o papel da lisofosfatidilcolina na ativação do...

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Universidade de Braslia UnB

Instituto de Cincias Biolgicas - IB

Programa de Ps-Graduao em Biologia Molecular

O papel da lisofosfatidilcolina na ativao do

inflamassoma NLRP3 e sua relao com a formao

de clulas gordurosas

Rafael Corra

Orientadora:

Prof. Dra. Kelly Grace Magalhes

Braslia

Fevereiro, 2016

2

Universidade de Braslia UnB

Instituto de Cincias Biolgicas - IB

Programa de Ps-Graduao em Biologia Molecular

Rafael Corra

O papel da lisofosfatidilcolina na ativao do

inflamassoma NLRP3 e sua relao com a formao

de clulas gordurosas

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular,

para a obteno do ttulo de Mestre em Biologia Molecular.

Orientadora:

Prof. Dra. Kelly Grace Magalhes

Braslia

Fevereiro, 2016

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Rafael Corra

O papel da lisofosfatidilcolina na ativao do inflamassoma NLRP3 e sua

relao com a formao de clulas gordurosas

Data: 19 de Fevereiro de 2016

Banca Examinadora

Prof. Dra. Kelly Grace Magalhes (Presidente)

Programa de Ps-graduao de Biologia Molecular- Universidade de Braslia

Prof. Dr. Marcelo de Macedo Brgido (Membro)

Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular - Universidade de Braslia

Prof. Dra. Patrcia Torres Bozza (Membro)

Instituto Oswaldo Cruz Rio de Janeiro

Prof. Dr. Jos Raimundo Correa (Membro suplente)

Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular - Universidade de Braslia

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Agradecimentos

A Deus pelo dom da vida, cincia e sabedoria. Por todo o suporte emocional, fsico e

material, alm de sempre estar presente na minha vida me abenoando e protegendo.

A minha orientadora Dra. Kelly Grace Magalhes por ter me acolhido, ensinado e

direcionado durante toda a minha carreira acadmica, e por todas as vezes que ela foi, amiga,

psicloga, confidente e principalmente Me. Agradeo por ter enxergado em mim, um

potencial que nem eu mesmo sabia que possua, por acreditar e confiar em mim desde sempre,

sem voc este trabalho certamente no existiria.

A minha amiga, irm e co-autora Raquel das Neves Almeida por ter caminhado junto

comigo desde do primeiro dia da graduao at hoje, por me ajudar nos momentos em que

quis desistir, por ser companheira das madrugadas na escrita ou no lab. Por sempre acreditar e

confiar em mim, e por todas as vezes que eu precisava de uma palavra amiga, um abrao ou

at mesmo um chocolate e voc estava sempre ao meu lado.

Aos meus co-autores Dalila e Lus Felipe, por todo apoio experimental e psicolgico

alm da companhia maravilhosa de vocs dois todos os dias no lab. sem vocs esse trabalho

no teria ficado to bom. Aos meus colegas, ex-colegas e amigos do Laboratrio de

Imunologia e Inflamao (LIMI): Adrielle, Beatriz, Ceclia, rika, Gabriel, Larissa, Lvia,

Lus Henrique, Nayara e Tiago. E aos agregados do LIMI: Ivy, Michelle e Pedro por toda a

pacincia em conviver comigo e por tudo o que fizeram por mim.

A todos estes listados que me ajudaram de alguma forma quando precisei: ao Lab. De

Radicais Livres (GPRO): Daniel, Ting, Luana, Igor, Hylane e Prof. Marcelo. Lab. De

Imunologia Aplicada (LIA): Raffael, Mrcio, Karina, Angelina, Pedro, Isaque, Gabriela,

Dawane, Prof. Aldo e Prof. Anamelia; (Ana Camila, Tssia e Luza). Ao Lab. De Interao

Parasito-Hospedeiro (LIPH): Raquel, Clnia, Camila, Milene, Natlia, Grazi, Yanna, Carol,

Marta e a Prof. Izabela, (Jhonata); Ao Lab. de Microscopia: Lorena, Jos, Nbia, Daniella e

ao Prof. Corra. Ao Lab. de Virologia: Miguel, Dbora, Daniel e o Prof. Fernando. Ao Lab.

de Anlises Moleculares de Patgenos (LAMP): Nayara, Erick, Prof. Tatiana e o Prof.

Vicente. A Prof. Cecilia, Prof. Beatriz, Sara, Jivago e Adriana do Biotrio. A Amanda, Joo

Paulo e todos os colegas do corredor da Biofsica em especial ao Chiquinho por todo suporte

e ajuda que me foi concedida.

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Aos meus bioamigos, Agnelo, Miguel e Mara, Raffael Castro e Raquel Almeida por

serem os melhores amigos que a biologia poderia me conceder, obrigado por estarem junto

comigo realizando este sonho. Que nossa amizade seja eterna.

As minhas melhores amigas Gleice Borges e Thas Amanda por todo o apoio

psicolgico, emocional e por todas as vezes que me ajudaram no lab. Etiquetando meus

tubinhos ou lavando minhas placas de ELISA, uma honra ter amigas como vocs.

As minhas meninas, Carol, Jussara, Rayane, Deyse, Bia, Veronica, Isadora e Camila.

Pela amizade, fidelidade, pacincia e compreenso. Aos meus amigos da Igreja, Claiton,

Ruan, Matheus Lothar, Matheus Rezende, Marcus Vinicius. Aos meus amigos de ensino

mdio, Weslen e Melissa, Geisiane, Diogo, Fabula, Yuri e Nayara, Paulo, Davson, Vanya,

irka e a todos que me apoiaram e me incentivaram durante todos esses anos.

Aos meus Vizinhos e amigos Jari e Evanor, por me ajudarem financeiramente, me

dando apoio e incentivo em todos os momentos. Aos meus afilhados Carol, Pablynne e Paulo

Henrique, Deus me deu vocs de presente pra cuidar e amar.

A minha famlia, minha me Lucineide e meu pai Marcos por me gerarem e criarem

com tanto amor, carinho e cuidado. A minha irm e melhor amiga Isabela por todas as vezes

que cuidou de mim, me amou e foi pro lab. etiquetar meus tubinhos. A meus animais de

estimao Amy e Uli por me mostrarem o amor da forma mais sincera e leal possvel. Vocs

so o bem mais precioso e valioso que eu possuo a melhor coisa que eu nunca tive e apesar

das dificuldades defeitos, a melhor famlia que eu poderia ter. A todos os meus Tios, Tias,

primos e primas, em especial aos meus padrinhos Hildete e Minoro por serem os melhores

padrinhos que eu poderia ter.

Essa dissertao eu dedico em especial a memoria das minhas duas avs, Maria

Moraes Correa e Josefa Romana de Jesus, por todo o amor, carinho, palavras de sabedoria e

incentivo. Esse ttulo pra vocs muito obrigado por tudo que fizeram por mim e por meus

pais. Saibam que meu amor e gratido por vocs sero infinitos.

Por fim, agradeo a Universidade de Braslia por ser minha segunda casa desde 2010,

ao programa de ps-graduao em Biologia Molecular, e as agencias de fomento FAPDF e

CNPq.

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Sumrio

Resumo ...................................................................................................................................8

Abstract...................................................................................................................................9

Lista de Abreviaturas............................................................................................................10

1) Introduo..........................................................................................................................12

1.1 Aterosclerose .................................................................................................................12

1.2 Lisofosfatidilcolina........................................................................................................14

1.3 Corpsculos lipdicos.....................................................................................................16

1.4 Inflamassoma e piroptose .............................................................................................18

2) Justificativa ......................................................................................................................22

3) Objetivos............................................................................................................................23

4) Materiais e Mtodos.........................................................................................................24

4.1 Camundongos, tratamentos in vivo e consideraes ticas...........................................24

4.2 Clulas utilizadas...........................................................................................................24

4.3 Estmulos e tratamentos.................................................................................................25

4.4 Anlise da viabilidade celular........................................................................................25

4.5 Anlise da ativao de caspase-1...................................................................................26

4.6 Anlise da produo de espcies reativas de oxignio..................................................26

4.7 Dosagem de citocinas.....................................................................................................27

4.8 Anlise da biognese de corpsculos lipdicos por citometria de fluxo e microscopia de

fluorescncia confocal.............................................................................................................27

4.9 Anlise de HMGB1 por imunofluorescncia.................................................................28

4.10 Anlises estatsticas......................................................................................................28

5) Resultados...........................................................................................................................29

5.1 A LPC possui um efeito citotxico e diminui a viabilidade celular de moncitos e

clulas endoteliais humanas.....................................................................................................29

5.2 LPC induz a ativao de Caspase-1 em macrfagos murinos.........................................30

5.3 LPC induz a produo de ROS in vitro e in vivo............................................................31

7

5.4 LPC induz a secreo de IL-1 em moncitos humanos.................................................33

5.5 Mecanismos de secreo de IL-1 induzida por LPC.....................................................35

5.6 A secreo de IL-1 em camundongos estimulados com LPC.......................................38

5.7 LPC induz a translocao do HMGB1 para o citoplasma em moncitos e clulas

endoteliais.................................................................................................................................39

5.8 LPC induz a biognese de corpsculos lipdicos em moncitos humanos......................41

5.9 Mecanismos envolvidos na biognese de CL em moncitos mediados por LPC...........43

5.10 LPC induz a biognese de corpsculos lipdicos em clulas endoteliais......................45

5.11 Mecanismos envolvidos na biognese de CL em clulas endoteliais mediados por LPC

...................................................................................................................................................47

5.12 LPC induz a biognese de CL in vivo, independente de Caspase-1/11 e NLRP3.........49

5.13 LPC induz a liberao de fatores pela clula endoteliais que medeiam a ativao de

moncitos humanos...................................................................................................................50

5.14 LPC induz a secreo de citocinas pr-inflamatrias por moncitos e clulas

endoteliais.................................................................................................................................52

6) Discusso ............................................................................................................................53

7) Concluses...........................................................................................................................60

7.1 - Modelo Proposto..............................................................................................................61

8) Referncias..........................................................................................................................62

8

O papel da lisofosfatidilcolina na ativao do inflamassoma NLRP3 e sua relao com a

formao de clulas gordurosas.

Resumo

Dissertao de mestrado

Rafael Corra

A Lisofosfatidilcolina (LPC) um lisofosfolipdio que constitui a membrana plasmtica e

possui um papel importante na sinalizao celular, pois est diretamente associada albumina

e a lipopoliprotenas. A LPC tem um amplo espectro de atividades pr-inflamatrias e exerce

um papel fundamental durante a aterosclerose, pois ela o principal componente fosfolipdio

de lipoprotenas de baixa densidade oxidada (oxLDL). Ela tambm capaz de induzir a

formao de clulas gordurosas, as quais so componentes celulares fundamentais para o

estabelecimento da aterosclerose e recrutamento leucocitrio para o stio desta patologia,

induzindo a progresso da doena. No entanto, o papel de LPC na ativao do inflamassoma e

na modulao da biognese de corpsculos lipdicos (CLs) neste processo ainda mal

compreendido. Este estudo tem por objetivo investigar se LPC capaz de ativar o

inflamassoma NLRP3 e induzir a secreo de IL-1 relacionando com os mecanismos de

formao de clulas gordurosas por meio da anlise da biognese de CLs. Nossos resultados

mostraram que a LPC induz um efeito citotxico em altas concentraes em moncitos e

clulas endoteliais, alm de induzir a produo de espcies reativas de oxignio (ROS) e a

ativao de caspase-1. A LPC induz a ativao do inflamassoma NLRP3 atravs da induo

da secreo de IL-1 dependente de efluxo de potssio, dano lisossomal, reconhecimento via

TLR-2, ativao de PPAR e estabilizao das jangadas lipdicas em moncitos humanos e

dependentes das caspases-1/11 e do inflamassoma NLRP3 em macrfagos peritoneais de

camundongos. Alm disso, a LPC induz a translocao do HMGB-1 do ncleo para o

citoplasma tanto em clulas endoteliais quanto em moncitos. Outro resultado importante foi

induo da formao de clulas gordurosas, via LPC, em moncitos e clulas endoteliais in

vitro, atravs do aumento da biognese de CLs de maneira independente do inflamassoma

NLRP3 e das caspases-1/11 in vivo. Alm disso, as clulas endoteliais estimuladas com LPC

ativam moncitos a se transformarem em clulas gordurosas, atravs da induo da biognese

de CL, por mecanismo ainda desconhecido. Portanto, o presente trabalho caracterizou

diferentes mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formao de clulas gordurosas,

correlacionando-os com as vias de ativao dos inflamassomas e do metabolismo lipdico

celular, e que corroboraram para a criao de um microambiente propcio ao estabelecimento

e manuteno da formao de placas aterosclerticas.

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The role of lysophosphatidylcholine in the activation of the NLRP3 inflammasome and its

relation to the formation of foam cells

Abstract

Dissertao de mestrado

Rafael Corra

Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has

an important role in cell signaling because it is directly associated with albumin and

lipoproteins. The LPC has a broad spectrum of pro-inflammatory activity and plays a key role

in atherosclerosis, since it is a major phospholipid component of oxidized low density

lipoprotein (oxLDL). Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam

macrophages, which are the key cell component for the establishment of atherosclerosis and

leukocyte recruitment on the site of the pathology. However, the role of LPC in modulating

inflammasome activation and lipid droplet biogenesis in this process is poorly understood.

This study is aimed to investigate if LPC is capable of inducing inflammasome activation and

IL-1 secretion, verify the foam cell formation by analyzing lipid droplet biogenesis and

characterize the signaling pathway involved in this process. Our results showed that LPC

induces a cytotoxic effect in high concentrations in monocytes and endothelial cells,

generation of reactive oxygen species (ROS) and activation of caspase-1. LPC induces

activation of the inflammasome NLRP3 by induction of IL-1 secretion dependent of

potassium efflux, and lysosomal damage via TLR-2 recognition, PPAR gamma activation and

stabilization of lipid rafts in vitro, and caspase-1/11 and NLRP3 inflammasome in vivo

assays. Furthermore, LPC induced translocation of HMGB1 from the nucleus towards the

cytoplasm in endothelial cells and monocytes. Another important result was the induction of

the formation of foam cells by LPC both in monocytes and endothelial cell in vitro assays, by

increasing the biogenesis of lipid droplets in a manner independent of the NLRP3

inflammasome and caspase-1/11 in vivo. Additionally, endothelial cells stimulated with LPC

activated monocytes to transform into foam cells through induction of lipid droplets

biogenesis by unknown mechanism. Therefore, the present study characterized different

cellular and molecular mechanisms involved in the formation of foam cells, correlating them

with the activation pathways of inflammasomes and cellular lipid metabolism, and

corroborated to create a favorable microenvironment for the establishment and maintenance

of formation atherosclerotic plaques.

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Lista de abreviaturas, acrnimos, siglas e smbolos

AA cido araquidnico

ADRP Protena relacionada diferenciao de adipcitos

AIM-2 Ausente no melanoma 2

ASC Protena particular associada apoptose contendo domnio de recrutamento de caspase

ATP Adenosina Trifosfato

BIR Domnio inibidor de baculovrus

CARD Domnio para recrutamento de caspase (CARD)

CL Corpsculo lipdico e ou CLs Corpsculos lipdicos

CO2 Dixido de carbono

DAMPs Padres moleculares associados a perigo

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DFC-DA 2,7 Diclorodihidrofluorescena-diacetato

DMSO Dimetilsulfxido

DNA cido desoxirribonucleico

DP Desvio padro

ELISA Ensaio imunoenzimtico

Fig. Figura

GM-CFS Fator de crescimento de colnias para granulcitos/moncitos

GPCR Receptor acoplado protena G

h Hora

HDL Lipoprotena de alta densidade

HMGB-1 Protena do grupo de alta mobilidade B1

HMGCoa 3-hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA redutase

HUVEC Clulas endoteliais derivadas de veia umbilical humana

ICAM-1 Molcula de adeso intercelular 1

INF Interferon

IL Inteleucina

LCAT Lecitina-colesterol aciltransferase

LDL Lipoprotena de baixa densidade

LE Lipase endotelial

LH Lipase heptica

LPC Lisofosfatidilcolina

LPL Lisofosfolipdios

LPS Lipopolissacardeo

MCD Metil- -ciclodextrina

MCP-1 Protena quimioatraente de moncitos/macrfagos

M-CSF Fator estimulante de colnia de macrfagos

MFI Mdia de intensidade de fluorescncia

mL - Mililitro

mM- Milimolar

NAC N-Acetil-L-Cisteina

NE No estimuladas

NFB Fator nuclear B

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NLRC Receptor do tipo NOD que contm domnio CARD

NLRP Receptor do tipo NOD que contm domnio pirina

NOD Domnio de oligomerizao de nucleotdeos

NK Clulas Natural Killer

OxLDL Lipoprotenas de baixa densidade oxidadas

PAMPS Padres moleculares associados a patgenos

PARP Poli-[ADP-ribose]-polimerase

PAT Famlia composta por perilipina, ADRP e TIP47

PBS Tampo Salino Fosfato

PC Fosfolipdios

pg Picograma

PLA2 Fosfolipase A2

PPAR Receptor ativado por proliferadores de peroxissomos

PRR Receptor de reconhecimento padro

PYD Pirina

ROS Espcies Reativas de Oxignio

RPMI Meio Roswell Park Memorial Institute

SFB Soro Fetal Bovino

THP-1 Linhagem de moncitos humanos

TGF- Fator de transformao do crescimento -

TLR Receptores do tipo Toll

TCD4+ Linfcitos T CD4 + (T helper )

TNF- Fator de necrose tumoral -

TIP-47 Protena de interao da poro terminal de 47 quilodaltons

V-CAM-1 Molcula de adeso celular vascular-1

WT - Tipo selvagem

g - Micrograma

M Micromolar

12

1. Introduo

1.1. Aterosclerose

As doenas cardiovasculares esto entre as principais causas de morte no mundo, onde a

doena isqumica do corao e o acidente vascular cerebral so responsveis por uma em

cada quatro mortes no mundo, e a aterosclerose a causa subjacente na maioria dos casos

(Lozano et al. 2012). A aterosclerose uma doena inflamatria crnica que se estabelece

pelo acmulo de lipdios na camada ntima arterial, resultando na formao de leses

vasculares, ou placas, que so caracterizadas por inflamao, morte celular e fibrose. A

aterosclerose geralmente permanece assintomtica ao longo de vrias dcadas, at que ocorra

uma ruptura da placa, provocando a formao de trombos que obstruem o vaso, causando

severos danos teciduais e at mesmo um ataque cardaco fulminante (Lundberg & Hansson

2010).

Os tradicionais fatores de risco incluem a idade, hipercolesterolemia, hipertenso arterial,

tabagismo, sexo, diabetes mellitus e histrico familiar, alm de dietas ricas em gorduras,

colesterol e triglicerdeos, obesidade e sedentarismo (Hopkins & Williams 1981). Na ltima

dcada, foi identificado um grande nmero de compostos biolgicos como novos fatores de

risco de aterosclerose. Estes compostos incluem fatores para a coagulao anormal e reduzida

(fibrinlise), remodelao cardiovascular, inflamao, adeso celular e infeco (Frishman

1998). A partir dessa identificao muitos estudos se mostram importantes para o melhor

entendimento dessa patologia (Hacman & Anand 2003).

Aps a descoberta de clulas imunes em placas aterosclerticas utilizando anticorpos

monoclonais (Jonasson et al. 1986), um grande foco foi colocado sobre a inflamao na

investigao das doenas cardiovasculares e isto levou a grandes descobertas a respeito da

patognese da aterosclerose. Estudos in vitro demonstraram que a lipoprotena de baixa

densidade oxidada (oxLDL) promove a ativao imunolgica inata de macrfagos. Em leses

aterosclerticas, macrfagos do infiltrado inflamatrio tm o fator de transcrio nuclear

NFB translocado para o ncleo, indicando sua ativao e regulao de genes relacionados a

imunidade inata (Edfeldt et al. 2002). Macrfagos presentes em placas aterosclerticas

expressam tambm vrios receptores do tipo Toll (Toll-like receptors - TLRs), e a LDL

modificada e seus produtos derivados podem ser ligantes endgenos de TLR2 e TLR4 (West

et al. 2010; Miller et al. 2003).

13

Dentre as clulas imunolgicas inatas, neutrfilos, mastcitos, clulas matadoras

profissionais (natural killer - NK) e clulas T matadoras naturais (NKT) desempenham papis

importantes durante a aterognese, porm apresentam-se em menor nmero nos stios

aterosclerticos em comparao com os macrfagos e clulas TCD4+ (Hansson &

Hermansson 2011). Experimentos usando camundongos hipercolesterolmicos mostraram que

neutrfilos so recrutados durante o inicio da aterosclerose, mas no esto presentes em fases

posteriores (Drechsler et al. 2010). J os mastcitos podem desempenhar um importante papel

na estabilidade das placas, atravs de suas enzimas que degradam a matriz extracelular (Bot et

al. 2014). As clulas NK e NKT agravam a aterosclerose, possivelmente devido a liberao de

Interferon gama (IFN-) (Whitman 2004; Tupin 2004). As clulas NKT que produzem IL-10,

por outro lado, podem limitar o desenvolvimento da doena (van Puijvelde et al. 2009).

Tomados em conjunto, as diversas clulas imunolgicas inatas desempenham papis

importantes em diferentes fases do desenvolvimento da doena, mas a principal clula efetora

da resposta imune inata, e tambm a mais abundante nas placas aterosclerticas, so os

macrfagos.

Nos macrfagos gordurosos a formao de cristais de colesterol pode ativar o

inflamassoma NLRP3, levando a secreo da citocina pr-inflamatria IL-1 (Duewell et al.

2010; Rajamki et al. 2010). Isto proporciona uma ligao clara entre o metabolismo do

colesterol e ativao imunolgica inata. A inibio da IL-1 para prevenir eventos

cardiovasculares, est atualmente sob avaliao em ensaios clnicos (Ridker et al. 2011). A

IL-1 secretada atua sobre as clulas musculares lisas para a produo de IL-6 (Loppnow &

Libby 1990), esta por sua vez induz a produo de protena C reativa (PCR) pelo fgado.

Uma artria normal constituda por trs camadas: i) a camada ntima com clulas

endoteliais e clulas do msculo liso; ii) a camada mdia com clulas de msculo liso e

lamelas elsticas; iii) e uma camada adventcia circundante com tecido conjuntivo frouxo

(Hansson 2005). O acmulo de LDL ocorre na camada ntima, e promove o desenvolvimento

da aterosclerose. Modificaes oxidativas atravs de mieloperoxidases, lipoxigenases, e

espcies reativas de oxignio (ROS) levam formao de oxLDL, que desencadeia uma

resposta inflamatria inata (Hansson & Hermansson 2011). Em resposta s oxLDLs, clulas

endoteliais comeam a aumentar a expresso de molculas de adeso, tais como VCAM-1,

ICAM-1, e P-selectinas, alm de promover a quimiotaxia atravs da secreo de protena

quimiottica de moncitos-1 (MCP-1) (Nakashima et al. 1998). Sendo assim, moncitos

circulantes e outros leuccitos so recrutados para estes locais. Os moncitos diferenciam-se

em macrfagos, que se infiltram na camada ntima em resposta ao M-CSF e GM-CSF

14

produzido pelas clulas endoteliais (Rajavashisth et al. 1990). Os macrfagos derivados de

moncitos so os mais abundantes em placas aterosclerticas e podem proliferar localmente

(Robbins et al. 2013). Eles expressam receptores scavenger, dos quais o receptor Scavenger -

classe A e CD36 foram identificados como os mais importantes para a absoro de oxLDL

(Kunjathoor 2002). Os receptores Scavenger so regulados positivamente em resposta

acumulao intracelular de colesterol. E a imerso contnua de lipdios leva formao de

clulas gordurosas a partir de macrfagos que fagocitam as oxLDLs (Park 2014).

O fosfolipdio Lisofosfatidilcolina e cidos graxos oxidados no esterificados so gerados

durante a oxidao da LDL, por lipoprotenas associadas fosfolipase A2, que tambm

ativam o sistema imune inato (Hurt-Camejo et al. 2001). Todos estes eventos so susceptveis

a serem fatores importantes que iniciam e contribuem para a manuteno da inflamao na

formao de leses aterosclerticas.

1.2. Lisofosfatidilcolina

Por muitos anos os lisofosfolipdios (LPL) foram associados apenas com sua funo

estrutural e de armazenamento energtico. Entretanto, com base em vrios estudos realizados

durante as ltimas dcadas, esta se tornando cada vez mais evidente a ao dos LPLs como

hormnios, molculas de sinalizao e mediadores lipdicos intracelulares. Estas molculas

tambm possuem a capacidade de ativar receptores de membrana especficos e/ou receptores

nucleares que regulam diversos processos fisiolgicos e fisiopatolgicos. Entre os LPLs, a

lisofosfatidilcolina (LPC) vem se tornando um modelo cada vez mais utilizado e estudado

(Drzazga et al. 2014) devido a sua importncia, no s fisiolgica, mas tambm patolgica,

em diferentes modelos.

A LPC um lisofosfolipdio constituinte de membranas plasmticas e possui um papel

importante na sinalizao celular por estar presente em alta quantidade na circulao

sangunea humana, a maior parte da LPC circulante esta associada molculas como a

albumina e s oxLDLs (Schmitz & Ruebsaamen 2010). Devido a essa associao, a LPC

exerce um papel fundamental durante a aterosclerose, pois ela o principal componente

fosfolipdio de oxLDL e desta forma, est diretamente implicada como um fator crtico na

atividade aterognica da oxLDL. Ela tambm capaz de induzir a formao de clulas

gordurosas, as quais so componentes celulares fundamentais para o estabelecimento da

aterosclerose e recrutamento leucocitrio para o stio desta patologia, induzindo a progresso

15

da doena (Matsumoto et al. 2007). Devido a esta relao direta com a aterosclerose, a LPC

tornou-se um interessante modelo pra estudos relacionados a essa patologia.

Vrias isoformas de LPC, com diversas cadeias acil, j foram identificadas, como os

cidos palmtico (16: 0), esterico (18: 0), oleico (18: 1), linoleico (18: 2), araquidnico (20:

4) e docosahexaenico (22: 6), e encontradas no plasma humano (Riederer et al. 2010). Todas

elas podem ser geradas por vrios processos biolgicos, incluindo: i) a clivagem da membrana

plasmtica de lipoprotenas de fosfatidilcolina (PC) pela fosfolipase A2 (PLA2) (Sato et al.

2008) ii) a atividade da enzima lecitina colesterol aciltransferase (LCAT) em lipoprotenas de

alta densidade (HDL) (Rousset et al. 2009), e iii) a oxidao de lipoprotenas de baixa

densidade (LDL) (Parthasarathy et al. 1985). Fontes adicionais de LPC so oriundas de

lipases endoteliais (LE) e lipases hepticas (LH) que por clivagem de HDL-PC, geram LPC

saturada (16:0) e quantidades substanciais de LPC insaturadas (18:1; 18:2; 20:4) (Gauster et

al. 2005; Santamarina-Fojo 2004).

Alguns receptores j foram descritos para a LPC, tais como receptores acoplados a

protena G (GPCRs), G2A, GPR4 e GPR119 (Murakami et al. 2004), TLR2 (Magalhes et al.

2010) e TLR4 (Carneiro et al. 2013). Tais receptores podem ativar diversas vias a partir de

diferentes protenas cinases (Schmitz & Ruebsaamen 2010) e a via do fator de transcrio

nuclear NFkB induzindo a sua translocao para o ncleo (Magalhes et al. 2010).

A LPC tem um amplo espectro de atividades pr-inflamatrias, que incluem a promoo

do crescimento celular (Nakano et al. 1994), a induo da migrao celular (Kohno et al.

1998) e a regulao positiva de molculas de adeso, como a ICAM-1, VCAM-1, e P-

selectinas (Zou et al. 2007), alm de promover a quimiotaxia atravs da induo de protena

quimiottica de moncitos-1 (MCP-1) (Takahara et al. 1996; Quinn et al. 1988). Outra funo

conhecida da LPC aumentar a atividade bactericida de neutrfilos via NADPH oxidase que

estimula a produo de espcies reativas de oxignio (ROS) (Hong et al. 2014; Lin et al.

2005). Tambm j foi descrito que a LPC ativa caspase-1 e a gerao de ROS dependente das

lipid rafts em micrglia (Schilling & Eder 2010). Alm disso, a LPC promove um aumento da

permeabilidade celular, que pode levar a apoptose (Takahashi et al. 2002), e possui um efeito

citotxico em clulas musculares lisas vasculares, pois promove um influxo de clcio e um

aumento na sntese de DNA (Chen et al. 1995).

A LPC induz a produo e secreo de diversas citocinas, tais como a interleucina-1

(IL-1)(Stock et al. 2006; Liu-Wu et al. 1998), o fator de necrose tumoral - (TNF-) (Huang

et al. 1999), a interleucina 6 (IL-6)(David & Bryan 1996), o Interferon (IFN) (Sheikh et al.

2001) e o fator transformador de crescimento 1 (TGF-1)(Hasegawa et al. 2011).

16

LPC tambm est envolvido na produo de prostaglandina I2 (PGI2 tambm conhecido

como prostaciclina) in vitro em clulas endoteliais articas humanas primrias e in vivo em

modelo murino. O produto da degradao estvel de PGI2, 6-ceto-prostaglandina F1a

(PGF1) tambm foi induzida por LPC (Riederer et al. 2010). Em clulas endoteliais a LPC

promove a liberao de cido araquidnico (AA), graas a ao das fosfolipases (Wong et al.

1998)e induz a ao da ciclooxigenase-2, sendo assim, a LPC uma importante precursora da

sntese de mediadores lipdicos (Zembowicz et al. 1995).

Em parasitos, como o Trypanossoma cruzi, a LPC tem demonstrado papel fundamental na

modulao da transmisso do parasito, agindo como um potente fator quimiottico de clulas

inflamatrias ao local da picada do vetor (Silva-Neto et al. 2012). Em Schistosoma mansoni, a

LPC exerce papel importante na patologia causada por este helminto ao induzir intensa

eosinofilia e liberao das citocinas IL-5 e IL-13 (Magalhes et al. 2010). Alm disso, a LPC

tambm tem sido utilizada como adjuvante de vacinas (Perrin-Cocon et al. 2006).

Em tumores, a LPC hidrolisada em cidos graxos para a nutrio do tumor, onde

pacientes com cnceres metastticos apresentam um menor nvel de LPC no plasma. Outro

ponto importante que a LPC, tanto saturada quanto monoinsaturada, tendem a atenuar a

atividade metasttica do tumor, revelando uma importante ao da LPC na progresso do

cncer (Raynor et al. 2015).

Outra importante funo da LPC a induo da biognese de corpsculos lipdicos, que

so marcadores de ativao celular e importantes stios de sntese e armazenamento de

mediadores lipdicos celulares (Magalhes et al. 2010).

1.3. Corpsculos Lipdicos

Corpsculos lipdicos (CLs) so organelas distribudas no citoplasma da maioria das

clulas eucariticas, possuem uma regio central composta de lipdeos neutros e envolto por

uma monocamada de fosfolipdios associados a protenas designadas PAT, que compreendem

as perilipinas, as protenas relacionadas com a diferenciao de adipcitos (ADRP) e a TIP47,

o que difere os CLs das demais organelas celulares convencionais (Melo et al. 2006; U et al.

1999).

No passado, acreditava-se que a presena de CLs nas clulas serviria simplesmente para o

armazenamento e transporte de lipdios, entretanto, atualmente j se sabe que CLs so

organelas altamente reguladas que esto envolvidas em vrios aspectos de ativao e

metabolismo celular e inclusive no processo inflamatrio (Bozza et al. 2009). CLs so

especializados em armazenar lipdios neutros, triacilglicerol, colesterol-ster e fosfolipdios,

17

associados a uma variada composio proteica. O armazenamento de lipdios celulares

varivel, e reflete o balano entre a chegada dos lipdios nas clulas e o seu consumo por elas;

um acmulo excessivo de CLs tambm ocorre em diversas doenas como a obesidade,

esteatose, diabetes, miopatia e aterosclerose (Greenberg et al. 2011).

Em leuccitos em estado de repouso, existe apenas um nmero basal de CLs, entretanto,

estas organelas se tornam abundantes quando as clulas se tornam ativadas e envolvidas em

processos inflamatrios (Bozza et al. 2009). A biognese dos CLs ocorre em decorrncia

um estmulo inflamatrio e est relacionado diversas patologias (Melo et al. 2011). Sendo

assim os CLs so formados sob duas condies ambientais diferentes: I) na primeira condio

as clulas acumulam CLs em resposta a disponibilidade exgena de lipdios e sabe-se que os

cidos graxos armazenados nos CLs so utilizados como substrato para o metabolismo

energtico, sntese de membranas celulares e produo de molculas derivadas de lipdios tais

como lipoprotenas, sais biliares, hormnios e mediadores lipdicos do sistema imune (Pol et

al. 2014); II) na segunda condio, as clulas recebem estmulos ou sofrem estresses, como a

prpria inflamao, o estresse oxidativo e patgenos que podem induzir a biognese de CLs,

refletindo assim o papel dos CLs em processos no diretamente relacionados com o

metabolismo lipdico, tais como na degradao de protenas ou na imunidade. (Melo et al.

2011; Walther & Farese 2012). Dessa forma, os corpsculos lipdicos atuam como

importantes marcadores de ativao celular uma vez que sua biognese desencadeada

imediatamente aps a ativao de leuccitos (Bozza et al. 2009).

Os CLs possuem enzimas chaves envolvidos no metabolismo de colesterol e na sntese de

cidos graxos, pois so stios ativos do metabolismo do cido araquidnico e ambos os passos

anablicos e catablicos do metabolismo lipdico esto presentes nessa organela. Todas as

enzimas necessrias para sntese de eicosanoides, como fosfolipase A2 (PLA2),

ciclooxigenases (COX), prostaglandina E2 e D2 (PGE2 e PGD2) sintase, 5- e 15-lipoxigenases

(5-LO e 15-LO) e leucotrieno C4 (LTC4) sintase, foram localizadas dentro de CLs em clulas

ativadas (Melo et al. 2011; Haeggstrom & Funk 2011). Outras enzimas envolvidas na

liberao de cido araquidnico como MAPK e PI3K, p38, ERK1/2 tambm esto co-

localizadas em CLs (Yu et al. 1998). Desta forma, os CLs so organelas multifuncionais e

stios de eventos regulatrios, bem como potenciais fontes de produo de mediadores

inflamatrios como os eicosanoides e as prostaglandinas (Bozza & Viola 2010; Haeggstrom

& Funk 2011). Sendo assim, estas organelas atuam na inflamao como marcadores da

ativao de leuccitos, constituindo assim um possvel alvo anti-inflamatrio (Bozza et al.

2009).

18

Os CLs alm de serem stios de eicosanides podem estar associados com o

armazenamento de citocinas pr-inflamatrias, como TNF-, MIF e RANTES (Beil et al.

1995; Pacheco et al. 2002; Bandeira-Melo et al. 2001), alm de fatores de crescimento

(Dvorak et al. 2001). A relao entre os CLs e a citocina pr-inflamatria IL-1, a qual

processada e maturada pelo complexo dos inflamassomas, ainda escasso e controverso.

1.4. Inflamassoma e Piroptose

Os inflamassomas so complexos multiproteicos intracelulares responsveis pela

clivagem e ativao da enzima pro-caspase-1 em caspase-1, que exerce um papel fundamental

no processamento e maturao das citocinas pr-inflamatrias IL-1 e IL-18 e numa forma de

morte pr-inflamatria rpida chamada de piroptose (Schroder & Tschopp 2010; Miao et al.

2011).

Existem duas vias descritas pelas quais os inflamassomas so gerados. A via cannica na

qual ele formado por receptores de reconhecimento padro (PRRs), uma caspase

inflamatria e, se necessrio, a protena adaptadora ASC (Keyel 2014). E a via no cannica,

na qual a caspase murina 11 ou a sua homloga humana, a caspase-4, se liga diretamente ao

estmulo microbiano (Shi et al. 2014). A ativao dos receptores ou ligao das caspases com

o estmulo, leva ao recrutamento das protenas do inflamassoma e oligomerizao da pr-

caspase-1, que promove sua autoprotelise e consequente ativao leva a clivagem e a

secreo de IL-1 e IL-18 ou a piroptose (Guo et al. 2015).

Para que ocorra o processo completo, dois sinais so necessrios para a eficiente

maturao de IL-1 e IL-18: o primeiro sendo a sinalizao por PRRs que induzam ativao

do fator de transcrio NF-B, promovendo a transcrio de pr-IL-1 e pr-IL-18; o segundo

sinal, consiste no processamento proteoltico desses precursores em suas formas

biologicamente ativa via caspase-1, a qual ativada pelo inflamassoma (Strowig et al. 2012).

O inflamassoma composto por PRRs intracelulares do tipo NLRs (Node-like

receptors), que em humanos codificado por 22 genes e possui a diviso em trs subfamlias:

NOD, NLRP e IPAF (NLRC). Esses so constitudos por trs regies funcionais, uma regio

NOD de regulao localizada na posio central, uma regio N-terminal efetora envolvida na

sinalizao, nesse domnio pode conter um domnio pirina (PYD), um domnio para

recrutamento de caspase (CARD), ou um domnio inibidor de baculovrus (BIR); e a regio

C-terminal que composta por repeties ricas em leucina (LRRs) (Schroder & Tschopp

19

2010). A montagem desse complexo ocorre de forma que o NLR recruta uma protena

adaptadora, a ASC, que interage com a caspase-1 ou caspase-11 levando a sua ativao, para

essa promover a maturao das citocinas pr-inflamatrias (Bauernfeind et al. 2011). Vrios

NLRs capazes de formar o complexo do inflamassoma j foram descritos, dentre eles:

NLRP1, NLRP3 (NALP3), NLRP6, NLRC4 (IPAF) e AIM2 (Strowig et al. 2012).

Cada um destes receptores parece ser responsvel por responder a estmulos distintos e

especficos. Por exemplo, NLRP1 participa no reconhecimento da toxina letal de Bacillus

anthracis, Toxoplasma gondii, e contribui para a depleo de ATP intracelular (Ewald et al.

2014; Liao & Mogridge 2013; Boyden & Dietrich 2006). J o NLRP6 est relacionado com a

manuteno e regulao da microbiota intestinal, previne contra inflamaes intestinais,

protege contra o cncer de clon e regula a imunidade inata antiviral intestinais (Jackson et al.

2015; Chen 2014; Anand & Kanneganti 2013). O inflamassoma AIM2 participa no

reconhecimento de DNA citoslico proveniente de vrus e bactrias (Fernandes-Alnemri et al.

2009; Warren et al. 2010). J o inflamassoma NLRC4 responsvel pelo reconhecimento de

flagelina e componentes do sistema de secreo do tipo III de bactrias alm de patgenos

bacterianos diferentes, incluindo Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella typhimurium, Shigella flexneri (Miao et al. 2010; Miao et al. 2006; Cerqueira et

al. 2015; Sutterwala et al. 2007; Franchi et al. 2006).

Dentre todos os inflamassomas at hoje descritos, o mais estudado e caracterizado o

NLRP3, que diferentemente dos receptores citados anteriormente, responsvel por

reconhecer uma vasta gama de agentes infecciosos, incluindo diversas bactrias como

Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia

pneumoniae e Citrobacter rodentium (He et al. 2010; Shimada et al. 2011; Duncan et al.

2009; Harder et al. 2009; Toma et al. 2010); Alguns fungos patognicos A. fumigatus, C.

albicans , C.neoformans e P.brasiliensis (Gross et al. 2009; Hise et al. 2009; Tavares et al.

2013; Sad-Sadier et al. 2010; Guo et al. 2014); E tambm vrus, como o influenza A (Allen

et al. 2009); e os parasitas Schistosoma mansoni e T.cruzi (Ritter et al. 2010; Gonalves et al.

2013).

A via e os mecanismos de ativao do Inflamassoma NLRP3 so muito bem

caracterizados. Os principais mecanismos que desencadeiam a ativao do NLRP3 consistem,

no primeiro sinal comum aos outros inflamassomas, na qual PAMPs ou DAMPs via PPRs

como TLRs, receptores de IL-1 ou TNF desencadeiam uma cascata de sinalizao ativando o

fator de transcrio NFB, que transcreve a pr IL-1, pr IL-18 e pr-caspase-1 e regula

positivamente a expresso do NLRP3 (Schroder & Tschopp 2010; Hornung & Latz 2010). E

20

o segundo sinal a partir do qual diversos mecanismos induzem a formao e ativao do

complexo NLRP3, como a produo de espcies reativas de oxignio (ROS)(Tschopp &

Schroder 2010); o efluxo de potssio e ATP (Ptrilli et al. 2007) e o dano lissosomal devido

liberao da protease catepsina B para o citoplasma. Estes eventos so iniciados a partir de

diversos ativadores, como partculas de slica, alum, protena fibrilar amilide- ou cristais de

cido rico (Cassel et al. 2009). Estudos recentes demonstram que a ativao exacerbada do

inflammasoma NLRP3 est associada com a patognese de vrias doenas auto-imune,

crnicas, inflamatrias e doenas metablicas, como alzheimer, aterosclerose, diabetes tipo 2,

gota e doenas inflamatrias intestinais (DII) (Ozaki et al. 2015). Alm disso, a ativao do

inflamassoma NLRP3 tambm pode levar a piroptose da clula hospedeira (Wree et al. 2014).

A piroptose um tipo de morte celular caracterizada pela lise celular resultante da

formao de poros da membrana plasmtica, aumento do volume celular, fragmentao

nuclear e condensao da cromatina que ocorrem dependente da atividade da caspase-1 ou 11,

e independentemente da secreo de IL-1 e IL-18 (Cookson & Brennan 2001; Monack et al.

2001; Fink & Cookson 2006; Silveira & Zamboni 2010).

A piroptose possui algumas semelhanas com a apoptose, como a condensao da

cromatina e a fragmentao do DNA. Entretanto, os efeitos entre estes dois tipos de morte

celular so diferentes. A piroptose considerada pr-inflamatrio por apresentar rompimento

da membrana celular e liberao dos componentes intracelulares, enquanto que a apoptose

descrita como no inflamatria por manter a integridade da membrana (Bergsbaken et al.

2009; Fernandes-Alnemri et al. 2007). Outra diferena diz respeito Poli-[ADP-ribose]-

polimerase (PARP), a clivagem de PARP determinante para a apoptose, mas no ocorre na

piroptose. (Jorgensen & Miao 2015).

As caspases so produzidas em sua pr-forma inativa e so clivadas e ativadas atravs

do inflamassoma ou piroptossoma (Guo et al. 2015; Fernandes-Alnemri et al. 2007). Alm de

clivar e ativar as citocinas pr-inflamatrias IL-1 e IL-18, a caspase-1 tambm leva

secreo da protena de alta mobilidade de grupo caixa-1 (HMGB1)(Keller et al. 2008). A

protena nuclear HMGB1 possui a funo de determinar a estrutura da cromatina e regular a

transcrio. Entretanto, ela pode ser secretada da clula por processo de morte celular ou

ativao do inflamassoma (Lamkanfi et al. 2010). Contudo, por qual mecanismo a caspase-1

induz a morte por piroptose ainda desconhecido, devido a isso, o interesse na piroptose e

ativao de caspases permanece crescente (Tait et al. 2014).

21

A relao entre CLs e os inflamassomas, bem como o papel dos CLs na maturao e

secreo de IL-1, ainda pouco descrita na literatura e os poucos trabalhos publicados

apresentam dados controversos. Itoh e colaboradores (2014) mostraram que macrfagos

deficientes para os componentes do inflamassoma NLRP3 apresentaram um aumento da

biognese de corpsculos lipdicos em modelo de infeco por Chlamydia pneumoniae. Por

outro lado, McRae e colaboradores (2015) demonstraram que quando se inibe

farmacologicamente ou atravs de RNA de interferncia as protenas NLRP3, ASC e

Caspase-1, ocorre uma diminuio da biognese de corpsculos lipdicos no modelo de

infeco pelo vrus da dengue. Apesar de alguns estudos mostrarem que a LPC induz a

secreo de IL-1 e a ativao de caspase-1, ainda no est descrito por qual inflamassoma e

por quais mecanismos este lipdio atua na ativao deste complexo, nem qual a relao entre

CLs e o inflamassoma no modelo de estimulao celular com LPC.

22

2. Justificativa

O interesse pela lisofosfatidilcolina tm-se intensificado cada vez mais na comunidade

cientfica. Tal relevncia devida a sua relao com a aterosclerose, e sua capacidade

imunomoduladora. Como j conhecido a LPC induz a secreo de IL-1 em moncitos

humanos (Liu-Wu et al., 1998) e em macrfagos murinos (Magalhaes et al, 2010). Entretanto,

ainda no foi descrito qual inflamassoma ativado por este lipdeo imunomodulador, por

quais mecanismos a LPC induz a maturao e secreo da citocina IL-1 e se este lipdio

capaz de induzir a piroptose em moncitos e clulas endoteliais, portanto uma de nossas

hipteses de que a LPC est ativando o inflamassoma NLRP3 e induzindo a secreo de IL-

1 dependente dessa via.

Alm disso, outro fator interessante a ser investigado a relao entre a formao de

clulas gordurosas, atravs da biognese de CL, com a ativao dos inflamassomas e a

secreo de IL-1. Nossa hiptese de que a LPC induz a formao de clulas gordurosas

dependente das vias de ativao do inflamassoma NLRP3. Com isso, esse projeto visa

preencher lacunas existentes no entendimento dos mecanismos celulares e moleculares

envolvidos na ativao inicial da resposta inflamatria desencadeada pela LPC, e desta

maneira poder utilizar os complexos dos inflamassomas como alvos farmacolgicos de

interveno contra a aterosclerose e outras patogenias relacionadas a este lipdio.

23

3. Objetivos

3.1. Objetivo geral:

Caracterizar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na ativao do

inflamassoma NLRP3 e sua relao com a formao de clulas gordurosas por biognese

de corpsculos lipdicos pela Lisofosfatidilcolina (LPC).

3.2. Objetivos especficos:

a) Investigar o papel da LPC na ativao de caspase-1 e produo de ROS;

b) Caracterizar os mecanismos intracelulares envolvidos na secreo de IL-1 induzida

por LPC;

c) Caracterizar os mecanismos intracelulares envolvidos na biognese de Corpsculos

lipdicos induzida pela LPC e sua relao com a via do inflamassoma NLRP3;

d) Investigar o papel da LPC na formao de clulas gordurosas, analisando a, biognese

de Corpsculos Lipdicos em moncitos e clulas endoteliais;

e) Analisar se a LPC induz piroptose em moncitos e clulas endoteliais humanas.

24

4. Materiais e Mtodos

4.1. Camundongos, tratamentos in vivo e consideraes ticas.

Utilizamos camundongos da linhagem C57/BL6, NLRP3-/-, Caspase1/11-/- e

selvagens, os quais foram mantidos no biotrio do Instituto de Cincias Biolgicas da

Universidade de Braslia com gua e alimento ad libitum. Todos os procedimentos

experimentais envolvendo animais foram aprovados pela Comisso de tica e uso de Animais

da UnB. Os camundongos foram estimulados com LPC 100g/mL diluda em PBS e

administrada intraperitonealmente ou intravenosa. Aps 24h os camundongos foram

anestesiados com 30l de quetamina e xilasina em propores iguais, administrados

intramuscularmente. O sangue foi coletado, para extrao do soro e posteriormente, esses

animais foram sacrificados em cmara de CO2, para a retirada das clulas do lavado

peritoneal.

4.2. Clulas utilizadas

THP-1: uma linhagem imortalizada de moncitos humanos no aderentes. Essas

clulas foram cultivadas em meio RPMI-1640 adquirido da Sigma-Aldrich e

suplementado com bicarbonato de sdio, 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 50M de

2-mercaptoethanol, 40g/mL de Gentamicina em estufa mida a 37C a 5% CO2.

HUVEC: uma linhagem de clulas derivadas de endotlio vascular umbilical

humano aderente com morfologia estrelada. Foram cultivadas com meio F12

adquirido da Sigma-Aldrich e suplementado com bicarbonato de sdio, 10% de SFB,

0.1 mg/ml heparina; 0.03 mg/ml de suplemento de crescimento de clulas endoteliais

(ECGS), 40g/mL de Gentamicina e 10g/mL de Cloranfenicol em estufa mida a

37C a 5% CO2.

Macrfagos Peritoneais: Os macrfagos peritoneais foram obtidos atravs de

lavagem peritoneal de camundongos previamente estimulados com tioglicolato.

Brevemente, os animais receberam injeo intraperitoneal de tioglicolato a 4% e aps

72h eles foram sacrificados e a lavagem peritoneal foi realizada injetando 5mL de

RPMI refrigerado dentro do peritnio. O meio foi recolhido, centrifugado a 300g por

5min. a 4C. As clulas ento foram ressuspendidas, contadas e plaqueadas em placas

25

de cultura. Aps 24h em estufa mida a 37C a 5% CO2, o sobrenadante foi

descartado e as clulas fortemente aderidas consideradas macrfagos.

4.3. Estmulos e tratamentos

Durante todo o projeto foi utilizado o lisofosfolipdio 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-

3- fosfocolina (16:0 LysoPC), mais conhecido como lisofosfatidilcolina (LPC), da Avanti

Polar Lipids. O estoque de LPC foi diludo em etanol e mantido a -20C em tubos de vidro.

Em todos os experimentos a quantidade de LPC total era retirada do estoque, secada em gs

nitrognio em outro tudo cnico de vidro. Em seguida a LPC era ressuspendida em meio de

cultura, sonicada durante 10min, vortexada por 30seg, e imediatamente pipetada a quantidade

desejada nos poos, a fim de estimular as clulas. Como controles positivos foram utilizados

lipopolisacardeo (LPS) (500ng/mL; Sigma-Aldrich), adenosina-tri-fosfato (ATP) (1mM;

Sigma-Aldrich) e Menadiona (100 M; Sigma-Aldrich).

Para a caracterizao de vias e mecanismos envolvidos no desenvolvimento do

trabalho, as clulas foram pr-tratadas de 45min a 1h com alguns inibidores farmacolgicos.

As drogas utilizadas foram: inibidor de espcies reativas de oxignio (ROS) [N-Acetil-L-

Cisteina (NAC) 5mM; Sigma-Aldrich] e [Rotenona 10M; Sigma-Aldrich]; inibidor de

catepsina B (CA074-Me 50M; Sigma-Aldrich); Inibidor de caspase-1 (Ac-YVAD-cho

20M; Enzo Life Sciences,); Inibidor de canais de potssio sensveis a ATP (Glibenclamida

ou Gliburdeo, 150M; Sigma-Aldrich); Inibidor de HMG-CoA redutase (Atorvastatina

25M; Sigma-Aldrich); Inibidor de translocao do NFB (JSH-23 30M; Sigma-Aldrich);

Antagonista de PPAR- (GW9662 1M; Sigma-Aldrich); Desestabilizador de lipids rafts

(Metil--ciclodextrina 10 M; Sigma-Aldrich) e um anticorpo neutralizante de TLR-2 (PAb-

hTLR2 10g/mL; InvivoGen).

4.4. Anlise da viabilidade celular

O reagente MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio brometo), foi

utilizado para anlise de viabilidade celular. Para esse experimento as clulas THP-1 e

HUVEC foram plaqueadas em placas de cultura de 96 poos, tratadas por 24 horas com LPC

em diferentes concentraes, 0.1, 1, 10, 20, 50 e 100 g/mL. Aps o tempo de estmulo, o

sobrenadante foi substitudo por uma soluo de 10% MTT, 5mg/mL (Sigma-Aldrich, USA)

diludo no prprio meio de cultura celular. Em seguida, a placa foi incubada por 4h protegida

26

da luz na estufa de cultivo. O sobrenadante foi descartado e os cristais de formazan formados

foram diludos em 100L de DMSO. A absorbncia foi lida a 570nm no espectrofotmetro

SpectraMax M3 (Molecular Devices, USA). Para o clculo da viabilidade, as clulas no

estimuladas foram consideradas como 100% viveis e os demais estmulos foram calculadas

proporcionalmente.

4.5. Anlise da ativao de caspase-1

A deteco de caspase-1 ativa foi obtido atravs da utilizao de um kit especfico e

manipulado de acordo com as instrues do fabricante: FLICA FAM-YVAD-FMK

(Immunochemistry). Este kit composto por uma sonda fluorescente que se liga de forma

irreversvel uma subunidade especfica de caspase-1 clivada. Macrfagos peritoneais

estimulados com LPC 1g/ml por 1, 3, e 6h foram submetidos marcao com FLICA, e

posteriormente analisados por citometria de fluxo (FACS VERSE, BD Biosciences). O gate

foi plotado na populao de clulas viveis, excluindo-se os debris celulares da anlise. Os

histogramas e mdias de intensidade de fluorescncia (MFI) foram feitos no software FlowJo

V10 (Tree Star Inc).

4.6. Anlise da gerao de espcies reativas de Oxignio (ROS)

Para anlise da formao de espcies reativas de oxignio (ROS) foi utilizada a sonda

2,7 Diclorodihidrofluorescena-diacetato (DFC-DA) a qual permevel membrana celular

e no fluorescente. Na presena de ROS, este composto oxidado no interior da clula e

produz um composto fluorescente, a 2,7 diclorofluorescena (DFC), que permanece no

interior da clula. Tanto THP-1 quanto HUVECs foram estimuladas com LPC 1g/mL por

diferentes tempos 1, 3, 6 e 24h. Completado o tempo dos estmulos as culturas de clulas

foram incubadas a 37C, protegidas da luz por 30 minutos com a sonda DFC-DA dissolvida

em meio de cultura na concentrao final de 20M. Aps esse perodo as clulas foram

lavadas com PBS1x 3 vezes, resuspendidas em 500 L de PBS1x gelado e mantidas a 4C. A

leitura foi realizada imediatamente por citometria de fluxo (FACS verse ou FACS Calibur), O

gate foi plotado na populao de clulas viveis, excluindo-se os debris celulares da anlise.

Os histogramas e mdias de intensidade de fluorescncia (MFI) foram feitos no software

FlowJo V10 (Tree Star Inc).

27

4.7. Dosagens de Citocinas

As citocinas provenientes do sobrenadante das culturas foram analisadas pelo mtodo

de ELISA, utilizando-se kits comerciais (eBioscience e R&D System). O ensaio foi realizado

seguindo-se as instrues do fabricante e os nveis de citocinas foram demonstrados em

valores absolutos (pg/mL).

4.8. Anlise da biognese de corpsculos lipdicos por citometria de fluxo e

microscopia de fluorescncia confocal

Para analisar e quantificar a biognese de corpsculos lipdicos (CLs) foi utilizado

uma sonda fluorescente lipoflica, BODIPY 493/503 (Life technologies), usado para a

identificao de lipdios neutros intracelulares (triglicerdeos e steres de colesterol) presentes

em grandes quantidades em CLs. Para a quantificao de CL por citometria de fluxo, THP-1 e

HUVECs pr-tratadas ou no com inibidores foram estimuladas com LPC 1g/mL por 24h.

Aps o estimulo as clulas foram incubadas com uma soluo de bodipy/PBS na

concentrao de 1/5000 por 30 minutos a 4C protegido da luz. Aps esse perodo as mesmas

foram lavadas com PBS1x 3 vezes, resuspendidas em 500L de paraformaldedo 1% e

mantidas a 4C at leitura por citometria de fluxo (FACS Calibur). O gate foi plotado na

populao de clulas viveis, excluindo-se os debris celulares da anlise. Os histogramas e

mdias de intensidade de fluorescncia (MFI) foram feitos no software FlowJo V10 (Tree Star

Inc).

Para analise de CL por microscopia de fluorescncia confocal, as clulas pr-tratadas

ou no com inibidores e estimuladas com LPC 1g/mL por 24h foram fixadas com

paraformaldedo a 4% por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida foram lavadas

por trs vezes com PBS e incubadas com uma soluo de Bodipy/PBS na concentrao de

1/300 por 30 minutos a 4C protegido da luz. Aps esse perodo as mesmas foram lavadas

com PBS 3 vezes e incubadas com uma soluo de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)

que um corante fluorescente que se liga a DNA amplamente utilizado na microscopia de

fluorescncia para demarcar o ncleo da clula. Essa soluo de DAPI foi diluda na

concentrao de 1/5000 de DAPI em PBS, as clulas foram incubadas por 5 minutos e em

seguida lavadas 3 vezes com PBS. As lminas foram montadas em meio anti-fadding Prolong

(Life technologies). As imagens foram obtidas no microscpio Leica TCS SP5 (Leica

Microsystems, DEU).

28

4.9. Anlise de HMGB1 por imunofluorescncia

Para verificar a localizao da protena HMGB1 nas clulas tratadas com LPC, foi

feita imunomarcao intracelular e anlise por microscopia de fluorescncia confocal. Aps o

tempo de estmulo, as clulas foram fixadas com paraformaldedo a 4% por 10 minutos em

temperatura ambiente. Em seguida foram lavadas por trs vezes com PBS e permeabilizadas

em Triton a 0,2% por 20 minutos em temperatura ambiente. Aps novas lavagens, foi

adicionada soluo de bloqueio (2% de BSA, 5% de SFB e PBS) por 20 minutos

temperatura ambiente. O anticorpo primrio foi diludo em soluo de bloqueio na

concentrao de 1:400 e incubado overnight a 4C. Aps esse perodo, as clulas foram

lavadas e incubadas com o anticorpo secundrio conjugado a Alexa Fluor 546 (1:2000 em

PBS) por 1 hora temperatura ambiente. Foram feitas novas lavagens e, em seguida,

incubao com o DAPI (1:5000 em PBS) por 5 minutos temperatura ambiente. As lminas

foram montadas em meio anti-fadding Prolong (Life technologies). As imagens foram obtidas

no microscpio Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, DEU).

4.10. Anlises Estatsticas

Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando programa GraphPad Prism

6.0, GraphPad Software, Inc. Os testes utilizados foram one-way ou two-way ANOVA para

comparao de mdias, seguido do ps-teste de Turkey ou test t de student no pareado. A

significncia estatstica foi assumida com valor de p 0,05.

29

5. Resultados

5.1. A LPC possui um efeito citotxico e diminui a viabilidade celular de moncitos

e clulas endoteliais humanas.

A fim de verificar se a LPC possui um efeito citotxico, moncitos (A), e clulas

endoteliais (B), foram plaqueadas e estimuladas durante 24h por diferentes concentraes de

LPC, aps o perodo de incubao o teste de MTT foi realizado e os dados analisados. Os

dados demonstraram que a LPC diminui a viabilidade celular a partir de 10g/mL em

moncitos humanos de forma dose dependente (Figura 1A). J em clulas endoteliais a LPC

diminuiu a viabilidade celular a partir da concentrao de 20g/mL (Figura 1B). Desta forma,

estes resultados comprovam que em altas concentraes a LPC possui um efeito citotxico,

diminuindo a viabilidade de diferentes tipos celulares. A partir destes resultados, a

concentrao de 1g/mL de LPC foi escolhida como concentrao ideal de trabalho para

grande parte dos ensaios.

Figura 1: LPC diminui a viabilidade celular em moncitos e clulas endoteliais humanas. THP-1

(A) e HUVEC (B) foram plaqueadas e estimuladas com LPC nas concentraes de 0,1 g/mL,

1g/mL, 10g/mL, 20g/mL, 50g/mL e 100g/mL por 24h, Aps os estmulos as clulas foram

incubadas com MTT , a citotoxidade foi analisada pelas mdias dos percentuais de clulas vivas em

relao as clulas no estimuladas (NE) (consideradas 100% vivas). Cada barra representa a mdia do percentual DP (n=3) e * representa a diferena estatstica significativa (p

30

5.2. LPC Induz a ativao de Caspase-1 em macrfagos murinos

A atividade da enzima caspase-1 possui um importante papel no processamento e

maturao da citocina IL-1 e na promoo da piroptose. Por este motivo, foi investigado se a

LPC induziria a ativao de caspase-1. Macrfagos peritoneais foram estimulados com

1g/mL de LPC por diferentes tempos. Aps o perodo de estimulao os macrfagos foram

marcados com FLICA, e as clulas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados

demonstram que a LPC induziu a ativao da Caspase-1 a partir de 1h, com uma taxa de

clulas positivas para FLICA de cerca de 45% , em 3h a porcentagem de clulas positivas

para FLICA continua elevada com cerca de 40% e ento a partir de 6h e 24h de estmulo

observa-se um decrscimo da porcentagem de clulas positivas para FLICA, que corrobora

para uma diminuio da ativao da caspase-1 em tempos mais tardios j descritos na

literatura. Portanto, a LPC ativa caspase-1 de modo tempo dependente com picos de ativao

em tempos iniciais de estimulao (Figura 2).

Fig. 2: LPC induz a ativao de Caspase-1 em macrfagos murinos de modo tempo dependente.

Macrfagos peritoneais oriundos de camundongos C57/BL6 foram plaqueados e estimulados com

1g/mL de LPC por 1h, 3h, 6h e 24h. Aps os estmulos as clulas foram marcadas com FAM-

FLICA-Caspase-1, e em seguida as clulas foram analisadas por citometria de fluxo. As barras

representam a porcentagem de clulas positivas para FLICA, e o grfico representativo de trs

exprimentos independentes. Clulas no estimuladas (NE).

C

lula

s F

LIC

A +

(%

)

N E 1 h 3 h 6 h 2 4 h

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

L P C

31

5.3. LPC induz a produo de ROS in vitro e in vivo

Espcies reativas de oxignio (ROS) so metablitos de oxignio que, devido sua

capacidade de ganhar e perder eltrons, so propensas a participar de reaes de oxidao-

reduo. As clulas de mamferos desenvolveram vrios mecanismos para limitar a produo

de ROS, entre elas desativ-los, e reparar os danos s clulas. No entanto, quando a taxa de

produo de ROS aumenta dramaticamente e/ou as defesas antioxidantes so insuficientes ou

falham, ocorre o estresse oxidativo. Esse estresse oxidativo um importante sinal para a

ativao do inflamassoma e desempenha um papel importante na patognese da aterosclerose

(Peluso et al. 2012; Yu & Bennett 2014).

A fim de verificar se a LPC induz estresse oxidativo, via gerao de ROS, clulas

endoteliais e moncitos humanos foram estimulados com 1g/mL de LPC por diferentes

tempos. Aps o perodo de estimulo as clulas foram incubadas com a sonda DFC-DA e a

gerao de ROS analisada por citometria de fluxo. Nas clulas endoteliais a LPC induziu a

gerao de ROS a partir de 3h, e o pico de induo foi verificado com 6h,. Em 24h houve um

decrscimo da gerao de ROS (Figura 3A). A partir destes resultados podemos concluir que

a LPC induz a gerao de ROS de modo tempo dependente em clulas endoteliais humanas.

J em moncitos humanos no houve gerao de ROS via LPC em nenhum dos tempos

verificados (Figura 3B).

Nos experimentos in vivo, camundongos C57/Black06 foram estimulados

intraperitonealmente com 100g/mL de LPC, por 24h, aps o tempo de estimulo os

camundongos foram sacrificados e as clulas do lavado peritoneal foram coletadas e marcadas

com a sonda DFC-DA e a gerao de ROS analisada por citometria de fluxo. Como j era

esperado a LPC tambm induziu consideravelmente o estresse oxidativo, via produo de

ROS in vivo (Figura 3C).

32

Fig.3: A induo da produo de ROS via LPC in vitro e in vivo. HUVEC (A) e THP-1(B) foram

estimuladas com LPC 1g/mL por 3h, 6h e 24h, Aps a estimulao as clulas foram marcadas com a

sonda DFC-DA e a gerao de ROS nas clulas foi analisada por citometria de fluxo. Como controle

negativo foi usado clulas no estimuladas (NE) e para controle positivo clulas estimuladas com

menadiona 100M (Men.). (C) Macrfagos peritoneais coletados de camundongos C57/BL6

estimulados com 100g/mL de LPC, durante 24h, foram marcados com DFC-DA e a gerao de ROS

nas clulas tambm foi analisada por citometria de fluxo. Como controle negativo foi utilizado

macrfagos peritoneais coletados de camundongos estimulados com PBS. Os histogramas so

equivalentes anlise de clulas vivas. Os nmeros so equivalentes mdia de intensidade de

fluorescncia (MFI). Os histogramas (A) e (B) so representativos de dois experimentos distintos,

enquanto o histograma (C) representativo de um experimento com N=5 animais.

33

5.4. LPC induz a secreo de IL-1 em moncitos humanos

A inflamao crnica da parede arterial um elemento chave na patognese da

aterosclerose, dentre os fatores que desencadeiam a inflamao a ativao dos inflamassomas

e a consequente secreo de IL-1 e IL-18 tm sido cada vez mais estudados devido a sua

capacidade aterognica (Liu et al. 2014). Sendo assim, fomos investigar se a LPC induz a

ativao do inflamassoma e a secreo de IL-1 tanto em moncitos quanto em clulas

endoteliais humanas. Para isso, moncitos THP-1 e clulas endoteliais HUVEC, foram

tratadas e estimuladas da seguinte maneira: I) primadas com 500ng/mL de LPS por 4h, como

primeiro sinal de ativao do inflamassoma, e estimuladas com 1g/mL de LPC, como

segundo sinal de ativao do inflamassoma. II) Estimuladas apenas com a 1g/mL de LPC e

III) Estimuladas com LPC como primeiro sinal da ativao do inflamassoma e depois tratadas

com 1mM de ATP como segundo sinal.

Em moncitos, LPC induziu a secreo de IL-1 significativamente quando comparada

aos moncitos no estimulados, entretanto podemos observar uma potencializao dessa

secreo quando primamos os moncitos com LPS. Alm disso, uma secreo semelhante a

das clulas estimuladas somente com LPC foi observado em moncitos que receberam o ATP

como segundo sinal (Figura 4A). Porm, em clulas endoteliais no observamos o mesmo

fenmeno, nelas a LPC no induziu a secreo de IL-1 significativamente (Figura 4B).

Tambm importante notar que clulas endoteliais apresentaram nveis constitutveis de IL-

1 nas clulas no estimuladas (Figura 4B). Portanto, nossos dados demonstram um papel

importante da LPC na ativao do inflamassoma, onde este lipdeo foi capaz de ativar o

inflamassoma tanto sozinha quanto atuando como primeiro e/ou segundo sinal para a secreo

de IL-1.

34

Fig.4: LPC induz a secreo de IL-1 em moncitos humanos. Moncitos THP-1 (A) e clulas

endoteliais HUVEC (B) foram plaqueadas e tratadas da seguinte maneira: um grupo foi primado com

500ng/mL de LPS por 4h antes do estmulo de LPC 1g/mL, outro grupo foi estimulado somente com

LPC 1g/mL e um ultimo grupo foi estimulado com 1g/mL de LPC e uma hora antes da coleta do

sobrenadante tradas com 1mM de ATP. Como controles foram usados clulas sem tratamento e

estmulos, tratadas somente com LPS, somente com ATP e clulas tratadas com ambos, controle

positivo. O sobrenadante foi recolhido aps aproximadamente 24h de estimulao, e os nveis de IL-

1 foram dosados pela tcnica de ELISA. Cada barra representa a mdia da concentrao DP. Os

dados so de um experimento em triplicata. Diferenas estatsticas entre os grupos foram

representados por asteriscos em comparao com as clulas sem tratamento *p 0.05

T H P -1

IL-1

(

pg

/mL

)

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

L P C

L P S

A T P

-

-

-

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

-

-

-

+

-

+

+

* *

* *

*

*

A )

H U V E C

IL-1

(

pg

/mL

)

0

5

1 0

1 5

2 0

L P C

L P S

A T P

-

-

-

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

-

-

-

+

-

+

+

B )

35

5.5. Mecanismos de secreo de IL-1 induzida por LPC

Vrios mecanismos esto associados ativao do inflamassoma e a secreo de IL-1. O

inflamassoma NLRP3 o inflamassoma mais conhecido e bem estudado, entretanto como a

LPC poderia estar ativando esse inflamassoma e seus mecanismos de ativao, ainda so

desconhecidos. Sabe-se que a ativao do inflamassoma NLRP3 caracterizada por um

primeiro sinal que pode ser um DAMP ou PAMP que via receptores de membrana, como os

da famlia dos TLRs, desencadeiam a ativao de fatores de transcrio como o NFB a

transcreverem os genes da pr-caspase-1, pr-IL1, ASC e NLRP3, entretanto um segundo

sinal necessrio para a montagem desse complexo e sua ativao. Os segundos sinais

conhecidos que exercem essa funo, so as espcies reativas de oxignio (ROS), o efluxo de

potssio e dano lisossomal, o qual induz a liberao de enzimas lisossomais como a catepsina-

B.

Para verificar se estes mecanismos estavam envolvidos na ativao do inflamassoma

NLRP3 pela LPC, moncitos humanos foram pr-tratados durante uma hora com: A)

Anticorpo neutralizante de TLR2; B) Inibidor de catepsina B; C) Inibidor de caspase-1; D)

Inibidor de ROS; E) Inibidor de efluxo de potssio; F) Inibidor de NFB; G) Desestabilizador

de jangadas lipdicas (lipid rafts); e H) agonista de PPAR. Aps os tratamentos os moncitos

foram estimulados com 1g/mL de LPC, e aproximadamente 24h depois da interao o

sobrenadante foi coletado e os nveis de secreo de IL-1 foram dosados pela tcnica de

ELISA.

Os resultados mostraram que induo da secreo de IL-1 via LPC dependente de

reconhecimento via TLR2, uma vez que observou-se uma diminuio dos nveis de IL-1 nas

clulas tratadas com anticorpo neutralizante de TLR2 quando comparadas com as clulas

estimuladas com LPC (Figura 5A). Os resultados demonstraram tambm que a LPC induz a

secreo de IL-1 independente de caspase-1, uma vez que os nveis de IL-1 gerados nas

clulas tratadas com inibidor de caspase-1 e no tratadas foram similares (Figura 5C). A

secreo de IL-1 induzida por LPC em moncitos foi independente de NFB, considerando

que a leve diminuio da secreo de IL-1 nas clulas tratadas com inibidor de NFB no foi

significativa quando comparadas as clulas estimuladas apenas com LPC (Figura 5F).

Com relao aos mecanismos envolvidos nos segundos sinais de ativao do

inflamassoma, a secreo de IL-1 mediada por LPC foi independente da gerao de espcies

reativas de oxignio, pois no houve diminuio da secreo de IL-1 nas clulas tratadas

com o inibidor de ROS, NAC (Figura 5D), e Rotenona (Dados no mostrados), quando

36

comparada com as clulas estimuladas apenas com LPC. Entretanto a secreo de IL-1 via

LPC dependente do efluxo de potssio (Figura 5E) e dano lisossomal (Figura 5B), pois

houve uma reduo significativa nos nveis de IL-1 nas clulas tratadas com os respectivos

inibidores quando comparado com as clulas estimuladas apenas com LPC. O PPAR e as

jangadas lipdicas (lipid rafts) presentes na membrana plasmtica, so fatores importantes no

metabolismo lipdico. Nossos resultados mostraram que eles apresentam um papel importante

na secreo de IL-1 mediada por LPC, uma vez que em clulas tratadas com os inibidores de

PPAR e lipid rafts houve uma diminuio significativa da secreo de IL-1 quando

comparada com moncitos estimulados apenas por LPC (Figuras 5G e 5H).

37

Fig.5: LPC induz a secreo de IL-1 dependente de TLR-2, dano lisossomal, efluxo de potssio,

estabilizao de jangadas lipdicas, NFkB e PPAR. Moncitos THP-1 foram pr-tratados com (A)

anticorpo bloqueador de TLR-2(-TLR2); (B) Inibidor de catepsina B , CA074-ME (CA074) ; (C)

Inibidor de caspase-1, Ac-YVAD-cho (Y-VAD); (D) Inibidor de ROS, N-Acetil-L-Cisteina (NAC);

(E) Inibidor de Efluxo de potssio, Glibenclamida (Gly); (F) Inibidor de NFB, JSH-23 (JSH); (G)

Desestabilizador de jangadas lipdicas , Metil--ciclodextrina (MCD); (H) Antagonista de PPAR-,

GW9662 (GW) por uma hora e em seguidas estimuladas com 1g/mL de LPC, aps aproximadamente

24h de interao o sobrenadante foi coletado e os nveis de secreo de IL-1 foram dosados pela

tcnica de ELISA. Os grficos so representativos de trs experimentos distintos e os dados so de um

experimento em triplicata. Cada barra representa a mdia da concentrao DP. Diferenas

estatsticas entre os grupos foram representados por asteriscos em comparao com as clulas sem

tratamento e com as clulas estimuladas com LPC *p 0.05.

38

5.6. A secreo de IL-1 em camundongos estimulados com LPC

A fim de verificar se a LPC induz a secreo de IL-1 in vivo, e entender se essa secreo

dependente ou no de NLRP3 e Caspase-1/11 in vivo, camundongos C57/BL6 selvagens e

nocautes para Caspase-1/11 e NLRP3 foram estimulados via intraperitoneal ou via

intravenosa com 100g/mL de LPC, por 24h. Aps o tempo de estimulo os camundongos

foram sacrificados e seu sangue coletado para obteno do soro, nos quais os nveis de

secreo de IL-1 foram dosados pela tcnica de ELISA. Nossos resultados demonstram que

embora a LPC tenda a induzir um aumento na secreo de IL-1, tanto intraperitonealmente

quanto via intravenosa em camundongos selvagens, esse aumento no foi estatisticamente

significativo, assim como a tendncia dessa secreo ser dependente de NLRP3 (Figura 6A) e

Caspase-1/11 (Figura 6B). Desta forma, so necessrios outros experimentos e novas

repeties, testando outras concentraes de LPC e outros tempos de estimulao in vivo.

Fig.6: Secreo de IL-1 induzida por LPC in vivo. Camundongos C57/BL6 Selvagens (WT) e

Nocautes para o inflamassoma NLRP3 e Caspases-1/11 foram infectados com 100g/mL de LPC

intraperitonealmente (PE) ou via intravenosa (IV) e com PBS como controle negativo. Aps 24h o

sangue dos camundongos foi coletado para obteno de soro, neste foi dosado a quantidade de IL-1

secretada por ELISA. Os grficos so representativos de um nico experimento e os dados so de um

n de 5 animais. Cada barra representa a mdia da concentrao DP. No foram encontradas

diferenas significativas entre os grupos.

39

5.7. LPC induz a translocao do HMGB1 para o citoplasma em moncitos e

clulas endoteliais

A HMGB1 uma protena de alta mobilidade, no histnica, com papel estrutural na

arquitetura cromossmica que geralmente encontrada no ncleo. Durante a inflamao,

ativao celular e morte celular, estas protenas translocam para o citoplasma. A translocao

de HMGB1 para o citoplasma ocorre aps a ativao da caspase-1 por diferentes

inflamassomas, levando a sua consequente secreo. Aps ser secretada por clulas do

sistema imune, a HMGB1 funciona como um DAMP que desencadeia a resposta inflamatria

em diversas clulas, podendo levar a morte por piroptose (Lamkanfi et al. 2010; Keyel 2014).

Para verificar se a LPC induz a translocao da HMGB-1 para o citoplasma, moncitos e

clulas endoteliais foram estimuladas com 10g/mL de LPC durante 18h e depois marcadas

para microscopia confocal. Em moncitos (Figura 7A) e em clulas endoteliais (Figura 7B) a

LPC induziu a translocao do HMGB1 para o citoplasma, quando comparadas com as

clulas no tratadas. Indicando que a HMGB1 pode estar envolvida na induo da piroptose

mediada por LPC.

40

Fig.7: LPC induz a translocao da HMGB-1 para o citoplasma. THP-1 (A) e HUVEC(B)

foram estimuladas com 10g/mL de LPC durante 18h, as clulas foram marcadas e as imagens

obtidas por microscpio confocal Leica TCS SP5 com aumento de 63X e Zoom de 6 para THP-1

(A) e Zoom de 4 para HUVEC (B), as imagens so representativas de toda populao das

lminas. O Ncleo das clulas foi corado com o DAPI que fluoresce em azul, a HMGB1 foi

corada com anticorpo conjugado a fluorforo Alexa 546 que fluoresce em vermelho, na figura

nomeada sobreposio esto expostas as sobreposies das imagens do DAPI com o HMGB-1

para mostrar a localizao da HMGB1 no citoplasma ou ncleo da clula e o Campo claro mostra

as imagens das clulas sem marcadores fluorescentes para observao da morfologia celular.

A)

B)

41

5.8. LPC induz a biognese de corpsculos lipdicos em moncitos humanos

Durante a aterosclerose, clulas gordurosas desempenham um papel importante no

desenvolvimento dessa patologia, pois macrfagos fagocitam as oxLDLs e o colesterol

presentes no local e armazenam este contedo em corpsculos lipdicos (CL), o que crtico

para o estabelecimento e manuteno do estado inflamatrio caracterstico da aterosclerose.

Nos macrfagos gordurosos a formao de cristais de colesterol pode ativar o inflamassoma

NLRP3, levando a secreo de IL-1. Nossos dados j comprovaram que a LPC induz a

ativao do inflamassoma e a secreo de IL-1, entretanto no estava claro se a LPC seria

capaz de induzir a formao de clulas gordurosas atravs da biognese de CL.

Para isso, moncitos foram estimulados com 1g/mL de LPC, durante 24h e em seguida

marcados com a sonda fluorescente bodipy, que marca lipdeos neutros presentes nos CL. A

formao de CL foi analisada quantitativamente, por citometria de fluxo (Figura 8A) e

morfologicamente, por microscopia de fluorescncia confocal (Figura 8B). Como j era

esperado a LPC induziu um aumento significativo na biognese de CL em moncito humanos

quando comparado com o controle no estimulado (NE), como pode ser visualizado no

histograma e nas fotos de microscopia confocal.

42

Fig.8: LPC induz o aumento da biognese de corpsculos lipdicos em moncitos humanos.

Moncitos THP-1 foram estimulados com 1g/mL de LPC, e aps 24h de estimulao as clulas

foram marcadas com a sonda fluorescente Bodipy e o aumento da biognese de CL nas clulas

foi analisada por citometria de fluxo e microscopia de fluorescncia confocal. (A) O histograma

equivalente anlise de clulas vivas. Os nmeros so equivalentes mdia de intensidade de

fluorescncia (MFI). Esse histograma representativo de 3 experimentos distintos. (B) mostra

imagens obtidas por microscpio confocal Leica TCS SP5 com aumento de 63X e Zoom de 6, as

imagens so representativas de toda populao das lminas de trs experimentos realizados

separadamente (n=3). O Ncleo das clulas foi corado em azul com o DAPI, os corpsculos

lipdicos foram corados em verde com Bodipy, na figura nomeada sobreposio esto expostas as

sobreposies das imagens do DAPI com o bodipy para mostrar a localizao dos corpsculos no

citoplasma da clula e o campo claro mostra as imagens das clulas sem marcadores

fluorescentes para observao da morfologia da clula. Como controle foram usadas clulas no

estimuladas (NE).

43

5.9. Mecanismos envolvidos na biognese de CL em moncitos mediados por LPC

Aps verificarmos que a LPC induz um aumento significativo na biognese de CL em

moncitos, contribuindo para a formao de clulas gordurosas, fomos investigar por quais

mecanismos a LPC induz esse fenmeno. Para isso usamos inibidores relacionados a via de

ativao do inflamassoma e ao metabolismo lipdico, afim de compreender melhor a relao

da formao de clulas de gordura com a ativao do inflamassoma e a secreo de IL-1.

Para essa investigao, moncitos humanos foram pr-tratados durante uma hora antes

com: A) Inibidor de ROS; B) Inibidor de caspase-1; C) Inibidor de efluxo de potssio; D)

Inibidor de catepsina B; E) Anticorpo neutralizante de TLR2; F) Inibidor de HMG-CoA

redutase G) Inibidor de PPAR e H) Desestabilizador de jangadas lipdicas. Aps uma hora os

moncitos foram estimulados com 1g/mL de LPC, e aps aproximadamente 24h de

interao as clulas foram marcadas com a sonda fluorescente Bodipy, e a biognese de CLs

foi analisada quantitativamente, por citometria de fluxo.

Nossos resultados mostraram que a LPC induziu a biognese de CL de maneira

dependente do estresse oxidativo via produo de ROS, pois a fluorescncia pra bodipy

diminuiu em clulas tratadas com inibidores de ROS, Rotenona (Figura 9A) e NAC (Dados

no mostrados), quando comparadas com as clulas no tratadas. Outro dado importante

relacionado a via de ativao do inflamassoma a dependncia de caspase-1 para a produo

de CL, induzida pela LPC (Figura 9B). Todavia, quando os moncitos foram tratados com

inibidor de efluxo de potssio, no houve diminuio da produo de CL induzida pela LPC,

mostrando que essa produo independente de Efluxo de potssio (Figura 9C). Entretanto,

como era esperado, quando inibimos a liberao de catepsina B, que liberada quando temos

dano lisossomal, diminumos a produo de CL mediada por LPC (Figura 9D).

LPC como j era esperada, tambm induz a biognese de CL dependente de

reconhecimento via TLR2 (Figura 9E). Analisando fatores relacionados ao metabolismo

lipdico, quando inibiu-se a enzima HMG-CoA redutase, importante na sntese de colesterol,

observou-se uma diminuio expressiva na produo de CL mediada por LPC (Figura 9F).

Outro resultado j esperado a dependncia de PPAR (Figura 9G) e jangadas lipdicas

(Figura 9H) para a formao de CL, induzida por LPC, pois so fatores importantes e que

regulam a biognese de CL.

44

Fig.9: LPC induz a biognese de corpsculos lipdicos dependente de ROS, caspase-1, dano

lisossomal, TLR-2, HMG-CoA redutase, PPAR e estabilizao de jangadas lipdicas em

moncitos humanos. Moncitos THP-1 foram pr-tratados com: (A) Inibidor de ROS, Rotenona

(Rot); (B) Inibidor de caspase-1, Ac-YVAD-cho (Y-VAD); (C) Inibidor de Efluxo de potssio,

Glibenclamida (Gly); (D) Inibidor de catepsina B , CA074-ME (CA074); (E) anticorpo bloqueador de

TLR-2(-TLR2) (F) Inibidor de HMG-CoA redutase, Atorvastatina (Ator); (G) Antagonista de

PPAR-, GW9662 (GW) e (H) Desestabilizador de jangadas lipdicas , Metil--ciclodextrina (MCD);

por uma hora e em seguidas estimuladas com 1g/mL de LPC, aps aproximadamente 24h de

interao, as clulas foram marcadas com a sonda fluorescente Bodipy e o aumento da biognese de

CL nas clulas foi analisada por citometria de fluxo. Os histogramas so equivalentes anlise de

clulas vivas. Os nmeros so equivalentes mdia de intensidade de fluorescncia (MFI). Esses

histogramas so representativos de trs experimentos distintos.

45

5.10. LPC induz a biognese de corpsculos lipdicos em clulas endoteliais.

Durante a aterosclerose, as clulas endoteliais desempenham um papel importante no

desenvolvimento dessa patologia, pois secretam quimiocinas e fatores que atraem os

moncitos circulantes para o stio de formao da placa aterosclertica, alm de super

expressarem molculas de adeso que facilitam a diapedese dos leuccitos do vaso para o

tecido. Entretanto, ainda no foi descrito na literatura se LPC seria capaz de induzir a

biognese de CL em clulas endoteliais. Como nossos resultados mostram que a LPC induz a

biognese de CL em moncitos humanos, fomos investigar se a LPC tambm poderia induzir

o aumento da biognese de CL e a sua diferenciao de clulas endotelial para clula

gordurosa.

Para isso, clulas endoteliais foram estimuladas com 1g/mL de LPC, durante 24h e em

seguida marcadas com a sonda fluorescente Bodipy, a qual marca lipdeos neutros presentes

nos CL. A formao de CL foi analisada quantitativamente, por citometria de fluxo (Figura

10A) e morfologicamente, por microscopia de fluorescncia confocal (Figura 10B). Para

nossa surpresa a LPC induziu um aumento significativo na biognese de CL em clulas

endoteliais quando comparado com o controle no estimulado (NE), o qual j possui uma

grande quantidade de CL basais, como pode ser visualizado no histograma e nas fotos de

microscopia confocal.

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Fig.10: LPC induz o aumento da biognese de corpsculos lipdicos em clulas endoteliais.

Clulas endoteliais HUVEC, foram estimuladas com 1g/mL de LPC, e aps 24h de estimulao

as clulas foram marcadas com a sonda fluorescente Bodipy e o aumento da biognese de CL

nas clulas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia de fluorescncia confocal. (A) O

histograma equivalente anlise de clulas vivas. Os nmeros so equivalentes mdia de

intensidade de fluorescncia (MFI). Esse histograma representativo de 3 experimentos

distintos. (B) mostra imagens obtidas por microscpio confocal Leica TCS SP5 com aumento de

63X e Zoom de 4, as imagens so representativas de toda populao das lminas de trs

experimentos realizados separadamente (n=3). O Ncleo das clulas foi corado em azul com o

DAPI, os corpsculos lipdicos foram corados em verde com bodipy, na figura Sobreposio

esto expostas as sobreposies das imagens do DAPI com o bodipy para mostrar a localizao

dos corpsculos lipdicos no citoplasma da clula e o Campo claro mostra as imagens das clulas

sem marcadores fluorescentes para observao da morfologia da clula. Como controle foram

usadas clulas no estimuladas (NE).

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5.11. Mecanismos envolvidos na biognese de CL em clulas endoteliais

mediados por LPC

Aps verificarmo

o papel da lisofosfatidilcolina na ativação do...

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