija i

analitika hrane (diplomske akademske studije); Spektroskopske i hromatografske

metode u analitici hrane, Analitičke metode u mikrobiologiji hrane i Hemijska

kontaminacija hrane (specijalističke akademske studije); Instrumentalne metode analiza

i Hemijske i biohemijske transformacije proizvoda biljnog porekla (doktorske akademske

studije).

U okviru Udžbenika su najpre dati teorijski osnovi hromatografije, a zatim su

detaljno opisane sledeće hromatografske tehnike: planarna hromatografija, apsorpciona

hromatografija u koloni, gasna hromatografija i tečna hromatografija visokih

performansi. Na kraju svakog od Poglavlja u kojima su opisane pojedinačne

hromatografske tehnike, dati su brojni primeri njihove primene u analizi hrane. S

obzirom da je Udžbenik namenjen višim nivoima studija, pretpostavlja se da je čitalac

upoznat sa osnovama organske hemije i fizičke hemije.

Zahvaljujemo se recenzentima na pažljivom čitanju rukopisa i korisnim

napomenama i sugestijama, koje su doprinele da se tekst značajno poboljša i unapredi.

Recenzentima smo takođe zahvalni na mišljenju da se Udžbenik može preporučiti i

studentima drugih fakulteta Univerziteta u Beogradu, kao što su studenti fizičke hemije,

hemije, farmacije, tehnologije i drugih nauka kojima je hromatografija komplementarna

naučna disciplina, kao i svima onima koji se bave hromatografijom u stručnom,

istraživačkom i svakodnevnom radu.

Budući da je ovo prvo izdanje ovog Udžbenika, autori će biti vrlo zahvalni svima

koji u njemu uoče propuste i greške bilo koje vrste, i daju nam usmene ili pismene

sugestije za njegovo ispravljanje.

Autori

SADRŽAJ

1. Principi i podela hromatografije ........................................................................................... 1 1.1. Uvod ............................................................................................................................. ........................ 1 1.2. Osnovi hromatografije ................................................................................................................ 2 1.2.1. Osnovni pojmovi u hromatografiji ...................................................................................... 3 1.2.1.1. Hromatogram ........................................................................................................................... 3 1.2.1.2. Gausov profil pika ................................................................................................................... 4 1.2.1.3. Koeficijent raspodele ............................................................................................................ 4 1.2.1.4. Teorijski podovi ...................................................................................................................... 4 1.2.1.5. Retencioni parametri ............................................................................................................ 5 1.2.1.6. Selektivnost i razdvajanje 6 1.2.2. Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima ....................... 7 1.2.2.1. Disperzione sile ....................................................................................................................... 7 1.2.2.2. Polarne sile ................................................................................................................................ 7 1.2.2.3. Jonske sile .................................................................................................................................. 8 1.2.2.4. Hidrofobne i hidrofilne interakcije ................................................................................. 8 1.3. Podela hromatografskih metoda ............................................................................................. 9 1.3.1. Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada ................................................. 9 1.3.2. Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja ........................ 10 1.3.3. Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge ...... 11 1.3.4. Podela hromatografskih metoda prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze ...........................................................................................................................

12

2. Planarna hromatografija ............................................................................................................ 14 2.1. Hromatografija na papiru ........................................................................................................... 14 2.1.1. Hromatografski papir ............................................................................................................... 14 2.1.2. Priprema i nanošenje uzorka ................................................................................................ 15 2.1.3. Mobilna faza ............................................................................................................................. ..... 18 2.1.4. Razvijanje hromatograma ...................................................................................................... 19 2.1.5. Određivanje položaja zona na hromatogramu ............................................................. 22 2.1.6. Kvantitativna analiza ................................................................................................................ 23 2.2. Hromatografija na tankom sloju ............................................................................................. 23 2.2.1. Stacionarna faza .......................................................................................................................... 23 2.2.2. Priprema i nanošenje uzorka ................................................................................................ 24 2.2.3. Mobilna faza............................................................................................................................. ...... 25 2.2.4. Razvijanje hromatograma ...................................................................................................... 26 2.2.5. Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči ................................................ 27 2.2.6. Kvantitativna analiza ................................................................................................................ 28 2.2.7. Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju ......................................... 28 2.2.8. Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane ................................................. 29

3. Adsorpciona hromatografija u koloni ................................................................................ 31 3.1. Stacionarna faza .............................................................................................................................. 31 3.1.1. Adsorbensi ............................................................................................................................. ........ 32 3.1.1.1. Silika-gel ............................................................................................................................. ........ 32 3.1.1.2. Aluminijum-oksid ................................................................................................................... 33

3.1.1.3. Aktivni ugalj ............................................................................................................................. . 33 3.1.1.4. Magnezijum-oksid .................................................................................................................. 34 3.2. Mobilna faza ............................................................................................................................. ........ 34 3.3. Tehnika rada ................................................................................................................................... 34

4. Gasna hromatografija ................................................................................................................... 37 4.1. Uvod ............................................................................................................................. ........................ 37 4.2. Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji ......................................... 39 4.3. Teorija o gasnoj hromatografiji ............................................................................................... 42 4.4. Gasni hromatograf ......................................................................................................................... 43 4.4.1. Noseći gas ............................................................................................................................. ......... 44 4.4.2. Unošenje uzorka - isparivači (injektori) .......................................................................... 44 4.4.2.1. Unošenje uzoraka gasa ........................................................................................................ 48 4.4.2.2. Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim supstancama bez rastvarača ................................................................................................

49

4.4.2.2.1. Statički Headspace .............................................................................................................. 49 4.4.2.2.2. Dinamički Headspace ........................................................................................................ 50 4.4.2.2.3. Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction – SPME) ... 50 4.4.3. Gasnohromatografske kolone ............................................................................................... 52 4.4.3.1. Pakovane kolone ..................................................................................................................... 53 4.4.3.2. Kapilarne kolone ..................................................................................................................... 54 4.4.3.3. Stacionarne faze ...................................................................................................................... 56 4.4.3.3.1. Čvrste stacionarne faze .................................................................................................... 57 4.4.3.3.2. Tečne stacionarne faze ..................................................................................................... 58 4.4.3.3.3. Selektivnost stacionarne faze ........................................................................................ 60 4.4.3. Detektori u gasnoj hromatografiji ....................................................................................... 64 4.4.3.1. Termoprovodljivi detektor ................................................................................................. 66 4.4.3.2. Plameno-jonizacioni detektor ........................................................................................... 68 4.4.3.3. Detektor sa zahvatom elektrona ...................................................................................... 69 4.4.3.4. Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor................................. 71 4.4.3.5. Plameno fotometrijski detektor........................................................................................ 72 4.4.3.6. Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi ............. 73 4.4.4. Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji .................................................................. 77 4.4.4.1. Temperatura kolone .............................................................................................................. 77 4.4.4.2. Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze ..... 79 4.4.5. Kvalitativna gasnohromatografska analiza ..................................................................... 80 4.4.6. Kvantitativna gasnohromatografska analiza .................................................................. 81 4.4.6.1. Metoda normalizacije površina ........................................................................................ 81 4.4.6.2. Metoda internog standarda ................................................................................................ 81 4.4.6.3. Metoda standardnog dodatka ........................................................................................... 83 4.4.7. Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji ............................................................ 83 4.5. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda .............................................................................................................

86

5. Tečna hromatografija visokih performansi – HPLC ................................................... 89 5.1. Uvod u HPLC ............................................................................................................................. ........ 89 5.2. Tehnike tečne hromatografije .................................................................................................. 90 5.3. Šta je HPLC? ...................................................................................................................................... 93 5.4. Princip rada tečne hromatografije visokih performansi ............................................... 94

5.5. Osnovni delovi HPLC sistema ................................................................................................... 94

5.5.1. Injektor ............................................................................................................................. .............. 95 5.5.2. Stacionarna faza – kolona ....................................................................................................... 96 5.5.3. Mobilna faza ............................................................................................................................. ..... 98

5.5.4. Pumpa .............................................................................................................................................. 99 5.5.5. Detektor ............................................................................................................................. ............. 99 5.6. Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om ...................................................................... 101 5.7. Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om ................................. 104 5.8. Izokratsko i gadijentno eluiranje ............................................................................................ 105 5.9. Analitički, preparativni i industrijski HPLC ........................................................................ 107 5.10. Performanse hromatografskog razdvajanja .................................................................... 109

5.10.1 Rezolucija ............................................................................................................................ ......... 109 5.10.2. Sposobnost mehaničkog razdvajanja – efikasnost .................................................... 109 5.10.3. Sposobnost hemijskog razdvajanja – selektivnost ................................................... 110 5.11. Režimi HPLC razdvajanja ......................................................................................................... 111 5.11.1. Razdvajanje na osnovu polarnosti ................................................................................... 111 5.11.1.1. HPLC normalnih faza .......................................................................................................... 113 5.11.1.2. HPLC reverznih faza ........................................................................................................... 114 5.11.1.3. Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija ........................................................ 115 5.11.1.4. Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija ..................................................... 115 5.11.2. Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena ........................................... 115 5.11.3. Afinitetna hromatografija .................................................................................................... 118 5.11.4. Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija ..... 120 5.11.4.1. Gelhromatograf ..................................................................................................................... 122 5.11.4.2. Materijal za pakovanje kolone – nosač stacionarne faze .................................... 123 5.11.4.3. Mobilna faza ........................................................................................................................... 123 5.11.4.4. Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom ............................. 124 5.11.4.5. Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom raspodelom molskih masa . 125 5.11.4.6. Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa ... 128 5.11.4.7. Univerzalna kalibracija ...................................................................................................... 128

5.12. Primena HPLC tehnike u analizi hrane .............................................................................. 130

6. Literatura ............................................................................................................................. ............... 135

1. Principi i podela hromatografije

Cilj poglavlja

Upoznavanje sa osnovnim principima hromatografskih metoda. Definisanje

pojmova koji se koriste u literaturi posvećenoj hromatografskim metodama:

hromatogram, pik, koeficijent raspodele, teorijski pod, međumolekulske sile i interakcije.

Definisanje kriterijuma za podelu hromatografskih metoda i podela hromatografskih

metoda.

1.1. Uvod

Hromatografske metode su danas najčešće korišćene metode za razdvajanje i

određivanje supstanci. Hromatografija je metoda za analitičko razdvajanje supstanci,

mada se može koristiti i u preparativne svrhe, posebno za izolovanje malih količina

supstance, koje se ne mogu drugim metodama izolovati i/ili prečistiti. Hromatografija se

može definisati kao skup analitičkih metoda kojima se razdvajaju supstance na osnovu

različitih raspodela između pokretne i nepokretne faze.

Prvi naučnik koji je opisao metodu razdvajanja, koja se danas može nazvati

hromatografskom, jeste ruski botaničar M. Cvet (rus. M. Цвет, engl. M. Tswett). Cvet je

tehniku opisao još početkom dvadesetog veka, 1903. godine. On je ekstrakt pigmenata iz

listova biljaka propuštao kroz kolonu ispunjenu kalcijum-karbonatom i eluiranjem

pomoću smeše petroletar/etanol razdvojio više zelenih i žutih pigmenata. Tehniku je

nazvao hromatografija (od grčkih reči χρώμα: chroma – boja i γραφειν: grafein – pisati).

Bez obzira na naziv, on je pretpostavio da se tehnika može koristiti i za razdvajanje bezbojnih

supstanci i preporučio je za razdvajanje složenih smeša. Međutim, ova tehnika je bila

skoro zaboravljena više od dvadeset godina, sve do 1930. godine, kada su Kuhn,

Winterstein i Lederer na koloni punjenoj istim adsorbensom razdvojili komponente

žumanca jajeta i identifikovali lutein i zeaksantin. Početkom pedesetih godina prošlog

veka Martin i Synge razdvajaju acetil derivate amino kiselina na koloni punjenoj silika

gelom na kome je adsorbovana voda nepokretna faza a rastvarač za eluiranje

hloroformom, odnosno pokretna faza. Ovo je početak tečno-tečne hromatografije ili

apsorpcione (podeone) hromatografije, engl. “partition column chromatography”.

Martin i Synge su zahvaljujući svojim istraživanjima dobili Nobelovu nagradu za hemiju

1952. godine. Kasnije, Martin u saradnji sa Consden-om i Gordon-om razvija

hromatografiju na papiru, gde je voda bila nepokretna faza a 1-butanol pokretna faza.

Ruski farmaceuti Izmailov i Schreiber postavljaju osnove hromatografije na tankom

sloju 1938. godine, kada kao nepokretnu fazu koriste vodu adsorbovanu na tankom

sloju silika gela koji je nanet na staklenu ploču. Ovu tehniku dalje razvija i unapređuje

Principi i podela hromatografije

2

nemački hemičar Stahl šezdesetih godina prošlog veka. U periodu od 1950. do 1965.

godine, naglo raste broj naučnih radova vezanih za hromatografiju i postavljaju se osnove

za razvoj savremenih hromatografskih metoda: gasnu hromatografiju (GC), visokoefikasnu

tečnu hromatografiju (HPLC), jonsku hromatografiju, itd.

Uvođenjem masenog spektrometra kao detektora za gasnu hromatografiju od

strane James-a i Martin-a, 1952. godine, odnosno kao detektora za tečnu hromatografiju

od strane Tal’roze-a i Karpov-a, 1968. godine, i kasnijim razvojem masene

spektrometrije i računara počinje nova era u razvoju gasne i tečne hromatografije.

Danas možemo, korišćenjem GC/MS i LC/MS metoda, kvalitativno i kvantitativno

određivati i najsloženije smeše organskih jedinjenja, kao i izuzetno male količine

supstanci (reda veličnine ppm) u složenim smešama. Vreme trajanja analiza na

savremenim GC/MS i LC/MS aparatima je kratko (od nekoliko minuta do jednog sata),

rad sa njima je jednostavan, moderni softveri omogućavaju laku intrepetaciju rezultata,

sve su manjih dimenzija i, zahvaljući velikom broju proizvođača, cena im je sve niža.

Moderne hemijske laboratorije za analizu prehrambenih i poljoprivrednih proizvoda,

lekova, uzoraka iz životne sredine, nafte i naftnih derivata i mnogih drugih uzoraka je

danas teško zamisliti bez ovih aparata.

1.2. Osnovi hromatografije

Osnovni cilj hromatografije je razdvajanje različitih supstanci koje čine smešu.

Primene se kreću od jednostavnog određivanja čistoće nekog jedinjenja do identifikacije

i kvantitativnog određivanja komponenti neke smeše. Hromatografski sistem sastoji se

od nepokretne, tj. stacionarne faze, koja može biti čvrsta ili tečna, i pokretne, tj. mobilne

faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno prolazi kroz (preko) stacionarnu

fazu. Faze se biraju tako da komponente smeše na različit način interaguju sa nepokretnom

fazom, ako se radi o čvrstoj stacionarnoj fazi, odnosno da imaju različitu rastvorljivost u

tečnoj stacionarnoj fazi i mobilnoj tečnoj ili gasovitoj fazi. Analizirana smeša se u

hromatografski sistem uvodi preko mobilne faze. Različiti afiniteti komponenti smeše

prema stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje. Svaka

komponenta se zadržava u različitom stepenu na/u stacionarnoj fazi u zavisnosti od

afiniteta/rastvorljivosti, odnosno kreće se različitom brzinom kroz stacionarnu fazu u

zavisnosti od rastvorljivosti u mobilnoj fazi.

Interakcije između komponenti uzorka i stacionarne faze se mogu klasifikovati

kao procesi adsorpcije ili apsorpcije. Kod adsorpcije uzorak interaguje sa površinom faze, i to

obično sa površinom čvrste supstance stacionarne faze. Sa druge strane, kod apsorpcije

uzorak difunduje u unutrašnjost stacionarne faze. Većina hromatografskih razdvajanja

su kombinacija adsorpcionih i apsorpcionih procesa.


3

Kada se šmeša uvede kao rastvor na stacionarnu fazu, mobilna faza nosi komponente

kroz nju. Svaka komponenta smeše je u ravnoteži između faza na drugačiji način, pre svega

zbog različitog afiniteta prema stacionarnoj fazi. Iz tog razloga, svaka od komponenti ima

specifičnu ravnotežnu konstantu i kreće se različitom brzinom, odnosno za različito vreme

prolazi kroz stacionarnu fazu. Kao rezultat analize, hromatografski sistem će prvo

napustiti komponenta koja se najkraće zadržava na stacionarnoj fazi, a poslednja ona koja se

najduže zadržava, odnosno sve komponente smeše će biti razdvojene.

1.2.1. Osnovni pojmovi u hromatografiji

1.2.1.1. Hromatogram

Hromatogram je krajnji rezultat hromatografskog postupka. Svakoj supstanci

odgovara zona na hromatogramu, odnosno određeni pik. Zone su razdvojene

komponente smeše raspoređene u stacionarnoj fazi. Hromatografski maksimum ili pik

je grafički prikaz odziva detektora (koncentracije komponente u eluatu ili neke druge

veličine srazmerne koncentraciji) u funkciji vremena ili zapremine eluata.

U zavisnosti od tipa hromatografije razlikujemo unutrašnje i spoljašnje

hromatograme. Kod unutrašnjih hromatograma komponente smeše prelaze različita

rastojanja za isto vreme i detektuju se na stacionarnoj fazi, tj. podlozi (Slika 1.1).

Unutrašnje hromatograme susrećemo kod planarne hromatografije. Spoljašnji

hromatogrami su rezultat hromatografije u koloni, kada komponente smeše prelaze isti

put za različito vreme i detektuju se van stacionarne faze. Spoljašnji hromatogrami

mogu biti diferencijalni i integralni. Ako detektor beleži promenu koncentracije

komponente u mobilnoj fazi u funkciji vremena eluiranja onda je to diferencijalni

hromatogram (Slika 1.2). Kod integralnog hromatograma detektor beleži ukupnu

količinu izeluiranih sastojaka u vremenu. Spoljašnji hromatogram predstavlja grafički

prikaz hromatografskog razdvajanja. Veličina merenog signala (hromatografskog

maksimuma ili pika) se prikazuje u funkciji vremena zadržavanja komponente smeše u

koloni ili funkciji zapremine mobilne faze koja je potrebna da eluira (spere)

komponentu iz kolone.

Slika 1.1. Unutrašnji hromatogram

Slika 1.2. Spoljašnji diferencijalni hromatogram


4

1.2.1.2. Gausov profil pika

Svi molekuli jedne komponente se ne kreću istom brzinom kroz hromatografsku

kolonu, već se jedni kreću brže a drugi sporije. Brzina kretanja na zidu kolone je

približno jednaka nuli, dok je brzina kretanja u centru kolone maksimalna. Dalje, postoje

i varijacije u broju sorpcija i desorpcija molekula, razlike u koncentraciji u zoni

ubrizgavanja, itd. Zbog različite brzine kretanja molekula iste komponente kroz kolonu,

molekuli u različito vreme dolaze na detektor, tako da se dobija signal koji, u idealnom

slučaju, izgleda kao Gausova kriva raspodele. Realni pikovi vrlo često ne izgledaju kao

idealna Gausova kriva, već imaju manja ili veća odstupanja iz već pomenutih razloga.

Postoje dva osnovna oblika asimetričnih pikova. Kada je kolona prezasićena komponentom,

onda je uzlazni deo pika strmiji od silaznog. U slučaju kada se komponenta jako vezuje

za stacionarnu fazu (provodi više vremena na stacionarnoj fazi), onda je silazni deo pika

strmiji od uzlaznog. Da bi ovaj nedostatak izbegli ili sveli na najmanju moguću meru,

proizvođači daju kapacitet kolone koji je izražen u ng/jedinjenju, i koji omogućava

procenu optimalne količine supstance za analizu.

1.2.1.3. Koeficijent raspodele

Osnovni fizičko-hemijski parametar hromatografije je ravnotežna konstanta K,

koja se naziva koeficijent raspodele i koja kvantifikuje odnos koncentracija svakog

jedinjenja unutar dve faze. Vrednost koeficijenta raspodele nekog jedinjenja x može se

prikazati kao:

Kx = [X]S / [X]M

gde je [X]S – koncentracija jedinjenja u stacionarnoj fazi i

[X]M – koncentracija jedinjenja u mobilnoj fazi

Vrednosti K su vrlo promenljive, jer one mogu biti veoma velike (npr. 1000), kada je mobilna

faza gas ili male (npr. 2) kada su i stacionarna i mobilna faza u tečnom stanju. Svako

jedinjenje zauzima samo ograničen prostor na koloni, uz promenljive koncentracije na

svakom mestu, dakle prave vrednosti [X]S i [X]M variraju u koloni, ali njihov odnos je

konstantan. Koeficijent raspodele zavisi od prirode supstance, stacionarne i mobilne

faze i temperature, dok je nezavistan je od koncentracije supstance.

1.2.1.4. Teorijski podovi

Teorijski pod (ili plato) je onaj zamišljeni deo kolone u kome je uspostavljena

ravnotežna raspodela koncentracija nekog jedinjenja između stacionarne i mobilne faze.

Model teorijskih podova pretpostavlja da se kolona sastoji od serije podova. Raspodela


5

neke komponente između mobilne i stacionarne faze se javlja na svakom podu. Iz tog

razloga, veći broj podova, znači bolje razdvajanje supstanci jer se dešava više ciklusa

sorpcije-desorpcije.

Broj teorijskih podova (N) je kvantitativna mera efikasnosti kolone i može se

dobiti direktno iz hromatograma:

N = 16(tr/tw)2

U jednačini tw je širina osnove pika (širina pika na baznoj liniji), izražena istom

jedinicom kao i retenciono vreme, tr, tj. vreme koje protekne od unošenja uzorka u

kolonu do pojave maksimuma njegovog pika. N ima približno iste vrednosti za različite

pikove nastale pod istim hromatografskim uslovima. To znači da se sa povećanjem

retencionog vremena povećava i širina pika što za posledicu ima da pik koji se eluira

poslednji ima malu visinu a veoma često ne može da se razlikuje od bazne linije.

Vrednost N proporcionalna je dužini kolone pa, ako su ostali faktori konstantni, duža

kolona vodi ka povećanju N, odnosno, boljem razdvajanju.

Efikasnost kolone se najčešće izražava preko broja teorijskih podova:

H = L/N

H - vrednost je visina ekvivalentna jednom teorijskom podu (engl. Height Equivalent to a

Theoretical Plate - HETP), L je dužina kolone. Iz jednačine se vidi da što je H – vrednost

manja, to je efikasnost kolone veća, odnosno širenje hromatografskih pikova je manje.

1.2.1.5. Retencioni parametri

Retencioni parametri su parametri koji definišu brzinu kojom komponetna

prolazi kroz hromatografski sistem, odnosno zapreminu mobilne faze koja je potrebna

da se komponenta eluira ili dužinu puta koji komponenta pređe za određeno vreme.

Retencioni parametri su: retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tM),

relativno retenciono vreme (t'r), retenciona zapremina (Vr), “Hold-up” zapremina ili

mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost.

Retenciono vreme (tr) je vreme koje protekne od unošenja uzorka u kolonu do

pojave maksimuma pika (slika 1.2).

Redukovano retenciono vreme (tM) je vreme koje supstanca provede u

stacionarnoj fazi.

Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog vremena posmatrane

komponente i referentne komponente (najčešće mobilne faze). Umesto relativnog

retencionog vremena se često koristi korigovano retenciono vreme koje predstavlja

razliku između retencionog vremena komponente i retencionog vremena mobilne faze

(t0) (hold-up time ili dead time).


6

Retenciona zapremina (Vr) je zapremina mobilne faze koja je potrebna da

komponenta pređe put od početka kolone do detektora.

“Hold-up” zapremina ili mrtva zapremina (VM) je zapremina mobilne faze

koja se nalazi u koloni.

Retencioni faktor (k) predstavlja meru zadržavanja komponente u koloni. Kada

se jedinjenje ukupne mase m unese na kolonu, razdvaja se na dva dela: jedan deo je u

mobilnoj fazi, mM - masa u mobilnoj fazi, a drugi deo u stacionarnoj fazi, mS - masa u

stacionarnoj fazi. Tokom migracije jedinjena kroz kolonu, ove dve mase ostaju

konstantne. Njihov odnos, koji se zove retencioni faktor, je konstantan i nezavisan od

ukupne mase jedinjena unete na kolonu (m):

k = mS/mM = CS/CM • VS/VM = K • VS/VM

Ovaj parametar uzima u obzir sposobnost kolone (njene stacionarne faze) da

zadrži jedinjenje. U idealnom slučaju vrednosti bi trebalo da se kreću od 1 do 5, ali ne

više jer bi se u tom slučaju komponenta previše zadržavala na koloni i time

neopravdano produžilo vreme analize, odnosno ne manje od jedan jer bi se tada

supstanca eluirala sa pikom mobilne faze.

Rf vrednost se definiše kao odnos pređenog puta komponente (dA) i pređenog

puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dM):

Rf = dA/ dM

Na Slici 1.1, na kojoj je prikazan unutrašnji hromatogram, Rf vrednost bi bila

jednaka b/a.

1.2.1.6. Selektivnost i razdvajanje

Selektivnost je sposobnost hromatografskog sistema da napravi razliku između

dve komponente na osnovu njihove različite raspodele između mobilne i stacionarne

faze. Mera selektivnosti je faktor selektivnosti (α) koji predstavlja meru razdvojenosti

dve komponente i smatra se da je za α >> 1 postignuto zadovoljavajuće razdvajanje

ispitivanih komponenti. Vrednost α se izračunava iz jednačine:

α = kA/kB

Faktor selektivnosti se, takodje, zove i relativno zadržavanje. Što je vrednost α veća, to

su dve komponente bolje razdvojene. Jedini način da se modifikuje ovaj parametar jeste

da se promeni jedna ili obe faze.

Rezolucija je stepen razdvajanja između dve komponente. Faktor rezolucije R

se može izračunati iz sledećeg izraza:


7

R = 2Δt/(WA-WB)

gde je : Δt – razlika u retencionim vremenima komponente A i B (tA – tB)

WA – širina pika komponente A

WB - širina pika komponente B

Faktor rezolucije treba da ima vrednost veću od 1,2. Rezolucija zavisi od

efikasnosti kolone (broja teorijskih podova), selektivnosti i kapaciteta kolone.

1.2.2. Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima

Sve međumolekulske (intermolekulske) sile su po prirodi električne. Postoje tri

različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione, polarne i jonske sile.

Međumolekulske interakcije proizilaze iz međumolekulskih sila.

1.2.2.1. Disperzione sile

Disperzione sile nastaju zbog oscilacija naelektrisanja kroz molekul, kao rezultat

vibracija elektroni - jezgro. Elektroni u interakciji sa jezgrom daju dipole koji se brzo

menjaju i ako se posmatraju kroz veliki broj konfiguracija u molekulu, njihova

rezultanta je nula. Međutim, oni su u svakom trenutku u mogućnosti da interaguju sa

dipolom iz drugog molekula i na taj način dovedu do interakcije između molekula.

Dominantan faktor koji kontroliše jačinu disperzione sile je polarizabilnost. Dakle,

disperzione interakcije nisu rezultat lokalizovanih dipola u bilo kom delu molekula, već

promenljivi dipoli jednog molekula mogu da u bilo kom trenutku stupe u intrakciju sa

promenljivim dipolima drugog molekula. Disperzione interakcije su slabe interakcije,

koje se, zbog toga sto se javljaju kod nepolarnih jedinjenja koja se ne rastvaraju u vodi,

zovu još i hidrofobne interakcije.

1.2.2.2. Polarne sile

Polarne interakcije nastaju kao posledica električnih sila (Van der Waals – ovih

sila) između lokalizovanih naelektrisanja koja su rezultat stalnih ili indukovanih dipola.

One se ne pojavljuju izolovano, već zajedno sa disperzionim interakcijama i u nekim

slučajevima mogu da se kombinuju i sa jonskim interakcijama. Polarne interakcije su

znatno jače od disperzionih interakcija, koje se mogu smatrati i indukovani dipol –

indukovani dipol interakcijama i uključuju dva tipa interakcija: dipol – dipol interakcije,

dipol – indukovani dipol interakcije.

Dipol – dipol interakcije se javljaju između polarnih molekula i najače su od

svih Van der Waals – ovih interakcija. Pozitivan kraj jednog dipola se orijentiše ka

negativnom kraju drugog dipola i na taj način se međusobno privlače. Ako u molekulu

imamo vezan vodonik za neki izrazito elektronegativan atom koji sadrži bar jedan


8

slobodan elektronski par, kao što su kiseonik i azot, onda nastaju veoma jake

međumolekulske interakcije poznate pod imenom vodonične veze. Vodonične veze su

karakteristične za jedinjenja koja sadrže hidroksilnu ili amino grupu: alkoholi,

karboksilne kiseline, amini, amidi, itd. Dipol – dipol sile se mogu javljati između

istovrsnih molekula ali i između različitih polarnih molekula, odnosno, polarni molekuli

mogu stupiti u interakciju međusobno ili, ako se nalaze u polarnoj sredini (npr. polarna

stacionarna ili mobilna faza) mogu interagovati sa dipolima iz te sredine.

Dipol – indukovani dipol interakcije su karakteristične za polarizabilne molekule,

kao što su molekuli aromatičnih jedinjenja, odnosno, molekuli sa delokalizovanim π

elektronima. Kada se takvi molekuli nađu u blizini molekula koji ima stalni dipol,

električno polje dipola indukuje dipol u polarizabilnom molekulu. Ovaj, novonastali

dipol, tj. indukovani dipol, se ponaša na isti način kao i stalni dipol i dalje indukuje dalje

stvaranje dipola, odnosno gradi dipol-dipol interakcije. Ove interakcije su takođe praćene

disperzionim interakcijama i slabije su u od interakcija između stalnih dipola.

1.2.2.3. Jonske sile

Jonske interakcije su interakcije između suprotno naelektrisanih jona. Joni su prisutni

u vodenim rastvorima i ovakve interakcije su karakteristične za tečnu hromatografiju. Jonske

interakcije su najjače od ranije pomenutih i mogu biti kombinovane sa disperzionim

interakcijama, polarnim interakcijama i jon - dipol interakcijama. Praktično, jonske

interakcije se koriste u jonizmenjivačkoj hromatografiji.

1.2.2.4. Hidrofobne i hidrofilne interakcije

U jednom istom molekulu može biti delova koji se razlikuju po polarnosti (npr.

masne kiseline), odnosno mogu imati polarni i nepolarni deo. “Veliki molekuli” kao što

su proteini, nukleinske kiseline i polisaharidi, mogu imati na stotine različitih interaktivnih

delova širom molekula (polarnih i nepolarnih). Interakcije molekula, kako inter- i

intramolekulske, tako i sa mobilnom i stacionarnom fazom, određuju ukupni efekat koji

može biti hidrofobni ili hidrofilni. Ako dominiraju nepolarni delovi (disperziona mesta)

onda molekul interaguje disperzionim silama i takve molekule svrstavamo u

hidrofobne, odnosno liofobne. Ako dominiraju dipolne i polarizabilne grupe, imamo

polarne molekule ili hidrofilne, odnosno liofilne molekule.

Termin “hidrofobnost” bukvalno znači “strah od vode” i podrazumeva neki oblik

odbijanja nepolarnih molekula od molekula vode, koji je nemoguć izvan Van der Waals-

ovih poluprečnika. Hidrofobnost se može objasniti na primeru mešanja nekog

nepolarnog disperzionog rastvarača, kao što je heptan sa veoma polarnim rastvaračem,

kao što je voda. Heptan i voda su nemešljivi jer su privlačne sile između dva molekula

heptana (disperzione sile) i dva molekula vode (vodonične veze) mnogo jače od

privlačnih sila između molekula heptana i vode. Voda se u maloj meri ipak rastvara u


9

heptanu, kao i heptan u vodi. Iako su interakcije voda-voda i heptan-heptan mnogo jače

od interakcije voda-heptan, interakcije voda-heptan postoje i dovoljno su jake da

omoguće rastvorljivost u maloj meri.

Termin “hidrofilnost” bukvalno znači “voli vodu” i podrazumeva interakcije polarnih

molekula i molekula vode. Polarni i hidrofilni su ekvivalentni termini, jer polarne supstance

jako interaguju sa vodom i drugim polarnim rastvaračima. Hidrofobnost i hidrofilnost

su termini koji se intenzivno koriste u biotehnologiji radi opisivanja interakcija molekula kao

celine, posebno kod biomakromolekula. Na primer polipeptidi sadrže veliki broj amino-

kiselina od kojih svaka ima grupe različitih polarnosti, od nepolarnih do izrazito

polarnih, a isto tako sadrže veliki broj peptidnih veza koje su izrazito polarne, tako da

imamo delove različitih polarnosti duž polipeptidnog lanca. Da bi lakše opisali ukupan

efekat svih prisutnih interakcija, inter- i intramolekulskih, koriste se termini hidrofobnost i

hidrofilnost, iako su oni u osnovi alternativni termini kojima se opisuju disperzione i

polarne interakcije.

1.3. Podela hromatografskih metoda

Hromatografske metode možemo podeliti na osnovu: primenjene tehnike rada,

fizičkog stanja mobilne i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske

podloge.

1.3.1. Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada

Metoda frontalne analize se sastoji u tome da se rastvor ispitivane smeše

kontinuirano propušta kroz kolonu. Ako smeša sadrži komponente A, B i C sa redosledom

koeficijenata raspodele KA > KB > KC, iz kolone prvo izlazi čista komponenta C, jer se

najslabije adsorbuje. Zatim izlazi smeša komponenata B i C i na kraju eluat koji sadrži

komponente A, B i C u istom odnosu u kome su unete u kolonu. Ovom metodom može se

dobiti samo deo čiste komponente C, odnosno komponente koja se najbrže kreće kroz

kolonu i iz tog razloga nema veći analitički značaj i retko se koristi.

Metoda istiskivanja se izvodi tako što se smeša, koja sadrži komponente A, B i C,

nanese na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano propušta rastvor komponente D,

koja se mnogo jače vezuje za adsorbens od komponenata analizirane smeše. Komponenta D

potiskuje komponente smeše, koje obrazuju zone. Zbog stalnog dejstva komponente D,

komponente smeše se ne mogu potpuno razdvojiti, već se zone međusobno dodiruju. Do

izlaska iz kolone, sve tri zone se kreću istom brzinom, koja zavisi od brzine kretanja

komponente D kroz kolonu.

Metoda eluiranja je praktično jedina metoda koja se koristi za razdvajanje u

analitičke svrhe, jer se pomoću nje komponente smeše mogu potpuno razdvojiti. Mala

količina analizirane smeše, koja sadrži komponente A, B i C, sa redosledom koeficijenata

raspodele KA > KB > KC, nanese se na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano


10

propušta mobilna faza, tzv. eluent, odnosno vrši eluiranje. Ako su razlike u vrednostima

koeficijenata raspodele komponenti dovoljno velike, postižu se potpuna razdvajanja, pri

čemu iz kolone prvo izlazi komponenta C, koja se najslabije vezuje za stacionarnu fazu.

1.3.2. Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja

Adsorpciona hromatografija se zasniva na razlici između adsorpcionih afiniteta

komponenti uzorka prema aktivnoj površini čvrste, odnosno, stacionarne faze (IUPAC

definicija). Takođe se još naziva tečno-čvrsta hromatografija. Adsorbenti su uglavnom

aktivne, porozne čvrste supstance sa velikom površinom, kao što su silika-gel,

aluminijum-oksid, magnezijum-silikat, aktivni ugalj itd. Adsorbensom može biti

napunjena kolona, može biti nanesen na neku podlugu u obliku tankog sloja a takođe

adsorbensom može biti impregniran i porozni papir. Aktivni delovi stacionarne faze

interaguju sa funkcionalnim grupama komponenti smeše koja se razdvaja i zahvaljujući

tome mogu se razdvojiti različite klase jedinjenja. Na primer, silika-gel jako interaguje

sa polarnim funkcionalnim grupama, a slabo sa nepolarnim grupama i na taj način se

mogu odvojiti polarna od nepolarnih jedinjenja (npr. alkoholi od ugljovodonika).

Podeona (particiona) hromatografija se zasniva na različitoj rastvorljivosti

komponenti uzorka u stacionarnoj fazi (gasna hromatografija) ili na različitoj

rastvorljivosti komponenti u mobilnoj i stacionarnoj fazi (tečna hromatografija) (IUPAC

definicija). Kod tečne hromatografije komponente uzorka se, prema rastvorljivosti,

raspoređuju između dve faze koje se međusobno ne mešaju. Tečna stacionarana faza je

ravnomerno raspoređena na čvrstom inertnom nosaču i različite je polarnosti od tečne

mobilne faze, da bi se izbeglo mešanje ove dve faze. Obično je stacionarna faza polarna a

mobilna nepolarna i u tom slučaju se radi o hromatografiji normalnih faza. U obrnutom

slučaju kada je stacionarna faza nepolarana a mobilna faza polarna onda je to tečna

hromatografija obrnutih ili reverznih faza.

Jonoizmenjivačka hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih

vrsta u rastvoru, prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje poseduju neki adsorbensi.

Takvi adsorbensi mogu biti neorganskog i organskog porekla, sintetički i prirodni. Prema

tome da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone, dele se na katjonske i

anjonske izmenjivače. Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje

elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i aktinida), odvajanje jonskih od

nejonskih vrsta, razdvajanje jona, razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona

metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje koncentracije jona.

Najčešće se kao jonski izmenjivači koriste visokopolimerne smole koje sadrže

aktivne kiselinske ili bazne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora. Katjonski

izmenjivači sadrže kiselinske grupe, kao što su –SO3H i –COOH, a anjonski izmenjivači

sadrže bazne grupe, kao što su –OH ili amino –NH2, –NHR i –NR2 grupe. Pomoću

katjonskih izmenjivača razdvajaju se aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza


11

koje su rastvorne u vodi. Anjonski izmenjivači se koriste za razdvajanje alkaloida,

hlorofenola, hemoglobina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase i

drugih jedinjenja.

Gel hromatografija ili gel filtracija (engl. Exclusion Chromatography) se zasniva

na razlikama u veličini molekula i/ili oblika ili naelektrisanja. Kada se razdvajanje zasniva na

veličini molekula, u engleskom jeziku se takođe koristi naziv Size-Exclusion Chromatography.

Termini gel filtracija i gel-propusna hromatografija (GPC) su korišćeni ranije da se opiše

ovaj proces kada je stacionarna faza u obliku nabubrelog gela. Engleski naziv Ion-Exclusion

Chromatography se specifično koristi za razdvajanje jona u vodenoj fazi (IUPAC definicija).

Razdvajanje gel hromatografijom se razlikuje od razdvajanja drugim

hromatografskim metodama po tome što se zasniva na veličini molekula, a ne na

hemijskim i fizičko-hemijskim fenomenima. Stacionarna faza je hemijski inertna i dolazi

do selektivne difuzije molekula uzorka iz mobilne faze u pore stacionarne faze, koja

može biti gel ili porozna neorganska čvrsta supstanca. Stepen zadržavanja zavisi od

veličine molekula uzorka u odnosu na veličinu pora. Manji molekuli će prodirati u sve

pore, molekuli srednje veličine će prodirati samo u neke pore, dok će veliki molekuli

prolaziti kroz kolonu bez zadržavanja. Ova metoda se najčešće koristi za međusobno

razdvajanje (frakcionisanje) polimera i biopolimera, odnosno, molekula velikih molskih

masa, kao i za razdvajanje (prečišćavanje) velikih molekula od malih molekula.

Afinitetna hromatografija se zasniva na različitom afinitetu komponenti smeše,

najčešće proteina, prema specifičnim hemijskim grupama – ligandima. Ligandi su vezani

za čvrsti nosač i predstavljaju stacionarnu fazu, dok je mobilna faza najčešće neki pufer.

Interakcije između liganada i proteina su vrlo specifične i selektivne, tako da se

određeni proteini vezuju samo za određene ligande, odnosno ligand može biti specifičan

samo za jedan protein iz uzorka biološkog materijala. Iz tog razloga se interakcije

protein – ligand, još zovu i ključ – brava interakcije. Najčešće protein – ligand interakcije

su: enzim-inhibitor, hormon-receptor, antitelo-antigen, protein-ugljeni hidrat, enzim-

koenzim i metaloprotein-jon metala.

1.3.3. Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge

Hromatografija u koloni je tehnika razdvajanja kod koje se stacionarna faza

nalazi u koloni (cevi). Stacionarnu fazu čine čestice čvrste supstance ili čestice čvrste

supstance obložene tankim „kapilarnim“ slojem tečnosti kojima je ispunjena kolona

(pakovana kolona) ili stacionarnom fazom može biti obložen unutrašnji zid kolone

(tubularna kolona). Mobilna faza se kreće kroz stacionarnu fazu ili duž stacionarne faze.

Hromatografske kolone mogu biti otvorene i kroz njih se moblna faza kreće pod

dejstvom sile Zemljine teže. To su najčešće staklene cevi ispunjene stacionarnom fazom,

na čiji vrh se nanosi uzorak i dodaje rastvarač (eluent) ili više rastvarača koji sa sobom

nosi komponente uzorka. Kod zatvorenih hromatografskih kolona mobilna faza se kroz

kolonu kreće pod pritiskom (pritisak gasa ili pumpa). U zavisnosti od jačine interakcija


12

komponenti uzoraka sa stacionarnom fazom one kroz kolonu putuju različitim

brzinama i na taj način se razdvajaju.

Planarna hromatografija je tehnika razdvajanja u kojoj je stacionarna faza ravan ili

se nalazi na ravni. Stacionarna faza može biti papir, tačnije voda vezana za papir, ili papir

impregniran stacionarnom fazom i ta vrsta hromatografije se zove hromatografija na

papiru. Takođe, stacionarna faza može biti tanki sloj čvrstih čestica nanetih na ravnu

površinu, najčešće staklenu, kada se radi o hromatografiji na tankom sloju. Ova

hromatografija se još naziva i hromatografija u „otvorenoj koloni“.

Kod hromatografije na papiru stacionarna faza je voda kojom je zasićena celuloza, dok

je mobilna faza neki organski rastvarač ili smeša rastvarača. Tehnika se izvodi tako što

se na papir nanese uzorak i papir postavlja u sud tako da rastvarač kroz papir prolazi

horizontalno, nadole ili nagore. Prema načinu na koji mobilna faza prolazi kroz papir

razlikuju se: horizontalna (kružna) hromatografija, silazna i uzlazna hromatografija na

papiru.

Kod hromatografije na tankom sloju stacionarnu fazu čini tanak sloj nekog

adsorbensa nanet na ravnu podlogu – staklenu ploču. Izbor adsorbensa zavisi od

prirode supstanci koje se razdvajaju. Najčešće se koriste: silikagel, aluminijum-oksid,

celulozni prah, magnezijum-oksid, itd. Danas se koriste i komercijalne ploče sa nekom

od ovih podloga ili sa podlogom koja sadrži specifične aditive. Kao i kod hromatografije

na papiru i kod ove tehnike se, u zavisnosti od načina prolaska mobilne faze kroz

stacionarnu, razlikuju tri tehnike: horizontalna, uzlazna i silazna.

1.3.4. Podela hromatografskih metoda prema fizičkom

stanju mobilne i stacionarne faze

Mobilna faza može biti gas ili tečnost, a stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna.

Prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze sve hromatografske metode možemo

podeliti na: gasno (mobilna faza) – tečnu (stacionarna faza), gasno – čvrstu, tečno –

tečnu i tečno – čvrstu hromatografiju. U zavisnosti od korišćene tehnike, vrste

stacionarne faze i podloge, ove hromatografske tehnike se mogu svrstati u neku od već

pomenutih podela.

Rezime poglavlja

Hromatografski sistem sastoji se od nepokretne, stacionarne faze, koja može biti

čvrsta ili tečna, i pokretne, mobilne faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno

prolazi kroz (preko) stacionarnu fazu. Različiti afiniteti komponenti smeše prema

stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje.

Osnovni pojmovi u hromatografiji su: hromatogram, pik, koeficijent raspodele,

teorijski pod, retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tM), relativno


13

retenciono vreme (t'r), korigovano retenciono vreme, retenciona zapremina(Vr), “hold-up”

zapremina ili mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost.

Međumolekulske interakcije u hromatografskim sistemima proizilaze iz

međumolekulskih sila. Postoje tri različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione,

polarne i jonske sile.

Hromatografske se dele na osnovu: primenjene tehnike rada, fizičkog stanja mobilne

i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske podloge.

Pitanja za proveru znanja ili diskusiju

1. Definisati pojmove: hromatogram, koeficijent raspodele, teorijski pod, retencioni

faktor i Rf vrednost.

2. Definisati retencione parametre.

3. Objasnite međumolekulske interakcije izazvane polarnim silama.

4. Šta su to hidrofobne i hidrofilne interakcije?

5. Kako se dele hromatografske metode prema mehanizmu razdvajanja? Objasniti

mehanizme razdvajanja.

Literatura

1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380,

1910.

2. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, 1941.

3. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, 1985.

4. S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Beograd, 1994.

5. Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp 819-872, 1993.

6. A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, 5th Edition, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1999.

7. Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold-Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G. Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography, Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp. 969–992, 2001.

8. R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series –Book 1, Library4science, 2003.

14

2. Planarna hromatografija

Cilj poglavlja

Upoznavanje sa metodama planarne hromatografije: hromatografija na papiru i

tankoslojna hromatografija. Definisanje i opis: stacionarne faze (hromatografski papir,

silika-gel, Al2O3, itd.), pripreme i nanošenja uzorka, mobilne faze, razvijanja i izazivanja

hromatograma, kvalitativne i kvantitativna analize.

2.1. Hromatografija na papiru

Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije i veoma je intenzivno

korišćena u prošlosti. Prvo hromatografsko razdvajanje na papiru uradili su Consden, Gordon

i Martin 1943. godine, oni su razdvajali amino-kiseline na trakama papira. Danas je papirna

hromatografija zamenjena tankoslojnom hromatografijom za većinu aplikacija ali se i dalje

koristi. Glavne prednosti ove metode su: jednostavnost, niske cene, nema komplikovanih

operacija, kvantitativno određivanje se pože postići bez upotrebe instrumenata itd.

2.1.1. Hromatografski papir

Papir koji se koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a

stacionarna faza je voda adsorbovana na molekulima celuloze. Dakle, hromatografija na

papiru je podeona, tečno – tečna, hromatografija. Mnogobrojne hidroksilne grupe u molekulu

celuloze čine njenu površinu hidrofilnom odakle potiče njen afinitet prema molekulima

polarnih rastvarača. Međutim, ne sme se zanemariti adsorpcija komponenata mobilne

faze i analizirane smeše na molekule celuloze, kao i jonska izmena. Adsorpcija i jonska izmena

se mogu kontrolisati podešavanjem eksperimentalnih uslova, ukoliko se želi da se uticaj

ovih faktora svede na najmanju moguću meru, onda se rastvarači koji čine mobilnu fazu

prethodno zasite vodom.

Za hromatografiju na papiru najčešće se koristi nemodifikovana pamučna celuloza,

koju karakteriše vlaknasta struktura. Papir se sastoji od velikog broja celuloznih

vlakana koja obrazuju trodimenzionalnu mrežu u čijoj strukturi se nalazi slobodan

prostor. Stacionarna faza se adsorbuje na površini vlakana, dok mobilna faza protiče

preko ove površine i adsorbovanog sloja i puni slobodne prostore. Ako su vlakna na

manjem rastojanju slobodan prostor je redukovan i brzina proticanja mobilne faze se

smanjuje. Brzina protoka mobilne faze zavisi od njenog viskoziteta, a za datu smešu

rastvarača brzina zavisi od fizičke prirode hartije. Proizvodi se papir različite gustine i

Planarna hromatografija

15

debljine. Deblja hartija iste gustine povećava brzinu protoka, pod kojim se podrazumeva

pomeranje fronta rastvarača a ne zapremina tečnosti koja protiče u jedinici vremena.

Danas postoje veoma raznovrsne vrste papira napravljene od nemodifikovane

celuloze:

- papiri male gustine, koji omogućavaju brži protok mobilne faze

- glatki papiri veće gustine

- papiri isprani kiselinom

- papiri bez rastvorljivih supstanci u lipidima

- papiri za preparativnu hromatografiju, itd.

Pored pomenutih proizvode se i papiri od modifikovane celuloze koji su pogodni

za hromatografisanje polarnih, nepolarnih ili jonskih supstanci. Za razdvajane polarnih

supstanci u molekul celuloze se uvode polarne grupe. Na primer celuloza sa povećanim

sadržajem karboksilnih grupa je pogodna za odvajanje polarnih jedinjenja kao što su

amini, amino-kiseline i katjoni. Papir koji sadrži jonoizmenjivačke smole pogodan je za

razdvajanje jonskom izmenom. Za razdvajanje hidrofobnih jedinjenja koristi se papir

impregniran suspenzijom dijatomejske zemlje ili papir napravljen od celuloznih estara,

na primer, acetilovani papir. Takođe, papir može biti impregniran „silikonskim uljem“ –

smešom cikličnih i acikličnih oligomera polisiloksana, može da sadrži adsorbente poput

glinice ili silika-gela itd. Za razdvajanje smeša koje sadrže korozivne supstance koriste

se papiri sa staklenim vlaknima, kod njih su i adsorpcioni efekti minimizirani i za analizu je

potrebno značajno manje vremena.

2.1.2. Priprema i nanošenje uzorka

Čvrsti uzorci moraju biti rastvoreni u lako isparljivom rastvaraču, kao što su

etanol i aceton, odnosno uz primenu odgovarajućih mera bezbednosti i hloroform

(trihlormetan) i metilen hlorid (dihlormetan). Količina uzorka koja se nanosi zavisi od

mogućnosti njegove detekcije i mora se voditi računa da se ne preoptereti sistem,

odnosno da se ne nanese velika količina uzorka. Poželjno je da se nanese oko 10 μl

rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u obliku kružne mrlje koja sadrži od 1 – 1000 µg uzorka.

Ako je koncentracija uzorka u rastvoru niska, ona se može povećati na jedan od sledećih

načina:

- ekstrakcijom uzorka iz rastvora i koncentrovanjem novog rastvora

- nanošenje rastvora uzorka više puta na papir u malim porcijama

- jonske supstance iz bioloških materijala mogu se koncentrovati

korišćenjem jonoizmenjivačkih papira.

Uzorci koji sadrže velike količine supstanci koje nisu od interesa za analizu moraju se

pre hromatografisanja prečistiti. Na primer uzorci koji se koriste za praćenje zagađenja

zemljišta ili vode, uzorci hrane, uzorci hrane za životinje, uzorci bioloških materijala itd.


16

Informacija o rastvorljivosti supstance koja se analizira, kao i o rastvorljivosti pratećih

supstanci je od velikog interesa. Ako je je analizirana supstanca rastvorna u nekom

rastvaraču, a prateće nisu, onda je ekstrakcija odgovarajućim rastvaračem dovoljna za

prečišćavanje i koncentrovanje. Neorganske supstance se mogu ukloniti korišćenjem

rastvarača koji selektivno rastvara komponente od interesa ili jonoizmenjivačke smole.

Proteini se mogu ukloniti taloženjem sa volframovom kiselinom, koagulacijom na

povišenoj temperaturi, koagulacijom u prisustvu metanola ili acetona. Lipidi se mogu ukloniti

ekstrakcijom sa nepolarnim (lipofilnim) rastvaračem. alternativno, hromatogram može

biti razvijen sa lipofilnim rastvaračem za uklanjanje lipida iz uzorka gde se određuju

supstance koje nisu lipofilne. Analit se zatim hromatografiše odgovarajućim rastvaračem.

Kod nekih uzoraka je pre hromatografisanja potrebno da jednu ili više komponenti

uzorka hemijskom reakcijom prevedemo u odgovarajući derivat. Uobičajeni načini

derivatizacije za uvođenje hromofora su dati u Tabeli 2.1.

Tabela 2.1. Uobičajeni načini derivatizacije za uvođenje hromofora

Derivatizacija je pogodna iz sledećih razloga:

- Bolja je detekcija analiziranih komponenti

- Smanjuje se isparljivost analiziranih komponenti

- Uklanjaju se supstance koje nisu od interesa za analizu

- Poboljšava se razdvajanje analiziranih komponenti.

Jedinjenje Reagens Derivat


17

Izbor reagensa za derivatizaciju zavisi od prisustva i reaktivnosti funkcionalnih grupa

u analiziranoj supstanci. U idealnom slučaju reakcija derivatizacije treba da bude brza,

kvantitativna, bez ili sa minimumom sporednih proizvoda. Pošto se za detekciju najčešće

koristi UV spektrometar, cilj derivatizacije je da se poveća UV apsorbanca jedinjenja od

interesa, vezivanjem hromofore sa visokim molarnim koeficijentom ekstincije. Reakcija

sa specifičnom funkcionalnom grupom ne samo da daje željeni derivat, već smanjuje i

polarnost i često derivat ima bolja hromatografska svojstva od polazne supstance.

Derivatizuju se najčešće jedinjenja koja sadrže amino-, karboksilnu- ili hidroksilnu

grupu. U Tabeli 2.1 su pokazani najčešći reagensi za uvođenje hromofora odnosno

povećanje UV apsorbcije, a u Tabeli 2.2 reagensi za dobijanje derivata sa većom

fluorescencijom. Treba napomenuti da se derivatizacija izvodi samo ako je neophodno, jer taj

postupak produžava vreme analize i zahteva pažljivo izvođenje da ne bi došlo do

gubitaka. Reakcije derivatizacije se mogu koristiti i za bolju detekciju zona nakon

razvijanja hromatograma (vidi deo Detekcija).

Tabela 2.2. Uobičajeni načini derivatizacije za povećanje fluorescencije

Jedinjenje Reagens Derivat


18

2.1.3. Mobilna faza

Mobilna faza je rastvarač ili smeša rastvarača zasićena vodom. Koristi se veliki

broj mobilnih faza u zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju (hidrofilne,

umereno polarne, hidrofobne). U Tabeli 3. su prikazani najčešće korišćeni rastvarači u

papirnoj hromatografiji. Osim rastvarača u mobilnu fazu se dodaju i različite supstance,

kao što su kiseline, baze, kompleksirajući agensi, sa ciljem da se poveća ili smanji

rastvorljivost pojedinih supstanci u analiziranoj smeši.

Tabela 2.3. Najčešće korišćeni rastvarači u papirnoj hromatografiji

Mešljiv sa vodom u svim odnosima Nepotpuno mešljiv sa vodom

Formamid 2-metil-2-propanol (t-butanol)

Metanol 1-butanol

Sirćetna kiselina 1-pentanol (amil alkohol)

Etanol Etil-acetat

2-propanol (Izopropanol) Dietil etar

Aceton Toluen

1-propanol Petrol etar

Razdvajanje supstanci hromatografijom na papiru se zasniva na raspodeli između

celuloze, za koju je vezana voda, i pokretnog rastvarača koji je zasićen vodom. S obzirom

da se na celulozi nalazi sloj molekula vode, vezanih za nju vodoničnim vezama i da

stacionarna faza adsorbuje molekule supstance iz mobilne faze, praktično ne postoji

dodirna površina rastvarač-rastvarač, već postepena promena sastava rastvarača u

pravcu suprotnom od površine celuloze i to od najpolarnijeg rastvarača (vode) do manje

polarnog organskog rastvarača. Dok mobilna faza prolazi kroz vlakna papira, celuloza

teži da adsorbuje više vode iz nje, tako da što rastvarač više napreduje sadrži manje vode, pa

sastav mobilne faze nije konstantan duž hromatografske hartije, odnosno, postoji „suvi“

i „mokri“ front rastvarača.

Za razdvajanje hidrofilnih supstanci najčešće se koriste mobilne faze koje se sastoje

od: 1-butanola/sirćetne kiseline/vode ili 2-propanola/amonjaka/vode. Za razdvajanje

umereno polarnih supstanci kao osnovni rastvarač se koristi formamid kombinovan sa

polarizabilnim organskim rastvaračima: formamid/hloroform, formamid/toluen. U

toluen i hloroform se često dodaju različite količine cikloheksana za poboljšavanje

razdvajanja. Kada se koristi „formamidna“ mobilna faza, hromatografski papir se impregnira

40 % rastvorom formamida u etanolu u koji se mogu dodati (do 5 %) amonijum-

formijat ili mravlja kiselina za zakišeljavanje stacionarne faze. Za razdvajanje hidrofobnih

supstanci najčešće se koriste dve smeše rastvarača: dimetilformamid/cikloheksan (za

impregnaciju papira koristi se 50 % DMF u etanolu) i parafinsko

ulje/dimetilformamid/metanol/voda (za impregnaciju papira koristi se 10 % rastvor

parafinskog ulja u nekom aromatičnom ugljovodoniku).


19

2.1.4. Razvijanje hromatograma

Podeona hromatografija na hartiji izvodi se u staklenoj posudi (hromatografskoj

kadi) sa poklopcem koji dobro zatvara. Atmosfera posude mora biti zasićena parama

rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa hartije. Širina zone izdvojene

komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Pomoću

kalibrisane kapilare ili mikropipete nanese se rastvor uzorka na nekoliko centimetara

od kraja trake od hartije, koja se nalazi u horizontalnom položaju.Uzorak se nanosi u

obliku zone, koja ne treba da ima prečnik veći od 5 mm, ili u obliku što tanje crte.

Hartija sa nanetom zonom uzorka može se postaviti u sud tako da rastvarač kroz

hartiju prolazi horizontalno, nadole ili nagore. Prema tome, razlikuju se: horizontalna

(kružna), silazna i uzlazna hromatografija na papiru.

Horizontalna ili kružna hromatografija na papiru izvodi se tako što se hartija kružnog

oblika stavi u komoru zasićenu parama mobilne faze i uzorak nanese u centar kružne

hartije. Pre toga se od ivice ka centru kruga iseče uzana traka i savije normalno na ravan

hartije. Kraj trake se uroni u rastvarač, koji kroz traku dospeva do centra hartije i

radijalno se širi. Na taj način formiraju se odvojene zone komponenti smeše u obliku

koncentričnih krugova (Slika 2.1).

Slika 2.1. Kružna hromatografija na papiru

Silazna hromatografija na papiru izvodi se tako što se kraj trake na koji je nanet

uzorak pričvrsti za dno rezervoara sa rastvaračem, koji se nalazi na vrhu posude (Slika

2.2). Protok rastvarača kroz hartiju ostvaruje se pomoću kapilarnog pritiska, dok front

rastvarača ne pređe zid rezervoara. Dalje se rastvarač kreće i pod uticajem sile

gravitacije, pomerajući zonu uzorka, koji je nanet izvan rezervoara, naniže. Ova tehnika

se koristi za razdvajanje komponenata koje imaju male ili vrlo bliske Rf vrednosti.

Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom hartije i visinom posude.


20

Slika 2.2. Silazna hromatografija na papiru

Dvodimenzionalna hromatografija na papiru se koristi kod supstanci sa bliskim Rf

vrednostima. Kad se završi razdvajanje silaznom tehnikom, traka se osuši, okrene za 90°

i protok rastvarača, najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog

rastvarača (Slika 2.3). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno

razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni

rastvarač potpuno ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač.

Slika 2.3. Dvodimenzionalna hromatografija na papiru

Uzlazna hromatografija na papiru je tehnika koja se najviše koristi, a izbegava se

samo kad su Rf vrednosti komponenata suviše bliske. Ovde se rastvarač sipa na dno

suda, a hartija postavi tako da donji deo hartije bude potopljen u rastvarač (Slika 2.4).

Mesto nanošenja uzorka mora biti dovoljno udaljeno od donjeg kraja i mora biti iznad

nivoa rastvarača, u kome bi se inače uzorak rastvorio. Pošto rastvarač kod ove tehnike

prodire kroz hartiju pod dejstvom kapilarnih sila, zbog suprotnog dejstva gravitacije

dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na određenoj visini.

smer

I razvijanjerastvarač 1 rastvarač 2II razvijanje


21

Slika 2.4. Uzlazna hromatografija na papiru

Parametar kojim se izražava ponašanje analizirane supstance kod hromatografije na

ravnim površinama jeste brzina kretanja ili faktor zadržavanja, Rf vrednost. U

Poglavlju 1 je već definisana Rf vrednost kao odnos pređenog puta komponente (dA) i

pređenog puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dM):

Rf = dA/ dM

Kod hromatografije na ravnim površinama merenje puteva vrši se od središta

zone nanetog uzorka (analizirane smeše), koje se zove startna linija, do središta zone

komponente, odnosno do fronta rastvarača (Slika 2.5). Najveću Rf vrednost imaće

komponenta koja se najbolje rastvara u organskom rastvaraču (mobilnoj fazi), jer se

brže kreće od komponente koja se bolje rastvara u stacionarnoj fazi. Smatra se da su

komponente dobro razdvojene ako je ΔRf > 0,05. Rf vrednost je karakteristična za svaku

komponentu u definisanom hromatografskom sistemu i služi za identifikaciju

komponente u analiziranoj smeši, što nije uvek sigurno s obzirom na veliki broj faktora

koji utiču na ovaj parametar. To je u prvom redu sastav rastvarača, čija i najmanja

promena može da dovede do znatnih razlika u Rf vrednostima, zatim temperatura, koja

utiče na podeone koeficijente i viskozitet mobilne faze, samim tim i na brzinu protoka i

ravnotežu u sistemu. Pored toga na Rf vrednosti utiču i kvalitet hromatografskog papira,

veličina posude u kojoj se razvijanje vrši, kao i priroda analizirane smeše. Za

identifikaciju je najpouzdanije istovremeno hromatografisanje analiziranog uzorka i

standarnog rastvora pod potpuno istim uslovima na jednom hromatografskom papiru.


22

Slika 2.5. Određivanje Rf vrednosti kod uzlazne hromatografije na papiru

2.1.5. Određivanje položaja zona na hromatogramu

Kada se završi razvijanje hromatograma, papir se uklanja iz hromatografske

kade, obeležava front rastvarača i suši. Ako su analizirane supstance obojene onda su

one vidljive i zone se lako mogu obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance

bezbojne (nevidljive), koriste se fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona.

Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne

(supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje

radioktivnosti. Hemijskim metode se sastoje od reakcije supstance sa reagensom koji

daje obojeni proizvod. Na primer, H2S sa metalnim jonima daje obojene sulfide, amino

kiseline daju obojeni kompleks sa ninhidrinom, dok AgNO3 sa redukujućim

supstancama kao što su šećeri daje srebrno ogledalo. U Tabeli 2.4. su prikazani neki

selektivni reagensi koji se u obliku spreja nanose na hromatogram i daju odgovarajuće

obojene proizvode.

Tabela 2.4. Selektivni “sprej” reagensi

Reagens Boja zone Primena

Pare joda Braon Nezasićena organska

jedinjenja

2’, 7’ - Dihlorofluororescein Žuto-zelena ispod UV

svetlosti na 254 nm

Veliki broj organskih

jedinjenja

0,1 - 0,5 % Bromkrezol zeleno Žuta Karboksilne kiseline

50 % SbCl3 u CH3COOH Različite boje Steroidi, karotenoidi,

aliciklični vitamini

0,3 % Ninhidrin u 1-butanolu sa

3% CH3COOH

Roze-ljubičasta Amino kiseline


23

2.1.6. Kvantitativna analiza

Kvantitativna analiza komponenata može se uraditi na dva načina: direktnim

određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom supstance iz zone pogodnim

rastvaračem. Supstance se određuju u izdvojenim zonama direktno na papiru (in situ),

pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere transparenciju,

refleksiju ili fluorescenciju. U tu svrhu se koriste denzitometri i spektrofotometri.

Denzitometri su podešeni tako da direktno “skeniraju” hromatografske trake: svetlosni

zrak prolazi kroz prorez preko površine hartije i u zavisnosti od koncentracije supstabce

dolazi do različitog propuštanja svetlosti što se registruje na detektoru kao kriva koja

odgovara Gausovoj krivoj. Površina ispod krive srazmerna je koncentraciji analizirane

supstance.

Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u

rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom količinom

rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski,

spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom.

2.2. Hromatografija na tankom sloju

Hromatografija na tankom sloju se, zajedno sa hromatografijom na papiru, zove

još hromatografija u “otvorenoj koloni”. Izvodi se na tankom sloju stacionarne faze

kojom je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala (staklo, aluminijum ili polietilen).

Ideju za tankoslojnu hromatografiju dali su ruski naučnici Izmailov i Schreiber 1938.

godine, kada su upotrebili adsorbens u obliku tankog sloja nanetog na inertan nosač.

Bilo je potrebno još dvadesetak godina da ova metoda postane praktična tehnika,

odnosno do opisa metoda, adsorbenasa i opreme za pripremanje hromatografskih ploča

(Stahl, 1951. godine). Danas je hromatografija na tankom sloju veoma zastupljena

metoda za analizu i razdvajanje velikog broja različitih supstanci. Koristi se za

kvalitativne, semikvantitativne i kvantitativne analize u hemijskim i farmaceutskim

laboratorijama, kao i u laboratorijama za analizu hrane i sirovina za pripremanje

prehrambenih proizvoda. Razlozi za široku upotrebu ove tehnike su: kratko vreme

analize, dobro razdvajanje komponenti iz relativno male količine uzorka, kvalitativna i

kvantitativna analiza, niska cena, mogućnost razdvajanja hidrofobnih sipstanci,

mogućnost preparativnog razdvajanja, mogu se koristiti agresivniji reagensi za bojenje

zona (H2SO4) itd.

2.2.1. Stacionarna faza

U tankoslojnoj hromatografiji se koristi veliki broj različitih stacionarnih faza.

Kod klasične hromatografije na tankom sloju stacionarna faza je silika gel i smatra se da

je to adsorpciona hromatografija. Međutim, razdvajanje se ne dešava samo zbog


24

adsorpcije na silika gelu, zbog toga što su uvek u silika gelu prisutne male količine vode

pa imamo i podeonu hromatografiju. Pored toga i rastvarači iz mobilne faze se

adsorbuju na silika gel tokom razvijanja hromatogrma i na taj način imamo još jedan

mehanizam razdvajanja.

Zahvaljujući različitim materijalima koji se koriste za oblaganje ploča mogući su

sledeći mehanizmi razdvajanja:

- Adsorpciona hromatografija, gde se kao adsorbensi koriste: silika-gel, glinica

(Al2O3), kizelgur (dijatomejska zemlja),

- Podeona hromatografija, gde se najčešće koristi celuloza, zatim kizelgur i silika-

gel,

- Jonoizmenjivačka hromatografija, kod koje se koristi derivatizovana celuloza:

celuloza-fosfat, polietilenimin-celuloza, DEAE-celuloza,

- Gel filtracija, gde se koriste umreženi polisaharidi – dekstrani sa različitim

dimenzijama pora, koji su komercijalno dostupni pod imenom “Sephadex”

(SEParation PHArmacia DEXtran).

- Korišćeni su i različiti poliamidi za razdvajanje tanina, kumarina i flavon

glukozida. Tačan mehanizam razdvajanja ovih jedinjenja nije definisan i

pretpostavlja se da do razdvajanja dolazi na osnovu istog, odnosno, različitog broja

hidrofilnih funkcionalnih grupa. Najčešće korišćeni poliamidi su: polikaprolaktam,

acetilovani polikaprolaktam i poliakrilonitril.

2.2.2. Priprema i nanošenje uzorka

Priprema uzorka podrazumeva koncentrovanje supstanci koje su analiziraju i

odvajanje supstanci iz uzorka koje mogu da ometaju analizu. Naročito je važna priprema

uzoraka bioloških materijala kada se u njima analiziraju tragovi nekih supstanci.

Praktično zadatak analitičara je da odstrani najveći broj kompononenti, a da pri tome

nema gubitaka supstanci koje analizira. Cilj je dobiti što čistije analizirane supstance u

koncentraciji koja se može detektovati.

Sledeći postupci se najčešće koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka:

- Taloženje neželjenih komponenti

- Tečno-čvrste ekstrakcije

- Tečno-tečna ekstrakcija

- Ultrafiltracija

- Ekstrakcija jonskom izmenom

- Derivatizacija

- Formiranje kompleksa

- Zamrzavanje - sušenje

- Ekstrakcija na čvrstoj fazi u koloni


25

- Ekstrakcija na specijalizovanim kolonama - kertridžima

- Prekoncentracija

Danas su komercijalno dostupne male kolone (kertridži) ispunjene različitim

adsorbensima koje se koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka za hromatografsku

analizu.

Hromatografija na tankom sloju se može koristiti i za prečišćavanje i

koncentrovanje uzoraka za druge osetljivije hromatografske metode analize. Takođe,

tankoslojna hromatografija se koristi i za preparativno razdvajanje supstanci. Za

preparativne svrhe se koriste ploče sa debljim slojem stacionarne faze (> 250 µm) i

uzorak se nanosi u obliku crte.

Uzorak za hromatografisanje na tankom sloju se rastvori u rastvaraču koji se

može lako upariti i 10-100 µl rastvora nanese na 1,5-2 cm od kraja ploče, tako da

obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm. Količina uzorka koji se nanosi

na ploču zavisi od mogućnosti za detekciju. Pre razvijanja hromatograma neophodno je

osušiti zonu, odnosno upariti rastvarač u kome je rastvoren uzorak.

2.2.3. Mobilna faza

Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan. U

zavisnosti od vrste tankoslojne hromatografije, najčešće se koriste smeše rastvarača

navedene u nastavku teksta.

Adsorpciona hromatografija na tankom sloju:

- heksan/etar

- heksan/etar/sirćetna kiselina

- hloroform/metanol

- toluen/aceton.

Podeona hromatografija na tankom sloju:

- 1-butanol/sirćetna kiselina/voda

- 1-butanol/aceton/dietiamin/voda

- 2-propanol/mravlja kiselina/voda

Jonoizmenjivačka hromatografija na tankom sloju:

- 0,001 – 1 mol/dm3 HCl

- 0,001 – 1 mol/dm3 NaOH

- 0,001 – 1 mol/dm3 NaCl

Reverzno-fazna hromatografija na tankom sloju:

- acetonitril/sirćetna kiselina

- aceton/voda

- hloroform/metanol/voda


26

Tankoslojna hromatografija na poliamidima:

- etanol/voda

- aceton/voda

- voda/etanol/sirćetna kiselina/dimetilformamid

Tankoslojna hromatografija na gelovima od dekstrana (Sephadex):

- 0,01 – 0,1 mol/dm3 sirćetna kiselina

- 0,01 – 0,1 mol/dm3 amonijak

- 0,01 – 0,1 mol/dm3 natrijum-fosfatni pufer

2.2.4. Razvijanje hromatograma

Hromatografija na tankom sloju se može izvesti horizontalnom, silaznom i uzlaznom

tehnikom, slično kao i hromatografija na papiru (Poglavlje 2.1.4.). Za razliku od

hromatografije na papiru gde je najzastupljenija silazna tehnika, kod hromatografije na

tankom sloju najčešće se koristi uzlazna tehnika. Obično su Rf vrednosti od 10 do 15 cm.

Hromatografska ploča se razvija u staklenoj komori (hromatografskoj kadi) koja

je opremljena poklopcem koji dobro zatvara (Slika 2.8, levo). Atmosfera posude mora

biti zasićena parama rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa ploče. Da bi se

dobila ravnomerna zasićenost parom u svim delovima komore, unutrašnji zidovi se

oblažu filter papirom natopljenim rastvaračem, koji služi kao mobilna faza. Širina zone

izdvojene komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Rf

vrednosti se izračunavaju za svaku komponentu posebno i na osnovu njih može se

izvršiti preeliminarna identifikacija jedinjenja poređenjem sa odgovarajućim

standardima (Slika 2.8, desno). Ponekad je poželjno da se koristi komora koja nije

zasićena rastvaračima zbog boljeg razdvajanja. Bolje razdvajanje se postiže zbog dužeg

vremena razvijanja hromatograma i smanjenog efekta adsorbovanog rastvarača na

ploči. Međutim, u ovom slučaju reproduktivnost Rf vrednosti može predstavljati

problem. Tankoslojna hromatografija se obično izvodi na sobnoj temperaturi, međutim,

razdvajanje komponenti se može poboljšati razvijanjem hromatograma na višoj ili nižoj

temperaturi od sobne u zavisnosti od rastvarača koji čine mobilnu fazu.

Da bi se povećala efikasnost razdvajanja komponenti, hromatografska ploča se

može razvijati na više načina:

- više puta u istom pravcu sa istim rastvaračem,

- uz stalnu promenu rastvarača, za razdvajanje jedinjenja koja se znatno razlikuju

po svojim osobinama, odnosno po brzini kretanja kroz stacionarnu fazu,

- sa dva rastvarača u istom ili u dva pravca (dvodimenzionalna hromatografska

tehnika).


27

Slika 2.8. Razvijanje hromatograma i izračunavanje Rf vrednosti

Dvodimenzionalna tehnika je poseban vid tehnike i koristi se kod supstanci sa bliskim

Rf vrednostima. Kad se završi razdvajanje, ploča se okrene za 90° i protok rastvarača,

najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog rastvarača (Slika

2.9). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno razdvojile. Da bi

dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni rastvarač potpuno

ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač.

Slika 2.9. Dvodimenzionalna tankoslojna hromatografija

2.2.5. Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči

Ako su analizirane supstance obojene onda su one vidljive i zone se lako mogu

obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance bezbojne (nevidljive), koriste se

fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona.

Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne

(supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje

Tanki sloj

Pare eluenta

Eluent

Uzorak

Start Front B


28

radioktivnosti. Kada se za određivanje položaja zona jedinjenja koja ne fluoresciraju

koristi UV lampa u adsorbens kojim se oblaže ploča se dodaje fluorescentni indikator

(kao što je smeša cink i kadmijum sulfida). Dodavanjem fluorescentnog indikatora se

postiže da cela ploča fluorescira, a zone se detektuju kao tamne mrlje na ploči.

Za bojenje zona koriste se različite hemijske supstance koje se pomoću raspršivača

nanose na ploču. Najčešće korišćeni hemijski reagens je jod. Pare joda reaguju sa

velikim brojem organskih jedinjenja (ne reaguju sa zasićenim ugljovodonicima i

halogenalkanima) i grade komplekse od žute do braon boje. Zone moraju biti odmah

označene, jer jod posle nekog vremena sublimuje i mrlje blede i mogu se izgubiti. Često

se koristi i koncentrovana sumporna kiselina koja većinu organskih supstanci oksiduje i

nakon zagrevanja ploče zone se detektuju kao tamne mrlje. Za određivanje

aminokiselina i amina koristi se ninhidrin. Za određivanje steroida i karotenoida se

koristi rastvor antimon-hlorida. Indikator bromkrezol zeleno se koristi za detekciju

zona koje potiču od karboksilnih kiselina. Za fenole se koristi rastvor gvožđe(III)-

hlorida, 2,4-dinitrofenilhidrazin se koristi za detekciju aldehida i ketona itd.

2.2.6. Kvantitativna analiza

Kao i kod hromatografije na papiru, kvantitativna analiza komponenata može se

uraditi na dva načina: direktnim određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom

supstance iz zone pogodnim rastvaračem. Supstance se određuju direktno u izdvojenim

zonama na ploči pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere

transparenciju, refleksiju ili fluorescenciju. Treba napomenuti da merenje

propustljivosti može da se koristi samo za vidljivu svetlost, za merenje UV moraju da se

koriste kvarcne ploče, jer staklene ploče apsorbuju UV zrake.

Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u

rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom

količinom rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski,

spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom.

2.2.7. Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju

- Tankoslojna hromatografija predstavlja ravnotežni sistem tri faze: čvrste

(stacionarne), tečne (mobilne) i gasne faze.

- Stacionarna faza je samo delimično u ravnoteži sa tečnom fazom pre migracije

komponenti analizirane smeše. U zavisnosti od načina razvijanja hromatograma,

mobilna faza može biti u ravnoteži sa gasnom fazom ili ne.

- Fenomen adsorpcije na čvrstoj fazi je znatno smanjen jer je deo mobilne faze

adsorbovan na stacionarnoj fazi. Kao rezultat toga Rf vrednost čistog jedinjenja se

neznatno razlikuje od Rf vrednosti istog jedinjenja u smeši.


29

2.2.8. Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane

U zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju koriste se različite mobilne

faze, odnosno stacionarne faze. Tako na primer za razdvajanje amino kiselina se koriste

«neutralne mobilne faze» kao što su etanol/voda, propanol/voda ili fenol voda,

međutim u takvim mobilnim fazama arginin i lizin migriraju znatno sporije od ostalih

amino kiselina. Ako su u mobilnu fazu doda slaba baza (amonijum-hidroksid) ili slaba

kiselina (sirćetna kiselina) bolje se razdvajaju kisele odnosno bazne amino kiseline.

Dalje, neki vodorastvorni vitamini se bolje razdvajaju na aluminijum oksidu, a ne

razdvajaju se na silika gelu, na primer vitamini B1 i B2. Praktično za analizu svake

smeše treba odabrati odgovarajuću mobilnu, odnosno stacionarnu fazu u zavisnosti od

prirode supstanci koje se analiziraju.

U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu hromatografije na

tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu se analizirati

prirodne komponente hrane, degradacioni proizvodi koji postaju tokom prerade,

pripreme, skladištenja, pakovanja i transporta hrane. Zatim, mogu se analizirati aditivi,

tragovi veterinarskih lekova, pesticida itd. Na primer u medu su određivani

antibakterijski sastojci, ugljovodonici, polifenoli itd. U raži su određivane karboksilne

kiseline i estri hidroksicimetne kiseline u listovima raži. U bademu je određivana

hlorogena kiselina, a njeni derivati u bambusu. U voćnim sokovima su određivani

ekstrakti iz kore citrusa. U različitim prehrambenim proizvodima su određivana etarska ulja.

U bezalkoholnim pićima određivani su ne nutritivni zaslađivači. Fenoli su određivani u

čaju, bosiljku, maslinovom ulju. U prehrambenim aditivima određivani su fitosteroli,

polifenoli itd. U sojinom ulju, ulju od sezama određivani su triacil gliceridi. U životinjskim

tkivima (jetri i mišićima) određuju se sulfonamidi. Tankoslojna hromatografija je brza i

jeftina metoda za utvrđivanje aflatoksina i drugih mikotoksina u mleku, mlečnim

proizvodima, kukuruzu, kikirikiju i proizvodima od kikirikija, kokosu, kakau u zrnu,

jajima itd. Ovo su samo neki od mnogobrojnih primera korišćenja tankoslojne

hromatografije u analizi prehrambenih proizvoda. Takođe, preparativna tankoslojna

hromatografija se koristi za prečišćavanje uzoraka koji se dalje analiziraju i određuju

drugim metodama, najčešće instrumentalnim.

Rezime poglavlja

Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije. Papir koji se

koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a stacionarna faza je voda

adsorbovana na molekulima celuloze. Količina uzorka za analizu koja se nanosi zavisi od

mogućnosti njegove detekcije. Obično se nanosi oko 10 μl rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u

obliku kružne mrlje koja sadrži od 1 – 1000 µg uzorka. Mobilna faza je rastvarač ili smeša

rastvarača zasićena vodom. Hromatogram se razvija u hromatografskoj kadi. U zavisnosti


30

od načina prolaska mobilne faze kroz hartiju, razlikuju se: horizontalna (kružna), silazna i

uzlazna hromatografija na papiru. Hromatogram se izaziva prskanjem hartije nekim

reagensom koji daje obojeno jedinjenja ili jedinjenje koje fluorescira u reakciji sa analitom.

Hromatografija na tankom sloju izvodi se na tankom sloju stacionarne faze kojom

je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala. Uzorak za hromatografisanje se

rastvori u rastvaraču koji se može lako upariti a zatim se 10-100 µl rastvora nanese na

1,5-2 cm od kraja ploče, tako da obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm.

Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan.

Najčešće se mobilna faza sastoji od dva ili više rastvarača. Hromatogram se razvija u

hromatografskoj kadi na više načina i mogu se dobiti jedno- i dvodimenzionalni

hromatogrami. U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu

hromatografije na tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu

se analizirati prirodne komponente hrane, aditivi, tragovi veterinarskih lekova, pesticida,

itd.


1. Od čega zavisi brzina protoka mobilne faze u planarnoj hromatografiji i kako se

može menjati?

2. Šta je stacionarna faza kod hromatografije na papiru? Navesti koje vrste

međumolekulskih interakcija postoje između stacionarne faze, mobilne faze i

analiziranih jedinjenja.

3. Kada i zašto se radi derivatizacija uzorka pre hromatografisanja? Šta se postiže

derivatizacijom? Navesti bar tri reagensa za derivatizaciju.

4. Definisati Rf vrednost.

Literatura



3. C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2003.

4. S. Ahuja, Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier Science, San Diego, 2003.

5. E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library – Volume 69A, Elsevier, Amsterdam, 2004.

31

3. Adsorpciona hromatografija u koloni

Cilj poglavlja

Upoznavanje sa tečno-čvrstom adsorpcionom hromatografijom. Definisanje fizičke

i hemijske adsorpcije. Karakterizacija adsorbenasa. Opis tehnike rada i mogućnosti

razdvajanja.

Tečno - čvrsta adsorpciona hromatografija podrazumeva kolonu pakovanu nekim

adsorbentom – stacionarna faza, a naneti uzorak se eluira sa nepolarnim rastvaračem –mobilna

faza, koji pod dejstvom sile gravitacije teče kroz kolonu. Razdvajanje komponenata iz smeše

adsorpcionom hromatografijom vrši se na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito

adsorbuje komponente smeše. Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstance – adsorbensi –

koje su porozne i imaju veliku aktivnu površinu, a samim tim i površinsku energiju koju teže

da smanje, tako što privlačnim silama vezuju molekule ili jone iz gasova ili tečnih rastvora.

Pri adsorpciji komponenata iz smeše razlikuju se fizička i hemijska adsorpcija. Fizička

adsorpcija se zasniva na uspostavljanju elektrostatičkih (dipol-dipol, Van der Waalsovih) i

vodoničnih veza izmeĎu stacionarne faze i komponenti, a pri hemijskoj adsorpciji dolazi do

stvaranja hemijskih veza usled čega se na površini adsorbensa obrazuje monomolekulski sloj

adsorbovane supstance.

Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini izmeĎu dve faze menja

koncentracija date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju

izmeĎu čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju

uz čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Adsorpcija na čvrstim površinama je složen

proces, jer zavisi od mnogo faktora kao što su heterogena priroda čvrste supstance koja se

menja od aktivnih do manje aktivnih površina, orijentacija adsorbovanih molekula na čvrstoj

površini, konkurencija izmeĎu molekula rastvarača i supstance za vezivanje za aktivne centre

na površini čvrstih čestica itd.

3.1. Stacionarna faza

Čvrsta supstanca (adsorbens), koja predstavlja stacionarnu fazu, kod ove vrste

hromatografije, je supstanca koja ima osobinu da na svojoj površini adsorbuje rastvoreni

uzorak. Koncentracija adsorbovane supstance na površini adsorbensa je u ravnoteži sa

koncentrcijom supstance koja se nalazi u rastvaraču – mobilnoj fazi.

Adsorpciona hromatografija u koloni

32

Strukturu adsorbensa sačinjava konglomerat mikro – čestica uglavnom sferičnog oblika.

Osnovne fizičke karakteristike adsorbensa su specifična površina i zapremina pora.

Specifična površina adsorbensa je funkcija veličine čestica, odnosno njihovog prečnika. Pore

se stvaraju izmeĎu dodirnih tačaka čestica ili dodirnih ivica i površina pojedinih sastavnih jedinica

adsorbensa. Zbog toga pore mogu biti različitog oblika ali najčešće preovlaĎuju pore jednog

oblika. Adsorbensi nemaju pore istog prečnika, kod svakog adsorbensa postoji distribucija

prečnika pora u obliku Gausove krive. Struktura i zapremina pora utiču na brzinu uspostavljanja

adsorpcione ravnoteže izmeĎu koncentracije supstance u stacionarnoj i mobilnoj fazi.

Adsorbens treba da sadrži što je moguće manje pora malog prečnika, s obzirom da molekuli

supstance teže difunduju u njih.

Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri na kojima dolazi do adsorpcije i

potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih centara. Drugim rečima, adsorpcione

sile zavise od hemijskih osobina adsorbensa, kao i od osobina supstanci koje se adsorbuju, i

one predstavljaju površinski afinitet koji izražava adsorpcioni potencijal jednog sistema.

Površinski afinitet se u velikoj meri gubi kada je adsorbent pokriven monomolekulskim

slojem adsorbovane supstance. Kada rastvor teče preko površine adsorbensa postiže se

ravnoteža izmeĎu adsorpcije i desorpcije prisutnih supstanci. Komponente smeše se

selektivno adsorbuju na adsorbensu. Jednu komponentu adsorbens više adsorbuje (onu koja

ima veći koeficijent raspodele), a drugu manje (onu koja ima manji koeficijent raspodele).

Ako je u pitanju adsorpciona hromatografija na koloni, komponenta koju adorbens više

adsorbuje nalaziće se pri vrhu kolone, dok će se komponenta za koju adsorbens ima manju

moć adsorpcije spustiti dublje u kolonu. Ako se vrednosti koeficijenata raspodele ispitivanih

komponenata dovoljno razlikuju, može se postići njihovo potpuno razdvajanje i pri procesu

eluiranja iz kolone prvo izlazi komponenta koja se slabije vezuje za adsorbens.

3.1.1. Adsorbensi

Dobar adsorbent treba da ima veliku površinu sa velikim brojem aktivnih centara. Kao što

je već rečeno, adsorpciona moć materijala zavisi od raspoložive površine, hemijske prirode

površine i od prethodne pripreme adsorbensa. Najčešće upotrebljavani adsorbensi su

aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe, i silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih,

upotrebljavaju se još i aktivni ugalj, poli(stiren-divinilbenzen) kopolimer, skrob, celuloza, kalcijum-

karbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijum-fosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijum-

silikat i drugi.

3.1.1.1. Silika-gel

Silikagel (SiO2 x nH2O) je jedan od najčešće upotrebljavanih adsorbenasa u hromatografiji.

Osnovnu strukturu ovog adsorbensa čine tetraedri silicijuma i kiseonika čiji polimeri obrazuju

poroznu strukturu karakterističnu za njegovu unutrašnju površinu. Specifična površina iznosi


33

oko 800 m2/g. Za adsorpciju su od značaja hidroksilne grupe vezane za silicijum koji gradi

adsorpcionu površinu. Adsorpcija se najčešće ostvaruje preko vodonične veze izmeĎu atoma

vodonika iz silika-gela i atoma kiseonika (ili nekog drugog elektronegativnog elementa) iz

uzorka (Slika 3.1).

Tok mobilne faze

Komponenta A

Površina silika-gela

Slika 3.1. Adsorpcija na silika-gelu

3.1.1.2. Aluminijum-oksid

Specifična površina aluminijum-oksida iznosi oko 200 m2/g. Površina adsorbensa se

sastoji od kiseonikovih jona u gornjem sloju i katjona Al3+

u donjem sloju. Pod normalnim

uslovima voda ne stvara hidroksilne grupe na površini adsorbensa ali je prisutna u stanju

hemisorpcije. Povećanjem temperature dolazi do delimične desorpcije vode a delimično do

obrazovanja hidroksilnih grupa na površini adsorbensa.

Joni kiseonika i aluminijuma na površini obrazuju jako elektrostatičko polje koje

stvara tri tipa aktivnih centara. Aktivni centri kiselog karaktera stvaraju jako pozitivno polje,

centri baznog tipa imaju karakter akceptora protona, dok se treća grupa sastoji od centara

akceptora elektrona. Elektrostatičko polje na površini aluminijum-oksida prouzrokuje

osnovni mehanizam adsorpcije – indukciju površinskog sloja. Aktivitet adsorbensa povećava

se sa povećanjem temperature aktiviranja.

3.1.1.3. Aktivni ugalj

Aktivni ugalj spada u grupu nepolarnih adsorbenata, njegova površina sastoji se

uglavnom od ugljenika i do adsorpcije dolazi zahvaljujući disperzionim silama. Iako je osnovna

komponenta ugljenik, aktivni ugalj je delimično polarni adsorbens jer se na površini mogu

naći oksidi, karbonilne i hidroksilne grupe. Unutrašnja površina aktivnog uglja je izrazito

diferencirana sa neravnomernim rasporedom prečnika pora i iznosi od 300-1000 m2/g.


34

3.1.1.4. Magnezijum-oksid

Magnezijum-oksid je adsorbent koji je visoko selektivan za dvostruke veze ugljenik-

ugljenik. Pokazuje slabo alkalne osobine i sličan je aluminijum-oksidu. Sa povećanjem

temperature od 100 – 500 °C povećava se adsorpcioni aktivitet, zatim sa daljim povećanjem

temperature opada i najzad nestaje na temperaturi od 1000 °C.

3.2. Mobilna faza

Izbor rastvarača za mobilnu fazu je podjednako važan kao i izbor stacionarne faze.

Tečna mobilna faza sastoji se od jednog ili više rastvarača i ona je, sa jedne strane, “nosač”

uzorka kroz adsorbens, a sa druge strane, jedna od dve faze izmeĎu kojih dolazi do raspodele

komponenti uzorka na osnovu koeficijenata raspodele. Dodatno, osim relativne rastvorljivosti

komponenti u eluirajućem rastvaraču, treba voditi računa i o konkurenciji izmeĎu rastvorene

supstance i rastvarača za adsorpciju na aktivnim centrima na površini stacionarne faze.

Rastvarači koji brzo eluiraju supstance sa adsorbensa neće dobro razdvojiti komponente, sa

druge strane, ako je eluiranje isuviše sporo, dolazi do širenja zona i nepotrebnog

razblaživanja uzorka.

Rastvarač ili smeša rastvarača za eluiranje se bira na osnovu osobina komponenti

smeše uzorka koji se analizira i osobina stacionarne faze. Mobilna faza treba da rastvara

analizirane supstance, kao i da interaguje sa stacionarnom fazom. Ne postoje opšta pravila za

izbor mobilne i stacionarne faze, već se na osnovu osobina uzoraka koji se analiziraju biraju

odgovarajući adsorbens i rastvarač. Najčešće se kao mobilna faza koriste sledeći rastvarači:

petrol-etar, ugljen-tetrahlorid, izopropil-etar, toluen, hloroform, dietil-etar, metil-etil keton,

aceton, etil-acetat, dioksan, acetonitril, etanol, metanol, voda. Rastvarači su poreĎani po

jačini interakcije sa polarnim stacionarnim fazama (aluminijum-oksid i silika gel).

3.3. Tehnika rada

Za adsorpcionu hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih

dimenzija. U zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom

adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom. Najčešće se

puni suspenzijom adsorbensa jer se na taj način omogućava efikasno izdvajanje gasova iz

adsorbensa. Osnovno je da kolona bude ravnomerno napunjena, bez mehurica vazduha ili

kanala kroz koje može da neefikasno prolazi velika količina mobilne faze.

Za unošenje uzorka koriste se tri metode: nanošenje uzorka na vrh sloja adsorbensa,

ispod mobilne faze i unošenje uzorka u sloj adsorbensa. Kod prve metode, rastvor uzorka se

pažljivo sipa na vrh kolone, posle čega se dodaje mala količina mobilne faze koja prodire

kroz sloj adsorbensa zajedno sa uzorkom. Drugom metodom uzorak se unosi u mobilnu fazu

iznad površine adsorbensa, ova metoda primenjuje se ako se površina adsorbensa može lako


35

poremetiti. Kod punjenja kolona suvim adsorbensom, uzorak se stavlja na vrh kolone napunjene

suvim adsorbensom a zatim se prekriva drugim slojem adsorbensa.

Uzorak se sa kolone može eluirati na više načina: običnim eluiranjem, postepenim ili

frakcionim eluiranjem i gradijentnim eluiranjem.

Obično eluiranje je kontinuirano propuštanje mobilne faze kroz kolonu čime se postiže

razdvajanje komponenata. Razdvajanje komponenata neke smeše postupkom eluiranja

prikazano je na Slici 3.2. Kada se razdvajanje komponenata u adsorpcionoj koloni završi,

njihove zone se mogu odvojiti jedna od druge rezanjem delova kolone koja je prethodno

pažljivo izvaĎena iz cevi. Nakon ovoga komponente se mogu ekstrahovati iz adsorbensa

pogodnim rastvaračem, a zatim analizirati pogodnim fizičkohemijskim metodama kvalitativne i

kvantitativne analize. Još jednostavniji način njihovog razdvajanja je da se eluiranje nastavi

do izlaska svih komponenata iz kolone, a sve pojedinačne frakcije istih zapremina se

sakupljaju pomoću tzv, frakcionog kolektora i posle toga analiziraju. Postepeno ili frakciono

eluiranje podrazumeva korišćenje više rastvarača različitih polarnosti kao eluenata. Eluiranje

počinje sa rastvaračem najmanje polarnosti, a završava sa rastvaračem najveće polarnosti od

upotrebljenih rastvarača.

Slika 3.2. Razdvajanje komponenata smeše postupkom eluiranja

Gradijentno eluiranje se sastoji u kontinuiranoj promeni sastava mobilne faze što

dovodi do promene polarnosti, jonske sile ili pH. Na primer, ako se kao polazni rastvarač za

odvajanje na koloni upotrebi etanol, a potrebno je eluirati polarnu supstancu koja se bolje

rastvara u vodi (voda je jače eluciono sredstvo), onda je potrebno etanolu dodavati vodu pri

čemu se eluciona moć mobilne faze povećava. Kao posledica ovog postepenog povećavanja

elucione moći rastvarača dolazi do uzastopnog eluiranja jače adsorbovanih supstanci.


36

Rezime poglavlja

Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se na

osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje prisutna jedinjenja u smeši.

Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini između dve faze menja koncentracija

date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju između

čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju uz

čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri

na kojima dolazi do adsorpcije i potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih

centara. Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu.

Najčešće upotrebljavani adsorbensi su aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe i

silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih, koriste se još i aktivni ugalj, polistiren-

divinilbenzen kopolimer, skrob, celuloza, kalcijum-karbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijum-

fosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijum-silikat i drugi. Za adsorpcionu

hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih dimenzija. U

zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom

adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom.


1. Objasniti razdvajanje supstanci iz smeše adsorpcionom hromatografijom.

2. Od čega zavisi adsorpcija na čvrstim površinama?

3. Koje su osnovne fizičke karakteristike adsorbensa?

4. Od čega zavise adsorpcione sile i šta one predstavljaju?

5. Nabrojati tehnike za punjenje kolone, nanošenje uzorka i eluiranje.

Literatura



3. J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier,

Amsterdam, 1997.


5. J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2005.

37

4. Gasna hromatografija

Cilj poglavlja

Upoznavanje sa osnovnim principima gasne hromatografije, komponentama

gasnog hromatografa, kvalitativnom i kvantitativnom gasnohromatografskom analizom.

Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda.

4.1. Uvod

U gasnoj hromatografiji mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta ili tečna.

Stacionarne faze koje su hemijski vezane za zid kolone se takođe često koriste. Kada se

tečna faza koristi kao stacionarna faza ili kada čvrsta faza kojom je obložena

unutrašnjost kolone postane tečna na radnoj temperaturi, tada se tehnika zove gasno-

tečna hromatografija (engl. Gas-Liquid Chromatography). Ako je stacionarna faza

čvrsta, ova tehnika se zove gasno–čvrsta hromatografija (engl. Gas-Solid

Chromatography). Obe ove tehnike se često jednostavno nazivaju gasna hromatografija,

GC (engl. Gas Chromatography).

Gasna hromatografija je prvi put primenjena 1952. godine, i opisana u radovima

James-a i Martin-a. Tehnika je bila zasnovana na studiji koju su objavili 11 godina ranije

Martin i Synge i koja se odnosi na particionu hromatografiju, za koju oni su oni dobili

Nobelovu nagradu za hemiju 1952. godine. Kao što je ranije pomenuto, stacionarna faza

može da bude čvrsta supstanca ili tečnost imobilisana na čvrstoj supstanci. Razdvajanje

u gasnoj hromatografiji se zasniva na relativnim pritiscima para komponenti uzorka i

njihovom afinitetu za stacionarnu fazu. Praktično, osnova gasnohromatografskog

razdvajanja je distribucija analita između dve faze. Jedna od ovih faza je stacionarna

faza, a druga faza inertni gas koji zajedno sa parama uzorka čini mobilnu fazu koja se

. Prvi gasni hromatograf

konstruisan je krajem 1954. godine u kompaniji Griffin and George (London, UK). Na

Slici 4.1 prikazan je jedan od najstarijih gasnih hromatografa, koji je izložen u Muzeju

hemije na Univerzitetu Sapienza u Rimu, Italija. Na Slici 4.2 prikazan je moderni gasni

hromatograf sa automatskim unošenjem uzorka (engl. autosampler).

Osetljivost, brzina, tačnost i jednostavnost primene metode gasne hromatografije

za separaciju, identifikaciju i kvantifikaciju isparljivih jedinjenja, doveli su do izuzetno

brzog razvoja ove tehnike. Danas je gasna hromatografija verovatno najrasprostranjenija

Gasna hromatografija

38

instrumentalna tehnika na svetu. Godišnji rast proizvodnje gasnih hromatografa je

iznad prosečnog rasta proizvodnje svih ostalih analitičkih instrumenata.

Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih derivata,

pesticida i ostataka pesticida, farmaceutskih proizvoda, u ,

kliničkoj hemiji i brojnim drugim oblastima.

Slika 4.1. Gasni hromatograf izložen u

Muzeju hemije na Univerzitetu Sapienza u

Rimu, Italija

Slika 4.2. Moderni gasni hromatograf sa

autosemplerom

Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su:

- Visoka rezolucija - na kapilarnoj koloni dužine 50 m može se lako generisati 100.000

teorijskih podova i time razdvojiti složene smeše bolje nego bilo kojim drugim, danas

dostupnim, tehnikama razdvajanja.

- Brzina - najveći broj gasno-hromatografskih analiza može se završiti u vremenu od 1

do 30 minuta. Neke jednostavnije analize mogu se završiti i za nekoliko desetina sekundi.

- Osetljivost - korišćenjem plameno jonizujućeg detektora, moguće je merenje milionitih

delova (ppm) skoro svih isparljivih organskih jedinjenja. Kada se koristite selektivni

detektori kao što su detektori sa zahvatom elektrona i azot-fosforni detektori mogu se

rutinski meriti i milijarditi delovi (ppb).

- Preciznost i tačnost - g

kvantitativnu analizu precizno pod različitim uslovima. Automatizacija i računarska

kontrola svih kritičnih hromatografskih parametara je proizvela nivo preciznosti i

tačnosti koji je bio nezamisliv pre samo desetak godina.


39

4.2. Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji

U literaturi koja se bavi gasnom hromatografijom koristi se veliki broj definicija,

termina i simbola koji su, najčešće, kombinacija onih koji se koriste široko i rutinski i

onih koje preporučuje Međunarodna unija za čistu i primenjenu hemiju - IUPAC.

Koeficijent raspodele ili podeoni koeficijent (K) predstavlja odnos koncentracija uzorka

u stacionarnoj (CS) i mobilnoj fazi (CM):

K = CS / CM

Retenciona zapremina (VR) se definiše na sledeći način:

VR = tR x Fc = VM + K x VS

gde je:

tR – retenciono vreme

Fc – protok nosećeg gasa na izlasku iz kolone

VM – zapremina mobilne faze

VS – zapremina stacionarne faze

K – koeficijent raspodele.

Zapremina mobilne faze ili mrtva zapremina (VM) izražava se kao:

VM = tM x Fc

Korigovana retenciona zapremina (V’R):

V’R = VR - VM = tR x Fc – tM x Fc = (tR – tM) x Fc =t’R x Fc =K x VS

gde je t’R – korigovano retenciono vreme

Faktor kapaciteta kolone (k’) je mera sposobnosti kolone da zadrži uzorak:

k’ = (tR – tM) / tM = t’R / tM

Retencioni odnos (R):

R = tM / t’R

Normalna distribucija pretpostavlja da će pikovi u hromatogramima biti simetrični i u

obliku krive jednačine Gausove raspodele:

y = yM exp [- (t – tR)2 / (2F2)]


40

Signal y zavisi od retencionog vremena i ima maksimalnu vrednost (yM) kada je t = tR.

Standardna devijacija Gausove krive je opisana kvadratom F. Ova dva parametra se

koriste da se opiše hromatografska širina pika. Za normalnu raspodelu, širina bazne

linije, W, ima vrednost 4F, širina na 60,7 % od visine pika je 2F, a širina na polovini

visine pika, koja se često izražava kao W1/2, je 2,354 F.

Asimetrija pika. Postoje mnogi faktori koji mogu da dovedu do asimetrije pika. U

velikom broju slučajeva, pikovi snimljeni sa gasnim hromatografom nemaju oblik

Gausova krive. Korišćeno je nekoliko načina za opisivanje

(As) koji se d

:

As = BC / AB

gde su AB i BC dva segmenta mereni na 10 % od maksimalne visine, kao što je

prikazano na slici X. Za simetrični pik, vrednosti As je 1.

1, respektivno (Slika 4.3).

Slika 4.3. Asimetričan hromatografski pik

Relativno zadržavanje ili selektivnost kolone, α, se definiše kao odnos korigovanih

retencionih vremena ili zapremina dve komponente pod identičnim uslovima.

α = t’R1 / t’R2 = V’R2 / V’R1 = k’2 /k’1

Kao što je definisano prethodnom 1, što znači da

se jedinjenje 2 zadržava duže na koloni od jedinjenja 1. Na vrednost α utiče priroda

stacionarne faze i temperatura. Za datu kolonu, α je funkcija temperature.


41

Rezolucija :

R1,2 = 2 (t’R2 – t’R1) / (W1 + W2) = 2d / (W1 + W2)

gde je d rastojanje između maksimuma dva pika a W je širina svakog pika na osnovi.

Velika vrednost R1,2, ukazuje na bolje razdvajanje pikova. Za potpuno odvajanje

potrebno je da vrednost rezolucije iznosi više od 1,5. Kada se rezolucija smanjuje ispod

1, interferencija između dva pika postaje jača, a “dolina” između dva pika čak nestaje na

R = 0,5.

Retencioni indeks. Postoje dve vrste retencionih indeksa, odnosno izotermni retencioni

indeks i indeks linearno programirane temperature. Oba indeksa izražavaju karakteristike

zadržavanja hemijskog jedinjenja analiziranog na gasnom hromatografu u odnosu na

zadržavanje homologne serije normalnih alifatičnih ugljovodonika analiziranih pod

istim uslovima. Kod oba sistema retencionih indeksa, analizirano hemijsko jedinjenje je

između dva uzastopna alifatična ugljovodonika čije vrednosti retencionih indeksa

odgovaraju broju atoma ugljenika u molekulu ugljovodonika pomnoženim sa 100.

Izotermni retencioni indeks (RII) je definisan kao logaritamska interpolacija između dva

uzastopna alifatična ugljovodonika eluirana neposredno pre i neposredno posle

jedinjenja A pod izotermskim gasno-hromatografskim uslovima, i izračunava se za

jedinjenje A na sledeći način:

RII = 100 x (logV’A – logV’Z) / (logV’Z+1 – logV’Z) + 100 x Z

gde je:

V’A – korigovana retenciona zapremina jedinjenja A

V’Z – korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z eluiranog neposredno pre jedinjenja A

V’Z+1 – korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z + 1 eluiranog neposredno posle jedinjenja A

Z – broj ugljenikovih atoma u ugljovodoniku Z

Eksperimentalno se izotermni retencioni indeks (RII) određuje na osnovu sledeće

jednačine:

RII = 100 x [log(tA – tCH4) - log(tZ – tCH4)] / [log(tZ+1 – tCH4) - log(tZ – tCH4)] + 100 x Z

gde su tA, tZ i tZ+1 retenciona vremena jedinjenja A, ugljovodonika Z i Z+1, respektivno.

Retencioni indeks linearno programirane temperature se određuje jednačinom:

RIP = 100 x (tA – tZ) / (tZ+1 – tZ) + 100 x Z

Retencioni indeksi se koriste za identifikaciju analiziranih jedinjenja.


42

4.3. Teorija o gasnoj hromatografiji

Koncept teorijskih podova (ili platoa) je odigrao veliku ulogu u razvoju

hromatografije. On je prvobitno predložen za merenje performansi procesa destilacije.

Koncept se zasniva na pretpostavci da je kolona podeljena u više zona koje se nazivaju

teorijski podovi, koji su tretirani kao da postoji savršena ravnoteža između gasa i tečne

faze u okviru svakog poda. Ova pretpostavka podrazumeva da koeficijent distribucije

ostaje isti od jednog poda na drugi pod i ne zavisi od drugih komponenti uzorka, i da je

izoterma distribucije linearna. Međutim, eksperimentalni dokazi pokazuju da to nije

tačno. Koncept teorijskih podova zanemaruje da je hromatografija dinamičan proces

transfera mase. U principu, nakon injektovanja uzorka, on ulazi u kolonu kao uska zona

molekula. Na koloni se zona širi usled interakcija komponenti sa stacionarnom fazom

koja neke komponente zadržava više od drugih. Konstantno kretanje mobilne faze

obezbeđuje brže razmene molekula analita između mobilne i stacionarne faze i tako

smanjuje mogućnost uspostavljanja ravnotežnih koncentracija analita između dve faze.

Kao posledica toga, u prednjem delu zone u kojoj je para, preovlađuje prelazak molekula

u tečnu fazu, a u zadnjem delu dolazi do suprotnog procesa – desorpcije. Na taj način,

jedinjenje se pomera kroz kolonu brzinom koja najviše zavisi od njegove rastvorljivosti

u tečnoj fazi. Slabije rastvorna jedinjenja provode kraće vreme u koloni od bolje

rastvornih jedinjenja.

Postoje tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u

koloni: uspostavljanje ravnoteže, longitudialna difuzija i vrtložna difuzija. Širenje

hromatografske zone usled sporog uspostavljanja ravnoteže prilikom prelaska molekula

iz jedne u drugu fazu, pre svega, zavisi od brzine mobilne faze. Brzina kretanja mobilne

faze utiče na brzinu kojom molekuli analita mogu da pređu dodirnu površinu faza, a ta

brzina zavisi i od kinetike sorpcije, odnosno desorpcije. Zadržavanje supstance u

stacionarnoj fazi ne zavisi samo od brzine mobilne faze već i od vremena koje je

potrebno da jedan srednji molekul difunduje na površinu mobilne faze iz bilo koje tačke

stacionarne faze. Longitudialna difuzija predstavlja difuziju rastvorene supstance u

stacionarnu fazu, što takođe dovodi do širenja zone. Longitudialna difuzija je obrnuto

proporcionalna brzini protoka mobilne faze. Do vrtložne difuzije dolazi u mobilnoj fazi i

ona je posledica različitih dužina puteva kojima molekul može da prođe kroz kolonu. U

jednoj hromatografskoj koloni postoji bezbroj puteva kojima molekul može da prođe i

oni nisu svi jednake dužine. Zbog toga je nekim molekulima potrebno duže, a nekim

kraće vreme da dođu do kraja kolone pa se hromatografska zona širi.

Van Demter (van Deemter) je polazeći od ovih faktora izveo kinetičku jednačinu

za gasnu hromatografiju:

h = A + B/μ +C x μ


43

gde je: h – dužina kolone podeljena brojem teorijskih podova.

A – konstanta koja zavisi od vrtložne difuzije (vrtložna difuzija zavisi od: veličine i oblika čestica

čvrste faze, načina pakovanja kolone i prečnika kolone).

B – konstanta koja zavisi od difuzije u nosećem gasu.

C – konstanta koja je merilo otpora prenosu mase u tečnoj fazi i najviše zavisi od debljine tečnog

filma i njegovog viskoziteta.

μ – linearna brzina kretanja gasa (protok).

Grafički prikaz van Demterove kinetičke jednačine dat je na Slici 4.4.

Molekulska

difuzijaOtpor prenosu mase

Vrtložna difuzija

Slika 4.4. Grafički prikaz van Demterove (van Deemter) kinetičke jednačine

4.4. Gasni hromatograf

Osnovne komponente većine gasnih hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom,

regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona,

termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač. Na Slici 4.5 su prikazane

osnovne komponente gasnog hromatografa.

KONTROLA

PROTOKA

INJEKTOR

KOLONA

PEĆ

DETEKTOR

ELUENTI

OBRADA

PODATAKA

Slika 4.5. Šema gasnog hromatografa


44

4.4.1. Noseći gas

Cilindar p i gas se koristi kao izvor nosećeg

gasa. Teorijski

i gas. Međutim, neka ograničenja moraju biti postavljena kod izbor

. Prvo, i gas mora biti inertan, ne treba da reaguje sa analitima i sa

bilo kojim komponentama gasnohromatografskog sistema. Drugo, od vrste

veoma zavisi osetljivost detekcije. Konačno, i gas da

nije otrovan. Najčešće se koriste: helijum, argon, vodonik i azot. Obično, da bi se

obezbedio visok kvalitet gasnohromatografske analize, pre injektora se postavlja cev sa

adsorbensom (trap), da bi se uklonili trag

.

Pritisak na početku kolone (nekoliko desetina do nekoliko stotina kPa) se

stabilizuje ili mehanički ili putem elektronske kontrole pritiska (EPC) u cilju da protok

ostaje konstantan na optimalnoj vrednosti. Ovaj uređaj je izuzetno važan jer ako se

analiza vrši sa temperaturnim programiranjem, viskoznost stacionarne faze s

podešeno da

bi se eliminisao ovaj efekat. Rezultat je brža analiza i duži životni vek kolone.

4.4.2. Unošenje uzorka – isparivači (injektori)

Uloga isparivača (injektora) je da uzorak trenutno prevede u parno stanje.

Isparivači su izrađeni od metala. Za jedinjenja koja se razlažu u dodiru sa vrelim

metalom u isparivač se ubacuje stakleni umetak, ili se u njega uvlači početak kolone.

Tečni uzorci i rastvori čvrstih uzoraka se unose pomoću mikrošpriceva zapremine od 1

– 100 µl (Slika 4.6) a gasovi pomoću šprica ili specijalnog sistema slavina.

Slika.4.6. Gasnohromatografski špricevi za injektovanje uzoraka


45

Za analize većeg broja sličnih uzoraka koriste se uređaji za automatsko

injektovanje – autosempleri (Slika 4.7).

Slika 4.7. Uređaji za automatsko injektovanje - autosampleri

Isparivač praktično predstavlja ulaz u hromatograf. Kao što je već rečeno uloga

isparivača je da se u njemu uzorak ispari, pomeša sa nosećim gasom i dovede do

početka kolone. Karakteristike isparivača i način injektovanja se razlikuju u zavisnosti

od tipa kolone. Isparivač, tj. injektor prikazan je na Slici 4.8.

Za pakovane i “530” kolone (vidi Odeljak 4.4.3.), kod kojih se obično koristi

protok od 10 ml/min, direktno isparavanje je najjednostavniji način da se unese uzorak.

Kao isparivač koristi se metalna cev sa staklenim umetkom (engl. liner) koja se zagreva

na nešto višu temperaturu od prosečne tačke ključanja komponenti koje se analiziraju.

Često se temperatura injektora podešava tako da bude za oko 50 °C viša od temperature

kolone. Na jednom kraju isparivača nalazi se zaptivač (septum) od termootporne gume,

danas se najčeće koriste silikonske gume, kroz koju se pomoću mikro-šprica unosi

uzorak. Drugi kraj isparivača direktno je povezan sa kolonom. Kada se injektuje tečnost,

ona isparava, meša se sa nosećim gasom i odlazi na kolonu u roku od nekoliko sekundi.

Kapilarne kolone imaju mnogo manji kapacitet od pakovanih i za unošenje

uzorka u takve kolone je neophodan i poseban razdeljivač protoka (engl. splitter) koji se

postavlja između isparivača i kolone. Razdeljivač protoka može da radi u dva režima, sa

razdvajanjem ili bez razdvajanja protoka (engl. split ili splitless).

Kod režima sa razdvajanjem protoka, noseći gas ulazi u komoru u isparivač gde

se meša sa parama isparenog uzorka. Protok nosećeg gasa je regulisan na 50 – 100

ml/min. Nakon ulaska u isparivač i mešanja sa uzorkom, jedan deo nosećeg gasa izlazi

kroz razdelni (split) ventil, a drugi ulazi u kolonu. Od veličine zazora na razdelnom

ventilu zavisi koja će količina nosećeg gasa (i uzorka) otići na kolonu, a koja kroz

razdelni ventil van aparata. Ovaj odnos: količina gasa koja ulazi u kolonu/količina gasa

koja izlazi kroz split ventil, obično varira od 1:20 do 1:500.


46

Razdelni (split) odnos se može izračunati na osnovu jednačine:

Split odnos = (protok kroz kolonu + protok kroz split ventil) / protok kroz kolonu

Gumeni

septum

Noseći gas

Uložak

Kolona

Slika 4.8. Uređaj za isparavanje uzorka – isparivač (injektor)

Povećavanjem split odnosa postiže se: bolji izgled pika, smanjuje se opterećenje

kolone, snižava se analitička osetljivost, smanjuje se ulazno vreme analita u kolonu i

time smanjuje mogućnost termičke degradacije. Osnovne prednosti split režima su:

jednostavno korišćenje, uske analitičke zone na koloni, kratko trajanje analize, pogodan

za termolabilne uzorke zbog krakog zadržavanja uzorka u zagrejanom injektoru, štiti

kolonu od neisparljivih komponenti uzorka i lak je za automatizaciju. Najveći

nedostatak ovakvog načina injektovanja je nemogućnost analize tragova supstanci.

Danas se većina parametara, kao što su protok nosećeg gasa, split odnos, vreme trajanja

split režima itd., automatski određuje uz pomoć odgovarajućih softvera.

Split režim (Slika 4.9) se koristi za uzorke koji su prilično koncentrovani -

generalno, jedinjenja od interesa su u koncentracijama im od 100 mg/ml. Split ventil

je otvoren tokom cele analize. Temperatura injektora bi trebalo da bude dovoljno visoka

da ispari sve analite. Početna temperatura kolone treba da bude ispod temperature na

kojoj se prvo jedinjenje eluira.

Splitless režim (Slika 4.10) je još jedan način da se koristi split/splitless injektor.

U ovom režimu, uzorak se ubrizgava dok je split ventil zatvoren. Nakon određenog


47

vremena split ventil se otvara kako bi se odstranio višak rastvarača iz injektora.

Komponente uzorka se deponuju na početku kolone i najveći deo lako isparljivog

rastvarača se odstranjuje. Zbog toga mogu da se injektuju velike količine uzorka i

splitless ubrizgavanje se koristi za analizu tragova. Da bi se sprečili gubici lako

isparljivih jedinjenja od interesa, tačka ključanja rastvarača treba da bude najmanje 20

°C ispod tačke ključanja komponente uzorka sa najnižom tačkom ključanja.

Slika.4.9. Split/splitlles injektor u

split režimu rada

Slika.4.10. Split/splitlles injektor u

splitlles režimu rada

Kod injektovanja u splitless režimu, temperatura injektora bi trebalo da bude

dovoljno visoka da ispari sve analite, a početna temperatura kolone treba da bude -

.

Koncentrovanje rastvarača, zatim isparavanje sa porastom temperature kolone, je

poznato kao fokusiranje rastvarača (solvent focusing). Otvaranje split ventila je obično

oko 0,5-1,0 minuta posle injektovanja, međutim, ovo vreme treba eksperimentalno

optimizovati. Ako se split ventil otvori prerano, dolazi do gubitka komponenti od

interesa, ako se split ventil otvori prekasno, “repovi” pika rastvarača prekrivaju komponente

koje se najbrže eluiraju.

Jedan od glavnih problema splitless režima injektovanja sa zagrejanim

injektorom je diskriminacija jedinjenja po molekulskim masama. To znači da ako uzorak

sadrži jedinjenja sa širokim spektrom tačaka ključanja, manje količine jedinjenja sa

višim tačkama otići u kolonu, u odnosu na isparljivija jedinjenja koja su u


48

uzorku. Još jedna mana splitless injekcije je da je vreme boravka u toplom injektoru

relativno dugo i termolabilna jedinjenja imaju tendenciju da se raspadaju. Zbog ovih

nedostataka, splitless ubrizgavanje se preporučuje za analizu uzoraka u tragovima kod

kojih su tačke ključanja komponenti u prilično uskom opsegu i koji ne sadrže komponente

koje su termički labilne.

Osim pomenutih injektora, danas su upotrebi i injektori koji se mogu zagrevati i

hladiti, takozvani PTV injektori (Programmable-temperature vaporizing injectors). Za

hlađenje se obično koriste tečni azot ili tečni CO2. Praktično se programiranjem

temperature zagrevanja, odnosno, hlađenja injektora eliminišu nedostaci klasičnog

split/splitless injektovanja, kao što su diskriminacija jedinjenja po molekulskim

masama i slično. Dalje, programiranjem temperature injektovanja omogućava se da se

već na početku kolone formira više uskih zona komponenti sličnih tačaka ključanja i na

taj način obezbedi njihovo bolje razdvajanje, odnosno da se dobiju uži i oštriji pikovi.

4.4.2.1. Unošenje uzoraka gasa

Uzorci gasa za gasno-hromatografsku analizu mogu se uneti iz nekoliko različitih

izvora: rezervoari gasa, kontejneri za sakupljanje uzoraka gasa, “headspace”, trapovi i

zamke za hvatanje gasova.

Vakumski špricevi mogu da se koriste

split/splitless u oba režima. Količina uzorka obično varira od 100 μl do 2 ml

ili više. Injektovanje vakumskim špricem može da se automatizuje. Špric od 100 μl se

može instalirati u nekim autosamplerima koji su dizajnirani za injektovanje tečnih

uzoraka. Takođe, postoje neki automatizovani sistemi koji koriste vakumske špriceve

koji se mogu zagrevati da bi se sprečila kondenzacija analita u uzorku gasa.

Za uzorkovanje gasova često se koriste specijalni ventili sa petljom koja služi da

uvede uzorak u kolonu (Slika 4.11). Ventil za uzorkovanje gasova je instaliran na vrhu

gasnog hromatografa, obično u svojoj odvojenoj peći sa kontrolom zagrevanja. Čak i

kada se sistem stalno koristi za analizu gasova, zagrevanje ventila je poželjno da se spreči

kondenzacija vode. Petlja za uzorkovanje gasa je dostupna u različitim veličinama, ali za

uvođenje uzorka u gasni hromatograf su tipične zapremine: 0,5 ml, 1 ml i 2 ml.

Slika.4.11. Ventil za uvođenje gasova sa četiri otvora i petljom


49

koriste se ventili sa 4-10 otvora. Ventili za uzorkovanje gasova su

obično zagrevaju i oni su dizajnirani da rade u određenom temperaturnom opsegu.

Dostupni su u širokom spektru veličina za različite veličine kolona, izrađeni su od

materijala različite inertnosti. Oni rade ili ručno okretanjem ručice ventila koji rotira

jezgro ili automatski sa pogonom koji pravovremeno rotira jezgro tokom analize. Oni

mogu biti instalirani u gasni hromatograf i koristiti se umesto injektora za uzorke gasa

ili mogu biti eksterni deo uređaja.

4.4.2.2. Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim

supstancama bez rastvarača

4.4.2.2.1. Statički Headspace

Headspace je metod pripreme uzorka za određivanje isparljivih jedinjenja u

čvrstim i tečnim uzorcima. Tehnika se koristi od kasnih 1950-ih do danas. Veoma je

popularna tehnika u gasnohromatografskoj analizi zbog svoje jednostavnosti i činjenice

da je veoma čist metod uvođenja nepostojanih analita u gasni hromatograf. Sistem za

injektovanje i kolona ne zahtevaju praktično nikakvo održavanje. Headspace tehnikom

iz

uzorka u otvor ventila ili kolonu.

Tečni uzorak koji treba da se analizira headspace tehnikom se čuva u

termostatiranom kontejneru ili frižideru u dobro zatvorenoj posudi kako se ne bi

izgubile lako isparljive supstance. Pre analize, tečni ili čvrsti uzorak se stavlja u ampulu

na sobnoj temperaturi, o

fazi iznad uzorka dok se ne postigne stanje ravnoteže. U ravnoteži, odnos koncentracije

analita u gasovitoj fazi i u tečnoj ili čvrstoj fazi je konstanta. Konstanta se definiše kao

koeficijent podele, K:

K = CS / CG

gde je CS koncentracija analita u uzorku nakon ravnoteže i CG koncentracija analita u

gasovitoj fazi posle uspostavljanja ravnoteže. Koeficijent podele se smanjuje sa

porastom temperature i takođe varira sa promenama u matriksu. Na primer, kada su

organske supstance rastvorene u vodi, dodavanje soli smanjuje K.

Kada se dostigne ravnoteža, alikvot gasne faze uzorka se uklanja iz headspace

ampule sa vakumskim špricem ili ventilima za uzorkovanje gasova i uzorak se uvodi u

gasni hromatograf.

Iz gornje jednačine, može se videti da supstance sa veoma visokim podeonim

koeficijentom imaju tendenciju da ostanu u fazi uzorka, dok one sa niskim koeficijentom

podele imaju tendenciju da se akumuliraju u gasnoj fazi. Dakle, granica detekcije


50

Headspace za supstancu kompatibilnu uzorku

(manja osetljivost) nego za supstancu nekompatibilnu uzorku (toluen u vodi).

Korišćenjem konvencionalne headspace tehnike, koncentracije analita se kreću u

opsegu od ppb do %.

Headspace tehnika se koristi za određivanje alkohola u krvi, zaostalih rastvarača

u farmaceutskim proizvodima i aditiva za poboljšavanje ukusa u hrani.

4.4.2.2.2. Dinamički Headspace

Ova tehnika se drugačija naziva “očisti i uhvati” (engl. purge-and-trap) tehnika.

I ak i isparljive supstance se prenose na

adsorbent (trap, zamku). Adsorptivni materijal je obično Tenax®, sintetički polimer koji

ne reaguje sa analiziranim supstancama ali ih efikasno vezuje pod ambijentalnim uslovima i

oslobađa ih na povišenoj temperaturi, bez hemijske modifikacije. Kao adsorptivni

materijali koriste se još i silika gel, aktivni ugalj i ugljenična molekulska sita. Adsorbens

se zagreva i isparljive supstance se oslobađaju ili desorbuju i prebacuju u gasni

hromatograf. Posle desorpcije, adsorbens

a tokom desorpcije kako bi se uklonili zaostali analiti i vlaga i sistem je spreman

za drugo uzorkovanje. Trapovi pakovani sa adsorbensima za specifične primene su

komercijalno dostupni.

Dinamički headspace generalno omog statičkog

headspace, jer ovom tehnikom teoretski treba da se uklone svi analiti iz matriksa, a kod

statičkog je ograničeno na uklanjanje jednog alikvota gasovite faze iznad uzorka.

Sistemi za dinamički headspace zahtevaju više održavanja od statičkog

headspace i podložni su problemima poput penušanja uzorka. U Sjedinjenim Američkim

Državama, dinamički headspace je standardni metod za određivanje isparljivih

organskih jedinjenja u vodi, dok se u mnogim evropskim zemljama za ovu primenu

koristi statički headspace. Druge primene ove tehnike uključuju analizu aroma u hrani i

toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima.

4.4.2.2.3. Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction – SPME)

Metodu mikroekstrakcije na čvrstoj fazi (SPME) je razvio Pavlicin (Pawliszyn) sa

saradnicima na Univerzitetu Waterloo u Ontariju, u Kanadi. To je termalna tehnika

adsorbcije-desorpcije za određivanje isparljivih supstanci u Headspace iznad vodenih i

čvrstih uzoraka ili određivanje “semiisparljivih” supstanci direktno u vodenim

uzorcima. Supelco Analytical (a division of Sigma-Aldrich Co.) je vlasnik Pavlicinovog

patenta i kontroliše distribuciju materijala koji se koriste za SPME .

Kod ove tehnike koristi se kratka, tanka šipka od topljenog silicijum-dioksida

(obično dužine 1 cm i prečnika 0,11 μm) obložena polimerom koji ima ulogu


51

adsorbensa. Polimerom obložena šipka silicijum-dioksida (SPME vlakno) je vezana za

metalnu iglu i one zajedno čine sklop SPME vlakana, kao što je prikazano na Slici 4.12.

Obojeni šraf

Opruga pod naponom

Septum

Prsten

Igla za probijanje septuma

SPME vlakno

Metalna igla

Slika.4.12. Uređaj za mikroekstrakciju na čvrstoj fazi

SPME vlakna su dostupna sa različitim polimerima i različitih debljina premaza.

Neka vlakna su obložena smešom adsorbujućih polimera i adsorbujućih jedinjenja

vezanih za aktivni ugalj. adsorbujućih polimera su polisiloksani koji se koriste

kao stacionarne faze u kapilarnim gasno-hromatografskim kolonama.

Sklop SPME vlakana se može koristiti za oko 100 injektovanja. SPME vlakna su

instalirana u modifikovanom špricu. U pasivnom položaju, vlakna se nalaze u

unutrašnjosti igle. Kod uzorkovanja, vodeni uzorak koji sadrži organska jedinjenja ili

čvrsta supstanca koja sadrži isparljiva organska jedinjenja se stavlja u headspace bočicu

koja je zatvorena poklopcem sa septumom. Septum se probija iglom i nakon toga se

vlakna, uz pomoć klipa, uranjaju direktno u uzorak ili prostor između poklopca i

površine uzorka. Organska jedinjenja iz uzorka se apsorbuju na vlaknima. Posle

određenog vremenskog intervala, koji se određuje tokom faze razvoja metode za

određenu analizu, vlakna se klipom vraćaju u iglu i igla izvlači iz bočice. Odmah nakon

toga, iglom se probija septum GC injektora, klip se gura nadole, a vlakna se ubacuju u

injektor gde se analiti termalno desorbuju i prebacuju na GC kolonu. Desorpcija obično

traje od 1-2 minuta, posle toga se vlakna uvlače u iglu i igla izvlači iz GC injektora. Na

slici 4.13 je šematski prikazan ovaj proces.


52

Probijanje

septuma uzorka

Izlaganje SPME

vlakna uzorku –

ekstrakcija

analita

Uvlačenje

vlakna

(uklanjanje)

Probijanje

septuma GC

injektora Desorpcija

analita

Uvlačenje vlakna

- uklanjanje

Slika.4.13. Mikroekstrakcija i injektovanje uzorka pomoću uređaja za SPME

ih injektora su pogodni za uvođenje SPME uzorka. Injektor treba da

bude opremljen staklenom oblogom (liner-om). SPME uzorci daju uske hromatografske

pikove, nema naglog povećanja zapremine uzorka izazvanog isparavanjem jer nema

rastvarača, odnosno nema potrebe da se uvodi velika zapremina gasa u injektor. Kao

statički headspace i SPME tehnika je zasnovana na ravnoteži i ekstrakcija nije potpuna,

međutim, rezultati su precizni i u skladu sa drugim analitičkim metodama, i objavljene

su niske granice detekcije, reda veličine ppt (part-per-trillion). U literaturi su opisane

brojne primene ove tehnike. Neke od tih primena su utvrđivanje aroma

, pesticida i isparljivih jedinjenja u ekološkim uzorcima i analiza droge i

toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima.

4.4.3. Gasnohromatografske kolone

(pokretna faza) i dovode do stacionarne faze gde na različit način

interaguj

4-20 °C/min.

Postoje dve vrste kolona: pakovane kolone (Slika 4.14) i kapilarne kolone (Slika

4.15). Kod pakovanih kolona stacionarna faza je deponovana ili hemijski vezana na

poroznom nosaču. Kod kapilarnih kolona unutrašnji zid kolone je obložen tankim slojem

stacionarne faze. Stacionarna faza može biti i hemijski vezana za unutrašnji zid kolone.


53

Slika.4.14. Metalne pakovane gasnohromatografske kolone

Slika.4.15. Kapilarne hromatografske kolone

4.4.3.1. Pakovane kolone

Ove kolone, danas se ređe koriste, imaju prečnik 1/8 ili 1/4 inča (3,18 i 6,35 mm)

i dugačke su između 1–3 m. Proizvode se od čelika ili stakla, unutrašnji zid cevi se

tretira da se izbegnu katalitički efekti sa uzorkom. One mogu da izdrže protok

gasa u opsegu 10-40 ml/min. One su punjene inertnim i stabilnim poroznim nosačem na

kome stacionarna faza može biti impregnirana ili hemijski vezana (između 3 i 20 %).

Potrebno je da čvrsti nosač zadovolji neke zahteve od kojih su najvažniji sledeći:

- velika specifična površina od 2 – 8 m2/g,

- da se sastoji od sfernih čestica ujednačene veličine i prečnika, najčešće 0,2 mm,

- ujednačena veličina pora po površini čestica (prečnik pore ≤ 10 μm)

- inertnost, minimalna hemijska i adsorptivna interakcija sa uzorkom,

- mehanička jačina, ne sme da se mrvi prilkom punjenja kolone.

Najveći broj čvrstih nosača se dobija od takozvane dijatomejske zemlje ili kizelgura.

To je skelet dijatoma, monoćelijske alge, koji se sastoji najvećim delom iz mikro-

amorfnog hidratisanog silikata (sadrži oko 90 % SiO2). Ostatak čine metalni oksidi:


54

Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO i MgO. Ovaj materijal je veoma porozan i ima veliku aktivnu

površinu. Čvrsti nosači koji se dobijaju od dijatomejske zemlje, ima ih više tipova,

komercijalno su poznati pod imenom Chromosorb®. Razvijeni su i drugi sintetički materijali

na bazi SiO2, kao što je Spherosil®, koji se sastoji od sitnih perli silicijum-dioksida.

Postoje i čvrste faze napravljene od umreženih kopolimera stirena i

divinilbenzena, kod kojih veličina pora zavisi od odnosa stiren/divinilbenzen i oni su

komercijalno dostupni pod nazivima Chromosorb 101-108 i Porapak Q, R S, N i T. Kod

njih veličina šupljina između polimernih lanaca zavisi od odnosa stiren/divinil benzen,

što je udeo divinil benzena veći, prečnik pora je manji. Veličina pora kod ovih nosača se

kreće od 0,01 do 0,35 μm, a aktivna površina iznosi od 50 – 400 m2/g. Ovakvi čvrsti nosači

mogu da se koriste i kao stacionarne faze. Da bi im se povećala polarnost u njih se

ugrađuju polarni vinil-monomeri, koji se dodaju pre polimerizacije. Za ovu svrhu se

koriste: akrilonitril, akrilatni estri, vinil-pirolidon i etilen-glikol-dimetil-akrilat.

Pakovane kolone se najčešće koriste za analizu gasova. Kolone pakovane sa

poroznim polimerima, sa i bez stacionarne faze, se preporučuju za analizu vodenih

rastvora polarnih organskih jedinjenja koja mogu da grade vodonične veze, kao što su

amini, alkoholi, glikoli i slobodne kiseline.

4.4.3.2. Kapilarne kolone

Kapilarna GC kolona se sastoji od dva glavna dela: cevi i stacionarne faze.

Unutrašnji zid cevi malog prečnika (0,05 do 0,53 mm) je obložen tankim filmom (0,1 do

10,0 μm) termički stabilnog polimera velike molekulske mase. Ovaj polimerni premaz

predstavlja stacionarnu fazu. Dužine kapilarnih kolona kreću se od 10 do 120 m. Poprečni

presek kapilarne hromatografske kolone prikazan je na Slici 4.16.

Kolone su obično napravljene od stopljenog silicijum-dioksida najviše č e,

dobijenog sagorevanjem tetrahlorosilana (SiCl4) u atmosferi bogatoj kiseonikom.

Stopljeni silicijum-dioksid je lako lomljiv i teško se savija. Fleksibilnost kolona se postiže

tako što se spoljašnji zid kolone oblaže poliamidom, termički stabilnim polimerom koji

podnosi temperature do 370 °C ili tankim aluminijumskim filmom.

Slika.4.16. Poprečni presek kapilarne hromatografske kolone a) bez stacionarne faze i

b) sa stacionarnom fazom

a) b)


55

Kolone se namotavaju oko metalnog nosača koji sprečava da dodje do njihovog

mehaničkog oštenja tokom namotavanja (vidi sliku 4.15.). Neki proizvođači nude kolone

napravljene od metala (aluminijum, nikl ili čelik) koje mogu da se koriste na visokim

radnim temperaturama reda veličine 450 °C, pod uslovom da je stacionarna faza

dovoljno stabilna. Unutrašnja površina kolone se obično tretira da se omogući vezivanje

sa stacionarnom fazom. Tretman može biti hemijski (HCl na 350 °C), ili podloga od

tankog sloja glinice ili silika gela u zavisnosti od tehnike koja se koristi za nanošenje

stacionarne faze. Debljina sloja glinice ili silika gela može da varira između 0,05 i 5 μ. Na

osnovu načina oblaganja untrašnjeg zida kolone one se mogu podeliti na:

- otvorene kolone sa zidom obloženim tečnom stacionarnom fazom (Wall-coated

open tubular – WCOT)

- otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem koji obložen tečnom

stacionarnom fazom (Support-coated open tubular - SCOT)

- otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem (Porous-layer open

tubular - PLOT). Slika.4.17.

Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona dat je na Slici 4.17.

Kovalentno vezivanje građenjem Si - O - S -

da se vežu na površinu silika gela.

zid kolone

tečna stacionarna faza

porozni nosač

porozni nosač obložen stacionarnom

fazom

Slika.4.17. Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona

Poseban tip kapilarnih kolona su kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,53 mm

(530 μm – kolone) i dužinom od 5 do 50 m. Poprečni presek kapilarne kolone prikazan

je na Slici 4.18. Te kolone su, u zavisnosti od proizvođača i njihovih glavnih karakteristika

poznate po k

5 ml/min do 15 ml/min, približno protoku

koji se koristi u pakovanim kolonama. Međutim, rezolucija i performanse ovih kolona su


56

slabije od kapilarnih

starijim hromatografima zamene sa 530 μm kolonama, uz korišćenje istih injektora,

detektora i protoka. Njihova glavna prednost nad pakovanim kolonoma je što kod njih

ne dolazi do progresivnog gubitka stacionarne faze sa vremenom. Ove kolone mogu i da

se pakuju ali se to radi vrlo retko.

Poliimidna prevlaka

Staklo

dC, Unutrašnji

prečnik kolone

df, Debljina filma

Stacionarna faza

Slika.4.18. Poprečni presek kapilarne kolone

4.4.3.3. Stacionarne faze

U literaturi je za pakovane kolone, za koje su tehnike impregnacije vrlo jednostavne,

predloženo preko 100 stacionarnih faza različitih tipova. S druge strane, za vezanu fazu

na kapilarnim kolonama izbor stacionarne faze je ograničen zbog toga što nanošenje

filma na unutrašnju površinu kolone zahteva različit princip od impregnacije. Najveći

broj stacionarnih faza koje se danas koriste su polisiloksani i polietilenglikoli, koji su

manje ili više hemijski i strukturno modifikovani. Za proučavanje optički aktivnih jedinjenja

(razdvajanje enantiomera), se koriste posebne faze koje sadrže sadrže ciklodekstrine.

Svaka od ovih faza može da se koristi između minimalne temperature ispod koje

se ravnotežna koncentracija suviše sporo uspostavlja i maksimalne temperature iznad

koje dolazi do degradacije polimera. Maksimalna temperatura na kojoj kolona može da

se koristi zavisi od prirode polimera i debljine filma. Svaka stacionarna faza ima

preporučeni opseg radnih temperatura. Ispod minimalne temperature, viskoznost faze

je velika i difuzija analita između stacionarne i mobilne faze je otežana. Kad se kolone

zagrevaju, one počinju da “cure”, to jest, deo faze se gubi iz kolone (Slika 4.19). To može

biti gubitak hemijski nepromenjene faze ili dolazi do razgradnje lanca polimera koja čini

stacionarnu fazu (Slika 4.20). Razgradnjom polimera nastaju isparljiva jedinjenja

sastavljena od tri, četiri, pet ili više monomernih jedinica. Ova jedinjenja daju neželjene

pikove na hromatogramu. Prisustvo kiseonika i vode u koloni može pospešiti

razgradnju polimera. Iznad maksimalne temperature, curenje kolone postaje intenzivno


57

i to uje radni vek kolone i daje veliki broj neželjenih pikova. Kolone sa polarnim

stacionarnim fazama imaju tendenciju da cure više nego kolone sa nepolarnim

stacionarnim fazama.

Poliimid

Film

Staklo

Poliimid

Oštećenje filma

Staklo

Poliimid

Oštećenje filma

Staklo Aktivna površina

Slika.4.19. Šematski prikaz preseka kapilarne kolone bez i sa oštećenjima

T

Slika 4.20. Degradacija polsiloksanske stacionarne faze

Debljina stacionarne faze je takođe važna za izbor radne temperature kolone. U

principu, tanka stacionarna faza (~0,2 μm ) je poželjna za rad jer kolona manje curi.

Tanak film stacionarne faze je dobar za razdvajanje jedinjenja sa visokim tačkama

ključanja ali za za razdvajanje jedinjenja sa niskim tačkama ključanja, potreban je deblji

film stacionarne faze (1,0 μm) da se obezbedi dovoljno zadržavanje jedinjenja koja se

razdvajaju.

4.4.3.3.1. Čvrste stacionarne faze

Čvrste stacionarne faze se prave od razl : silicijum-

dioksida ili aluminijum-oksida, deaktiviranih mineralnim solima, molekulskih sita,

poroznog stakla, grafita (Chromosorb® 100, Porapak®), kao i čvrste faze napravljene

od umreženih kopolimera stirena i divinilbenzena (Chromosorb® 101-108 i Porapak®

Q, R S, N i T). Kapilarne kolone napravljene taloženjem ovih materijala u obliku finog

poroznog sloja nazivaju se PLOT (Slika 4.17). One se koriste za razdvajanje gasovitih ili

nestabilnih uzoraka. Kolone koje sadrže grafit su razvijene za analizu N2, CO, CO2 i

gasovitih ugljovodonika. Efikasnost ovih kolona je veoma visoka.


58

4.4.3.3.2. Tečne stacionarne faze

Čvrsti nosač obložen tečnom fazom je jednostavan primer tečne stacionarne faze.

Priprema se tako što se napravi rastvor tečne faze u isparljivom rastvaraču, zatim doda

čvrsti nosač u rastvor, dobro izmeša, a zatim se rastvarač ukloni isparavanjem. Ovi

materijali izgledaju suvo čak i sa relativno visokim udelom tečne faze, i mogu lako da se

pakuju u kolonu. Punjenja sa niskim udelom tečne faze daju visoku efikasnost i koriste

se za jedinjenja sa visokim tačkama ključanja, dok se punjenja sa visokim udelom tečne

faze koriste za lako isparljiva jedinjenja i gasove.

Dobra stacionarna faza u gasno-tečnoj hromatografiji

karakteristike:

- zanemarljiv napon pare na radnoj temperaturi,

- dobru stabilnost na radnoj temperaturi,

- uzorci treba da imaju umerenu rastvorljivost u stacionarnoj fazi,

- komponente uzorka treba da pokazuju različite koeficijente distribucije.

Jedna od velikih prednosti gasne hromatografije je da se supstance sa istim ili

sličnim naponom pare mogu dobro razdvojiti stacionare faze.

Raznovrsnost i selektivnost gasne hromatografije leži u širokom izboru stacionarnih

faza. Stacionarne faze pokrivaju širok spektar, od nepolarnih dimetil-polisiloksanado

visoko polarnih polisiloksana i polihidroksilnih jedinjenja kao što je polietilen-glikol

(Carbowax 20M).

Polisiloksani (takođe poznati kao silikoni, silikonska ulja ili silikonske gume) su

polimeri kod kojih lanci izgrađeni od alternirajućih veza silicijuma i kiseonika, -Si-O-, i

gde se na svakom atomu silicijuma nalaze po dve alkil, aril ili neke druge funkcionalne

grupe. Najčešće su to kopolimeri polidimetilsiloksana i nekog drugog dialkil- diaril- ili

alkil/aril-polisiloksana. Postoji oko 20 različitih kombinacija alkil i aril supstituenata

(najčešće su to metil i fenil) na koje se mogu dalje ugraditi funkcionalne grupe (npr.

cijanopropil, trifluropropil itd.). Monomeri kombinovani u promenljivim molskim

odnosima dovode do promena u osobinama stacionarnih faza (polaritet, interval

stabilnosti, odnosno radne temperature, koji se npr. menja od -50 do 300/325 °C).

Strukture najčešće korišćenih polisiloksanskih polimera i kopolimera prikazane su u

Tabeli 4.1. Zbog njihovog veoma širokog opsega radnih temperatura ove faze su

najrasprostranjenije u gasnoj hromatografiji.

Slika 4.21. Struktura polisiloksanskog kopolimera


59

Polietileneglikoli (PEG) se koriste za dobijanje polarnih stacionarnih faza.

Najpoznatiji predstavnik ove grupe polimera je Carbowax®. Ovi polarni polimeri (npr.

Mr = 1500 do 20 000 - za Carbowax 20M) mogu se koristiti za nanošenje, impregnaciju

ili kao vezana faza. Njihove radne temperature su niže od polsiloksana i iznose od 40 °C

do 260 °C, u zavisnosti od prečnika kolone i debljine filma. Struktura i osobine najčešće

korišćenih polietilenglikola prikazani su u Tabeli 4.1.

Tabela 4.1. Struktura i svojstva tečnih faza u gasnoj hromatografiji

Struktura tečne faze Sastav

kopolimera

Polarnost Maksimalna

temperatura*1

Komercijalna imena

kolona

nepolarna 340/360 °C

OPTIMA(1/1MS),

PERMABOND®SE30, OV1,

DB‑1, SE‑30,HP‑1,SPB‑1,

CP-Sil 5 CB, Rtx®-1,

007‑1, BP1, MDN-1, AT™-

1, ZB-1, OV-101

m = 5%

n = 95%

slabo –

polarna

340/360 °C

OPTIMA 5, PERMABOND®

SE-52, SE-54, SE‑52, DB‑5,

HP-5, SPB-5, CP‑Sil 8,

Rtx®‑5, 007-5, BP5,

MDN‑5, AT™‑5, ZB-5

m = 5%

n = 95%

slabo –

polarna

340/360 °C

OPTIMA(5MS), DB-5MS,

HP-5MS, Ultra-2, Equity™-

5, CP-Sil8CB low

bleed/MS, Rtx®-5SIL-MS,

Rtx®-5MS, 007-5MS,

BPX5, MDN-5S, AT™-5MS,

VF-5MS, DB-XLB, Rtx®-

XLB, MDN-12, VF-XMS.

m +n = 5%

o = 95%

slabo –

polarna

340/360 °C

m = 6%

n = 94%

polarna 300/320 °C OPTIMA(1301/624) HP-

1301, DB-1301, SPB‑1301,

Rtx®1301, CP-1301, 007-

1301 HP-624, HPVOC, DB-

624, DB-VRX, SPB-624, CP-

624, Rtx®-624, Rtx®-

Volatiles, 007-624, BP624,

VOCOL

m = 14%

n = 86%

polarna 300/320 °C OPTIMA 1701, OV-

1701, DB-1701, CP‑Sil 19

CB, HP-1701, Rtx®-

1701, SPB-1701, 007-

1701, BP10, ZB-1701

m+n= 35%

o = 65%

polarna 360/370 °C OPTIMA 35MS, DB-35 MS,

HP-35, SPB-35, Rtx-35,

007-35, BPX-35, MDN-35,

AT-35 MS, ZB-35, OV-11,

VF-35 MS


60

Tabela 4.1. nastavak

Struktura tečne faze Sastav

kopolimera

Polarnost Maksimalna

temperatura*1

Komercijalna imena

kolona

polarna 320/340 °C OPTIMA 17, OV-17, DB-17,

HP‑50+, HP-17,

SPB‑50, SP-2250,

Rtx®-50, CP-Sil 24 CB,

007-17, ZB‑50

jako –

polarna

260/280 °C OPTIMA 210, OV-210,

DB-210, Rtx®-200,

007‑210

jako –

polarna

260/280 °C OPTIMA 225, DB-225,

HP-225, OV-225, Rtx®-

225, CP-Sil 43, 007-225,

BP225

m = 33%

n = 67%

jako –

polarna

260/280 °C OPTIMA 240

jako –

polarna

250/260 °C OPTIMA WAX, DB-

Wax, HP‑Wax,

Supelcowax™, ,

Rtx®‑Wax,CP-Wax 52 CB,

Stabilwax, 007-CW, BP20,

AT™-Wax, ZB-Wax

jako –

polarna

250/260 °C OPTIMA FFAP,

PERMABOND® FFAP, DB-

FFAP, HP FFAP, CP-SIL 58

CB, 007-FFAP, CP-

FFAP CB, Nukol

*1 – prva temperatura je za izotermalne programe

4.4.3.3.3. Selektivnost stacionarne faze

Za pravilan izbor stacionarne faze potrebno je dobro poznavanje hemijskih i

fizičkih osobina komponenti uzorka koji se analizira. Takođe su potrebni literaturni

podaci o sličnim uzorcima i podaci dobijeni u eksperimentalnom radu. S

:

- Treba dobro da rastvara komponente uzorka, jer će se komponente sa slabom

rastvorljivošću brzo eluirati.

- Neophodno je da dobro razdvaja komponente uzorka, a razdvajanje zavisi od

njihovih podeonih koeficijenata.

- Treba da ima dobru termičku stabilnost – termičku nestabilnost može izazvati

katalitički uticaj čvrstog nosača pri visokim temperaturama.


61

- Treba da pokazuje slabu isparljivost, odnosno stacionarna faza treba da bude

neisparljiva i njen napon pare na radnoj temperaturi treba da bude od 0,01 do 0,1 mm.

- Treba da bude hemijski inertna u odnosu na komponente uzorka na radnoj

temperaturi.

Kao što je već rečeno, važno je poznavanje hemijske prirode komponenti uzorka.

Ako ova informacija nije dostupna, neophodno je da se uzorak analizira na kolonama

različite polarnosti, jednoj nepolarnoj i najmanje dve polarne od kojih jedna sadrži

stacionarnu fazu sa elektron – donorskim, a druga stacionarnu fazu sa elektron –

akceptorskim svojstvima, kako bi se osiguralo da sve komponente budu eluirane i

detektovane. Tako dobijeni hromatogrami mogu da pruže dosta informacija o prirodi

komponenti i da posluže kao polazna osnova za izbor kolone sa odgovarajućom tečnom

fazom. Osnovni princip je da se pokuša da se klasifikuje uzorak u jednu od pet grupa, na

osnovu polarnosti njegovih komponenti.

1. Jako polarna jedinjenja. U ovu grupu spadaju voda i polifunkcionalna

jedinjenja koja u svom molekulu sadrže više aktivnih vodonikovih atoma i koja su

sposobna da grade više vodoničnih veza. Takva jedinjenja su: voda, glicerol, amino

alkoholi, hidroksi kiseline, dikarboksilne kiseline i polifenoli.

2. Polarna jedinjenja. Ovu grupu čine jedinjenja koja sadrže aktivni vodonikov

atom i jako elektronegativni atom sa slobodnim elektronskim parom (O, N ili F). Najveći

broj ovih jedinjenja, takođe može da gradi vodonične veze. Takva jedinjenja su: alkoholi,

fenoli, masne kiseline, primarni i sekundarni amini, nitro jedinjenja sa α – vodonikovim

atomom i nitrili sa α – vodonikovim atomom.

3. Umereno polarna jedinjenja. Ova jedinjenja sadrže jako elektronegativni

atom sa slobodnim elektronskim parom ali ne sadrže aktivne vodonikove atome. Takva

jedinjenja su: aldehidi, ketoni, etri, estri, tercijarni amini, nitro jedinjenja bez α –

vodonikovog atoma i nitrili bez α – vodonikovog atoma.

4. Slabo polarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja sa slabo aktivnim vodonikovim

atomima ali bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovu

grupu spadaju: halogenovani ugljovodonici, aromatični ugljovodonici i alkeni.

5. Nepolarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja bez aktivnog vodonikovog atoma i

bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovi grupu

spadaju: zasićeni ugljovodonici, merkaptani, sulfidi i potpuno halogenovani

ugljovodonici, kao CCl4.

Nije lako kvantifikovati polarnost stacionarne faze u gasnoj hromatografiji.

Pojam polarnosti tečne faze se, na neki način, razlikuje od klasične definicije polarnosti

izražene preko dipolnih momenata i on obuhvata sumu više efekata od kojih zavise

retenciona vremena. Polarnost je određena i međumolekulskim interakcijama, koje su

veoma složene prirode i često ih je teško predvideti u hromatografskom sistemu.

Intermolekulske interakcije mogu da igraju značajnu ulogu u gasnoj hromatografiji


62

(detaljno su opisane u Poglavlju 1.2.2.). Na primer, kod tečnih faza koje sadrže slobodne

hidroksilne grupe, polarnost zavisi, kako od dipolnih momenata, tako i od mogućnosti

građenja vodoničnih veza sa komponentama uzorka. Prema polarnosti, tečne

stacionarne faze u gasnoj hromatografiji se dele na više načina. Jedna od podela

prikazana je u Tabeli 4.1., a po drugoj dele se na:

- Polarne – sadrže veliki broj polarnih grupa (npr. polietilen-glikol).

- Nepolarne – ne sadrže polarne grupe (polidimetilsiloksan).

- Srednje polarne – po broju polarnih i polarizabilnih grupa se nalaze između

polarnih i nepolarnih.

Razdvajanje na gasnohromatografskoj koloni zavisi od vrste i jačine

međumolekulskih interakcija između komponenti uzorka i tečne stacionarne faze, kao i

od tačaka ključanja komponenti uzorka. Zbog toga, što su međumolekulske interakcije najače

između molekula sličnih po strukturi, sledi pravilo da se najbolja gasnohromatografska

odvajanja postižu na tečnim fazama koje su po polarnosti slične komponentama uzorka.

Pri izboru tečne faze neophodno je da se vodi računa da ona ne interaguje suviše jako sa

komponentama smeše, što bi kao posledicu imalo suviše duga retenciona vremena ili

trajno zadržavanje komponente na koloni. Svako građenje adicionog jedinjenja sa

tečnom fazom je nepoželjno zbog nepovratne adsorpcije datog jedinjenja i, samim tim,

nepovratnog oštećenja kolone. Zbog toga, ako je neka od komponenti bazna, tečna faza

mora imati takođe bazna (elektron-donorska) svojstva. Kada se razdvajaju kisela

jedinjenja preporučuju se tečne faze sličnog (elektron-akceptorskog) karaktera ili one

koje nisu isuviše bazne.

Na Slici 4.22 su prikazani hromatogrami smeše jedinjenja koja se sastoji, po

prethodno navedenoj podeli, od nepolarnih alkana (1, 2, 8, 9, 10), umereno polarnih

estara (6,7), umereno polarnog ali jako baznog dimetilanilina (4) i polarnih (po

funkcionalnoj grupi) alkohola i primarnog amina (3, 5). Decilamin i 1-oktanol sadrže

izrazito polarne funkcionalne grupe sa aktivnim vodonikovim atomom i elektron

donorskim atomom azota, odnosno kiseonika, ali je zbog veličine molekula doprinos

ovih grupa ukupnoj polarnosti molekula mala i ti molekuli se ponašaju kao slabo

polarni.

Sa Slike 4.22 se vidi da je raspored pikova alkana, bez obzira na stacionarnu fazu,

uvek identičan i da se oni eluiraju po rastućim molekulskim masama, odnosno tačkama

ključanja. Najbrže se eluiraju na polarnim kolonama, a najveća retenciona vremena

imaju na nepolarnoj koloni, što je u potpunosti očekivano na osnovu njihovih i osobina

stacionarne faze.

Alkohol i primarni amin su polarniji od alkana i iz tog razloga, na polarnim

kolonama, imaju veća retenciona vremena od komponenti 1 i 2, ali manja od alkana 8, 9

i 10, zbog mnogo manjih molekulskih masa. Takođe na svim kolonama jedinjenja 3 i 5

imaju manja retenciona vremena od estara 6 i 7, bez obzira na veću polaranost u odnosu


63

na njih. Ovo je očigledan primer kompleksnosti razdvajanja na gasnohromatografskoj

koloni i uticaja različitih faktora. U zavisnosti od veličine molekula i polarnosti

jedinjenja imamo različita retenciona vremena na različitim stacionarnim fazama.

Hromatogram *1, *2 Stacionarna faza Opis S.F. Polarnost

m = 33%

n = 67%

m = 14%

n = 86%

m = 5%

n = 95%

*1- Uzorak: 1. Undekan - C11H24; 2. Dodekan - C12H26; 3. Oktanol - C8H17OH; 4. Dimetilamin - C6H5N(CH3)2;

5. Decilamin - C10H21NH2; 6. Metildekanoat - C9H19CO2CH3; 7. Metilundekanoat - C10H21CO2CH3;

8. Heneikozan - C21H44; 9. Dokozan - C22H46; 10. Trikozan - C23H48

*2 - Svi hromatogrami su snimljeni pod istim uslovima: sve kolone su imale istu debljinu filma stacionarne

faze, istu dužinu i isti prečnik, injektovana je uvek ista količina uzorka u istom režimu (split 1:50), pritisak

nosećeg gasa je bio isti za sve kolone, korišćen je uvek plameno jonizacioni detektor i rađeno je u

izotermalnom režimu.

Slika 4.22. Poređenje selektivnosti različitih stacionarnih faza

pod istim hromatografskim uslovima


64

Posebno je zanimljivo ponašanje dimetilanilina, odnosno njegova retenciona

vremena na različitim stacionarnim fazama. Na dve najpolarnije kolone dimetilanilin

ima najveća retenciona vremena u odnosu na ostale komponente (8, 9 i 10 imaju mnogo

veće molekulske mase). Na sledeće tri po polarnosti ima manja retenciona vremena od

estara jer ovde dominiraju molekulske mase u odnosu na polarnost ali još uvek se

međumolekulske interakcije dovoljno jake da ima veće retenciono vreme u odnosu na

primarni amin veće molekulske mase. Na slabo polarnoj i nepolarnoj koloni imamo,

očekivani, redosled po molekulskim masama jer su tu interakcije između jedinjenja iz

smeše i stacionarne faze zanemarljive i utiču samo na apsolutni iznos retencionih

vremena. Interesantno je poređenje retencionog vremena dimetilanilina na stacionarnoj

fazi od poli(trifluoropropilmetilsiloksana) i stacionarnoj fazi od poli(metilfenil-

siloksana). Na manje polarnoj ali hemijski sličnoj poli(metilfenil-siloksanskoj) fazi

(prisustvo aromatičnog jezgra), dimetilanilin ima veće retenciono vreme.

Kao što je već rečeno, za dobro razdvajanje i uspešnu analizu smeše neophodno

je poznavanje fizičko-hemijskih osobina jedinjenja u smeši, kao i osobina tečnih

stacionarnih faza u kolonoma. Važno je napomenuti da se danas proizvode kolone sa

stacionarnim fazama koje su hemijski modifikovane, aktivirane ili dezaktivirane, i da je

danas dostupno preko 200 različitih tipova kolona. Proizvođači u katalozima daju

mnoštvo informacija o osobinama tih kolona, na osnovu kojih se možemo odlučiti za

izbor odgovarajuće kolone.

4.4.3. Detektori u gasnoj hromatografiji

Detektor je direktno povezan sa izlazom kolone, tako da sve što je sa nje eluirano

prolazi kroz njega. U gasnoj hromatografiji se koristi veći broj različitih detektora,

mnogi od ovih detektora, osim termoprovodljivog detektora, su posebno razvijeni za

gasnu hromatografiju. Uglavnom se primenjuju takozvani diferencijalni detektori čiji se

princip rada zasniva na neprekidnom merenju nekog fizičkog svojstva nosećeg gasa koje

je u direktnoj vezi sa koncentracijom ili masom pare u njemu. Neki od ovih detektora su

navedeni u Tabeli 4.2. U principu, oni se mogu klasifikovati na osnovu toga da li se mogu

koristiti za sve klase jedinjenja ili da li su selektivni za datu klasu jedinjenja.

Tabela 4.2. Primena komercijalno dostupnih detektora za gasnu hromatografiju

Detektor Primena

Termoprovodljivi detektor (TCD) Univerzalni

Plameno jonizacioni detektor (FID) Sagorljiva organska jedinjenja

Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) Halogenovana jedinjenja

Fotojonizacioni detektor (PID) Aromatična jedinjenja

Detektor sa alkalnim plamenom (NPD) N-, P-, i halogena organska jedinjenja

Plameno fotometrijski detektor (FPD) S- i P-, organska jedinjenja

Maseni spektrometar (MSD) Univerzalni


65

Osnovne karakteristike tri detektora su sledeće:

- Termoprovodljivi detektor (Thermal conductivity detector - TCD) - može se smatrati

univerzalnim detektorom koji reaguje na koncentraciju i opšte osobine, nije

destruktivan.

- Plameno-jonizacioni detektor (Flame ionization detector - FID) - je selektivan za

ugljenična jedinjenja, reaguje na protok mase i specifične osobine, destruktivan je.

- Detektor sa zahvatom elektrona (Electron capture detector - ECD) - je selektivan za

halogena jedinjenja, reaguje na opšte osobine, nije destruktivan.

Granica detekcije je ona količina supstance na koju detektor reaguje dajući pik

čija je visina najmanje dva puta veća od visine bazne linije. Za granicu detekcije se u

literaturi koriste sledeći termini: minimalna detektovana količina (engl. minimal

amount detected - MAD), minimalna granica detekcije (Minimum limit of detection -

MLD) ili limit detekcije (Limit of detection - LOD). U principu, poželjno je da se vrednost

granice detekcije utvrdi eksperimentalno. U daljem tekstu će termin “povećanje granice

detekcije” podrazumevati veću osetljivost detektora, odnosno, sposobnost detektora da

registruje manju količinu supstance.

Termoprovodljivi detektori mogu da detektuju količinu analizirane supstance do

reda veličine 100 ppm. To je praktično univerzalni detektor koji radi na merenju razlike

u električnoj provodljivosti nosećeg gasa sa uzorkom i čistog nosećeg gasa.

Plameno-jonizacioni detektor može detektovati male količine, reda veličine ppm,

. Uzorak na izlasku iz kolone se uvodi u plamen koji izaziva

jonizaciju uvedenog jedinjenja i zatim se meri električna provodljivost nosećeg gasa,

koja je direktno proprcionalna broju jona. Ovaj tip detektora daje slab odgovor na neka

jedinjenja, kao što su na primer heterociklična jedinjenja azota.

Posebni detektori, kao što su detektori sa zahvatom elektrona, mogu detekovati

izuzetno male količine, reda veličine ppb, odgovarajućih halogenih jedinjenja. Granice

detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji su date na Slici 4.32.

Slika 4.23. Granice detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji


66

4.4.3.1. Termoprovodljivi detektor

Kao što je već pomenuto, termoprovodljivi

dnosu

na toplotnu provodljivost . Detekcija se zasniva na činjenici da brzina

prelaska toplote sa zagrejanog tela na okolni gas zavisi od sastava gasa. Najveći deo

toplote odvodi se procesom termičke provodljivosti koji zavisi od broja sudara molekula

gasa, u jedinici vremena, sa zagrejanim telom, to jest od pokretljivosti molekula gasa.

Zbog toga najveću toplotnu provodljivost pokazuju gasovi sa najmanjim, samim tim

najpokretljivijim molekulima, kao što su vodonik i helijum.

Detektor se sastoji od metalnog bloka u kome se nalaze četiri ćelije. Presek ćelije

prikazan je na Slici 4.24.

Blok

detektora

Slika 4.24. Blok termoprovodljivog detektora sa četiri ćelije

Dve ćelije su merne i kroz njih protiče gas sa gasnohromatografske kolone

(noseći gas i pare uzorka), a dve referentne i kroz njih protiče čist noseći gas. U svakoj

od njih se nalazi po jedan vlaknast otpornik od materijala koji ima veliki temperaturni

koeficijent otpora. Za ovu svrhu koriste se platina, volfram, volframove legure i nikal.

Takođe se koriste i sinterovane smeše oksida nikla, mangana, i kobalta. Ove smeše su

poznate pod imenom termistori i njihova upotreba je ograničena na niske temperature,

pošto im osetljivost opada sa porastom temperature. Šema termoprovodljivog

detektora prikazana je na Slici 4.25.

Sva četiri otpornika povezana su u Vitstonov (Wheatstone) most. Kako kroz

otpornike neprekidno protiče struja, jačine I, oni se nalaze na višoj temperaturi od

temperature bloka koji se zagreva posebnim grejačem. Temperatura vlakna otpornika

određena je ravnotežom između prispele električne energije (I2R) i toplote odvedene,

toplotnim provođenjem, preko nosećeg gasa. Kada kroz obe ćelije protiče čist noseći gas

konstantnom brzinom, temperature svih otpornika su konstantne. Pod tim uslovima


67

Vitstonov most je uravnotežen i ΔE = 0. Kada sa kolone naiđu molekuli analiziranog

jedinjenja, menja se sastav gasa u mernim ćelijama, što izaziva promenu temperature

otpornika u mernim ćelijama. Posledica toga je pojava napona između mernih tačaka

Wheatstone-ovog mosta i ΔE ≠ 0. Ovaj električni signal se pojačava i registruje kao

gasnohromatografski pik. Površina ispod pika (P) proporcionalna je ukupnoj masi

eluirane komponente (M), a obrnuto proporcionalna brzini protoka nosećeg gasa (F):

P = ki x M / F

Konstanta proporcionalnosti ki zavisi od razlike između toplotnih provodljivosti

nosećeg gasa i pare eluiranog jedinjenja. Što je ova razlika veća, to je i konstanta

proporcionalnosti veća, a samim tim veća je i površina ispod pika, odnosno granica

detekcije. Činjenica da Ki zavisi i od toplotne provodljivosti pare analiziranog jedinjenja,

dovodi do toga da ovaj detektor nema istu osetljivost za različita jedinjenja. Osetljivost

termoprovodljivog detektora proporcionalna je i kvadratu jačine struje koja protiče

kroz vlakna otpornika, otporu vlakna, kao i razlici između temperatura otpornika i

bloka. Povećanje osetljivosti povećanjem jačine struje kroz vlakna, čime se menjaju i sve

pomenute veličine, ograničeno je termičkom izdržljivošću vlakna. Kada se pređe

određena temperatura vlakno može da pregori. Smanjivanjem temperature bloka

takođe može da se poveća osetljivost detektora ali, istovremeno, može doći do

kondezacije i deponovanja teže isparljivih jedinjenja u bloku detektora.

Slika 4.25. Šema termoprovodljivog detektora

Ranije je već rečeno da je osetljivost termoprovodljivog detektora manja od

osetljivosti drugih detektora. Njegove glavne prednosti su što nije destruktivan i što


68

omogućava detekciju jedinjenja koja ne mogu da se detektuju jonizacionim detektorima

kao što su: neorganski gasovi, voda, ugljen-disulfid i mnoga druga.

4.4.3.2. Plameno-jonizacioni detektor

Plameno-jonizacioni detektor (FID gasnoj

hromatografiji. Na izlazu iz kolone eluirane pare ispitivanih jedinjenja spaljuju u malom

plamenu, dobijenim sagorevanjem vodonika u kiseoniku, da bi se proizveli joni. Kada se

prikupe, joni proizvode malu struju koja se meri kao signal. Kada uzorak nije zapaljiv,

treba da postoji minimalna jonizacija i na taj način se dobija bazna linija.

Tipičan plameno-jonizacioni detektor (FID) je prikazan na Slici 4.26. Eluent sa

kolone se meša sa vodonikom i dovodi do malog gorionika gde sagoreva u atmosferi

vazduha koji se neprekidno dovodi sa visokim protokom. Pošto se u toku sagorevanja

uvek dobija voda, potrebno je da detektor bude zagrejan kako bi se sprečila

kondenzacija vode. U plamenu se proizvode joni i oni provode struju od gorionika, koji

služi kao jedna elektroda, do kolektorske elektrode postavljene iznad ili oko plamena

koje su pod naponom od oko 300 V (Slika 4.26.). Kada sa kolone izlazi čist noseći gas,

između elektroda protiče konstantna jednosmerna struja koja ide dalje kroz merni

otpornik, a rezultujući pad apona se pojačava elektrometrom i detektuje kao bazna

linija. Visina bazne linije podešava se kompenzovanjem ove struje strujom suprotnog

smera. Kada u prostor između gorionika i kolektorske elektrode dospeju joni nastali u

plamenu od jedinjenja eluiranog sa kolone, nihovo prisustvo smanjuje otpor između

elektroda. Na taj način se pojačava struja, odnosno pad napona na mernom otporniku.

Nastali signal se pojačava i registruje kao hromatografski pik. Površina pika direktno je

proporcionalna ukupnoj masi eluirane supstance i ne zavisi od protoka nosećeg gasa.

Držač kolektora

Zamenljivi kolektor

Oklop kolektora

Vodonik

Vazduh

Izolator

Plamen

Zid gorionika

Kolona - izlaz

Usmerivač mlaza

Slika. 4.26. Presek plameno-jonizacionog detektora


69

Granica detekcije ovog detektora znatno je veća od od granice detekcije

termoprovodljivog detektora (Slika 4.23.). Pomoću plameno-jonizacionog detektora ne

mogu da se detektuju: voda, neorganski gasovi, metanska kiselina, freoni, odnosna sva

jedinjenja koja ne mogu da gore. Granica detekcije organskih jedinjenja raste sa

porastom procenta ugljenika u njima, tako da se za iste količine različitih jedinjenja

dobijaju pikovi različitih površina. Granica detekcije ovog detektora zavisi i od brzina

protoka vodonika i vazduha. Povećanje protoka vodonika iznad optimalne vrednosti

smanjuje granicu detekcije.

4.4.3.3. Detektor sa zahvatom elektrona

Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) je selektivan za jedinjenja sa

elektronegativnim elementima, posebno sa hlorom, bromom ili fluorom. To je veoma

osetljiv detektor za neke od ovih jedinjenja i u ppt opsegu. Za rad sa ECD detektorom

kao noseći gas neophodan je azot ili argon. ECD detektor se sastoji od kontejnera od

u kome se nalazi ona količina radioaktivnog 63Ni čija je radioaktivnost

5 mCu (1,85 x 1011 Bq). Kontejner sa radioktivnim niklom se nalazi u peći koja se može

termostatski kontrolisati od sobne temperature do 380 oC. U nekim detektorima se

unesto nikla koristi 3H kao β emiter ali je njegova upotreba ograničena na niske

temperature.

Radioaktivni 63Ni se nalazi dobro zatvoren unutar ECD detektora i emituje

elektrone (β čestice) koji se sudaraju sa molekulima nosećeg gasa i jonizuju ih. Ovom

jonizacijom formira se stabilni oblak sporih elektrona u . Primenom

periodičnih impulsa na anodu i katodu održava se konstantna struja elektronskog

oblaka (Slika 4.27). Vrednost stalne struje bira operater, a trenutna vrednost stalne

struje predstavlja broj impulsa kroz . Ako je trenutna vrednost stalne struje

elektronika detektora održavati konstantnu struju od 0,3

nanoampera . Ako vrednost padne ispod zadate vrednosti stalne struje,

broj impulsa u sekundi za održavanje stalne struje (Slika 4.28).

Slika 4.27. Impulsi koji zadaje detektor da se održi stalna struja

Slika. 4.28. Povećani broj impulsa u prisustvu halogenog jedinjenja

da se održi stalna struja


70

Kada jedinjenje sa elektronegativnim atomom, tačnije sa atomom koji ima veliki

afinitet prema elektronu, iz kolone detektora sa zahvatom elektrona, odmah

vezuje neki od slobodnih elektrona i na taj način smanjuje broj slobodnih elektrona u

oblaku. Kada je smanjen broj elektrona se broj impulsa u jedinici vremena za

održavanje konstantne struje jednake zadatoj stalnoj struji. Taj povećani broj impulsa se

konvertuje na analogni izlaz kao signal. Za razliku od drugih detektora koji mere

signala u odgovoru detektora, elektronika detektora sa zahvatom elektrona

meri puls potreban da se održi zadata konstantna struja. Detektor sa zahvatom

elektrona šematski je prikazan na Slici 4.29.

Izolator

Radioaktivni emiter

Sa GC koloneU otpad

- Elektroda+ Elektroda

Izolator

Anoda

Katoda -Emiter

Noseći

gas- ulaz

Noseći

gas- izlaz

Slika. 4.29. Šematski prikazi detektora sa zahvatom elektrona

Površina pika kod detektora sa zahvatom elektrona zavisi od količine eluiranog

jedinjenja. Površina pika takođe zavisi i od afiniteta jedinjenja prema elektronima. Zbog

toga je ovaj detektor izuzetno osetljiv na halogenalkane koji, zahvaljujući halogenu,

imaju veliki afinitet prema elektronima. Takođe, pokazuje i veliku osetljivost, mada

znatno manju nego u odnosu na halogenide, prema konjugovanim karbonilnim

jedinjenjima, nitrilima, nitratima i organometalnim jedinjenjima. Praktično je potpuno

neosetljiv na ugljovodonike, alkohole, ketone i ostala jedinjenja čiji je afinitet prema

elektronima slab. Zbog navedenih osobina vrlo je pogodan za analizu tragova

halogenovanih jedinjenja. Od velike je važnosti za analizu tragova pesticida u

poljoprivrednim proizvodima (ratarskim i povrtarskim) i prehrambenim proizvodima.


71

4.4.3.4. Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor

Azot - fosforni detektor (engl. Nitrogen Phosphorus Detector - NPD), koji se

ponekad naziva i termoelektronski detektor, je veoma osetljiv, specifičan detektor za

jedinjenja koja sadrže azot i/ili fosfor. Iako je njegova konstrukcija veoma slična

plameno jonizacionom detektoru, on radi na potpuno drugačijem principu. Šematski je

azot - fosforni detektor prikazan na Slici 4.30.

Anoda

Kuglica od rubidijuma

ili cezijuma

Plamen

Vazduh

Noseći gas -

helijum

Vodonik

Grejni

kalem

Konektori

kalema

Slika 4.30. Šematski prikaz azot-fosfornog detektora

Senzor azot-fosfornog detektora se razlikuje od onog u plameno jonizacionom

detektoru po tome što sadrži kuglicu (perlu), od rubidijum ili cezijum hlorida, koja se

nalazi unutar grejnog kalema neposredno iznad otvora mlaznice kroz koju prolazi

smeša nosećeg gasa i vodonika. Struja vodonika i vazduha stvara plazmu vodonika oko

zagrejane perle. Zagrejana alkalna kuglica emituje elektrone koji se prikupljaju na anodi

i daju osnovnu struju kroz sistem elektroda. Kada molekuli koji sadrže azot ili fosfor

dospeju u plazmu iz kolone kroz otvor mlaznice dolazi do katalitičke reakcije na površini

perle i dodatne emisije elektrona, samim tim se povećava broj elektrona koji dolazi do

anode, odnosno struja. NPD ima veoma visoku granicu detekcije, 1x10-12 g/ml za fosfor i

1x10-11 g/ml za azot. On je osetljiv i na ugljovodonike ali je granica detekcije za njih oko

100.000 puta manja od granice detekcije za fosforna i azotna jedinjenja.

Osnovni nedostatak ovog detektora je da se njegove performanse pogoršavaju sa

vremenom. Sagorevanjem vodonika stvara se vodena para. Na normalnoj radnoj


72

temperaturi kuglica od alkalnih soli trpi značajan pritisak vodene pare i samim tim,

dolazi do kontinuiranog gubitka rubidijuma ili cezijuma tokom rada detektora. Ovo je

problem sa svih NPD detektora i kod rada sa njima treba redovno menjati perle sa

alkalnim solima.

Azot-fosforni detektor je, kao i plameno jonizacioni, relativno neosetljiv na

pritisak, brzinu protoka i promene temperature, ali se obično termostatira na 260 oC ili

više. Specifičan odgovor NPD na azot i fosfor, zajedno sa ,

čini ovaj detektor posebno korisnim za analizu mnogih farmaceutskih uzoraka, a naročito

uzoraka iz životne sredine koji sadrže herbicide i pesticide

sisteme kolona lako se mogu odrediti tragovi herbicida na nivou 500 pg. Iz pomenutih

razloga, ovaj detektor se često koristi za analizu tragova pesticida i herbicida, koji

sadrže fosfor, u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima.

4.4.3.5. Plameno fotometrijski detektor

Plameno fotometrijski detektor (engl. Flame Photometric Detector - FPD) je jedan

od na detektora u gasnoj hromatografiji. Plameno

fotometrijski detektor analizira svetlost redukcionog plamena koji nastaje

sagorevanjem (zagrevanjem) neke hemiluminiscentne molekulske vrste u struji

vodonika i vazduha. Hemiluminiscencija je optička emisija koja se javlja kada se

ekscitovani molekuli vraćaju u osnovno stanje. Zbog toga što svetlost potiče od

molekularne emisije, trake dobijene na ovaj način su šire i složenije nego trake dobijene

emisijom atoma. Molekuli emituju svetlost karakteristične talasne dužine koja se

propušta kroz odgovarajući filter. Izabrana talasna dužina određuje koji će jedinjenje

biti detektovano. Filtrirana svetlost se meri i pomoću fotomultiplikatora prevodi u

signal.

Plameno fotometrijski detektor je sličan plameno jonizacionom detektoru po

tome što uzorak izlazi iz kolone i ulazi u difuzioni vodonični plamen. Za razliku od

plameno jonizacionog detektora koji meri struju jona proizvodenih od organskih

jedinjenja tokom sagorevanja, plameno fotometrijski detektor analizira spektar svetlosti

koju emituju hemiluminiscentna jedinjenja u plamenu. Komora u kojoj se nalazi

detektor ne sme da propušta svetlost, tako da samo svetlost iz plamena može, kroz

filter, doći do fotomultiplikatora. Kod FPD se koristi drugi protok vodonika koji služi da

očisti optički put između fotomultiplikatora i difuzionog plamena vodonika. Kod PFD se

takođe koristi i drugi protok vazduha usmeren preko staklene površine

fotomultiplikatora koja je okrenuta prema plamenu (“lice” fotomultiplikatora) da spreči

helijum i/ili molekule vodonika da prodiru kroz stakleni prozor fotomultiplikatora i

izazivaju kvar. Plameno fotometrijski detektor šematski je prikazan na Slici 4.31.


73

Slika 4.31. Šematski prikaz plameno fotometrijskog detektora

Filteri mogu biti izabrani za mnoga različita jedinjenja e se koriste za

selektivnu detekciju sumpornih i fosfornih jedinjenja u kompleksnim smešama. Sumporna

jedinjenja se detektuju pomoću emisije ekscitovanog S2. Talasna dužina na kojoj je

maksimalna emisija (Lambda max) S2 je 394 nm. Fosforna jedinjenja se detektuju preko

ekscitovanih molekula HPO (Lambda max = dublet 510-526 nm). Iako nije u potpunosti

selektivan, FPD je oko 100.000 puta osetljiviji na sumporna i fosforna jedinjenja nego na

ugljovodonike. Jedinjenja sumpora kao što su H2S ili SO2 se mogu detektovati u

koncentracijama oko 200 ppb, a fosforna jedinjenja u koncentracijama oko 10 ppb.

Gasna hromatografija sa plameno fotometrijskim detektorom se u analizi hrane

koristi za detekciju neželjenih ukusa (engl. off-flavors) koji nastaju kao rezultat

oslobađanja isparljivih sumpornih jedinjenja. Takođe se koristi i za detekciju pesticida

koji sadrže fosfor i sumpor u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima. U oblasti

životne sredine se koristi za otkrivanje organofosfornih pesticida i herbicida. Nekoliko

EPA metoda za detekciju pestic

. Takođe se koristi za istovremeno otkrivanje sumpora i fosfora u

hemijskim bojnim otrovima. Može se koristiti i za detekciju sumpora u sirovoj nafti i

sumpornih kontaminanata u prirodnom gasu.

4.4.3.6. Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi

Maseni spektrometar, svakako, ne može da se posmatra kao običan detektor.

Kombinacija gasne hromatografije i masene spektrometrije predstavlja najmoćniju

metodu za razdvajanje i kvalitativnu i kvantitativnu analizu isparljivih organskih

jedinjenja. Detaljan opis ove metode zahteva mnogo prostora i u mnogome prevazilazi


74

obim i namenu ovog rukopisa. Međutim, zbog velikog značaja i široke upotrebe, ovde će

ukratko biti opisani osnovni principi i mogućnosti koje pruža ova metoda.

Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) je najzastupljenija

analitička tehnika za identifikaciju i kvantifikaciju organskih jedinjenja u složenim

uzorcima. Kombinacija gasnog hromatografa i masenog spektrometra danas je

neophodna u oblasti ekologije, forenzike, zdravstvene zaštite, medicinskih i bioloških

istraživanja, zdravlja i bezbednosti, industrije aroma i poboljšivača ukusa i mirisa,

bezbednosti hrane, pakovanja hrane, i mnogim drugim oblastima.

. Gasni

hromatograf razdvaja komponente smeše u vremenu, a maseni spektrometar pruža

informacije koje pomažu u strukturnoj identifikaciji svake komponente. Ova

kombinacija ima nekoliko prednosti. Prvo, odvaja komponente kompleksne smeše tako

da se dobijaju maseni spektri pojedinačnih jedinjenja za kvalitativne svrhe; drugo, može

da obezbedi kvantitativne informacije o ovim istim jedinjenja. Jonizacione tehnike

masene spektrometrije koje zahtevaju analite u gasnoj fazi su idealne za GC/MS, jer je

isparljivost uzorka uslov za gasnu hromatografiju.

GC/MS može da obezbedi kompletan maseni spektar ako je sadržaj analita u

uzorku oko 1 x 10-10 g. Ovaj spektar daje molekulski jon i fragmentacione jone ili

"hemijski" otisak prsta koji se može koristiti kao osnova za identifikaciju zajedno sa

retencionim vremenima dobijenih gasnohromatografskim razdvajanjem.

Metoda GC/MS je ograničena na analite koji, osim što treba da budu isparljivi,

takođe treba da budu stabilni u gasnohromatografskoj koloni u uslovima razdvajanja

(temperatura kolone, interakcije sa stacionarnom fazom, injektovanje, itd.). Čak i sa

ovim ograničenjem, postoje mnoga jedinjenja koja mogu da budu odvojena i

identifikovana i /MS.

Maseni spektrometar u sistemu GC/MS ima dvostruku ulogu, služi kao detektor i

snima masene spektre eluiranih jedinjenja. Neprekidnim merenjem ukupne jonske

struje (Total Ion Current - TIC), odnosno sume svih jona koji se stvore u jonskom izvoru

za vreme hromatografisanja, dobija se gasni hromatogram. Dobijeni gasni hromatogram

je po izgledu isti kao i gasni hromatogrami dobijeni pomoću nekog od standardnih

gasnohromatografskih detektora. Maseni spektar se dobija merenjem struja koje potiču

od jona razdvojenih prema masa/naelektrisanje (m/z) vrednostima. Maseni spektar

predstavlja zavisnost jačine jonske struje od m/z vrednosti. Intenziteti jonskih struja

(obilnosti jona) u masenom spektru izražavaju (u %) u odnosnu na intenzitet

najobilnijeg jona, koji se zove osnovni jon i njegov intenzitet je 100 %.

Maseni spektrometar se sastoji od sledećih osnovnih delova:

- Jonskog izvora gde se stvaraju joni od analiziranih molekula.

- Masenog analizatora ili filtera masa gde dolazi do razdvajanja jona nastalih u jonskom

izvoru u zavisnosti od odnosa m/z ili m/e.

- Detektora i sistema za obradu podataka.


75

U jonskom izvoru ili jonizacionoj komori dolazi do stvaranja jona od analiziranih

molekula. Do jonizacije molekula, u zavisnosti od konstrukcije jonskog izvora, može doći

na više načina. U GC/MS sistemima najčešće se koriste bombardovanje elektronima sa

visokim sadržajem energije i hemijska jonizacija. Osim ovih načina u masenoj

spektrometriji koriste se još i bombardovanje brzim atomima (Fast Atom Bombardment

- FAB), jonizacija u plazmi (Plasma Desorption Ionisation - PDI), elektrosprej jonizacija

(Electrospray Ionisation - ESI), jon sprej jonizacija (Ion Spray Ionisation - ISI) i laserska

jonizacija (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation - MALDI).

Jonizacija molekula elektronskim bombardovanjem (engl. Electron Impact -EI)

izvodi se u komori koja je smeštena između dva magneta. Elektroni se emitiju sa usijane

katode, koja je napravljena od volframa ili rutenijuma, i imaju energiju od E = 70 eV. Za

jonizaciju molekula dovoljno je 13 eV. Elektroni se na putu prema anodi sudaraju sa

molekulima analita i prilikom sudara im izbijaju jedan elektron i tako nastaju pozitivni

molekulski joni. Nastali joni su nestabilni i dalje se fragmentišu i daju nove jone. Joni

nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka analizatoru masa. Fragmetacija molekulskih

jona je specifična za svako jedinjenje i predstavlja “otisak prsta” jedinjenja. Na slici 4.32

šematski je dat prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima.

M + e- → M+ + 2e-

Odbijač

Filament

(W ili Ru)

Magnet

Magnet

Trap

Fokus

MS

Slika 4.32. Šematski prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima

Komora za hemijsku jonizaciju je slična opisanoj komori. Razlika je u tome što se

u ovu komoru uvodi takozvani reagens gas - metan, amonijak, izobutan, u

koncentracijama i 1000 puta većim od koncentracije analita. Elektroni se sudaraju sa

molekulima reagens gasa i jonizuju ih:


76

2 CH4 + 2e- CH4+ + CH3

+ +H + 4e-

CH4+ + CH4 CH5

+ + CH3

CH3+ + CH4 C2H5

+ + H2 Joni nastali jonizacijom molekula reagens gasa su nestabilni i reaguju sa

molekulima analizirane supstance i daju nove jone:

M + CH5+ MH+ + CH4

M + C2H5+ MH+ + C2H4

Proizvod nove jonizacije su takozvani kvazimolekulski joni MH+ čija je

molekulska masa za 1 veća od molekulske mase jedinjenja. Ovi joni su stabilniji od jona

koji se dobijaju elektronskim bombardovanjem i samo se delimično fragmentišu.

Joni nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka masenim analizatorima -

filterima, gde se razdvajaju po masama. Za razdvajanje jona po masama u sistemima

gasni hromatograf / maseni spektrometar najčešće se koriste magnetni analizator

(magnetno polje) i kvadrupolni maseni analizator. Osim ovih načina u masenoj

spektrometriji koriste se i sledeći analizatori masa: analizator koji meri vreme

preletanja jona (engl. time-of-flight, TOF) i jonski trap (engl. ion trap analyser).

Joni razdvojeni u masenom analizatoru dolaze do detektora gde se registruju u

obliku signala. Što ima više jona sa određenim odmosom m/z dobija se intenzivniji

signal. Jon koji daje najintenzivniji signal zove se osnovni jon i uzima se da je intenzitet

tog signala 100%. Intenziteti ostalih signala se daju kao procenti od osnovnog signala.

Svaki molekul se fragmentiše (raspada) na jone na isti način pod istim uslovima.

Grafički prikaz zavisnosti intenziteta signala od odnosa m/z zove se maseni spektar.

Maseni spektar je karakterističan za svako jedinjenje i zove se još i “otisak prsta”.

Intenzitet pika je direktno proporcionalan vremenu života jona. Stabilan jon traje duže i

daje intenzivniji pik. Visokoenergetski joni su nestabilni i kratkoživući, pa ne “traju”

dovoljno dugo da stignu do detektora. Šematski prikaz sistema gasni

hromatograf/maseni spektrometar dat je na Slici 4.33.

Slika 4.33. Šematski prikaz sistema gasni hromatograf/maseni spektrometar


77

4.4.4. Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji

Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za

što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i

dobru razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od niza činilaca od kojih su

najvažniji:

- Hemijska i fizička svojstva jedinjenja koja se razdvajaju, u prvom redu, njihova

polarnost i napon pare;

- Hemijska i fizička svojstva stacionarne faze - polarnost, viskozitet i termička stabilnost;

- Brzina protoka nosećeg gasa;

- Temperatura kolone i

- Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze.

Činioci koji se odnose na hemijska i fizička svojstva analita i stacionarne faze, kao

i brzinu protoka nosećeg gasa, su detaljno razmatrani u prethodnim poglavljima (1.2.2.;

4.4.1. i 4.4.3.). U ovom poglavlju će biti razmatran uticaj temperaturnog režima i

karakteristika kolone na gasno-hromatografsku analizu.

4.4.4.1. Temperatura kolone

Izbor temperature kolone zavisi od termičke stabilnosti njene tečne stacionarne

faze i od osobina jedinjenja koja se razdvajaju. Minimalnu i maksimalnu temperaturu na

kojoj se može koristiti kolona daje proizvođač i u ovom opsegu temperatura kolona ima

optimalne karakteristike. Zagrevanje preko maksimalne temperature dovodi do

termičke degradacije polimera stacionarne faze, isparavanja i eluiranja stacionarne faze

- curenja kolone. Rad na nižoj temperaturi od minimalne preporučene temperature,

znatno smanjuje efikasnost kolone, zbog toga što su viskoziteti tečnih faza na tim

temperaturama veliki, neke mogu preći i u čvrsto agregatno stanje. Postoje dve vrste

temperaturnih režima: izotermalni - konstantna temperatura kolone i programirani -

temperatura se linearno podiže.

Raspodela analiziranog jedinjenja između tečne i gasovite faze veoma zavisi i od

temperature. Koeficijent raspodele se porastom temperature kolone za 30 °C smanjuje

za polovinu u najvećem broju slučajeva. Kao posledica povećanja temperature dolazi do

bržeg eluiranja supstanci sa kolone, smanjivanja njihovih retencionih vremena i

smanjivanja širine bazne linije pika, što je prikazano na Slici 4.34. Sa povećanjem

temperature smanjuje se i razlika u retencionim vremenima, odnosno opada i stepen

razdvajanja i potrebno je za svaku analiziranu smešu odabrati kompromisnu

temperaturu koja će obezbediti dobro razdvajanje, sa uskim pikovima za kratko vreme.


78

Optimalna radna temperatura kolone zavisi od niza faktora od kojih su najvažniji: tačke

ključanja analiziranih komponenti, njihova polarnost, polarnost tečne faze, debljina

filma tečne faze i dužina kolone.

a) T = 100 °C, izotermalno, širina pika(2) 1,4 minuta b) T = 130 °C, izotermalno,

širina pika(2) 0,5 minuta

Slika 4.34. Hromatogrami smeše hromatografisane pod istim uslovima na dve različite

temperature pri izotermalnom režimu

Izotermalni temperaturni režim se primenjuje na smeše jedinjenja čije se tačke

ključanja i polarnosti nalaze u relativno uzanim opsezima. Kod razdvajanja smeša u

kojima postoji širok opseg tačak ključanja, pod izotermalnim uslovima će najisparljivija

jedinjenja da se eluiraju isuviše brzo, a najmanje isparljiva suviše sporo.

Programirani temperaturni režim podrazumeva linerano povećavanje temperature

kolone nakon ubrizgavanja uzorka. Najčešće se primenjuje linearno programiranje

temperature. Temperatura se od početne postepeno povećava do zadate temperature

određenom brzinom, na primer 5 °C / min. Primenjuje se i multilinearno programiranje,

temperatura se od početne do prve zadate temperature linearno povećava određenom

brzinom, na toj temperaturi kolona ostaje određeno vreme, a zatim linearno povećava

do druge zadate temperature brzinom koja može biti ista ili različita sa prvom brzinom.

Primena programiranja temperature ima mnogo prednosti u odnosu na izotermalni

režim od kojih su najvažnije sledeće:

- Znatno kraće vreme analize;

- Podjednako dobro razdvajanje komponenti sa niskim i visokim tačkama ključanja;

- Ujednačene širine osnova pikova i

- Minimalno zaostajanje komponenti sa visokim tačkama ključanja na koloni.


79

4.4.4.2. Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze

Dužina kolone je direktno proporcionalna efikasnosti, odnosno broju teorijskih

podova. Hromatografisanje na dužim kolonama daje bolju rezoluciju, međutim, udvostručena

1,4, dok su troškovi i vreme analize

proporcionalni dužini kolone. Uticaj dužine kolone na rezoluciju i retenciono vreme

prikazan je na Slici 4.35. Rutinska razdvajanja e sa kolonama dužine 25

ili 30 m, dok se za razdvajanja složenih smeša koriste duže kolone 50 ili 60 m.

Kapilarne kolone se proizvode sa unutrašnjim prečnicima od 0,1 do 0,530 mm.

Što je manji prečnik kolone veći je broj teorijskih podova po metru kolone ali je manji

kapacitet. Uticaj unutrašnjeg prečnika kolone na rezoluciju prikazan je na Slici 4.36.

Najčešće se koriste kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,25 mm. Kolone sa većim

prečnicima od 0,32 i 0,53 mm se koriste za rutinske analize jednostavnijih smeša i lako

isparljivih jedinjenja, kao i koncentrovanijih uzoraka jer imaju veći kapacitet.

Slika 4.35. Uticaj dužine kolone na

rezoluciju i retenciono vreme

r = 0,53 mm r = 0,32 mm

Slika 4.36. Uticaj unutrašnjeg prečnika

kolone na rezoluciju

Debljina filma u GC kapilarnim kolonama se kreće od 0,1 do 5,0 µm. Standardna

debljina filma je 0,25 µm. Tanki filmovi (0,1 - 0,2 µm) su veoma pogodni za razdvajanje

jedinjenja sa visokim tačkama ključanja ili nestabilnih jedinjenja, za razdvajanje

supstanci sa vrlo sličnim osobinama (sa bliskim retencionim vremenima) i brza

razdvajanja. Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne

faze prikazana je na Slici 4.37. Sa p anjem debljine filma se ava kapacitet

kolone, povećavaju se retenciona vremena jedinjenja sa niskim tačkama ključanja i

poboljšava inertnost. Veća debljina filma takođe znači više stacionarne faze u koloni, a

samim tim i e curenje. Ovo rezultira nižim maksimalnim radnim temperaturama za

kolone sa debljim filmovima.


80

Debljina filma

0,25 µm

Debljina filma

1,00 µm

Slika 4.37. Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne faze

4.4.5. Kvalitativna gasnohromatografska analiza

Danas se kvalitativna gasnohromatografska analiza radi najčešće korišćenjem

GC/MS metode gde gasni hromatograf služi da razdvoji komponente smeše, a maseni

spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti. Poređenjem masenih

spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih jedinjenja vrši se

identifikacija nepoznatih komponenti smeše. Svi sistemi gasni hromatograf - maseni

spektrometar danas se isporučuju sa bibliotekom masenih spektara velikog broja

jedinjenja u elektronskom obliku. Osim toga, komercijalno su dostupne biblioteke

masenih spektara u elektronskom obliku, kao i programi za njihovo korišćenje,

odnosno brzu pretragu i poređenje. U slučaju analize jednostavnijih smeša i dobrog

preklapanja dobijenih masenih spektara sa literaturnim, maseni spektar je dovoljan za

identifikaciju jedinjenja prisutnih u smeši.

Međutim, kod analiza složenih smeša koje sadrže komponente sa sličnim

retencionim vremenima i gde nije postignuta najbolja rezolucija, dobijeni maseni spektri

mogu biti značajno različiti od literaturnih i onda je neophodno koristiti i retencione

parametre za identifikaciju komponenti smeše. Svi retencioni parametri su detaljno

opisani u Poglavljima 1.2.1 i 4.1. Retenciono vreme nekog jedinjenja zavisi od njegovih

fizičko - hemijskih osobina i uslova hromatografisanja i, ako su uslovi hromatografisanja

identični, predstavlja karakterističnu veličinu za neko jedinjenje. Kako retenciono

vreme zavisi od velikog broja spoljašnjih faktora, uslova hromatografisanja, koje jako

teško kontrolisati, koriste se podešeno retenciono vreme, korigovano retenciono vreme

i relativno retenciono vreme. Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog

vremena posmatrane komponente i retencionog vremena standarda:

t'rk = trk / trs

gde je trk - retenciono vreme komponente, a trs - retenciono vreme standarda.


81

Kao standard se obično koristi sastojak smeše sa najmanjim retencionim

vremenom. Na relativno retenciono vreme, od spoljašnjih činilaca, utiču samo

temperatura kolone i vrsta tečne stacionarne faze. Zbog jednostavnog određivanja i

visoke reproduktivnosti, relativno retenciono vreme se najčešće koristi u kvalitativnoj

analizi. Kombinacijom podataka o retencionim parametrima i literaturnih masenih

spektara dolazi se do nedvosmislene identifikacije nepoznatog jedinjenja.

4.4.6. Kvantitativna gasnohromatografska analiza

Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet

gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog

jedinjenja. Najednostavniji način za određivanje koncentracije datog jedinjenja bio bi merenje

površine pika i deljenjem te površine sa zbirom površina svih pikova. Međutim, ovakav

način određivanja koncentracije je povezan sa mnogim ograničenjima od kojih su

najčešća:

- Različite osetljivosti detektora na različita jedinjenja.

- Smanjenje intenziteta ili potpuno odsustvo pika usled trajnog zadržavanja pojedinih

jedinjenja na koloni ili termičkog razlaganja u isparivaču ili koloni.

- Način uzimanja uzorka i način injektovanja.

4.4.6.1. Metoda normalizacije površina

Metoda normalizacije površina je najbrža i najednostavnija metoda za

određivanje procentnog sastava analizirane smeše. Danas se hromatografi prodaju sa

računarima koji služe za obradu podataka. Ovi računari su snabdeveni programima za

izračunavanje površina pikova i izračunavanje procenata svake površine pika u smeši.

Greške do kojih može doći zbog različitih osetljivosti detektora na različita jedinjenja

mogu biti svedene na minimum korišćenjem računarskih programa sa korekcionim

faktorima koji su komercijalno dostupni i isporučuju se sa aparatom. Ovi programi

omogućavaju i eliminciju pikova koji potiču od rastvarača (znatno veći od ostalih

pikova) i eventualno prisutnih nečistoća (priprema uzorka, curenje kolone i slično).

4.4.6.2. Metoda internog standarda

Metoda internog standarda je najpreciznija metoda za kvantitativnu analizu i

podrazumeva prethodnu pripremu kalibracionih krivih za svako jedinjenje čija se

koncentracija određuje. Kalibraciona kriva se pravi hromatografisanjem standardnih

rastvora koji sadrže različite masene odnose jedinjenja koje se određuje i standarda.

Obično se rastvori prave tako što se odmerava ista masa standarda za sve rastvore i


82

različite mase ispitivane supstance. Standardni rastvori se hromatografišu pod istim

uslovima, određuju se površine pikova PA i PS, a kalibraciona kriva (za jedinjenje A)

konstruiše se nanošenjem količnika PA / PS u zavisnosti od mA (Slika 4.38).

Jedinjenje koje se koristi kao interni standard mora da zadovolji sledeće uslove:

- Da se dobro rastvara u analiziranoj smeši i da bude hemijski slično komponentama

koje se određuju;

- Da bude hemijski inertno u odnosu na sastojke smeše i stacionarnu fazu kolone;

- Njegov pik ne sme da se preklapa ni sa jednim iz analizirane smeše, ali je poželjno da

ima retenciono vreme blisko retencionim vremenima komponenti;

- Mora da postoji pouzdan podatak da to jedinjenje ne može da se pojavi u prirodnom

uzorku (kod analize metil estra masnih kiselina kao interni standard se uzima metil

estar masne kiseline sa neparnim brojem ugljenikovih atoma, zbog toga što se

biosintezom uvek dobijaju masne kiseline sa parnim brojem ugljenikovih atoma).

Slika 4.38. Kalibraciona kriva za jedinjenje A

Posle konstruisanja kalibracione krive, u uzorak se dodaje odmerena količina

standarda, ista kao u standardnim rastvorima za pravljenje kalibracione krive. Uzorak

se zatim hromatografiše na isti način kao i standardni rastvori. Mere se površine pikova

standarda i jedinjenja koje se određuje i na osnovu njihovog količnika određuje masa

supstance jedinjenja koje se određuje - crvena linija na slici 4.38. Kalibraciona kriva se

pravi za svako jedinjenje čija se koncentracija određuje. Dobra strana metode je što

promena uslova hromatografisanja (temperatura kolone, detektora i injektora, kao i

protok nosećeg gasa) ne utiču bitno na tačnost rezultata, odnosno na sličan način utiču i

na standard i na analizirano jedinjenje. Metoda je veoma tačna i nije neophodno da se u

gasni hromatograf uvek injektuju iste zapremine.

Ako se ova metoda koristi za određivanje malih koncentracija, kao što su tragovi

pesticida u hrani, tragovi veterinskih lekova u animalnim proizvodima, biomedicinske

analize itd., potrebno je prethodno prečišćavanje uzorka. Prethodno prečišćavanje

uzorka podrazumeva nekoliko koraka: ekstrakciju, hromatografiju na koloni ili


83

tankoslojnu hromatografiju i derivatizaciju. Kod svakog od ovih koraka može doći do

gubitaka supstance koja se određuje. Da bi se ovi gubici kompenzovali, interni standard

se dodaje u smešu koja se analizira pre prečišćavanja. Na taj način su praktično

približno jednaki gubici i internog standarda i analizirane supstance, tako da se njihov

maseni odnos praktično ne menja.

4.4.6.3. Metoda standardnog dodatka

Za analizu malih koncentracija supstanci bez prethodnog prečišćavanja uzorka,

na primer alkohola u krvi, koristi se metoda standardnog dodatka. Vrlo je često da se

pik primese čija se koncentracija određuje nalazi na repu signala glavne komponente.

Kod ove metode, tačno odmerena, uvek ista zapremina uzorka se više puta

hromatografiše pod istim uslovima i odredi srednja visina pika jedinjenja koje se

određuje (h1). Zatim se u uzorak doda tačno odmerena količina supstance koja se

određuje (najbolje približno jednaka količini supstance u uzorku) i ponovo više puta

hromatografišu iste zapremine pod istim uslovima i odredi srednja visina pika (h2). Na

osnovu razlike u visini pikova h2 i h1, dobija se visina (h) koja je proporcionalna količini

dodatog standarda i na osnovu te visine se određuje količina supstance:

a = h1 x b / h

gde je:

a - količina supstance koja se određuje

b - odmerena količina supstance koja se određuje.

4.4.7. Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji

Cilj ovih reakcija je prevođenje neisparljivih jedinjenja u stabilne isparljive

derivate pogodne za hromatografisanje, kao i za snimanje masenih spektara. Pored toga,

promena retencionog vremena izazvana derivatizacijom, često omogućava i identifikaciju

funkcionalnih grupa u nepoznatom jedinjenju. Svaka hemijska reakcija koja se koristi za

derivatizaciju mora da zadovolji sledeće uslove:

- Velika brzina reakcije;

- Kvantitativan prinos reakcije;

- Blagi reakcioni uslovi;

- Minimum sporednih proizvoda;

- Termička stabilnost nagrađenog derivata i

- Jednostavna obrada reakcione smeše pre hromatografisanja.

Najčešće se derivatizuju jedinjenja koja sadrže aktivne vodonikove atome vezane

za azot ili kiseonik, kao što su: karboksilne kiseline, alkoholi, fenoli, ugljeni hidrati,


84

amini i amino kiseline. Osim njih derivatizuju se i jedinjenja velike molekulske mase sa

polarnim grupama, kao što su amidi i steroidi.

Danas je komercijalno dostupan veliki broj reagenasa za brzu derivatizaciju

glavnih funkcionalnih grupa. Ovi reagensi su dostupni kao pojedinačni ili kao kompleti

za derivatizaciju više funkcionalnih grupa ili više reagenasa za derivatizaciju jedne

funkcionalne grupe (na primer kit-ovi za derivatizaciju masnih kiselina). U Tabeli 4.3. su

prikazane najčešće metode za derivatizaciju funkcionalnih grupa, nagrađeni derivati i

komercijalni nazivi reagenasa. Strukture i imena reagenasa za derivatizaciju nalaze se u

Tabeli 4.4.

Tabela 4.3. Derivatizacija funkcionalnih grupa

Klasa jedinjenja Metod Derivat Komercijalni reagensi

Alkoholi Sililovanje RO – TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TSIM, SILYL‑2110,

SILYL-21, SILYL-1139

Fenoli Acilovanje

Alkilovanje

Sililovanje

RO – CO – R

RO – R

RO – TMS

TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA

TMSH

TSIM, BSTFA, SILYL-991

Amini (prim. i

sekundarni)

Hidrohloridi

Sililovanje

Acilovanje

Sililovanje

R–NR’– TMS

R–NR’–CO– R

R – NR’ –TMS

BSA, MSTFA, MSHFBA, SILYL-991

TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA

MSTFA

Amidi Acilovanje R’–CO–NH-CO – R TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA

Amino kiseline Sililovanje

BSA, BSTFA, MSTFA, MSHFBA

Alkilovanje

MeOH/TMCS, TMSH

Acilovanje TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA

Masne kiseline

Sililovanje R–CO–O –TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TMCS, TSIM,

SILYL-2110, SILYL-21

Alkilovanje R’ – CO – O – R DMF-DMA, MeOH/TMCS, TMSH

Soli masnih k. Sililovanje R–CO–O – TMS TMCS

Ugljeni hidrati Sililovanje

Acilovanje

- MSTFA, TSIM, HMDS, SILYL-1139

TFAA, MBTFA

Steroidi Sililovanje

Acilovanje

- BSA, TSIM

TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA


85

Tabela 4.4. Reagensi za derivatizaciju

Komercijalno ime Formula Hemijsko ime

BSA

N,O-bis(trimetilsilil)acetamid

MSTFA

N-Metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamid

MSHFBA

N-Metil-N-trimetilsililheptafluorobutilamid

TSIM

N-Trimetilsilil-imidazol

SILYL-2110

HMDS

TCMS

Heksametildisilazan (HMDS) –

trimetilhlorsilan(TMCS) – piridin 2:1:10

SILYL-21 Heksametildisilazan (HMDS) –

trimetilhlorsilan(TMCS) 2:1

SILYL-1139

N-Trimetilsilil-imidazol (TSIM) – piridin 11:39

SILYL-991

N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid(BSTFA)–

trimetilhlorosilan (TMCS) 99:1

BSFTA N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid

TFAA

Anhidrid trifluorosirćetne kiseline

HFBA

Anhidrid heptafluorobutanske kiseline

MBTFA

N-Metil-bis(trifluoroacetamid)

MBHFBA

N-metil-bis(heptafluorobutilamid)

TMSH

Trimetilsulfonijum-hidroksid

TMCS

Trimetilhlorosilan

DMF-DMA

1,1-Dimetoksi-N,N-dimetilmetilamin


86

4.5. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih

i prehrambenih proizvoda

Gasna hromatografija ima veoma široku primenu u analizi hrane. Veliki broj

gasnohromatografskih metoda je standardizovan i rutinski se koristi u analizi hrane.

Spisak standarnih gasnohromatografskih metoda koji se koriste u analizi hrane je

veoma dugačak i prevazilazi okvire ovog rukopisa. Gasna hromatografije se koristi za

analizu, kako osnovnih sastojaka hrane, tako i za analizu kontaminanata koji u hranu

dospevaju na različite načine. Značajnu primenu gasna hromatografija ima i u analizi

aromatskih kopleksa pojedinih prehrambenih proizvoda kao što su: sir, vino, pivo, neki

proizvodi od mesa kojima se dokazuje autentičnost, odnosno geografsko poreklo ovih

proizvoda. O primeni ove metode bilo je reči i u prethodnim poglavljima koja se odnose

na kolone i detektore.

Gasnohromatografske metode u analizi hrane možemo podeliti u dve osnovne

grupe: metode za određivanje prirodnih sastojaka hrane i metode za određivanje

toksičnih supstanci u hrani dospelih zagađivanjem hrane.

U prvu grupu spadaju metode za određivanje masnih kiselina, koje se pre određivanja

prevode u odgovarajuće derivate, vidi Tabelu 4.3. U ovu grupu spadaju i metode za

određivanje aromatičnih materija u hrani, kao i materija koje utiču na ukus hrane.

U drugu grupu spadaju metode za određivanje toksičnih materija koje na

različite načine mogu da dospeju u hranu. Sigurno su najvažnije metode za određivanje

pesticida u hrani, polihlorovanih bifenila (PCB), polihlorovanih dibenzo-p-dioksina i

dibenzofurana, policikličnih aromatičnih ugljovodonika (PAH), akrilamida, ftalata,

estara adipinske kiseline itd. Veliki broj toksina se pre određivanja prevodi u

odgovarajuće derivate, kao na primer: veterinarski lekovi, mikotoksini, hloropropanoli,

heterociklični amini, epoksi jedinjenja itd.

Danas se sve više unapređuju osobine gasnohromatografskih kolona, pomeraju

granice osetljivosti detektora, razvijaju i koriste metode kuplovanih tehnika kao što su

GC/GC/MS, GC/MS/MS itd. Sve ovo omogućava razdvajanje i određivanje velikog broja

supstanci iz najrazličitijih supstrata u veoma niskim koncentracijama. Oblast primene

gasne hromatografije u analizi hrane i, uopšte, u analitičkoj hemiji se svakodnevno

proširuje.

Rezime poglavlja

U gasnoj hromatografiji (GC) mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta (GSC)

ili tečna (GLC). Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih

derivata,

, kliničkoj hemiji i


87

brojnim drugim oblastima. Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su: visoka

rezolucija, brzina, osetljivost, preciznost i tačnost.

Osnovne komponente gasnog hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom,

regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona,

termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač.

Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za

što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i dobru

razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od: hemijskih i fizičkih svojstava analita

i stacionarne faze, temperature i karakteristika kolone.

Kvalitativna gasnohromatografska analiza se radi najčešće korišćenjem metode

gasna hromatografija - masena spektrometrija, gde gasni hromatograf služi da razdvoji

komponente smeše, a maseni spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti.

Poređenjem masenih spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih

jedinjenja vrši se identifikacija nepoznatih komponenti smeše.

Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet

gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog

jedinjenja. Površina pika, osim od koncentracije, zavisi i od mnogih drugih faktora. Iz tog

razloga koncetracije analiziranih supstanci se određuju: metodom normalizacije površina,

metodom internog standarda i metodom standardnog dodatka.


1. Koja su tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u

koloni? Objasniti kako dolazi do širenja zona.

2. Objasniti split i splitless režim injektovanja. Koje su prednosti, a koji nedostaci

ovih načina injektovanja? U kojim slučajevima se koristi split, odnosno splitless

režim?

3. Šta je statični, a šta dinamični headspace?

4. Koji su najvažniji zahtevi koje čvrsti nosač treba da zadovolji kod pakovanih

kolona?

5. Koje kriterijume treba da zadovolji stacionarna faza?

Literatura




88

3. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry – A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, 1996.

4. S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication®, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, 1998.

5. R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 2, Library4science, 2003.

6. R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 4,

Library4science, 2003.



9. E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of

Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library – Volume 69A, Elsevier, Amsterdam, 2004.

10. F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2007.

11. R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry,

John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2008.

12. S. Ötles (Ed.)¸ Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, 2009.

13. O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass

Spectrometry – A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, 2011.

14. Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA, 2014.

89

5. Tečna hromatografija visokih performansi – HPLC

Cilj poglavlja

Upoznavanje sa principom rada tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i

osnovnim delovima HPLC sistema. Upoznavanje sa kvalitativnim i kvantitativnim

određivanjem jedinjenja primenom HPLC tehnike, kao i sa različitim režimima

razdvajanja - na osnovu polarnosti, naelektrisanja i veličine molekula. Opis afinitetne

hromatografije kao najspecifičnijeg oblika visokoefikasne tečne hromatografije. Prikaz

primene HPLC tehnike u analizi prehrambenih proizvoda.

5.1. Uvod u HPLC

Tečna hromatografija (engl. Liquid Chromatography, LC), je tehnika

hromatografskog razdvajanja kod koje je mobilna faza tečnost. Tečna hromatografija

može biti planarna (hromatografija na papiru ili tankom sloju) ili hromatografija u

koloni. Moderna tečna hromatografija, kod koje se koriste manje čestice za pakovanje

kolona i veći pritisci u koloni naziva se tečnom hromatografijom visokih performansi. Za

tečnu hromatografiju visokih performansi, koja se ranije označavala kao tečna

hromatografija pod visokim pritiskom, odomaćena je skraćenica HPLC, koja predstavlja

akronim od High-Performance (pressure) Liquid Chromatography (engl.). Od 2004.

godine, tečna hromatografija ultra performansi, UPLC (engl. Ultra-Performance Liquid

Chromatography), dramatično je podigla mogućnosti tečne hromatografije na još viši

nivo.

Kao što je već pomenuto, tehniku tečne hromatografije je definisao ruski

botaničar Mihail Cvet početkom dvadesetog veka, kada je razdvojio pigmente iz listova

biljaka, nanoseći ekstrakt na kolonu pakovanu kalcijum-karbonatom i zatim

propuštajući rastvarač, što je dovelo do pojave traka različitih boja, usled različite

brzine kretanja komponenti ekstrakta kroz kolonu, Slika 5.1. Cvet je povezao te

razdvojene, obojene trake sa različitim jedinjenjima koja su bila prisutna u ekstraktu

pigmenata. Analitičko razdvajanje pigmenata zasnivalo se na različitoj jačini vezivanja

svakog pojedinačnog jedinjenja za čestice pakovane kolone. Jedinjenja koja su bila jače

vezana kretala su se sporije, dok su se jedinjenja koja su bila slabije vezana kretala brže

kroz kolonu. Ovaj proces se može opisati na sledeći način: jedinjenja koja sadrži uzorak

raspodeljuju se između rastvarača koji se kreće, i označava se kao mobilna faza, i čestica

kojima je punjena (tj. pakovana) kolona, i koje se označavaju kao stacionarna faza. Ovo

omogućava da se svako pojedinačno jedinjenje kreće različitom brzinom, što vodi

razdvajanju jedinjenja određene smeše. Kovanicu hromatografija predložio je Cvet

(hroma – boja i graphein – pisati), da bi opisao svoj eksperiment. Zanimljivo, prezime

Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC

90

ovog naučnika, Cvet (рус. Цвет), na ruskom znači boja. U današnje vreme, tečna

hromatografija, u svojim različitim oblicima, je postala jedna od najmoćnijih metoda u

analitičkoj hemiji.

Slika 5.1. Eksperiment M. Cvet-a

5.2. Tehnike tečne hromatografije

Tečna hromatografija može biti planarna (hromatografija na tankom sloju ili na

papiru) ili hromatografija na koloni. Kod svih ovih tehnika, uzorak se najpre mora

rastvoriti a zatim naneti na/u uređaj za hromatografisanje. Na primeru razdvajanja

smeše FD&C boja, koje se koriste u prehrambenoj industriji, prikazan je dalje u tekstu

princip hromatografije na tankom sloju, papiru i u koloni.

Kod hromatografije na tankom sloju (engl. thin-layer chromatography, TLC)

uzorak se kreće kroz tanki sloj čestica (stacionarna faza) koje su fiksirane na površini

staklene ploče (Slika 5.2). Donja ivica ploče je smeštena u rastvarač. Do protoka

rastvarača dolazi zahvaljujući kapilarnim silama, kada rastvarač (mobilna faza)

difunduje u tanki sloj suvih čestica i “penje se” uz staklenu ploču. Obratite pažnju da je

crni uzorak (Slika 5.2, levo) smeša FD&C žute, crvene i plave boje koje se koriste u

industriji hrane i koja se hromatografski razdvaja (Slika 5.2, desno).

Kod hromatografije na papiru, uzorak se nanosi na papir (nosač stacionarne

faze), a rastvarač se zatim nanosi na centar mrlje (tj. uzorka), da bi se postigao spoljašnji

radijalni protok. Ovo je jedan od oblika hromatografije na papiru. Klasična papirna

hromatografija se izvodi na način sličan opisanoj hromatografiji na tankom sloju, sa

Ekstrakt

biljaka


91

linearnim tokom tečnosti. Na Slici 5.3 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C

boja papirnom hromatografijom.

Slika 5.2. Tankoslojna hromatografija – razdvajanje FD&C boja za industriju hrane

Očigledna je razlika u moći razdvajanja ove vrste papirne hromatografije i

hromatografije na tankom sloju. Zeleni prsten ukazuje da se ovom tehnikom ne mogu

razdvojiti žuta i plava boja jedna od druge, ali se ove boje mogu odvojiti od crvenih boja

(vrh Slike 5.3). Na dnu Slike 5.3, zeleni uzorak, koji čine žuta i plava boja, nanesen je na

papir. Kao što se može videti, ove dve boje se ne mogu razdvojiti primenjenom

tehnikom. U sredini Slike 5.3, ljubičasti uzorak, koji čine crvena i plava boja, nanesen je

na papir. Očigledno je da se ove boje mogu razdvojiti primenjenom tehnikom

hromatografije na papiru.

Slika 5.3. Hromatografija na papiru – razdvajanje FD&C boja za industriju hrane

Kadica za

analizu

Rastvarač Rastvarač

Nulto vreme Posle 10 minuta

Žuta 5

Plava 1 / Žuta 5

Crvena

40Crvena 3

Crvena 40

Plava 1

Plava 1 / Žuta 5

Opaska: ovaj papir ne

može da razdvoji plavu

od žute boje, pa se one

pojavljuju kao zelena!


92

Kod hromatografije u koloni uzorak prolazi kroz kolonu (ili kertridž – engl.

cartridge), koja sadrži odgovarajuče čestice (stacionarna faza). Te čestice se još nazivaju

materijal za pakovanje hromatografske kolone. Rastvarač (mobilna faza) teče, tj. kreće

se kroz kolonu i pri tome struja rastvarača nosi uzorak kroz kolonu. Kao i u Cvet-ovom

eksperimentu, jedinjenja iz uzorka se razdvajaju zahvaljujući različitim brzinama

putovanja kroz kolonu. Na Slici 5.4 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C

boja primenom ekstrakcije čvrstom fazom (engl. Solid-Phase Extraction, SPE). U tehnici

ekstrakcije čvrstom fazom koristi se uređaj za hromatografisanje koji se zove kertridž,

obično uz protok rastvarača pod dejstvom sniženog pritiska. Ekstrakcija čvrstom fazom

koristi se da bi se analizirale ili prečistile veoma kompleksne smeše pre njihovog daljeg

ispitivanja. Kao što je prikazano na Slici 5.4, različiti rastvarači su korišćeni u svakom

pojedinačnom koraku da bi se postiglo razdvajanje smeše FD&C boja.

Kada se koristi oblik kertridža, postoji nekoliko načina da se postigne

odgovarajući protok rastvarača. Gravitacija ili vakuum se koriste za kolone koje nisu

dizajnirane da izdrže povišeni pritisak. Čestice su u tom slučaju većeg promera (> 50

mikrona), tako da pružaju manji otpor proticanju rastvarača. Za prečišćavanje i

pripremu uzoraka takođe mogu da se koriste i male plastične kolone, koje imaju oblik

šprica, i koje su napunjene odgovarajućim materijalom za pakovanje.

Čestice manjih dimenzija (<10 mikrona) su potrebne da bi se povećala moć

razdvajanja. Međutim, manje čestice daju veći otpor protoku tečne faze, pa su potrebni

viši pritisci da bi se dobila odgovarajuća brzina proticanja rastvarača. Tada su potrebne

pumpe i kolone dizajnirane tako da mogu da proizvedu i izdrže visok pritisak. Ako se

primenjuju umereno visoki do visokih pritisaka da bi rastvarač tekao kroz

hromatografsku kolonu, tada se hromatografska tehnika naziva HPLC.

Slika 5.4. Hromatografija na koloni (ekstrakcija čvrstom fazom) – razdvajanje FD&C

boja za prehrambenu industriju

Eluiranje

Stupanj 1

Eluiranje

Stupanj 2

Eluiranje

Stupanj 3

Opaska: plava boja se

može eluirati smešom

izopropilalkohol/voda

Jedan kertridž može da razdvoji sve tri boje

Nanošenje

uzorka


93

5.3. Šta je HPLC?

Akronim HPLC, predložen od strane prof. Horváth-a 1970. godine, pre svega je

ukazivao na činjenicu da se u tečnoj hromatografiji, kada se primenjuju pakovane

kolone, koristi visok pritisak da bi se omogućio protok rastvarača. U početku, pumpe su

imale sposobnost da proizvedu pritisak od 500 psi (35 bar). Takva tehnika je označena

kao tečna hromatografija pod visokim pritiskom, HPLC (engl. High-Pressure Liquid

Chromatography). Početkom 1970. godine dolazi do ogromnog tehnološkog napretka,

pa su novi HPLC instrumenti mogli da razviju pritisak do 6000 psi (400 bar) i uključivali

su unapređene i poboljšane injektore, detektore i kolone. Sa daljim poboljšanjem

performansi instrumenata (manje čestice za pakovanje kolona, još viši pritisci), akronim

HPLC ostaje isti, ali se naziv menja u tečna hromatografija visokih performansi (engl.

High-Performance Liquid Chromatography).

Tečna hromatografija visokih performansi je danas jedna od najmoćnijih tehnika

u analitičkoj hemiji. Ona pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog

određivanja jedinjenja koja su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u

tečnosti. Danas, jedinjenja u tragovima, čija je koncentracija reda veličine parts per

trillion (ppt), mogu lako da se identifikuju uz pomoć tečne hromatografije visokih

performansi. HPLC može da se primeni na skoro svaki uzorak, kao što su lekovi,

prehrambeni proizvodi, kozmetika, uzorci iz životne sredine, forenzički uzorci i

industrijske hemikalije.

HPLC je brza tehnika kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska;

zatim veoma efikasna tehnika za razdvajanje, zahvaljujući česticama malih dimenzija kojima

se pune kolone, a koje imaju veliku specifičnu površinu za interakcije između stacionarne

faze i molekula koji se razdvajaju; i takođe osetljiva tehnika kod koje se detektuju

veoma male koncentracije analita.

Značajna karakteristika HPLC metode jeste ta da je često pogodna za analizu

organskih jedinjenja koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasno-

hromatograsku analizu bez prethodne derivatizacije. Broj publikovanih HPLC metoda je

danas toliko veliki da se pretraživanjem literature mogu pronaći hromatografski uslovi

za skoro bilo koju vrstu jedinjenja. U analizi hrane, HPLC se primenjuje za nekoliko

kategorija jedinjenja: ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive, sintetičke boje, prirodne

pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide), aminokiseline i druga jedinjenja.

Od 2004. godine dalji napredak u tehnologiji izrade instrumenata i kolona doveli

su do značajnog povećanja rezolucije, brzine i osetljivosti tečne hromatografije. Kolone

sa još manjim česticama (1,7 mikrona) i instrumenti dizajnirani za rad na pritiscima od

15000 psi (1000 bar) potrebni su da se postigne novi nivo mogućnosti u tzv. tečnoj

hromatografiji ultra performansi (engl. Ultra-Performance Liquid Chromatography,

UPLC).

Osnovna istraživanja se danas izvode i sa kolonama koje sadrže čestice koje su

prečnika manjeg od 1 mikrona, i instrumentim sposobnim da rade na pritiscima od


94

100000 psi (6800 bar). Ovi podaci nam pružaju dovoljno informacija o onome što

možemo očekivati u budućnosti.

5.4. Princip rada tečne hromatografije visokih performansi

Pod principom rada HPLC-a podrazumeva se forsiranje prolaska analizirane

supstance (ili smeše) kroz kolonu, odnosno cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a

time i velike površine, pri čemu se tečnost (mobilna faza) pumpa pod visokim pritiskom

kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih

hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smeše na

koloni. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne

faze i sastava mobilne faze. Vreme za koje se supstanca eluira, tj. dođe do kraja kolone

(drugim rečima vreme koje provede u stacionarnoj fazi) naziva se redukovano

retenciono vreme i ono je karakteristično za određenu supstancu (Poglavlje 1.2.).

Korišćenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje jedinjenjima manje vremena

za zadržavanje na koloni, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni

rastvarači, čisti ili kao smeše (npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd). Voda može

sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i

gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja.

5.5. Osnovni delovi HPLC sistema

Osnovni delovi HPLC sistema su prikazani na Slici 5.5. U rezervoaru se nalazi

rastvarač, tj. mobilna faza. Pumpa za proizvodnju visokog pritiska (sistem za “isporuku”,

tj. “raznošenje” rastvarača) se koristi za generisanje i održavanje specifičnog protoka

mobilne faze, koji je obično reda veličine mililitar po minuti. Injektor (sistem za

upravljanje uzorcima) služi za uvođenje, tj. injektovanje (engl. inject) uzorka u

kontinualni tok mobilne faze koja ga nosi u HPLC kolonu. Kolona je napunjena česticama

hromatografskog materijala, koji je neophodan da bi došlo do razdvajanja komponenti

unetog uzorka. Materijal kojim je pakovana kolona se naziva stacionarnom fazom.

Kolona je smeštena u termostatu koji održava temperaturu kolone konstantnom u toku

analize, što je veoma značajno jer promena temperature utiče na raspodelu ispitivanog

jedinjenja između stacionarne i mobilne faze, kao i na njegovu rastvorljivost i viskoznost

mobilne faze.

Detektor je neophodan da se vide trake razdvojenih jedinjenja nakon što se ona

eluiraju sa HPLC kolone. Mobilna faza zatim napušta detektor i može biti poslata u

otpad, ili po želji prečišćavana.

Cevi i ostali delovi opreme koja se koristi za povezivanje pumpe, injektora,

kolone i detektora, da bi se omogućio nesmetani protok mobilne faze i uzorka, izrađeni

su od materijala koji može da podnese visok pritisak.

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%BC%D0%B5%D1%88%D0%B5

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B2%D0%B0%D1%80%D0%B0%D1%87

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B5%D1%82%D0%B0%D0%BD%D0%BE%D0%BB

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D1%83%D1%84%D0%B5%D1%80


95

Slika 5.5. Schema sistema za tečnu hromatografiju visokih performansi - tečnog

hromatografa

Legenda : (1) Rezervoari rastvarača, (2) Uređaj za degaziranje rastvarača, (3) Gradijentni ventil,

(4) Posuda za mešanje i isporuku mobilne faze, (5) Pumpa za proizvodnju visokog pritiska, (6)

Injekcioni ventil u poziciji za injektovanje, (6') Injekcioni ventil u poziciji za “punjenje” (engl.

load position), (7) Petlja za injektovanje uzorka, (8) Pretkolona, (9) Analitička kolona, (10)

Detektor, (11) Kompjuter - obrada podataka, (12) Kolektor za otpad ili frakcioni kolektor.

Detektor je povezan sa kompjuterom koji obrađuje dobijene podatke. Detektor

beleži i obrađuje električni signal potreban za generisanje hromatograma na ekranu.

Hromatogram omogućava identifikaciju i kvantitativno određivanje koncentracije

pojedinačnih jedinjenja u analiziranoj smeši (Slika 5.5).

5.5.1. Injektor

Injektor predstavlja deo HPLC sistema putem koga se uzorak uvodi u kolonu.

Injektovanje je jedan od kritičnih momenata HPLC analize. Ako se injektovanje ne izvodi

pažljivo, čak i najbolja kolona može da da loše rezultate razdvajanja. U teoriji, veoma

mala zapremina uzorka treba da se uvede u centar vrha kolone, vodeći računa da se

spreči ulaženje vazduha u isto vreme.

Postoji više načina da se uzorak injektuje: pomoću šprica i septuma, pomoću

injekcionog ventila sa petljom ili pomoću automatskog sistema za injektovanje, tj.

autosemplera (engl. autosampler). Mada je injektovanje kroz septum na vrh kolone

najdirektniji način nanošenja uzorka, koji daje najmanje moguće širenje hromatografskih

traka, takav način nije pogodan za HPLC. Injektovanje kroz septum je jedino prihvatljivo

pri pritiscima nižim od 100 bar, mada uvek postoji opasnost od zapušenja igle česticama

septuma, a osim toga septum mora da bude hemijski stabilan preme različitim

mobilnim fazama koje se koriste za hromatografisanje.


96

Najčešće se injektovanje izvodi putem petlje, u koju se se uzorak unosi

mikrolitarskim špricem, tako što se iglom probode zaptivena guma na ulazu u petlju.

Prebacivanjem injekcionog ventila iz položaja za punjenje u položaj za injektovanje,

mobilna faza se usmerava kroz petlju, povlači uzorak sa sobom i unosi ga u kolonu

(Slika 5.5). Petlje su dizajnirane tako da se specifična zapremina injektuje u kolonu i

dostupne su u veličinama od 5 do 2000 µL. One se lako vezuju za ventil i lako menjaju.

Manje zapremine uzoraka, koje su potrebne kod rada sa mikrokolonama, najbolje je

injektovati koristeći specijalan ventil sa petljom kapaciteta od 0,5 do 5 µL. Nedostatak

ovakvog manuelnog injektora je što se svaki uzorak mora posebno injektovati.

Autosempler omogućava da se automatski injektuje jedan uzorak za drugim, čime se

obezbeđuje da se bez prisustva analitičara uradi sto i više analiza.

5.5.2. Stacionarna faza – kolona

Stacionarna faza tj. kolona predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih

hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika

ili stakla i njihov izbor zavisi od prirode supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti

različite dužine, najčešće od 2,5 do 25 cm (i više), sa različitim unutrašnjim prečnikom

(najčešće 2,0-4,6 mm) i različitim dijametrom čestica (od 2 do 50 µm). Uobičajeni

materijali za pakovanje HPLC kolona su sledeći: silika-gel, kopolimeri na bazi stirena i

divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje. Hemijska struktura silikagela

prikazana je na Slici 5.6.

Slika 6. Hemijska struktura silika-gela

Silika-gel može hemijski da se modifikuje na različite načine, što je prikazano na

Slici 5.7, pa se tako dobija veliki broj materijala koji se koriste za punjenje HPLC kolona,

tj. kao stacionarne faze (Tabela 5.1). Izbor vrste kolone zavisi od vrste analize, tj. od

primene.

Slobodni

silanolSiloksan Geminalni

silanoli

Vodonično

vezani

silanoli

Kiseli silanol

blizu Me+


97

Slika 5.7. Hemijske modifikacije silika-gela

Veliki broj HPLC razdvajanja izvodi se na sobnoj temperaturi. U slučajevima kada

temperaturu kolone treba promeniti, to može da se učini pomoću odgovarajućeg

vodenog kupatila ili peći za zagrevanje kolone. Ako se HPLC kolonama rukuje na

pravilan način, one mogu da imaju dug vek trajanja. Kolone mogu često da se regenerišu

propuštanjem serije rastvarača u kojoj se povećava sposobnost eluiranja, što je zatim

praćeno propuštanjem rastvarača obrnutog redosleda u pogledu sposobnosti eluiranja

(npr. heksan-metilenhlorid, metanol- metilenhlorid-heksan). Zapremina svakog od

upotrebljenih rastvarača za ispiranje treba da bude oko 20 zapremina kolone, i

propušta se pri veoma visokom protoku.

Najvažniji koraci koji mogu da se preduzmu za zaštitu HPLC kolone su filtracija

rastvarača, filtracija rastvorenog uzorka, upotreba dodatnih filtera i/ili pretkolona

(engl. guard column), pažljivo rukovanje, održavanje priključaka čistim i izbegavanje

preteranog zatezanja, i čuvanje dobro zatvorne kolone u odgovarajućem rastvaraču

kada je van upotrebe.

= Silika-gel

Anhidrovani uslovi

Anhidrovani uslovi


98

Tabela 5.1. Funkcionalne grupe u hemijski modifikovanom silika-gelu

Grupa

Formula Grupa Formula

Triakontil

Difenil

Dokosil

Dimetil-amino

Oktadecil

Amino

Oktil

Nitro

Heksil

Nitrilna (Cijano)

Trimetilsilil

Oksipropan-

nitril

Alkil-

karbamat

vic-Hidroksil (diol)

Cikloheksil

Fluoralkil

Fenil

Poli(kapro-

laktam)

5.5.3. Mobilna faza

Mobilna faza za HPLC analizu treba da se bira tako da pre svega dobro rastvara

sve komponente ispitivane smeše. Drugim rečima, ako se analiziraju nepolarna

jedinjenja, tada biramo nepolarne rastvarače, i obrnuto - pri analizi polarnih jedinjenja

kao mobilna faza se biraju polarni rastvarači. Polarnost mobilne faze može da se varira


99

od puferovanih vodenih rastvora do ugljovodonika. Rastvarači koji se koriste kao

mobilna faza moraju biti odgovarajuće čistoće, bez stranih primesa organskog i

neorganskog porekla. HPLC rastvarači su komercijalno dostupni i treba ih uvek koristiti.

Takođe, mobilna faza mora biti oslobođena mehurića gasova. Zbog toga se pre upotrebe

mobilna faza filtrira i degazira. Degaziranje može biti postignuto na različite načine:

primenom toplote, sniženog pritiska ili ultrazvuka, ili produvavanjem inertog gasa kao

što je helijum. Poslednji način je najpogodniji, s obzirom da omogućava kontinualno

degaziranje tokom izvođenja eksperimenta. Neki od problema koje rastvarači mogu da

prouzrokuju ako nisu degazirani su: nastajanje mehurova vazduha u pumpi, što vodi

gubitku protoka rastvarača; formiranje mehurića na izlazu iz kolone, gde nastaje visok

pritisak koji vodi ozbiljnom narušavanju hromatograma i pomeranje bazne linije zbog

rastvorenog vazduha.

Mobilna faza ne sme da menja karakteristike kolone i mora da bude kompatibilna sa

detektorom. Viskoznost, temperatura, pH vrednost mobilne faze i protok biraju se u

zavisnosti kako od primenjene stacionarne faze, tako i od prirode analizirane supstance.

5.5.4. Pumpa

Pumpe koje se koriste za HPLC sisteme moraju biti izrađene od materijala koji je

otporan na rastvarče koji se koriste kao mobilna faza. Takođe moraju biti sposobne da

proizvedu i izdrže pritiske do 6000 psi, i da obezbede protoke od 1 do 10 pL/min, pa sve

do 0,5 do 10 mL/min. Kako se efikasnost razdvajanja povećava sa opadanjem protoka

mobilne faze, generalno je poželjan nizak protok. Pumpe su elektronski kontrolisane da

regulišu pritisak i protok mobilne faze u veoma uskom opsegu. Programator se obično

koristi za regulisanje isporuke rastvarača ili smeše rastvarača konstantnog (izokratski

način) ili promenljivog sastava (gradijentni način eluiranja). Veoma je važno da se

pumpa redovno održava, da bi protok rastvarača tokom hromatografisanja bio

konstantan. Promena u protoku rastvarača će uticati na retenciona vremena

analiziranih jedinjenja, i zbog toga može doći do grešaka u identifikaciji uzorka.

Reproduktivnost hromatograma, kako standarda, tako i uzoraka, je od suštinskog

značaja. Pritisak koji obezbeđuje pumpa zavisi od dimenzija kolone i veličine čestica

kojima je pakovana, a isto tako i od protoka i viskoznosti mobilne faze koja se koristi.

5.5.5. Detektor

Detektor je vezan na izlaz HPLC kolone i njegova uloga je da “prati” rastvor koji

se eluira sa kolone u realnom vremenu. Detektor je uglavnom najsofisticiraniji i

najskuplji deo HPLC opreme. Kako karakteristike jedinjenja prisutnih u uzorku mogu

biti veoma različite, razvijeno je nekoliko tipova detektora. Postoje selektivni detektori,

koji daju različite odgovore u zavisnosti od strukture analiziranog uzorka, i tzv.

univerzalniji detektori, kod kojih je odgovor sličan za većinu jedinjenja. Na primer, ako


100

jedinjenje apsorbuje ultraljubičastu ili vidljivu svetlost, koristi se UV-Vis apsorbujući

detektor (engl. ultraviolet-visible detector). Ako jedinjenje ima sposobnost fluorescencije,

koristi se fluorescentni detektor. Oba tipa detektora su selektivni detektori. Ako

analizirano jedinjenje nema ni jednu od pomenutih karakteristika, koristi se

univerzalniji tip detektora, kao što je RI detektor, tj. detektor koji radi na principu

prelamanja svetlosti (engl. refractive index detector), ili ELSD detector, tj. detektor koji

radi na principu isparavanja i rasipanja svetlosti (engl. evaporative-light-scattering

detector). Najbolji pristup je korišćenje više serijski vezanih detektora. Recimo, UV-Vis

i/ili ELSD detektor mogu da se koriste u kombinaciji sa masenim spektrometrom (MS),

da bi se analizirali rezultati HPLC razdvajanja. To omogućava sveobuhvatnije informacije o

ispitivanom uzorku (analitu), na osnovu samo jednog HPLC injektovanja. Kuplovanje

HPLC sistema sa masenim spektrometrom se u praksi zove LC/MS.

UV-Vis detektor je selektivniji i osetljiviji od RI detektora. Dok je UV-Vis detektor

u stanju da detektuje količinu supstance od 10-10 g/ml, osetljivost RI detektora je u

oblasti od 10-7 g/ml. Osetljivost fluorescentnih detektora je u oblasti od 10-13 g/ml za

izabrana jedinjenja. Osetljivost detektora se definiše kao odnos odgovora detektora

prema koncentraciji uzorka.

HPLC detektori mogu da apsorbuju u tri različite optičke apsorpcione oblasti:

ultraljubičastoj (190-400 nm), vidljivoj (400-700 nm) i infracrvenoj oblasti (IR – engl.

infrared, 2,5-25 µm). Postoje tri glavne klase optičkih apsorpcionih detektora: a)

detektori koji rade na fiksnoj talasnoj dužini u UV oblasti, gde je obično talasna dužina

fiksirana na 254 ili/i 280 nm; b) UV-Vis detektori sa promenljivom talasnom dužinom; i

c) IR apsorpcioni detektori.

Najmanje se koriste IR detektori, koji imaju ograničenu osetljivost i kod kojih se

kao problem javljaju značajne smetnje zbog uticaja rastvarača. Njihova glavna upotreba

je u okviru ekskluzione hromatografije.

Veoma bitna karakteristika pri izboru detektora je i da li je on destruktivan

prema ispitivanom uzorku ili ne. Uobičajeno korišćeni optički detektori nisu

destruktivni, pa je nakon hromatografisanja moguće prečistiti analizirano jedinjenje i

koristiti ga u daljim koracima za karakterizaciju.

Gradijentno eluiranje zahteva detektor koji će biti neosetljiv na promenu sastava

rastvarača. UV-Vis i fluorescentni detektori zadovoljavaju ovaj zahtev, za razliku RI

detektora, koji se veoma retko koristi za gradijentno eluiranje,

Očigledno je, da kao i kod drugih tehnika za hromatografisanje, ne postoji

univerzalni detektor za HPLC. UV-Vis, fluorescentni i elektrohemijski detektori su

bazirani na specifičnoj prirodi supstance koja se analizira. Na primer, jedinjenje koje

hromatografišemo apsorbuje svetlost određene frekvence, dok sistem rastvarača u

kome se analiza izvodi tu istu svetlost ne apsorbuje. S druge strane, RI detektori reaguju

na promenu indeksa prelamanja, koji je karakteristično svojstvo rastvora. Promena


101

indeksa prelamanja je direktni rezultat eluiranja rastvorenog hemijskog jedinjenja koje

se hromatografiše.

U nekim slučajevima, potrebno je modifikovati eluat da bi uzorak mogao da se

detektuje. Ti slučajevi se odnose na detektore koji zahtevaju isparavanje rastvarača koji

se koristi za eluiranje, pre detekcije jedinjenja koje se analizira. Ovo uključuje FID i

masene detektore (videti Poglavlje 3 o gasnoj hromatografiji).

Mogućnost detekcije nekih jedinjenja može se poboljšati hemijskom

derivatizacijom pre HPLC analize, ili posle hromatografskog razdvajanja a pre detekcije

(tzv. derivatizacija posle kolone). Postoje raznovrsne komercijalno dostupne

mogućnosti, od strane nekoliko proizvođača, da se drugi način, tj. derivatizacija posle

kolone automatizuje.

U rutinskoj analizi prehrambenih proizvoda, 90 % analiza se vrši uz upotrebu

UV-Vis ili RI detektora. Fluorescentni detektor se koristi u 8-9 % slučajeva, dok se

detektori koji rade na principu amperometrijske provodljivosti koriste u 1-2 %

slučajeva.

5.6. Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om

Jednostavan način da se razume kako dolazi do razdvajanja jedinjenja nekog

uzorka u HPLC koloni je prikazan na Slici 5.8.

Slika 5.8. Hromatografske trake - ilustracija rada hromatografske kolone

Mobilna faza ulazi u kolonu sa leve strane, prolazi kroz čestice kojima je napunjena

kolona i izlazi sa desne strane. Smer protoka mobilne faze je predstavljen zelenim

strelicama. Gornji deo Slike 8 predstavlja kolonu u nultom vremenu (trenutak kada se

injektuje uzorak), kada uzorak ulazi na kolonu i počinje da formira traku. Ispitivani

uzorak, koji je smeša jedinjenja žute, crvene i plave boje, javlja se na ulasku u kolonu kao

jedna crna traka. U stvarnosti, ovaj uzorak može biti bilo šta što se može rastvoriti u

Traka injektovanog uzorka - pojavljuje se kao crna boja

(smeša plave, crvene i žute )

Nulto vreme

Mobilna faza

Nulto vreme + 10 minuta

Mobilna faza

Trake analita


102

rastvaraču. Tipično jedinjenje će biti bezbojno a zid kolone neproziran, tako da bi bio

neophodan detektor da se “vide” razdvojena jedinjenja nakon što se eluiraju sa kolone.

Nakon nekoliko minuta (donji deo Slike 5.8), tokom kojih mobilna faza teče

kontinualno i stalno prolazi kroz čestice materijala kojim je napunjena kolona, možemo

da vidimo da su se jedinjenja premestila u odvojene trake, što znači da su se kretala

različitim brzinama kroz kolonu. Razlog ovakvom ponašanju je postojanje konkurencije

između mobilne i stacionarne faze za privlačenje svakog od jedinjenja, tj. analita. Može

se primetiti da se traka žute boje kreće najbrže i samo što nije izašla iz kolone.

Jedinjenje žute boje je vezano za mobilnu fazu jače od jedinjenja dugih boja i zbog toga

se kreće većom brzinom, koja je bliska brzini kretanja mobilne faze. Jedinjenje plave

boja više “voli” materijal za pakovanje kolone nego mobilnu fazu. Ono je jako vezana za

čestice stacionarne faze, što prouzrokuje da se značajno sporije kreće kroz kolonu.

Drugim rečima, jedinjenje plave boje se najduže zadržava na koloni od svih komponenti

ispitivane smeše. Traka crvene boje kreće se srednjom brzinom kroz kolonu, odnosno

jedinjenje crvene boje vezano je srednjom jačinom za mobilnu fazu. Kako se svaka od

traka kreće različitom brzinom, ova tri jedinjenja je moguće hromatografski razdvojiti.

Slika 5.9. Hromatogram kao rezultat obrade električnog signala u kompjuteru

vezanom za HPLC hromatograf

Čim razdvojene trake analizirane smeše napuste kolonu, odmah prelaze na

detektor. Detektor ima protočnu ćeliju koja “vidi”, tj. detektuje svaku pojedinačnu traku,

tj. jedinjenje. Odgovarajući detektor ima sposobnost da “oseti” prisustvo određenog

jedinjenja i da pošalje odgovarajući električni signal kompjuteru za obradu podataka.

Izbor se vrši između mnogo različitih tipova već pomenutih detektora, a u zavisnosti od

osobina i koncentracije jedinjenja koja treba da se razdvoje i analiziraju. Idealan

detektor bi trebalo da je visoko osetljiv, odnosno utoliko je bolji ukoliko daje veći signal

pri niskoj koncentraciji analizirane supstance. Zatim, detektor treba da bude pogodan za

HPLC kolona

Detektor –

protočna ćelija

Injektovanje

Start

Bazna linija


103

sva jedinjenja u ispitivanoj smeši i da se njegov odgovor ne menja sa promenama u

sastavu mobilne faze i temperature. Detektor treba da daje brz odgovor proporcionalan

koncentraciji, tj. da ima širok opseg linearnosti i mali šum na baznoj liniji. Najzad,

odgovor detektora treba da bude nezavistan od mobilne faze, inertan prema dejstvu

mobilne faze i treba da bude lak i jednostavan za upotrebu. Danas su najčešće u

upotrebi UV/VIS, fluorescentni, infracrveni, maseni, elektrohemijski, kao i detektori

bazirani na indeksu refrakcije.

Kao rezultat obrade električnog signala koji je poslat detektoru, dobija se HPLC

hromatogram. Hromatogram je grafički prikaz razdvajanja koje se odigralo u HPLC

sistemu. Serija pikova koji se “izdižu” iznad bazne linije nacrtana je na vremenskoj osi.

Svaki pik predstavlja odgovor detektora na različito hemijsko jedinjenje (Slika 5.9).

Žuta traka na Slici 5.9 je potpuno prošla kroz protočnu ćeliju detektora i generisani

električni signal je poslat kompjuteru za obradu podataka. Rezultujući hromatogram se

pojavljuje na ekranu. Hromatogram u stvari počinje kada se uzorak injektuje, i to kao

prava linija pri dnu ekrana, koja se naziva baznom linijom. Bazna linija predstavlja čistu

mobilnu fazu koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora tokom vremena. Kako traka

žutog jedinjenja prolazi kroz protočnu ćeliju, sve jači signal se šalje kompjuteru.

Površina ispod krive linije, koja je najpre uzlazna, a zatim silazna, proporcionalna je

koncentraciji jedinjenja žute boje u uzorku. Na ovaj način kreira se pik u

hromatogramu. Nakon što žuta traka potpuno izađe iz ćelije detektora, nivo signala se

vraća na baznu liniju. Kroz detektor sada ponovo prolazi samo čista mobilna faza. Kako

se žuta traka kreće najbrže, eluirajući se najbrže sa kolone, to je prvi pik koji se javlja u

hromatogramu.

Malo kasnije, crvena traka stiže do protočne ćelije detektora. Signal se ponovo

“diže” sa osnovne linije kako crvena traka ulazi u detektor, i pik koji predstavlja crvenu

traku počinje da se pojavljuje na ekranu. Na Slici 5.9 crvena traka još uvek nije potpuno

prošla kroz protočnu ćeliju detektora. Slika pokazuje kako bi crveni pik izgledao ako bi

u ovom trenutku zaustavili proces hromatografisanja. S obzirom da je veći deo crvene

trake prošao kroz ćeliju, veći deo pika je nacrtan, kao što pokazuje puna linija na Slici

5.9. Kada bi proces hromatografisanja restartovali, crvena traka bi potpuno prošla kroz

ćeliju detektora i crveni pik bi bio potpun (isprekidana linija). Plava traka, koja se

najduže zadržala na koloni, odnosno koja putuje najmanjom brzinom, eluira se sa kolone

posle crvene trake. Isprekidana linija pokazuje kako bi izgledao potpuni hromatogram,

ako bismo pustili proces hromatografisanja do kraja. Zanimljivo je primetiti da bi širina

plavog pika bila najveća, zbog toga što se plava traka kreće najsporije kroz pakovanu

kolonu i zahteva više vremena i veću zapreminu mobilne faze da bi se potpuno eluirala.

Pošto mobilna faze teče konstantnom brzinom, plava traka se širi i razblažuje. Kako

detektor reaguje proporcionalno koncentraciji trake, to za posledicu ima da je plavi pik

manji po visini ali veće širine u poređenju sa prethodna dva pika.


104

5.7. Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om

Na Slici 5.9 su tri obojena jedinjenja su predstavljena sa tri pika na hromatogramu,

koja su razdvojena u vremenu. Svaki se pojavljuje u posebnom vremenskom trenutku,

odnosno na posebnom retencionom vremenu (tr), koje se meri od momenta kada se

uzorak injektuje (nulto vreme) do trenutka kada se javlja maksimalna vrednost, tj. vrh

pika. Poređenjem retencionih vremena svakog pojedinačnog pika sa retencionim

vremenima odgovarajućih referentnih standarda, koji se pod istim uslovima hromatografišu

(ista mobilna i stacionarna faza, protok i temperatura), nepoznata jedinjenja se mogu

identifikovati.

Na Slici 5.10 vidi se da će, pod određenim uslovima za hromatografisanje, analit,

u ovom slučaju akrilamid, imati retenciono vreme od 2,85 minuta (Uzorak A). Kada se

novi uzorak, koji sadrži akrilamid, injektuje u HPLC sistem pod istim hromatografskim

uslovima, njegov pik će se takođe pojaviti na 2,85 minuta (Uzorak B).

Kada je jedinjenje idetifikovano, sledeći važan korak je ustanoviti količinu, tj.

koncentraciju jedinjenja u ispitivanom uzorku. Hromatogram i odgovarajući podaci sa

detektora omogućavavaju da se koncentracija prisutnog jedinjenja izračuna. Kako

detektor reaguje na koncentraciju jedinjenja, veća koncentracija će davati veći signal,

što će se u hromatogramu videti kao viši pik iznad iznad bazne linije.

Na Slici 5.10, hromatogrami uzoraka A i B su prikazani na istoj vremenskoj skali,

jedan iznad drugog. Ista zapremina uzorka je injektovana u oba slučaja, i oba

hromatograma pokazuju pikove na retencionom vremenu od 2,85 minuta, što ukazuje

da svaki od uzoraka sadrži akrilamid. Međutim, uzorak A pokazuje mnogo veći pik

akrilamida. Površina ispod pika je mera koncentracije prisutnog jedinjenja. Vrednost

površine se integrali i računa automatski od strane kompjutera vezanog na HPLC

uređaj. U slučaju sa Slike 5.10, pik za akrilamid u uzorku A ima 10 puta veću površinu od

pika u uzorku B.

Nepoznata koncentracija uzorka, u ovom slučaju akrilamida, može se odrediti

metodom normalizacije pikova, metodom eksternog standarda ili metodom internog

standarda. Metoda internog standarda, koja se smatra najpouzdanijom, zasniva se na

dodatku odabrane supstance (interni standard) rastvorima akrilamida poznatih

koncentracija i rastvoru uzorka nepoznate koncentracije, u potpuno istoj koncentraciji.

Pik izabranog internog standarda mora biti dobro razdvojen od pika analiziranog

jedinjenja, ali ne i previše udaljen od njega. Takođe je potrebno da bude slične hemijske

strukture kao i ispitivano jedinjenje, kako bi se izbegle razlike u odgovoru detektora, a i

da bi se mogla koristiti ista kolona za hromatografisanje. Dobar interni standard za

određivanje nepoznate koncentracije akrilamida HPLC-om je npr. metakrilamid, i ova

metoda se koristi prilikom određivanja akrilamida u suncokretovom ulju za pripremu

hrane. Precizno pripremljeni standardni rastvori se zatim injektuju u HPLC sistem i

nakon hromatografisanja se izračunava odnos površine pika supstance koja se analizira


105

i internog standarda. Kalibraciona kriva se konstruiše koristeći odnose površine pika

standarda i internog standarda u funkciji od koncentacije standardnih rastvora. Na opisani

način može se izračunati da Uzorak A sadrži 10 pikograma akrilamida, što je deset puta

više od količine akrilamida u uzorku B (1 pikogram). U hromatogramima uzoraka A i B

može se takođe uočiti još jedan neidentifikovani pik na retencionom vremenu od 1,8

minuta. Kako je površina ovog pika u oba uzorka otprilike ista, to nepoznato jedinjenje

može imati istu koncentraciju u oba uzorka.

Slika 5.10. Identifikacija i kvantitativno određivanje HPLC metodom

5.8. Izokratsko i gadijentno eluiranje

U HPLC-u se koriste dva osnovna načina eluiranja. Prvi je izokratsko eluiranje,

kod koga sastav mobilne faze, bilo da se radi o čistom rastvaraču ili o smeši rastvarača,

ostaje isti tokom hromatografisanja. Tipičan izokratski sistem eluiranja je prikazan na

Slici 5.11.

Drugi način eluiranja je gradijentno eluiranje, kada se, kao što samo ime ukazuje,

sastav mobilne faze menja tokom HPLC razdvajanja. Ovaj način je koristan za uzorke

koji sadrže jedinjenja u širokom opsegu polarnosti, kada izokratsko eluiranje ne dovodi

do zadovoljavajućeg razdvajanja komponenti ispitivane smeše. Naime, na početku

eksperimenta mobilna faza može eluirati neke komponente smeše ali je previše “slaba”

da bi eluirala ostale komponente. Dakle “snaga”, odnosno sposobnost eluiranja mobilne

faze će se tokom eksperimenta povećavati, da bi se da bi se eluirala jedinjenja koja su

jače vezana za stacionarnu fazu. U najjednostavnijem slučaju, u okviru HPLC sistema,

Akrilamid

Uzorak B

Akrilamid

Uzorak A

Injektovanje

Injektovanje

Površina

ispod pika

Retenciono vreme – identifikacija uzorka

Površina ispod pika –

kvantitativno odreĎivanje

1 pg

10 pg

pg

tR

tR= 2:85

tR= 2:85


106

kada se koristi gradijentno eluiranje, postoje dve boce sa rastvaračem i dve pumpe

(Slika 5.12).

Slika 5.11. Izokratski sistem eluiranja pod visokim pritiskom

Brzina svake pumpe se kontroliše, da bi se isporučilo manje ili više rastvarača

tokom razdvajanja. Dve struje rastvarača se mešaju u mešaču (mikseru) da bi se dobio

stvarni sastav mobilne faze koja se isporučuje koloni tokom vremena. Na početku

eksperimenta, mobilna faza sadrži veći udeo rastvarača koji eluira jedinjenja slabije

vezana za stacionarnu fazu (rastvarač A, Slika 5.12). Tokom vremena, udeo rastvarača

koji eluira jedinjenja jače vezana za stacionarnu fazu se povećava (rastvarač B, Slika

5.12), prema određenom režimu.

Slika 5.12. Gradijentni sistem eluiranja pod visokim pritiskom

HPLC kolona Hromatogram

Kompjuterska obrada

podataka

Otpad

Detektor

Uzorak

Injektor

Pumpe

Rastvarač A

Rastvarač B

Mikser


107

Na Slici 5.13 uređaj za mešanje rastvarača se nalazi posle pumpi, tako da se

gradijent stvara pod visokim pritiskom. Drugi HPLC sistemi su dizajnirani da mešaju

više struja rastvarača pod niskim pritiskom, ispred jedne pumpe, kao što je prikazano

na Slici 5.13. Ventil za formiranje gradijenta “bira” udeo svakog od rastvarača iz četiri

boce, menjajući na taj način “jačinu”, tj. sposobnost eluiranja mobilne faze.

Slika 13. Gradijentni HPLC sistem pod niskim pritiskom

5.9. Analitički, preparativni i industrijski HPLC

Do sada je pokazano kako HPLC analiza obezbeđuje podatke koji mogu biti

korišćeni kako za idektifikaciju, tako i za kvantitativno određivanje jedinjenja prisutnih

u analiziranom uzorku (analitički HPLC). Međutim, HPLC takođe može da se koristi za

prečišćavanje i “sakupljanje” željene količine svakog od analiziranih jedinjenja, uz

primenu frakcionog kolektora, koji se montira iza protočne ćelije detektora. Ovaj proces

se naziva preparativnom hromatografijom, tj. preparativni HPLC. U preparativnoj

hromatografiji je moguće “prikupiti” individualna jedinjenja, tj. analite, po redosledu

kako se ona eluiraju, odnosno izlaze sa kolone. Frakcioni kolektor selektivno sakuplja

eluat u određenom vremenskom periodu, pri čemu sakupljeni eluat sada sadrži

prečišćeni analit. Prihvatni sudovi kolektora se pomeraju, tako da svaki sakuplja samo

jedno jedinjenje, tj. jedan eluirani pik. Analitičar koji je odgovoran za HPLC eksperiment

utvrđuje koji nivo čistoće i koju količinu analita želi da dobije kao rezultat. Postavljeni

ciljevi u pogledu čistoće i količine analita koji želi da se dobije, zajedno sa informacijama

Rastvarač A

Rastvarač B

Rastvarač D

Rastvarač C

Ventil za

formiranje

Gradijenta

Pumpa

Injektor

HPLC kolona

Kompjuterska

obrada podataka

Hromatogram

Detektor

Otpad

Uzorak


108

o prirodi i složenosti uzorka, sa druge strane određuju veličinu uzorka za hromatografisanje i

potreban kapacitet kolone. U principu, kako se količina uzorka povećava, neophodna je i

veća HPLC kolona. Određivanje kapaciteta HPLC sistema naziva se izbor HPLC skale. U

Tabeli 5.2 prikazane su različite HPLC skale i njihovi hromatografski ciljevi.

Tabela 5.2. Različite HPLC skale

Skala Hromatografski cilj

Analitička Informacije - identifikacija jedinjenja i koncentracija

Semi-preparativna Podaci i mala količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g)

Preparativna Veća količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g)

Industrijska Proizvodne količine prečišćenog jedinjenja ( g – kg)

Maksimalno povećanje selektivnosti sa određenom kombinacijom stacionarne i

mobilne faze, postizanjem najboljeg mogućeg razdvajanja između dve komponente

analiziranog uzorka, je kritični momenat u određivanju zahteva za skaliranje

hromatografskog razdvajanja. Kapacitet HPLC sistema tada postaje pitanje skaliranja

zapremine kolone (Vc) prema količini uzorka koji će se injektovati, kao i izbora

odgovarajuće veličine čestica, što određuje pritisak u koloni i efikasnost kolone.

Zapremina kolone, koja zavisi od njene dužine (L) i unutrašnjeg prečnika (r), određuje

količinu materijala za pakovanje (čestica) koju kolona treba da sadrži.

Generalno, HPLC kolone su dužine od 2 do 50 cm, i unutrašnjeg prečnika 1 do

100 mm (Slika 5.14). Kako se hromatografska skala povećava, tako se povećavaju i

dimenzije kolone, naročito njihov prečnik (Tabela 5.3).

Slika 5.14. Dimenzije HPLC kolona

Analitičke Preparativne

Unutrašnji prečnik

1 mm – 50 mm

Dužina

2 – 50 cm


109

Da bi se optimizovao protok, on se mora povećati u srazmeri sa površinom

poprečnog preseka kolone. Ako je poželjna manja veličina čestica za veću moć

razdvajanja, tada pumpa mora biti dizajnirana da održi visok protok mobilne faze pri

visokom povratnom pritisku. Tabela 5.3 prikazuje jednostavne smernice za izbor kolone

odgovarajućeg unutrašnjeg prečnika koji se preporučuje za svaku skalu hromatografije.

Tabela 5.3. Hromatografska skala prema unutrašnjem prečniku kolone i

prečniku čestica za pakovanje kolone

Skala Prečnik

kolone,

1-8 mm

Prečnik

kolone,

10-40 mm

Prečnik

kolone,

50-100

mm

Prečnik

kolone,

100 mm

Veličina

čestica,

m

Analitička x 1,7-10

Semi-preparativna x 5-15

Preparativna x 15-100

Industrijska x 100 +

Na primer, za primenu u okviru preparativne skale koristila bi se kolona unutrašnjeg

prečnika 50-100 mm, koja sadrži čestice veličine 15-100 mikrona. Optimalna dužina

kolone tada može da se izračuna na osnovu količine prečišćenog jedinjenja koja želi da

se obradi u svakom eksperimentu i na osnovu zahtevane moći razdvajanja.

5.10. Performanse hromatografskog razdvajanja

5.10.1 Rezolucija

Stepen do koga su jedinjenja razdvojena naziva se hromatografskom

rezolucijom. Dva glavna faktora koji određuju moć razdvajanja ili rezoluciju koja se

može postići HPLC kolonom su: sposobnost mehaničkog razdvajanja, koja je određena

dužinom kolone, veličinom čestica i uniformnošću pakovanja i sposobnost hemijskog

razdvajanja, koja je određena fizičko-hemijskim “takmičenjem” za jedinjenja, između

stacionarne i mobilne faze. Efikasnost kolone je mera mehaničke sposobnosti

razdvajanja, dok je njena selektivnost mera hemijske sposobnosti razdvajanja.

5.10.2. Sposobnost mehaničkog razdvajanja – efikasnost

Ako je kolona stabilna i uniformno pakovana, sposobnost mehaničkog razdvajanja je

određena njenom dužinom i veličinom čestica kojima je napunjena. Sposobnost mehaničkog

razdvajanja, koja se zove efikasnost kolone, se često meri i predstavlja brojem podova


110

(N). Kolone punjene manjim česticama imaju veću efikasnost i viši povratni pritisak. Za

određenu veličinu čestica dobija se veća sposobnost mehaničkog razdvajanja sa

povećanjem dužine kolone. Međutim, povećanje dužine kolone vodi dužim vremenima

potrebnim za hromatografisanje, većoj potrošnji rastvarača i većim povratnim

pritiscima. Kraće kolone minimiziraju sve prethodno navedeno, ali takođe imaju manju

efikasnost, kao što je prikazano na Slici 5.15.A.

Slika 5.15. A) Dužina kolone i sposobnost mehaničkog razdvajanja (pri istoj veličini

čestica) i B) Veličina čestica i sposobnost mehaničkog razdvajanja pri istoj dužini kolone

Pri određenoj hemijskoj strukturi čestica za punjenje kolone, određenoj mobilnoj

fazi i protoku, kolona iste dužine i unutrašnjeg prečnika, ali punjena manjim česticama,

imaće veću sposobnost mehaničkog razdvajanja (Slika 5.15.B). Međutim, njen povratni

pritisak će biti mnogo veći nego u koloni za čije punjenje su korišćene čestice većih

dimenzija.

5.10.3. Sposobnost hemijskog razdvajanja – selektivnost

Izbor kombinacije vrste stacionarne faze (hemijske strukture čestica) i sastava

mobilne faze, odnosno izbor sistema za razdvajanje, određuje stepen hemijskog razdvajanja,

tj. selektivnost. Optimizacija selektivnosti je najefikasniji način za postizanje

razdvajanja, koji može otklaniti nepovoljne eksperimentalne uslove neophodne kod

najvećih mogućih mehaničkih efikasnosti. Da bi se postiglo razdvajanje bilo koja dva

jedinjenja, analitičar može da bira kako između velikog broja kombinacija stacionarne i

mobilne faze, tako i retencionih mehanizama, odnosno načina za hromatografisanje. O

tome će biti reči u sledećem Poglavlju.

50 mm 100 mm

50 mm

5 m

50 mm

1,7 m

A)

B)


111

5.11. Režimi HPLC razdvajanja

U principu, tri osnovne karakteristike hemijskih jedinjenja mogu da se koriste da

bi se postiglo HPLC razdvajanje: polarnost, naelektrisanje i veličina molekula. Prvo će

biti razmatrana polarnost i dva osnovna načina razdvajanja koji se zasnivaju na ovoj

karakteristici: hromatografija normalnih faza i hromatografija reverznih faza.

Na osnovu polarnosti stacionarne i mobilne faze, HPLC se deli na dve različite

podklase. Režim ili tehnika kod koje je stacionarna faza polarnija od mobilne faze (npr.

toluen kao mobilna faza a silika-gel kao stacionarna faza), naziva se hromatografijom

normalnih faza (engl. normal phase liquid chromatography, NPLC). Suprotno, kada je

mobilna faza polarnija od stacionarne faze (npr. voda-metanol kao mobilna faza i

oktadecilsilil- modifikovani silika-gel kao stacionarna faza, C18), takva tehnika se naziva

hromatografijom reverznih faza (engl. reversed phase liquid chromatography, RPLC).

Ironija je da hromatografija “normalnih faza” ima znatno manju primenu od

hromatografije reverznih faza, koja se znatno više koristi.

5.11.1. Razdvajanje na osnovu polarnosti

Struktura molekula i njegove fizičko-hemijske karakteristike su određeni

rasporedom njegovih konstitutivnih atoma i vrstama veza između njih. Specifični

raspored određenih atoma, koji je odgovoran za specijalna svojstva i predvidive

hemijske reakcije molekula, naziva se funkcionalna grupa. Funkcionalna grupa često

određuje da li je molekul polaran ili nepolaran.

Organska jedinjenja su klasifikovana prema funkcionalnim grupama koje sadrže.

Kada se razdvajanje zasniva na polarnosti jedinjenja, relativno hromatografsko zadržavanje

različitih vrsta molekula u velikoj meri zavisi od prirode i položaja funkcionalnih grupa.

Kao što je prikazano na Slici 5.16, klase organskih jedinjenja mogu se poređeti u niz, od

veoma polarnih do veoma nepolarnih.

Slika 5.16. Niz hromatografske polarnosti prema funkcionalnoj gupi analita

Polarnimolekul

Soli

Kiseline

Alkoholi

Ketoni

Aromatični

ugljovodonici

Halogenalkani Alifatični

ugljovodonici

FluoralkaniEtri

Nepolarnimolekul


112

Voda, mali molekul sa velikim dipolnim momentom, je polarno jedinjenje.

Benzen, aromatični ugljovodonik, je nepolarno jedinjenje. Molekuli sa sličnom

polarnošću imaju tendenciju da se međusobno privlače, dok se oni sa različitom

polarnošću ili mnogo slabije privlače, ili čak odbijaju. Pravilo “slično privlači slično”

postaje osnova za hromatografske režime razdvajanja koji se zasnivaju na različitoj

polarnosti.

Da bi se dobio efikasan sistem za hromatografsko razdvajanje, biraju se mobilna i

stacionarna faza različitih polarnosti. Jedinjenja iz uzorka koja su slične polarnosti sa

stacionarnom fazom (tj. sa materijalom za pakovanje kolone), će se mnogo sporije

kretati kroz kolonu, zato što su jače vezana za čestice stacionarne faze. S druge strane,

jedinjenja slične polarnosti sa mobilnom fazom kretaće se brže. Na osnovu ovih razlika

u relativnom vezivanju jedinjenja za stacionarnu/mobilnu fazu dolazi do njihovog

razdvajanja, i to zahvaljujući različitoj brzini kretanja svakog pojedinačnog jedinjenja

kroz kolonu.

Slike 5.17 i 5.18 prikazuju tipične opsege polarnosti za mobilne i stacionarne faze. Niz

koji je prikazan na Slici 5.17, na kome su neki uobičajeni rastvarači poređeni po

relativnoj polarnosti, naziva se eluotropnom serijom. Molekuli mobilne faze, koji se

takmiče sa molekulima analita za pogodna mesta vezivanja za stacionarnu fazu, pomeraju

analite, prouzrokujući njihovo brže kretanje kroz kolonu, tj. manje zadržavanje. Voda je

polarni kraj ovog niza mobilnih faza, tj. rastvarača, dok je heksan, alifatični ugljovdonik,

nepolarni kraj. Između se nalaze pojedinačni rastvarači, kao i smeše rastvarača (sa

odnosom rastvarača pogodnim za određeno hromatografsko razdvajanje), koji su

poređani po eluacionoj sposobnosti. Koji kraj ovog niza predstavlja “najjaču” mobilnu

fazu, zavisi od prirode površine stacionarne faze gde se odigrava “takmičenje” za molekule

analita.

Slika 5.17. Niz mobilnih faza (rastvarača) različite polarnosti

Površina silika-gela je hidrofilna površina koja sadrži kisele silanolne grupe.

Zbog toga se silika-gel nalazi na polarnom kraju niza stacionarnih faza, što je prikazano

na Slici 5.18. Polarnost ili aktivnost površine silika-gela može biti modifikovana

hemijskim vezivanjem manje polarnih grupa (engl. bonded phase). Primeri koji su

prikazani na Slici 18, redosledom opadajuće polarnosti, obuhvataju cijanopropilsilil-

Polarnimolekul

Voda Alkohol Acetonitril THF

Mobilne faze

Nepolarnimolekul

Heksan


113

(CN), n-oktilsilil- (C8) i n-oktadecilsilil (C18, ODS) grupe na silika-gelu. Modifikacija

silika-gela n-oktadecilsilil- grupama daje veoma nepolarne, hidrofobne stacionarne faze.

Slika 5.18. Niz stacionarnih faza različite polarnosti

Za datu stacionarnu fazu analitičar mora da izabere odgovarajuću mobilnu fazu,

odnosno najbolju kombinaciju faza suprotnih polarnosti. Hromatografsko pravilo “slično

privlači slično” određuje koji će se od analita kretati sporije a koji brže kroz kolonu.

Između rastvarača sličnih polarnosti, razmatra se koji od njih, u kombinaciji sa datom

stacionarnom fazom, može najbolje iskoristiti suptilne razlike u polarnosti i

rastvorljivosti različitih analita iz uzorka, i na taj način maksimalno povećati

selektivnost hromatografskog sistema. Razdvajanje na bazi polarnosti podrazumeva

dobro poznavanje uzorka i iskustvo sa različitim analitima i režimima razdvajanja.

5.11.1.1. HPLC normalnih faza

Prilikom razdvajanja ekstrakta dobijenog iz listova biljaka, Cvet je koristio

polarnu stacionarnu fazu (kalcijum-karbonat u staklenoj cevi, Slika 5.1), u kombinaciji

sa mnogo manje polarnom, tj. nepolarnom mobilnom fazom. Ovaj klasični način

hromatografisanja je postao poznat kao hromatografija normalnih faza.

Slika 5.19. Hromatografija normalnih faza

Slika 5.19 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja test smeše koju čine

tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima normalnih faza.

Polarnimolekul

Silika-gel CN C8

Stacionarne faze

Nepolarnimolekul

C18

(ODS)

Polarna stacionarna faza –

silika -gel

Nepolarna mobilna faza –

heksan

Razdvajanje komponenti

uzorkaUzorak


114

Stacionarna faza je polarna (silika-gel) i najjače zadržava polarno žuto obojeno

jedinjenje. Nepolarno plavo obojeno jedinjenje se eluira brzo, zahvaljujući najboljoj

rastvorljivosti u mobilnoj fazi (heksan). Kako je plavo obojeno jedinjenje slično mobilnoj

fazi (oboje su nepolarni), ono se kreće najbrže. Crveno jedinjenje je po polarnosti

između žutog i plavog, pa se zbog toga kreće brzinom koja je veća od brzine kretanja

žutog a manja od brzine kretanja plavog jedinjenja. Opisano ponašanje je tipično za

hromatografiju normalnih faza.

5.11.1.2. HPLC reverznih faza

Hromatografija reverznih faza opisuje način razdvajanja koji je upravo obrnut od

hromatografije normalnih faza, naime koristi se nepolarna (hidrofobna) stacionarna

faza i polarna mobilna faza. Slika 5.20 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja

test smeše koju čine tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima

reverznih faza.

Sada je za stacionarnu fazu najjače vezano nepolarno plavo obojeno jedinjenje i

ono se najduže zadržava na nepolarnoj stacionarnoj fazi. Polarno žuto jedinjenje, koje je

najslabije vezano, kreće se najbrže kroz čestice stacionarne faze, i zbog toga eluira

najranije sa kolone.

Slika 5.20. hromatografija reverznih faza

U današnje vreme, zbog veće reproduktivnosti i širokog opsega primene,

reverzno-fazna hromatografija se koristi u otprilike 75 % svih HPLC metoda. Mnoge od

reverzno-faznih metoda koriste kao mobilnu fazu smešu vode i nekog polarnog

organskog rastvarača, kao što je acetonitril ili metanol. Ovakav sastav mobilne faze

obezbeđuje odgovarajuću interakciju analita sa površinom nepolarnih, hidrofobnih

čestica stacionarne faze. Nepolarna kolona koja je punjena modifikovanim C18 silika-

gelom (ODS kolona, tj. n-oktadecilsilil- modifikovani silika-gel) je najpopularnija i

najčešće korišćena vrsta reverzno-fazne kolone.

Nepolarna stacionarna faza

– C18

Uzorak

Razdvajanje komponenti

uzorka

Polarna mobilna faza –

vodeni rastvor


115

5.11.1.3. Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija

Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija je jedna od varijanti

hromatografije normalnih faza. U hromatografiji normalnih faza, mobilna faza je 100 %

organski rastvarač. Jedino tragovi vode mogu biti prisutni u mobilnoj fazi i u porama

materijala kojim je pakovana HPLC kolona. Polarni molekuli se vezuju veoma čvrsto za

stacionarnu fazu i ponekad ne mogu da se eluiraju. Dodavanjem izvesne količine vode

(< 20 %) organskoj mobilnoj fazi, koja je obično aprotični rastvarač kao npr. acetonitril,

omogućeno je razdvajanje i eluiranje polarnih jedinjenja koja su čvrsto vezana za

stacionarnu fazu u hromatografskom režimu normalnih faza. Voda, kao veoma polarni

rastvarač, efikasno se takmiči sa polarnim analitima u vezivanju za stacionarnu fazu.

Razdvajanje na bazi hidrofilnih interakcija može da se izvodi primenom bilo

izokratskog, bilo gradijentnog načina za eluiranje. Polarna jedinjenja, koja su inicijalno

vezana za čestice polarnog materijala kojim je pakovana kolona, mogu se eluirati sa

povećanjem polarnosti mobilne faze, tj. sa povećanjem udela vode u smeši sa organskim

rastvaračem. Analiti se tada eluiraju redosledom u kome se povećava njihova

hidrofilnost, odnosno polarnost izražena relativno prema vodi. Puferi ili soli se takođe

mogu dodati mobilnoj fazi da bi se analiti koji mogu da jonizuju zadržali u nejonizovanom

obliku.

5.11.1.4. Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija

Razdvajanje na osnovu hidrofobnih reakcija je jedna od varijanti hromatografije

reverznih faza, koja se koristi za razdvajanje velikih biomolekula, kao što su proteini.

Poželjno je da ovi molekuli ne menjaju strukturu, odnosno da ostanu intaktni u vodenim

rastvorima, izbegavajući kontakt sa organskim rastvaračima ili supstancama koje mogu

da ih denaturišu. Hromatografsko razdvajanje zasnovano na hidrofobnim intereakcijama

velikih molekula sa umereno hidrofobnim stacionarnim fazama, na primer sa češće

korišćenim butilsilil-modifikovanim silika-gelom (C4 kolone), nego oktadecilsilil-

modifikovanim silika-gelom (C18 kolone). Početno veća koncentracija soli u vodi će

“podstaći” proteine da se da se zadrže na česticama kojima je pakovana kolona (tzv.

“isoljavanje”). Stepen razdvajanja se uobičajeno postiže smanjenjem koncentracije soli.

Na ovaj način, biomolekuli se eluiraju redosledom u kome se povećava njihova hidrofobnost.

5.11.2. Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena

Pokazano je da za razdvajanje na bazi polarnosti važi hromatografsko pravilo

“slično privlači slično”. U hromatografiji koja se zasniva na izmeni jona, i naziva se jonska

hromatografija (engl. ion-exchange chromatography), kao i u drugim metodama

razdvajanja koje se zasnivaju na naelektrisanju, ovo pravilo je obrnuto. Kod ovih metoda

“slično i slično se odbijaju”, dok se suprotnosti privlače.


116

Jonska hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u

rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje imaju neki adsorbensi. Adsorbensi

mogu biti sintetički i prirodni, a takođe neorganskog i organskog porekla, i nazivaju se

jonskim izmenjivačima. Jonski izmenjivači se dele na katjonske i anjonske, u zavisnosti

od toga da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone i koriste se kao

stacionarne faze u jonskoj hromatografiji. Katjonski izmenjivači se koriste za

“zadržavanje” i razdvajanje pozitivno naelektrisanih jona, tj. katjona, na negativno

naelektrisanoj površini. Obrnuto, anjonski izmenjivači se koriste za “zadržavanje” i

razdvajanje negativno naelektrisanih jona, tj. anjona, na pozitivno naelektrisanoj

površini (Slika 5.21). U praksi se uglavnom koriste polimeri na bazi polistirena koji je

umrežen divinilbenzenom, koji se nazivaju jonoizmenjivačke smole. Smole sadrže

aktivne kisele ili bazne funkcionalne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora.

Katjonski izmenjivači sadrže kisele grupe, kao što su sulfonske kiseline (–SO3H) i

karboksilne kiseline (–COOH), a anjonski izmenjivači sadrže bazne grupe, kao što su

hidroksilne (–OH) ili amino grupe (–NH2, –NHR, –NR2).

Slika 5.21. Principi hromatografije zasnovane na izmeni jona

U jonskoj hromatografiji mobilna vaza je obično vodeni rastvor, koji sadrži

konkurentne jone istog naelektrisanja kao i analiti koji se razdvajaju. Kada je potrebno,

mobilnoj fazi se dodaje mala količina metanola ili acetona.

Jonoizmenjivači tipa jakih baza ili jakih kiselina (npr. kvaternerni amini ili

sulfonska kiselina) imaju funkcionalne grupe koje su uvek u jonizovanom obliku.

Tipična primena takvih jonoizmenjivača je za razdvajanje jona koji mogu biti eluirani

vezan za pozitivno

naelektrisanu površinu

vezan za negativno

naelektrisanu površinu

Negativno naelektrisani

analit (anjon)

Pozitivno naelektrisani

analit (katjon)

Čestica

stacionarne faze

(anjonski

jonoizmenjivač)

Čestica

stacionarne faze

(katjonski

jonoizmenjivač)

++

++ +

+

++

+

+

+

+

++

+

+

+

+ +

+

++

++

+

+

+ -- -

--

-- --

- -- -

- - --- ---

---

-

-- -- --- - -- -

--

-

--

--

----

-

-


117

“istiskivanjem”, pomoću mobilne faze koja sadrži jone koji se mogu jače vezati za

stacionarnu fazu. Alternativno, joni analita mogu zaostati na koloni, a zatim biti

neutralizovani promenom pH vrednosti mobilne faze in situ, što dovodi do njihovog

naknadnog eluiranja.

Jonoizmenjivači tipa slabih baza i slabih kiselina (npr. sa sekundarnim amino ili

sa karboksilnim funkcionalnim grupama), mogu biti neutralizovani iznad ili ispod

određene pH vrednosti, pri čemu gube sposobnost “zadržavanja” jona. Slabi

jonoizmenjivači se za razdvajanje jona koriste u jonizovanom obliku. Ako se joni analita,

vezani za jonoizmenjivač, ne mogu eluirati “istiskivanjem”, tada se mesta za izmenu,

odnosno joni izmenjivača, moraju neutralizovati. Neutralizacija vodi onemogućavanju

privlačenja jona analita od strane stacionarne faze i dozvoljava njihovo eluiranje.

Kada se slabi jonoizmenjivači neutralizuju, oni mogu “zadržavati” i razdvajati

analite na osnovu hidrofobnih (reverzno fazno razdvajanje) ili hidrofilnih interakcija

(razdvajanje na principu normalnih faza). U ovim slučajevima, sposobnost eluiranja je

određena polarnošću mobilne faze (Slika 5.17), pa tako slabi jonoizmenjivači mogu da

se koriste za razdvajanje analita koje je zasnovano i na njihovoj polarnosti i na

naelektrisanju.

U Tabeli 5.4. prikazane su glavne smernice za primenu jonske hromatografije. Na

primer, da bi se “zadržao” veoma bazni analit (pozitivno naelektrisan) na stacionarnoj

fazi, koristiće se slabi katjonski izmenjivač pri pH > 7, što obezbeđuje negativno

naelektrisanu površinu stacionarne faze. Da bi se eluirala jaka baza, pH vrednost

mobilne faze mora biti niža od 3, što dovodi do neutralizovanja naelektrisanja na

površini stacionarne faze i onemogućava dalju razmenu i zadržavanje jona.

Ne treba koristiti jake katjonske izmenjivače za hromatografisanje jakih baza – to

će rezultovati jakim privlačenjem analita i stacionarne faze koji će ostati naelektrisani,

te će biti gotovo nemoguće eluirati bazu sa kolone. Tada se baza jedino može ukloniti

istiskivanjem sa konkurentnom bazom koja pokazuje još jače vezivanje za jone

stacionarne faze. Ovaj pristup retko ima praktičnu primenu, zbog toga što je opasno

raditi sa veoma jakim bazama i kiselinama u HPLC tehnici. Veoma jake kiseline i baze

takođe mogu biti korozivne prema materijalima koji se koriste za izradu HPLC kolona i

ostalih delova instrumenta.

Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje katjona

od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje

koncentracije jona, razdvajanje elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i

aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, itd. Pomoću katjonskih izmenjivača se

mogu razdvojiti aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza. Anjonski izmenjivači

se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, aldehida, ketona, organskih kiselina

male molske mase, itd. Nitriti u povrću, fluoridi u pastama za zube, organske kiseline u

pićima, amonijum, kalijum, nitrati i fosfati u zemljištu i veštačkim đubrivima su samo

neki od specifičnih primera primene jonske hromatografije.


118

Tabela 5.4. Smernice za jonsku hromatografiju

5.11.3. Afinitetna hromatografija

Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije.

Kod afinitetne hromatografije specifičan molekul iz smeše vezuje se za “kompatibilan”

molekul koji je kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz

kolonu bez zadržavanja, kao što je to prikazano na Slici 5.22. Najveći broj interakcija na

kojima se zasniva afinitetna hromatografija su po prirodi biohemijske interakcije, npr.

antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor.

Visoko specifična priroda ovih interakcija leži u činjenici da dva jedinjenja koja

učestvuju u njima idealno odgovaraju jedno drugom, kako u prostornom, tako i u

elektrostatičkom pogledu. Jedno jedinjenje (ligand) je vezano za nosač (stacionarna

faza), dok se drugo jedinjenje (uzorak) nalazi u odgovarajućem rastvaraču (mobilna

faza). Proces vezivanja uzorka za ligand je reverzibilan. Uzorak se zadržava na

stacionarnoj fazi, dok se drugi molekuli, koji ne mogu da se specifično vežu za

stacionarnu fazu, eluiraju iz kolone mobilnom fazom. Uzorak se na taj način oslobađa

pratećih nečistoća, a sa stacionarne faze se naknadno uklanjanja eluiranjem rastvorom

koji sadrži neko jedinjenje sa još većim afinitetom prema ligandu ili promenom pH

vrednosti ili jonske jačine mobilne faze. Kako bilo koja biohemijska interakcija može da

se odigrava samo u jednoj, specifično definisanoj sredini, jasno je da promena pH ili

koncentracije mogu raskinuti te specifične interakcije. Afinitetna hromatografija se

razlikuje od drugih hromatografskih metoda po tome što pogodna stacionarna faza


119

“hvata” ili pojedinačnu komponentu ili eventualno nekoliko komponenti iz smeše

jedinjenja, zahvaljujući nastajanju (bio)specifičnih veza. Zatim sledi pogodan proces

eluiranja, koji obezbeđuje čisto jedinjenje, odnosno čisti željeni analit.

Slika 5.22. Princip afinitetne hromatografije

U afinitetnoj hromatografiji se obično koriste kolone veoma malih dimenzija.

Stacionarne faze za afinitetnu hromatografiju, koje mogu da se koriste za veoma različite

procese razdvajanja, u današnje vreme su komercijalno dostupne. Mnoge od njih sadrže

dugolančanu grupu, tzv. spejser (engl. spacer) između nosača na bazi silika-gela i

liganda, da bi se obezbedio potpuno slobodan, nesmetani pristup molekula uzorka

mestu za vezivanje, koje se nalazi na ligandu (Slika 5.23). Osim opisanim načinima koji

uključuju uspostavljanje neke vrste gradijenta (pH, jonska jačina ili konkurentni

uzorak), vezani uzorak se može eluirati i primenom sredstava koja menjaju strukturu

analita, što uslovljava raskidanje interakcija između analita i liganda (npr. urea ili

guanidin-hlorovodonik menjaju strukturu proteina). Ovu tehniku ipak treba izbegavati

kad kod je to moguće, jer se može desiti, ako se npr. eluira protein, da dođe do njegove

denaturacije.

Slika 5.23. Primer boljeg vezivanja biomolekula za ligand i boljeg eluiranja u prisustvu

spejsera između liganda i stacionarne faze

Biomolekul

Stacionarna

fazaLigandA280 A280

Neefikasno vezivanje Efikasno vezivanje

Spejser

Ligand je vezan direktno za stacionarnu fazu Ligand je vezan za stacionarnu fazu preko spejsera


120

5.11.4. Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija

Pedesetih godina prošlog veka, Porath i Flodin su otkrili da biomolekuli mogu da

se razdvoje na osnovu njihove veličine, putem prolaženja ili filtriranja kroz hidrofilni

polimer na bazi dekstrana, koji je imao kontrolisanu poroznost. Ovaj proces je označen

kao gel filtriranje. Kasnije je analogna metoda primenjena za razdvajanje sintetičkih

organskih oligomera i polimera. Za pakovanje kolona su korišćeni takođe organski

polimeri sa specifičnim opsegom veličine pora. Ovaj proces je označen kao gel-propusna

hromatograija (engl. Gel- Permeateon Chromatography, GPC). Slična razdvajanja su

postignuta korišćenjem silika-gela kontrolisane poroznosti kao materijala za pakovanje

kolona, pri čemu je takav proces označen kao ekskluziona hromatografija na osnovu

veličine molekula (engl. Size-Exclusion Chromatography, SEC). Prvi komercijalni HPLC

instrument, koji je plasiran na tržište 1963. godine od strane kompanije Waters (SAD),

bio je upravo dizajniran za GPC primenu.

Čestice umreženog polimera, koji se koristi za pakovanje kolone, u rastvaraču

prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje gela. Raspodela veličina pora gela mora biti u opsegu koji

dozvoljava polimernim molekulima (makromolekulima) da uđu u pore ili da, manje ili

više, budu “istisnuti” iz zapremine pora. Gel-propusna hromatografija predstavlja

specifični oblik tečno-tečne hromatografije, koji se zasniva na tom fenomenu. Dakle,

kada rastvor polimera, koji sadrži makromolekule različitih veličina, dovedemo u

kontakt sa gelom, iz rastvora će u gel moći da difunduju samo makromolekuli sa

određenom hidrodinamičkom zapreminom, odnosno makromolekuli čiji je prečnik u

rastvoru manji od prečnika pora gela (Slika 5.24). U rastvoru ostaju oni makromolekuli

čiji je prečnik veći od prečnika pora gela.

Slika 5.24. Mehanizam razdvajanja makromolekula po veličini

hidrodinamičke zapremine prilikom kretanja kroz GPC kolonu

(Strelica označava smer kretanja rastvarača)


121

Razdvajanje makromolekula po veličini se izvodi tako što se kroz kolonu, u kojoj

se nalazi gel umreženog polimera, propušta rastvor polimera koji se analizira. Na Slici

5.25. prikazano je razdvajanje polimera koji se sastoji od dve frakcije makromolekula

različitih po veličini, tj. molskoj masi.

Slika 5.25. Razdvajanje makromolekula po veličini prilikom prolaska kroz GPC kolonu

Granica faza gel/rastvarač, odnosno aktivna površina, je veoma velika, što vodi

relativno kratkom vremenu koje je potrebno za uspostavljanje difuzione ravnoteže,

odnosno raspodele makromolekula između rastvarača koji se kreće kroz kolonu

(mobilna faza) i rastvarača koji miruje u porama čestica gela (stacionarna faza). Kod

tehnike gel-propusne hromatografije, materijal kojim je pakovana kolona predstavlja

nosač stacionarne faze. Slobodna zapremina između sfernih čestica gela omogućava

neometan prolaz rastvarača i rastvorenih makromolekula kroz kolonu. Da bi

mehanizam razdvajanja bio jasan, analizirani polimer na Slici 5.25 sastoji samo se od

dve frakcije makromolekula, koji su prikazani u obliku kugli sa značajno različitim

prečnicima. Manji makromolekuli mogu da difunduju u pore čestica gela, dok veliki

makromolekuli ne mogu da difunduju i oni se kreću bez zadržavanja, zajedno sa

rastvaračem, između čestica gela. Kretanje manjih molekula kroz kolonu se usporava

usled difuzije u pore gela. Što je makromolekul manji, on se duže zadržava u koloni,

usled dubljeg prodiranja u čestice pora gela. Zapremina rastvarača koja je neophodna da

bi se makromolekul eluirao iz kolone je obrnuto proporcionalna njegovoj veličini – što

Protok

rastvarača

Uzorak polimera

Čestica

umreženog,

poroznog

polimera

Hromatogram

Retenciono

vreme

Detektor


122

je makromolekul manji, potrebna je veća zapremina rastvarača za njegovo eluiranje i

obrnuto. Dakle, prilikom propuštanja rastvora polimera kroz GPC kolonu, kolonu će

prvo napustiti veliki makromolekuli, a zatim manji, upravo kao što je prikazano na Slici

5.25. Očigledno je da postoji veza između molske mase molekula (M) i zapremine

rastvarača koja je potrebna za njegovo eluiranje (zapremina eluata ili eluaciona zapremina,

Ve), koja se može iskoristiti za eksperimantalno određivanje molskih masa polimera:

M = f(Ve)

Ova funkcija zavisi od više faktora: hemijske strukture gela kojim je napunjena kolona,

hemijske strukture polimera koji se analizira i njegove koncentracije, vrste mobilne faze

i brzine njenog proticanja kroz kolonu, kao i od temperature i dimenzija kolone. Za

određenu vrstu gela i određeni rastvarač, pri konstantnoj temperaturi i konstantnoj

brzini proticanja rastvarača, pri istim dimenzijama kolone, makromolekuli iste molske

mase će napuštati kolonu posle tačno određene zapremine eluata koja protekne kroz kolonu.

Danas je GPC jedna od najmoćnijih analitičkih tehnika za razumevanje i

predviđanje svojstava polimera. Ona je takođe najpogodnija tehnika za karakterizaciju

kompletne raspodele molskih masa polimera.

5.11.4.1. Gelhromatograf

Danas na tržištu postoji veliki broj gelhromatografa, potpuno automatizovanih

aparata, kojima je moguće veoma brzo i jednostavno odrediti molsku masu i raspodelu

molskih masa polimera. Gelhromatograf se sastoji od sledećih delova:

- Injektora sa petljom

- Jedne ili više kolona koje služe za razdvajanje uzorka po hidrodinamičkim zapreminama,

odnosno molskim masama makromolekula

- Pumpe za proizvodnju visokog pritiska, kojom se podešava brzina proticanja

mobilne faze

- Detektora

- Sistema za obradu podataka.

Različiti polimeri daju rastvore različitih viskoznosti. Pumpa mora da obezbedi istu

brzinu proticanja rastvora, nezavisno od razlike u viskoznosti. Takođe su neki detektori

veoma osetljivi na preciznost protoka mobilne faze. Zbog toga konstantan protok mora

biti suštinska karakteristika pouzdanog gelhromatografa.

Kolone moraju da daju reproduktivne rezultate u dužem vremenskom periodu.

Visoko efikasne kolone obezbeđuju maksimalnu sposobnost razdvajanja i brze analize.

Detektori moraju da budu osetljivi i da pokazuju širok opseg linearnosti, kako bi

mogli da reaguju na tragove analita, kao i na velike koncentracije, ako je potrebno. Kako

sva jedinjenja prelamaju svetlost, diferencijalni refraktometar (RI) se koristi kao


123

univerzalni detektor. On je najčešće korišćeni detektor za praćenje raspodele molskih

masa. Indeks prelamanja polimera je konstantan iznad molske mase od 1000, pa zbog

toga detektor reaguje proporcionalno koncentraciji. Pored informacija o srednjim

vrednostima molskih masa i raspodeli molskih masa polimera, koje se dobijaju sa RI

detektorom, korišćenje UV apsorbujućih detektora može obezbediti informacije o

sastavu polimera, dok detektori na bazi rasipanja svetlosti, u sprezi sa viskozimetrima

daju informacije o strukturi polimera.

5.11.4.2. Materijal za pakovanje kolone – nosač stacionarne faze

Kao nosač stacionarne faze najčešće se primenjuju gelovi dobijeni bubrenjem

umreženih polimera u rastvaraču u kome je rastvoren i polimer kome se određuje raspodela

molarnih masa. Čestice gela treba da budu sfernog oblika, iste po veličini i što je moguće

manje. Ove uslove je neophodno ispuniti da bi se uspostavila brza difuziona ravnoteža,

odnosno raspodela makromolekula između mobilne i stacionarne faze. Kao materijali za

punjenje kolona za GPC najčešće se koriste umreženi polistiren, polimetilmetakrilat i

polivinilacetat.

S obzirom da na uspešnost razdvajanja nema uticaja priroda nosača stacionarne faze,

već veličina i raspodela pora po veličini, kao nosači stacionarne faze koriste se i porozno

staklo i silica-gel. Ovi nosači stacionarnih faza primenjuju se kod određivanja raspodele

molskih masa poliolefina, koji su rastvorni u ograničenom broju rastvarača, kao što su npr.

trihlorbenzen i m-krezol, i to na povišenoj temperature iznad 110 C. Na temperaturama

iznad 100 C umreženi sintetički polimeri su uglavnom nestabilni, pa ne mogu da se koriste

kao nosači stacionarne faze.

Umreženi dekstrani, umreženi poliakrilamid i porozni silika-gel koriste se kao

nosači stacionarnih faza prilikom karakterisanja vodorastvornih polimera. Ovi nosači

bubre u vodi ili se dobro kvase vodom.

5.11.4.3. Mobilna faza

Mobina faza treba da bude dobar rastvarač za analite koji se hromatografišu i,

takođe, mora da onemogućava bilo koju vrstu interakcije (na bazi polarnosti ili

naelektrisanja) između analita i površine stacionarne faze, koje postoje kod

konvencionalne HPLC tehnike. Ako se obezbede eksperimentalni uslovi bez interakcija

analita sa materijalom za pakovanje kolone, biće omogućeno da se najveći molekuli

eluiraju prvi, dok će manji putovati sporije i eluiraće se kasnije (ulaze/izlaze u veliki

broj pora gela). Razdvajanje makromolekula je bazirano na njihovoj veličini u rastvoru i

zbog toga uzorak mora da bude rastvoren u pogodnom rastvaraču.


124

Pri analizi sintetičkih polimera nerastvornih u vodi, kao rastvarači se mogu

koristiti svi organski rastvarači u kojima dobro bubri umreženi polimer i dobro se rastvara

polimer koji se ispituje. Najčešće se u praksi koriste tetrahidrofuran, hloroform i toluen.

Koncentracija uzorka polimera u rastvoru zavisi od njegove molske mase, pa je

npr. za vrednosti molskih masa od ~100000 uobičajeno se radi sa koncentracijama od

0,10 % (m/V).

5.11.4.4. Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom

GPC tehnikom može da odredi nekoliko parametara koji su važni za

karakterizaciju polimera. To su molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti, molska

masa srednja po masenoj zastupljenosti, srednja z vrednost molske mase i najosnovnija

karakteristika polimera – kriva raspodele molskih masa, koja je, zajedno sa označenim

srednjim vrednostima (momentima krive raspodele), prikazana na Slici 5.26. Ovi

parametri su veoma važni, s obzirom da utiču na mnoga karakteristična fizička svojstva

polimera. Kriva raspodele molskih masa polimera predstavlja matematičku funkciju

koja povezuje zastupljenost svake pojedine “vrste” makromolekula (wi na Slici 5.26) i

njegovu molsku masu.

Slika 5.26. Diferencijalna kriva raspodele molskih masa polimera

Legenda: – molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti; - molska masa srednja po

masenoj zastupljenosti; - srednja z vrednost i – srednja viskozimetrijska vrednost

molske mase.

Niskomolekulske supstance se sastoje od molekula istog hemijskog sastava i iste

molske mase, pa su zbog toga monodisperzne. Monomeri, kao što su etilen, stiren, vinil-

hlorid i drugi, su monodisperzni. Ovo ne važi za polimere, zato što se oni sastoje od

Mi


125

makromolekula istog hemijskog sastava ali različite veličine, odnosno različitih molskih

masa. Polimeri su polidisperzni u odnosu na veličinu makromolekula, odnosno molsku

masu. Zbog toga se za polimere koriste srednje vrednosti molskih masa, od kojih najveći

značaj upravo imaju , i . Izuzetak su veoma retki slučajevi polimera koji mogu

biti monodisperzni, tačnije veoma blizu monodisperznom uzorku, i koji se dobijaju

specijalni tehnikama anjonske polimerizacije, a koriste se kao standardi za kalibraciju

GPC instrumenata. Širina GPC pika odražava širinu raspodele veličina molekula za

određeni uzorak polimera. Širi pik znači da uzorak ima širu raspodelu molskih masa, i

obrnuto. Širina raspodele molskih masa izražava se indeksom polidisperznosti

(polimolekularnosti), koji predstavlja odnos vrednosti molske mase polimera po

masenoj zastupljenosti i vrednosti molske mase po brojnoj zastupljenosti, / .

Ukoliko je polimer polidisperzniji utoliko su razlike u vrednostima i veće, pa je i

njihov odnos veći. Ako je polimer monodisperzan, indeks polidisperznosti iznosi 1.

Kada se dobije kriva raspodele molskih masa uzorka polimera, potreban je dalje

način da se ona kvantifikuje. Srednje vrednosti molskih masa su statističke veličine. Da

bi se srednje vrednosti mogle izračunati, instrument mora da se kalibriše. Za kalibraciju,

tj. eksperimentalno određivanje funkcije M = f(Vi), koriste se tri načina:

- Konstruisanje kalibracione krive na osnovu standardnih uzoraka ispitivanog

polimera, koji imaju poznate molske mase i veoma usku raspodelu ( / < 1,10),

- Primena uzorka ispitivanog polimera sa širokom, ali poznatom raspodelom molskih

masa i

- Metoda univerzalne kalibracije.

5.11.4.5. Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom

raspodelom molskih masa

Kada se za kalibraciju koriste standardni uzorci koji imaju različite molske mase i

veoma usku raspodelu, potrebno je da se za seriju uzoraka (obično desetak) ispitivanog

polimera, odrede eluacione krive i sa njih očita vrednost eluacionih zapremina, Ve, koje

odgovaraju maksimumu na krivoj (Slika 5.27). Ekperimentalno je pokazano da je

zavisnost logaritamskih vrednosti poznatih molskih masa polimera, Mi, od

odgovarajućih očitanih vrednosti Ve, za veliki broj polimera pravolinijska, i to u širokom

opsegu molskih masa. S obzirom da makromolekuli različitih polimera, iste molske

mase, imaju različite hidrodinamičke zapremine (zbog različite hemijske strukture i

interakcija sa rastvaračem), to praktično znači da se za svaki polimer mora konstruisati

posebna kalibraciona kriva. Na tržištu se mogu nabaviti standardi polistirena,

polimetilmetakrilata, poliizoprena, polietilenoksida, polietilenglikola, dekstrana i

pululana, uskih raspodela molskih masa, koji se koriste za GPC kalibraciju. Molske mase

standarda određuju se nekom od apsolutnih metoda, na primer:


126

- može da se dobije membranskom osmometrijom ili analizom završnih grupa

(titracija, NMR),

- može da se dobije metodom rasipanja svetlosti,

- vrednost može da se dobije ultracentrifugiranjem.

Slika 5.27. Konstruisanje kalibracione krive logMi – Ve,

za određivanje molske mase nepoznatog uzorka polimera

Kada se izvrši kalibracija GPC instrumenta, sve ove srednje vrednosti mogu da se

dobiju na osnovu samo jednog injektovanja.

Izračunavanje raspodele molskih masa iz podataka dobijenih GPC metodom

zasniva se na činjenici da je odgovor detektora proporcionalan koncentraciji polimera u

rastvoru koji protiče kroz kolonu, pa je zbog toga i površina ograničena baznom linijom

i krivom, koja prikazuje promenu odgovora detektora sa eluacionom zapreminom,

proporcionalna ukupnoj masi uzorka polimera koji je hromatografisan (Slika 5.28). Kod

difrakcionog refraktometra kao detektora, odgovor detektora predstavlja razliku u

indeksima prelamanja ( n) čistog rastvarača (eluent) i rastvora makromolekula (eluat),

koja se kontinualno meri.

Signal

detektora

Polidisperzni

uzorak

Monodisperzni

standardi

Isključeni

makromolekuli

Molekuli koji delimično

prodiru u gel

Molekuli koji potpuno

prodiru u gel

Mi

Vi

logMi

Ve


127

Da bi se dobio maseni udeo pojedinih frakcija polimera, površina treba da se

podeli na odgovarajući broj intervala (Slika 5.28), pri čemu je visina, hi, koja odgovara

sredini intervala, proporcionalna masi frakcije, čija je molska masa Mi. Maseni udeo

frakcije, wi, sada može da se izračuna iz izraza:

Molska masa frakcije Mi se očitava sa kalibracione krive, za odgovarajuću

eluacionu zapreminu Ve,i . Koristeći određene vrednosti za wi i Mi, za sve frakcije, može

se konstruisati kriva raspodele molskih masa hromatografisanog polimera. Srednje

vrednosti molskih masa mogu se izračunati prema sledećim jednačinama:

Svi gelhromatografi su su automatizovani i povezani sa sistemom za obradu

podataka, tj. kompjuterom, koji je povezan sa detektorom, a isto tako i sa meračem

zapremine rastvora koja istekne iz kolone. U memoriju kompjutera ubace se podaci za

kalibracionu krivu i program po kome se rezultati obrađuju. Kao rezultat

hromatografisanja uzorka polimera dobijamo izračunatu krivu njegove raspodele

molskih masa i sve srednje vrednosti.

Slika 5.28. Idealizovani hromatogram uzorka polimera i podela na intervale

koji odgovaraju određenim molskim masama

Normalizovana

površina

Eluaciona zapremina Vi

wi

wi = 1


128

5.11.4.6. Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa

Gelhromatograf se takođe može kalibrisati korišćenjem standarda koji ima široku

raspodelu molskih masa i istu hemijsku strukturu kao i ispitivani uzorak polimera

nepoznate raspodele molskih masa. Standardi sa širokom raspodelom molskih masa,

dobro okarakterisani u pogledu , i , mogu se kupiti od različitih

proizvođača. Srednje vrednosti molskih masa ovih standarda određene su drugim

metodama kao što su na primer membranska osmometrija, rasipanje svetlosti i

ultracentrifugiranje. Alternativno, i aktuelnom uzorku za analizu (ako ga ima u

dovoljnoj količini) mogu se odrediti molske mase pomenutim tehnikama.

Srednje vrednosti molskih masa se unose u softver kompjutera i standard sa

širokom raspodelom molskih masa se zatim hromatografiše na uobičajeni način, pod

istim uslovima pod kojima će se hromatografisati i nepoznati uzorak. Softver zatim

“fituje” široki oblik hromatografskog pika prema datim srednjim vrednostima molskih

masa. Rezultujuća kalibraciona kriva sadrži tačke za svaku srednju vrednost. Ako su

poznate samo i vrednosti, kalibraciona kriva će se sastojati od te dve tačke i od

tačke koja odgovara molskoj masi vrha hromatografskog pika, odnosno kriva će imati

ukupno tri tačke.

Preporučuje se da se za kalibraciju koriste dva “široka” standarda različitih

molskih masa, da bi se povećao opseg molskih masa kalibracione krive. Tada se dobija

kalibraciona kriva sa šest tačaka, što i dalje predstavlja mali broj tačaka, ali je ovakva

kriva ipak zadovoljavajuća za svakodnevnu, rutinsku analizu polimera koji ima molske

mase u istom opsegu kao i “široki” standardi korišćeni za kalibraciju.

5.11.4.7. Univerzalna kalibracija

Kako se GPC tehnikom makromolekuli razdvajaju prema veličini hidrodinamičke

zapremine u rastvoru, a ne prema hemijskom sastavu, veliki broj istraživača je pokušao

da iskoristi ovu činjenicu i da postavi univerzalnu kalibracionu krivu. Najviše uspeha u

konstruisanju univerzalne kalibracione krive imao je Benoit, koji krenuo od poznate

jednačine Flory-Fox-a:

[ ]M = r(< r2 >)3/2

Benoit je konstatovao da je za jedan rastvarač, bez obzira na hemijsku strukturu

polimera, proizvod graničnog viskozitetnog broja, [ ], i molske mase polimera, M,

proporcionalan trećem stepenu poluprečnika inercije, r3. Pošto je r konstanta,

proizvod [ ]M se može uzeti kao mera hidrodinamičke zapremine, odnosno mera

veličine makromolekula u rastvoru. Eksperimentalno je pokazano da za veliki broj

polimera u istom rastvaraču važi da je:


129

log([ ]M) = A - bVe

gde su A i b konstante.

Kada se za čitav niz različitih polimera eksperimantalno odrede vrednosti [ ]M i

Ve u istom rastvaraču i unesu u koordinatni sistem log([ ]M) - Ve, tada sve tačke leže na

jednoj krivoj, koja se može smatrati univerzalnom kalibracionom krivom (Slika 5.29).

Slika 5.29. Tipična univerzalna kalibraciona kriva

5.12. Primena HPLC tehnike u analizi hrane

Veoma veliki broj metoda koje se odnose na primenu HPLC tehnike za analizu

hrane je do sada opisan u literaturi. Pored primera koji su već dati u Poglavlju 5, ovde će

biti dat pregled još nekih tipičnih primera primene HPLC metoda u analizi

prehrambenih proizvoda. Sve velike kompanije za proizvodnju HPLC instrumenata

(Waters, Agilent) publikovale su svoje kataloge u kojima su opisani brojni

standardizovani postupci i metode koje se primenjuju u analizi hrane.

Eluaciona zapremina (5 ml, rastvarač THF)

PS (polistiren)

PS u obliku češlja

PS u obliku zvezde

Hetero-kalemljeni kopolimer

PVC polivinilhlorid

Kalemljeni kopolimer PS/PMMA

Polifenilsiloksan

Polibutadien

Eksponencijalna kriva

PMMA (polimetilmetakrilat)


130

U Tabeli 5.5. prikazan je samo mali broj jedinjenja koja su značajna za

prehrambenu industriju, a koja se mogu analizirati primenom HPLC metoda. Skoro svi

osnovni sastojci namirnica, kao što su proteini, lipidi, ugljeni hidrati i vitamini su

pogodni za analizu tečnom hromatografijom. Primena različitih vrsta kolona i detektora

za ove analize odražava prilagodljivost ove tehnike različitim analitima.

Tabela 5.5. Primeri jedinjenja značajnih za prehrambenu industriju,

koja se mogu analizirati HPLC metodama

Analit Proizvod koji se analizira

Kolona i detektor

Askorbinska kiselina

Bezalkoholna pića; hrana za bebe; mleko u prahu; krompir i ljuske od krompira.

Kolona - silika-gel sa amino-nitrilnim grupama ; izokratsko eluiranje; mobilna faza – sirćetna kiselina/metanol (75/25); UV detektor (248 nm).

Kofein; teobromin

Kakao; čokolada, čokoladni premazi i likeri od čokolade.

Kolona – silika-gel sa oktadecil- grupama (ODS); izokratsko eluiranje; mobilna faza – methanol/voda/sirćetna kiselina (20/79/1); UV detektor (272 nm).

Saharin; acesulfam-K

Pića na bazi pomorandže; čokolada za dijabetičare.

ODS kolona; mobilna faza – kalijumdihidrogen-ortofosfat, tetrabutil-amonijumhidrogen-sulfat, methanol, hlorovodonična kiselina, voda, konačni pH = 4; UV detektor (212 nm za saharin i 227 nm za acesulfam-K).

Benzoeva kiselina; sorbinska kiselina; metil-, etil- i propil-p-hidroksibenzoat

Jogurt; sir; bezalkoholna pića; vino.

Kolona – silika-gel sa oktil- grupama (C8); mobilna faza – methanol/0,01mol dm-3 amonijum acetat (40/60), pH = 4,5; UV detektor (240 nm).

Stiren

Sve vrste prehrambenih proizvoda.

ODS kolona; mobilna faza – methanol/voda (7/3); UV detektor (254 nm.

Šećeri

Meso; cerealije; voće; voćni sokovi i sirupi.

Jonska hromatografska kolona; pulsni amperometrijski detector sa Au elektrodom; mobilna faza – 150 mmol dm-3 natrijum-hidroksida + 0,30 mmol dm-3 zink acetata (analiza od sukroze do maltose) ili Pakovana GPC kolona; RI detektor; mobilna faza – voda.

Slobodni tokoferoli i tokotrienoli

Životnjska i biljna ulja i masti.

ODS kolona; mobilna faza – heptan/ heptan zasićen vodom/2-propanol (49,55/49,55/0,9); Fluorescentni detektor (pobuđivanje na 290 nm i emisija na 330 nm).


131

Skoro svaka vrsta prehrambenog proizvoda može da se ekstrahuje u cilju

identifikacije i kvantitativnog određivanja tragova analita. U cilju upoznavanja sa vrstom

pripreme uzorka koja je neophodna i informacijama koje daje HPLC metoda, može se na

primer opisati analiza organskih kiselina u voćnim sokovima.

Voćni sokovi se veoma često analiziraju da bi se ispitalo da li je proizvod

neovlašćeno izmenjen i/ili da li je pokvaren. Analitičar koji vrši ispitivanje proizvoda

pretražuje spisak standardnih HPLC metoda i utvrđuje da li postoji pogodna metoda za

tip jedinjenja koje treba da se analizira. Kada se takva metoda pronađe, ona može da se

primeni na uzorak bez izmena ili neznatno modifikovana, u zavisnosti od supstrata

donetog na analizu. Pri ispitivanju voćnih sokova metoda obuhvata analizu organskih

kiselina kao što su askorbinska, maleinska i ćilibarna. Režim HPLC razdvajanja koji se u

ovom slučaju primenjuje je jonska hromatografija i to reverzno-fazno razdvajanje na

osnovu hidrofobnih reakcija, kada je slabi jonoizmenjvač neutralizovan (engl.

hydrophobic ion suppression). Kiseli pufer se koristi da bi se smanjila pH vrednost

mobilne faze i na taj način suzbila jonizacija organskih kiselina. To takođe omogućava

zadržavanje kiselina na koloni. Komponente uzorka se eluiraju i razdvajaju na reverzno-

faznoj koloni (C18) i detektuju UV-detektorom podešenim na 220 nm. Koncentracija

kiselina se određuje pomoću eksternog standarda (u ovom slučaju su korišćene i

jabučna i fumarna kiselina). Mobilna faza je 2 % vodeni rastvor kalijum-hidrogen-

fosfata (KH2PO4), podešen na pH 3,2 pomoću fosforne kiseline. Brzina proticanja

mobilne faze je 0,5 ml/min.

Oblast primene GPC metode, osim za određivanje molskih masa i raspodele

molskih masa polimera, obuhvata razdvajanje kompleksnih smeša u cilju prečišćavanja

uzoraka. Primeri su uklanjanje soli i drugih niskomolekularnih jedinjenja iz biološkog

materijala i uklanjanje plastifikatora iz sintezičkih polimera. Polimeri su takođe veoma

važni za prehrambenu industriju, pošto se mnogi od njih koriste kao materijali za

pakovanje hrane.

Gel-propusnom hromatografijom mogu da se razdvoje smeše polimera i drugih

jedinjenja na, na primer, frakcije polimera, oligomera, monomera i aditiva. Jedan od

prvih GPC eksperimenata od strane kompanije Waters bio je analiza gume za žvakanje.

Guma za žvakanje je smeša sintetičkog polimera sa aditivima kao što arome,

stabilizatori, omekšivači, itd. Na Slici 5.30. prikazan je GPC hromatogram gume za

žvakanje, gde su komponente smeše razdvojene uz upotrebu nekoliko serijski vezanih

kolona. Polimer, tj. guma u ovom slučaju se eluira prva, zato što je najveći molekul u

smeši, a zatim se ređaju aditivi opadajućim redosledom u pogledu veličine molekula.


132

Slika 5.30. Razdvajanje komponenata gume za žvakanje GPC tehnikom

Primenom GPC metode se mogu određivati različite arome u prehrambenim

proizvodima, a takođe se mogu analizirati uzorci biološkog porekla, npr. izolovati

proteini.

Rezime poglavlja

U tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) mobilna faza je tečnost a

stacionarna faza je čvrsta. HPLC je jedna od najmoćnijih tehnika u analitičkoj hemiji koja

pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog određivanja jedinjenja koja

su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u tečnosti. HPLC je veoma efikasna

tehnika za razdvajanje, kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska kroz

kolone punjene česticama malih dimenzija a velike specifične površine za interakciju sa

molekulima koji se razdvajaju. HPLC metoda je pogodna za analizu organskih jedinjenja

koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasnohromatograsku analizu bez

prethodne derivatizacije. Osnovni delovi HPLC instrumenta su injektor, kolona, pumpa za

proizvodnju visokog pritiska, detektor i sistem za obradu podataka. Za pakovanje HPLC

kolona najčešće se koriste: silika-gel i različite vrste hemijski modifikovanog silika-gela,

kopolimeri na bazi stirena i divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje.

Razdvajanje u HPLC tehnici može da se postigne na osnovu polarnosti,

naelektrisanja i veličine molekula.

gumaza žvakanje GPC

polimer

komponente

omekšivač stabilizator aroma


133

Dva osnovna načina razdvajanja zasnovana su na polarnosti: hromatografija

normalnih faza i hromatografija reverznih faza. Kada je stacionarna faza polarnija od

mobilne faze, radi se o režimu normalnih faza Suprotno, kada je mobilna faza polarnija od

stacionarne faze, takva tehnika se naziva hromatografijom reverznih faza.

Ako se razdvajanje zasniva na naelektrisanju, odnosno na razlikama u afinitetu

jonskih vrsta u rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa nekih adsorbenasa, tada

se tehnika razdvajanja naziva jonska hromatografija.

Tehnika razdvajanja na osnovu veličine molekula je gel-propusna hromatografija

(GPC). GPC se najčešće koristi za razdvajanje prirodnih i sintetičkih makromolekula.

Kolone koje se koriste za GPC su punjene umreženim polimerima sa specifičnim opsegom

veličine pora. Čestice umreženog polimera u rastvaraču prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje

gela. Raspodela veličina pora gela je u opsegu koji dozvoljava analiziranim

makromolekulima da uđu u pore ili da, manje ili više, budu “istisnuti” iz zapremine pora,

što vodi njihovom razdvajanju po veličini, odnosno molskoj masi.

Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije

kod koje se specifičan molekul iz smeše vezuje se za “kompatibilan” molekul koji je

kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz kolonu bez

zadržavanja. Najveći broj interakcija na kojima se zasniva afinitetna hromatografija su

biohemijske interakcije, npr. antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor.

U analizi hrane, HPLC se primenjuje za ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive,

sintetičke boje, prirodne pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide),

aminokiseline i druga jedinjenja.


1. Objasniti princip rada tečne hromatografije visokih performansi.

2. Navesti i opisati osnovne delove HPLC sistema.

3. Opisati dva osnovna režima HPLC razdvajanja koji su zasnovani na polarnosti:

hromatografiju normalnih faza i hromatografiju reverznih faza.

4. Objasniti princip rada jonske hromatografije.

5. Opisati tehniku gel-propusne hromatografije.

6. Objasniti princip rada afinitetne hromatografije.

Literatura

1. L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion – Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, 2000.

2. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 3, Library4science, 2003.


134

3. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 5,

Library4science, 2003.

4. V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 2004.

5. S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2004.

6. S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2007.

7. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid

Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2010.

8. L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, 2013.

9. S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography:

Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

10. S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

135

6. LITERATURA

1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380, 1910.

2. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, 1941.



5. Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp 819-872, 1993.

6. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry – A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, 1996.

7. J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier, Amsterdam, 1997.

8. S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication®, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, 1998.


10. L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion – Revised and Expanded, Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, 2000.

11. Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold-Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G. Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography, Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp. 969–992, 2001.

12. R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series –Book 1, Library4science, 2003.

13. R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 2, Library4science, 2003.

14. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 3, Library4science, 2003.

15. R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 4, Library4science, 2003.

16. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 5, Library4science, 2003.

Literatura

136



19. E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A: Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library – Volume 69A, Elsevier, Amsterdam, 2004.

20. V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 2004.

21. S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2004.

22. J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2005.

23. F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2007.

24. S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2007.

25. R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2008.

26. S. Ötles (Ed.)¸ Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, 2009.

27. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2010.

28. O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass Spectrometry – A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, 2011.

29. L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton - New York, 2013.

30. S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

31. S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography: Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

32. Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA, 2014.

CIP - Каталогизација у публикацији Народна библиотека Србије, Београд

543.544(075.8)(0.034.2)

АНТИЋ, Весна В., 1967- Hromatografija u analizi hrane [Elektronski izvor] / Vesna V. Antić, Mališa P. Antić. - 1. izd. - Zemun : Poljoprivredni fakultet, 2014 (Zemun : Poljoprivredni fakultet). - 1 elektronski optički disk (CD-ROM); 12 cm

Sistemski zahtevi: Nisu navedeni. - Nasl. sa naslovnog ekrana. - Tiraž 100. - Sadrži bibliografiju.

ISBN 978-86-7834-200-4 1. Антић, Малиша П., 1965- [аутор] a) Хроматографија COBISS.SR-ID 208752140

nvp « á poljoprivredni fakultet univerzitet u … u... · piroliza interni standard nvp nvp....

Documents