OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE BREZO

(Calluna vulgaris) CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Y

EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD FRENTE AL VIRUS

DE LA HEPATITIS C

Departamento de Producción y Caracterización de Nuevos Alimentos

Grupo Ingredientes Alimentarios Funcionales

Centro Biología Molecular Severo Ochoa

VIRUS HEPATITIS C

2,8% POBLACIÓN INFECTADA

350.000 MUERTES/AÑO

NO EXISTE VACUNA

INTERFERÓN (IFN-) + RIBAVIRINA

Síntomas ~ gripe

Anemia hemolítica

Efectos teratológicos

efectos

secundarios

Necesidad de nuevos agentes con alto índice

terapéutico y pocos efectos secundarios

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

OH

O

OH

OH

O

OH

Acido oleanólico Acido ursólico

ANTIINFLAMATORIA

ANTI-TUMORAL

ANTI-REUMÁTICO

HEPATOPROTECTORA

ANTIVIRAL HEPATITIS C

Brezo (Calluna vulgaris) Brezo (Calluna vulgaris)

Afecciones

infecciosas vías

urinarias

Antiinflamatorio Antiespasmódico

Cicatrizante

FITOQUÍMICOS:

ANTIOXIDANTES, ANTIINFLAMATORIOS, ANTICANCERÍGENOS

Quercetina

Acido clorogénico

kaempferol-3-O-β-d-

galactosido

α,β-amirina

Sitosterol

Acido ursólico (52 mg/g)

Acido oleanólico (11 mg/g)

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

OBTENCIÓN DE

NUTRACEUTICOS E

INGREDIENTES ALIMENTARIOS

Celda de extracción 2 L

Separadores (S1, S2) 0.5 L

Recirculación CO2

Bomba cosolvente

28 µg/g extracto flores

125 µg/g extracto hojas

75 µg/g extracto flores

398 µg/g extracto hojas

Szakiel y col. 2013

Zhao, 2011

Extractos SFE: Taraxasterol, Friedelinol, α,β- amirin

A. Szakiel, B. Nizynski and C. Paczkowski. Natural Product Research. 2013. 27 (15) 1404-1407

J. Zhao. The extraction of high value chemicals from heather (Calluna vulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum). PhD

Thesis, University of , 2011.

SFE

CONDICIONES DE EXTRACCIÓN

Ext. P T Tiempo Caudal CO2 co-solvente

(MPa) (ºC) (h) (g/ min) (% etanol)

1 20 50 3 60 0

2 30 50 3 60 0

3 40 50 3 60 0

4 50 50 3 60 0

5 40 40 3 60 0

6 40 60 3 60 0

7 40 70 3 60 0

8 30 50 3 60 5

9 30 50 3 60 10

10 30 50 3 60 15

Ext. P T Tiempo Caudal CO2 co-solvente

(MPa) (ºC) (h) (g/ min) (% etanol)

11a S1 50 50 4 50 0

11b S2

12a Etapa 1 25 50 1.5 50 0

12b Etapa 2 30 50 2.5 50 10

RESULTADOS SFE: EFECTO DE LA PRESIÓN

0 10 20 30

20

30

40

50

mg/g extrato

P (

bar)

50ºC

OA

UA

0.00

1.00

2.00

3.00

200 300 400 500

P (bar)

50ºC

RESULTADOS SFE: EFECTO DE LA TEMPERATURA

0 5 10 15 20 25 30 35

40

50

60

70

mg/g extrato

T (

ºC)

Variación de extracción triterpenos con la Tª de extracción a presión constante de 400 bar

OA

UA

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

40 50 60 70

Ren

dim

ien

to (

%)

Tª (ºC)

Variación del rendimiento con la Tª de extracción a presión constante de 400 bar

Rendimiento

Concentración

de triterpenos

RESULTADOS SFE: EFECTO DEL % COSOLVENTE

0 50 100 150 200 250

0

5

10

15

mg/g extrato

co

so

lve

nte

(%

)

Variación de extracción triterpenos con el % de cosolvente a presión y Tª constantes (300 bar, 50ºC)

OA

UA

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

0 5 10 15

Ren

dim

ien

to (

%)

Cosolvente (%)

Variación del rendimiento con el % de cosolvente a presión y Tª constantes (300 bar, 50ºC)

Rendimiento

Concentración

de triterpenos

RESULTADOS SFE: FRACCIONAMIENTO

Ext. Rendimiento Ácido oleanolico Ácido ursolico

(%) (mg/g extracto) (mg/g extracto)

11a S1 0.26 13.50 98.56

11b S2 1.94 2.53 2.95

El fraccionamiento en línea del extracto (Ext.11) produce: rendimiento S2

>S1, [triterpenos] >S1.

Cuando la extracción se lleva a cabo en dos etapas (Ext.12) el uso de etanol

en la segunda etapa da como resultado: ↑rendimientos, ↑ [triterpenos].

En el brezo ursólico>oleanólico (ratio ursólico/oleanólico ≈4), sin embargo

solubilidad oleanólico>ursólico en etanol produce: uso cosolvente ↓ratio

(ratio ursólico/oleanólico ≈0.7).

Ext. Rendimiento Ácido oleanolico Ácido ursolico

(%) (mg/g extracto) (mg/g extracto)

12a Step1 2.65 1.44 2.19

12b Step2 5.28 73.14 51.62

RESULTADOS: ACTIVIDAD ANTI-HCV

Diluciones extractos

SFE-brezo

Diluciones extractos

SFE-brezo

Células Huh7.5 no

infectadas

Células Huh7.5

infectadas con HCVcc

CC50

IC50

Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSIC-UAM), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)

Actividad Anti-HCV extractos IT>1

Ext.

OA

(mg/g extracto)

UA

(mg/g extracto)

Indice Terapéutico

(CC50/IC50)

2 2.36 16.92 0.99

4 5.66 18.86 0.80

5 2.49 17.85 0.44

7 9.19 21.59 1.40

8 12.41 11.33 2.84

9 69.75 55.57 3.25

10 82.87 141.45 1.52

11a 13.50 98.56 1.24

13b 73.14 51.62 3.60

OA 10.50

UA 5.00

RESULTADOS: ACTIVIDAD ANTI-HCV

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0

50

100

150

200

250

0 1 2 3 4

Th

era

pe

uti

c In

de

x (T

I)

mg

/g o

lea

no

lic +

urs

oli

aci

ds

ethanol/heather ratio

Uso etanol como

cosolvente aumenta

la concentración de

ácidos triterpénicos

en los extractos

pero reduce el TI

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 20 40 60 80 100

TI

(CC

50

/IC

50

)

mg/g olenolic acid

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0 25 50 75 100 125 150

TI

(CC

50

/IC

50

)

mg/g ursolic acid

La SFE permite obtener extractos con altas

concentraciones de ácidos triterpénicos

(oleanólico y ursólico) (2-22 % en peso).

Aunque es necesario continuar con las

investigaciones, los extractos supercríticos de

brezo podrían presentar una alternativa

terapéutica contra el virus de la Hepatitis C.

CONCLUSIONES

Los extractos supercríticos de brezo presentan

actividad anti-HCV. Algunos extractos presentan

índices terapéuticos cercanos a los del ácido

ursólico aunque dos veces menores que los del

ácido oleanólico.