obtenção de um sistema de liberação modificada contendo
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e
avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos
Maria Carolina Bonjovanni de Paiva
Ribeirão Preto
2017
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e
avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
Área de Concentração: Medicamentos e
Cosméticos
Orientada: Maria Carolina Bonjovanni de
Paiva
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carolina Patrícia
Aires
Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas em 29/09/2017. A versão original encontra-se
disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.
Ribeirão Preto
2017
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Bonjovanni, Maria Carolina
Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo
clorexidina e avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos.
Ribeirão Preto, 2017. 41 p.; 30cm.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:
Medicamentos e Cosméticos.
Orientador: Aires, Carolina Patrícia.
1. Sistema de liberação. 2. Biofilmes orais. 3. Clorexidina.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Maria Carolina Bonjovanni de Paiva
Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e avaliação de seu
efeito em biofilmes orais patogênicos
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
Área de Concentração: Medicamentos e
Cosméticos.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carolina Patrícia Aires
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________
Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________
Dedico este trabalho, primeiramente, à minha família que com
muito esforço, amor e companheirismo fez com que essa
realização se tornasse possível.
Dedico também, à professora e amiga Carolina Patrícia Aires que
contribuiu enormemente, tanto para a minha formação
profissional, como pessoal.
Obrigada por tudo!
AGRADECIMENTOS
À Universidade de São Paulo e à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto pela
oportunidade e pela infraestrutura para o desenvolvimento do trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação, na pessoa da sua coordenadora Prof.ª Dr.ª Renata Fonseca
Vianna Lopez, pelo apoio institucional e científico.
Aos funcionários da secretaria de Pós-Graduação, pelo apoio institucional.
Agradeço a Deus por todo o amor que cerca minha vida, por me proteger de todo o mal e estar
presente em todos os momentos iluminando meus passos, me enchendo de esperança nos
momentos difíceis e de humildade a cada vitória.
Agradeço ao meu pai, Sebastião de Paiva Filho, por todo esforço para me proporcionar a
melhor educação, bem-estar e conforto. Por estar sempre ao meu lado não só como pai, mas
como amigo e companheiro para todas as horas. Agradeço à minha mãe, Carla Bonjovanni de
Paiva, por toda a dedicação, amizade, paciência, e por cuidar de mim com tanto carinho e
amor. Agradeço ao meu irmão Giuseppe Bonjovanni de Paiva e à minha prima-irmã Giulia
Moreira Paiva por todos os momentos compartilhados. Obrigada a vocês por me ensinarem o
que é certo e o que é errado, por permitirem que eu caminhasse sempre com meus próprios
pés nunca me deixando desamparada, por me mostrarem todos os dias o que realmente tem
valor na vida. Espero que um dia eu seja pelo menos a metade do que vocês são.
Agradeço à minha orientadora Carolina Patrícia Aires e ao professor Osvaldo de Freitas pela
enorme oportunidade, por todos os ensinamentos profissionais e pessoais, pela confiança,
amizade e dedicação.
Agradeço às técnicas Ana Cristina Morseli Polizello e Maíra Peres Ferreira Duarte por todos
os ensinamentos, momentos compartilhados e amizadade sincera. Vocês fizeram meus dias
mais felizes.
Agradeço às companheiras de laboratório Ana Carolina dos Santos Ré e Erika Kawakita
Hashimoto que cresceram comigo durante esses anos e me ajudaram na realização deste
projeto.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (2015/17712-9) pelo apoio
científico e financeiro que possibilitou a realização desta pesquisa.
Ainda que eu fale as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver amor, serei como o bronze
que soa ou como o címbalo que retine.
Ainda que eu tenha o dom de profetizar e conheça todos os mistérios e toda a ciência; ainda
que eu tenha tamanha fé, a ponto de transportar montes, se não tiver amor, nada serei.
(Coríntios, 13)
i
RESUMO
BONJOVANNI, M. C. Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo
clorexidina e avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos. 2017. 41f.
Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.
Considerando que a obtenção de uma formulação farmacêutica pode ser melhor planejada se
algumas condições biológicas inerentes à cavidade oral forem contempladas e que os sistemas
de liberação modificada podem ser ferramentas para o controle de doenças orais, o objetivo
do trabalho é obter uma formulação contendo clorexidina, avaliando seu efeito sobre os
mesmos. Este trabalho foi dividido em duas etapas, sendo que a primeira envolveu a obtenção
da formulação mais adequada aos experimentos biológicos e a segunda avaliou seus efeitos
sobre biofilmes patogênicos orais. Assim, formulações com diferentes concentrações de
clorexidina foram preparadas e avaliadas visualmente em relação à sua integridade física
nas condições de crescimento dos biofilmes, seguido de ensaio de liberação em meio
estático utilizando tampão como meio de dissolução (meio de dissolução convencional).
A formulação selecionada foi submetida a ensaios de liberação em meio estático
contendo os diferentes caldos de cultura bacterianos como meio de dissolução. Na
segunda etapa do trabalho, o efeito da formulação selecionada foi avaliado em biofilmes
cariogênicos de Streptococcus mutans ou biofilmes periodontopatogênicos de Porphyromonas
gingivalis. Biofilmes de S. mutans (n=6) ou P. gingivalis (n=3) foram formados em caldos de
cultura sob lâminas de vidro por 6 e 3 dias, respectivamente, sendo expostos a um dos
seguintes tratamentos: 1) Formulação contendo 92% de quitosana e 8% de hidroxipropil
metilcelulose (CV, como controle do veículo) ou 2) Formulação contendo 82% de quitosana,
8% de hidroxipropil metilcelulose e 10% de clorexidina (CHX, grupo experimental). Um
grupo sem exposição à formulação foi incluído como controle negativo (CN). Após o período
experimental, a viabilidade bacteriana, o pH dos biofilmes e a quantificação de clorexidina
liberada para os caldos de cultura foram determinados. Os dados foram analisados
estatisticamente por teste de Tukey-Kramer e Tukey, sendo o nível de significância
estabelecido em 5%. Os resultados sugerem que ainda que a liberação de clorexidina da
formulação nos caldos de cultura de S. mutans e P. gingivalis tenha sido menor se comparada
ao meio de dissolução convencional (p<0,05), o efeito biológico promovido foi observado
para ambos os biofilmes. Para o pH dos biofilmes de S. mutans, os grupos CN e CV não
apresentaram diferença entre si (p>0,05), mas apresentaram quedas de pH maiores se
comparados à CHX (p<0,05). CHX também resultou em menor viabilidade bacteriana dos
biofilmes se comparada aos controles (p<0,05), que não apresentaram diferença entre si
(p>0,05). Para P. gingivalis também houve mais morte celular nos biofilmes expostos à CHX
(p<0,05) mas CV também apresentou perda de viabilidade em comparação à CN (p<0,05).
Apesar da liberação de clorexidina da formulação ter sido dificultada pela presença dos
microrganismos, os resultados sugerem que o sistema de liberação obtido foi capaz de
diminuir a patogenicidade dos biofimes de Streptococcus mutans e de Porphyromonas
gingivalis. Assim, o presente estudo sugere a importância de aliar os estudos de diferentes
áreas de conhecimento de forma a contribuir no planejamento das formulações, vislumbrando
futuros benefícios clínicos para o controle das doenças orais.
Palavras-chave: Sistema de liberação; Biofilmes orais;
ii
ABSTRACT
BONJOVANNI, M. C. Obtention of a modified release system containing chlorhexidine
and evaluation of its effect on pathogenic oral biofilms. 2017. 41f. Dissertation (Master).
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2017.
Considering that obtaining a pharmaceutical formulation can be better planned if some
biological conditions inherent to the oral cavity are contemplated and that the modified
release systems may be tools for the control of oral diseases, the aim of the work is to obtain a
formulation containing chlorhexidine and evaluate its effect in pathogenic biofilms. This work
was divided in two stages, the first involved obtaining the most appropriate formulation for
biological experiments and the second evaluate its effect on oral pathogenic biofilms. Thus,
formulations with different concentrations of chlorhexidine were prepared and evaluated
visually for their physical integrity under the biofilm growth conditions, followed by the static
media release assay using buffer as the dissolution medium (conventional dissolution
medium). The selected formulation was subjected to static release tests containing the
different bacterial culture broths as the dissolution medium. In the second stage of the work,
the effect of the selected formulation was evaluated in cariogenic biofilms of Streptococcus
mutans or periodontopathogenic biofilms of Porphyromonas gingivalis. Biofilms of S. mutans
(n = 6) or P. gingivalis (n = 3) were formed in culture broths under glass slides for 6 and 3
days respectively, being exposed to one of the following treatments: 1) Formulation
containing 92 % of chitosan and 8% of hydroxypropyl methylcellulose (CV, vehicle control)
or 2) Formulation containing 82% of chitosan, 8% of hydroxypropyl methylcellulose and
10% of chlorhexidine (CHX, experimental group). A group without exposure to the
formulation was included as negative control (CN). After the experimental period, bacterial
viability, biofilms pH and quantification of chlorhexidine released into the culture broths were
determined. Data were statistically analyzed by Tukey-Kramer and Tukey test with a level of
significance of 5%. Results suggest that although chlorhexidine release from formulation in
the culture broths of S. mutans and P. gingivalis was lower compared to the conventional
dissolution medium (p <0.05), the treatment promoted biological effect for both biofilms.
Regarding S. mutans biofilms pH, CN and CV groups showed no difference (p> 0.05), but
showed higher pH drops when compared to CHX (p <0.05). CHX also resulted in lower
bacterial viability of biofilms compared to controls (p <0.05), which did not show any
difference (p> 0.05). For P. gingivalis, there was higher cell death in the biofilms exposed to
CHX (p <0.05) and CV presented loss of viability compared to CN (p <0.05). Although the
release of chlorhexidine from the formulation has been hampered by the presence of
microorganisms, results suggest that the release system was able to reduce the pathogenicity
of Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis biofilms. Thus, the present study
suggests the importance of combining studies from different areas of knowledge in order to
contribute to the design of formulations aiming future clinical benefits for the oral diseases
control.
Keywords: Drug delivery system; Oral biofilms; Chlorhexidine.
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Cárie dental após tratamento ortodôntico ................................................................... 5
Figura 2 - Periodontite avançada com presença de biofilme, cálculo, migração dental
patológica e grave perda de inserção dental ............................................................................... 6 Figura 3 - Estrutura química da clorexidina ............................................................................... 7 Figura 4 - Inserção do Periochip® na bolsa periodontal ............................................................. 9 Figura 5 – Delineamento experimental do trabalho ................................................................. 12
Figura 6 – Formação do biofilme de S. mutans e exposição aos tratamentos .......................... 17 Figura 7 – Formação do biofilme de P.gingivalis e exposição aos tratamentos ...................... 19 Figura 8 – Perfis cromatográficos (CLAE-DAD) obtidos pela análise de: a) solução
preparada em tampão contendo 50 µg/mL de clorexidina; b) caldo de cultura na presença
de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de S.mutans; c) caldo de
cultura na presença de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de P.
gingivalis .................................................................................................................................. 22 Figura 9 – Concentração de clorexidina liberada das formulações-teste 2, 3 e 4 contendo,
respectivamente, 10, 20 e 40% de ativo ................................................................................... 23 Figura 10 – Concentração de clorexidina liberada em cada tempo a partir da formulação-teste
2 utilizando diferentes meios de dissolução ............................................................................. 23 Figura 11 – Viabilidade do biofilme de S. mutans de acordo com os tratamentos .................. 25
Figura 12 – Viabilidade do biofilme de P. gingivalis de acordo com os tratamentos .............. 27
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição das formulações-teste preparadas com concentrações variáveis de
digluconato de clorexidina na presença ou ausência do HPMC ............................................... 13
Tabela 2 – Mensuração do pH dos biofilmes de S. mutans de acordo com os tratamentos ..... 24 Tabela 3 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de
fármaco na formulação (média + dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem
bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans ........................................................... 25 Tabela 4 - Concentração do fármaco em porcentagem nos diferentes meios de liberação
(média ± dp).............................................................................................................................. 26 Tabela 5 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de
fármaco na formulação (média ± dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem
bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis ...................................................... 28 Tabela 6 – Concentração do fármaco nos diferentes meios de liberação (média ± dp) ........... 29
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................... i ABSTRACT .............................................................................................................................. ii LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. iii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. iv 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1 2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 3
2.1 BIOFILMES ......................................................................................................... 3 2.2 DOENÇAS ORAIS .............................................................................................. 4
2.2.1 Cárie .............................................................................................................. 4 2.2.2 Doença periodontal ...................................................................................... 5
2.3 CLOREXIDINA ................................................................................................... 7
2.4 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS ..................... 8 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 10 4 MATERIAIS E MÉTODO ................................................................................................. 11
4.1 MATERIAIS ....................................................................................................... 11 4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................. 11
4.3 OBTENÇÃO DO SISTEMA DE LIBERAÇÃO MODIFICADA ..................... 13
4.4 ENSAIO DE LIBERAÇÃO DO FÁRMACO EM MEIO ESTÁTICO
(TAMPÃO) ........................................................................................................................... 14 4.5 QUANTIFICAÇÃO DE DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA .................... 14
4.6 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)
.............................................................................................................................................. 15
4.7 BIOFILMES ....................................................................................................... 15 4.7.1 Biofilme de Streptococcus mutans ............................................................. 16
4.7.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis ..................................................... 17 4.7.3 Análises ....................................................................................................... 19
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 20 5 RESULTADOS .................................................................................................................... 21
5.1 SELETIVIDADE DO MÉTODO ....................................................................... 21
5.2 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO) .................... 21 5.3 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)
.............................................................................................................................................. 23 5.4 BIOFILMES ....................................................................................................... 24
5.4.1 Biofilme de Streptococcus mutans ............................................................. 24 5.4.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis ..................................................... 27
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 30 7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 34
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 35 ANEXO I ................................................................................................................................. 41
1
1 INTRODUÇÃO
A cavidade oral apresenta uma variada e exuberante colonização microbiana
(DEWHIRST et al., 2010; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; MYSAK et al. 2014;
ARWEILER; NETUSCHIL, 2016). Estes microrganismos colonizam naturalmente tanto as
superfícies dentais quanto os tecidos moles mas uma disbiose pode contribuir para a formação
de biofilmes patogênicos supra e subgengivais relacionados à doenças como cárie e a doença
periodontal, respectivamente (BEIKLER; FLEMMIG, 2011). De acordo com a indicação
clínica, o uso de antimicrobianos como a clorexidina podem auxiliar no controle de tais
doenças (RODE et al., 2012).
Antimicrobianos são comumente administrados na cavidade oral na forma de
enxaguatórios (SENEL et al., 2000; RIBEIRO; HASHIZUME; MALTZ, 2007; VARONI et al.,
2012; YENGOPAL; MICKENAUTSCH, 2012; PITHON et al., 2015; SMILEY et al., 2015;
LEE et al., 2016) mas a tecnologia farmacêutica tem contribuído para prolongar seus efeitos,
desenvolvendo sistemas de liberação modificados que podem estender o tempo de liberação
do fármaco. Entretanto, as condições biológicas encontradas na cavidade bucal tornam o
desenvolvimento das formulações orais um verdadeiro desafio (SANKAR et al., 2011) e
muitas vezes o benefício clínico não pode ser evidenciado como preconizado
laboriatorialmente.
Uma das condições biológicas mais desafiadoras encontradas na cavidade oral é a
presença de enzimas bacterianas, que podem interagir com componentes específicos da
formulação (SANKAR et al., 2011). Além disso, o metabolismo dos microrganismos pode
produzir altos níveis de ácidos (VAN HOUTE, 1994) ou bases orgânicas (TAKAHASHI et
al., 1997), causando oscilações de pH que podem comprometer a liberação de determinados
fármacos. Em acréscimo, há que se considerar os biofilmes, comunidades bacterianas
altamente organizadas que promovem proteção física contra antimicrobianos pela formação
de uma matriz polimérica, produzindo suas próprias enzimas para adaptação fisiológica
celular (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014; FLEMMING et al., 2016).
Analisados em conjunto, estes fatores podem implicar na degradação precoce ou na menor
liberação do fármaco da formulação, comprometendo sua eficácia clínica. Entretanto,
formulações farmacêuticas como os sistemas de liberação modificada contendo
antimicrobianos raramente são delineadas na presença de tais condições.
Sistemas de liberação modificada de fármacos são formulações que proporcionam uma
atividade a longo prazo, pois liberam o princípio ativo em concentração terapêutica por um
2
período estendido (LAVOINE et al., 2014). Em acréscimo, tais sistemas podem ser utilizados
como ferramenta para aumentar as propriedades biofarmacêuticas do fármaco aumentando
sua solubilidade, biodistribuição e estabilidade, além de melhorar sua atividade biológica
(MARTIN et al., 2015). Assim, a veiculação de um antimicrobiano em uma formulação
farmacêutica de liberação modificada poderia trazer inovações para o controle dos biofilmes
orais patogênicos.
Um dos antimicrobianos mais prescritos na Odontologia é a clorexidina, considerada
padrão ouro no controle de biofilmes (VARONI et al., 2012). Seu amplo espectro de ação
antibacteriano permite sua indicação tanto como coadjuvante na redução do biofilme
supragengival cariogênico em pacientes que utilizam aparelhos ortodônticos (PITHON et al.,
2015) quanto no controle do biofilme subgengival em pacientes com periodontite (SMILEY
et al., 2015). Entretanto, sua veiculação em sistemas de liberação modificada é considerada
controversa, ao menos para o tratamento da periodontite (TABARY et al., 2014; MEDAIAH
et al., 2014).
Neste contexto, considerando que a obtenção de uma formulação farmacêutica pode
ser melhor planejada se algumas condições biológicas inerentes à cavidade oral forem
contempladas e que os sistemas de liberação modificada podem ser ferramentas para o
controle de doenças orais, o objetivo do trabalho é obter uma formulação contendo
clorexidina na presença de biofilmes patogênicos, avaliando seu efeito sobre os mesmos.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 BIOFILMES
Os biofilmes são comunidades de microrganismos associados entre si, protegidos por
uma matriz polimérica extracelular e aderidos à superfícies biológicas ou sintéticas
(BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014;
HURLOW et al., 2015; MARTIN et al, 2015; FLEMMING et al., 2016). O processo de
formação dos biofilmes se inicia com a deposição dos microrganismos, seguida de sua
adsorção reversível à superfície de adesão (MONROE, 2007). Esta adsorção é facilitada pela
presença de moléculas que revestem as superfícies ou que estão no meio líquido circundante
como, por exemplo, as proteínas salivares (MONROE, 2007; PAPAIOANNOU et al., 2012;
MARTIN et al., 2015). A adesão se torna irreversível a partir da produção bacteriana de uma
matriz viscosa de substâncias poliméricas extracelulares (JOLIVET-GOUGEON;
BONNAURE-MALLET, 2014), composta por macromoléculas como proteínas, ácidos
nucleicos, lipídeos, polissacarídeos, componentes sanguíneos entre outros (MARTIN et al,
2015). Além disso, estas substâncias favorecem a adsorção de colonizadores secundários,
iniciando o estágio de formação do biofilme denominado maturação (MONROE, 2007;
JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014).
No estágio de maturação, as bactérias se comunicam por quorum sensing e ocorrem
trocas de substâncias (oxigênio, nutrientes) entre o biofilme e o meio, além da replicação dos
microrganismos e metabolização de substrato circundante (MARTIN et al., 2015). Por fim,
esta estrutura permite a dispersão de agregados bacterianos que podem aderir e colonizar
novas superfícies, iniciando outro ciclo de formação do biofilme (MONROE, 2007). Em
acréscimo, a alta densidade celular dos biofilmes aliada à presença das substâncias
extracelulares poliméricas diminuem a susceptibilidade do biofilme ao antimicrobiano na
ordem de 10 a 1000 vezes se comparado às mesmas bactérias em sua forma planctônica
(MONROE, 2007; WU et al., 2014; FLEMMING et al., 2016). Em conjunto, estas
características contribuem para o desenvolvimento da doença, dificultando seu controle
(MONROE, 2007). Segundo Bleikler e Flemmig (2010), os biofilmes são responsáveis por
mais de 75% das doenças microbianas encontradas em humanos e, na Odontologia, as
doenças orais tem sido relacionadas diretamente à qualidade de vida, saúde geral e gastos em
saúde pública (BEIKLER; FLEMMIG, 2011).
4
2.2 DOENÇAS ORAIS
As doenças orais representam um problema de saúde pública mundial afetando,
principalmente, locais com menos recursos financeiros (WHO, 2012; JIN et al., 2016). Além
disso, estão frequentemente associadas à doenças sistêmicas crônicas como doenças
cardiovasculares, câncer, diabetes e doenças respiratórias (WHO, 2012). Atualmente, os
gastos para tratamento das doenças orais estão entre os maiores, tendo sido o mais alto dos
EUA no ano de 2006 quando comparado com todas as outras doenças (BEIKLER;
FLEMMIG, 2011). Na União Europeia os gastos anuais com saúde oral entre 2008 e 2012
chegaram a 79 bilhões de euros e estima-se que em 2020 os gastos cheguem a 93 bilhões de
euros (JIN et al., 2016).
O microbioma da cavidade oral compreende cerca de 700 espécies de bactérias
(DEWHIRST et al., 2010; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; MYSAK et al. 2014;
ARWEILER; NETUSCHIL, 2016), favorecendo a formação de biofilmes que se aderem
naturalmente às mucosas e aos dentes (LAUDENBACH; SIMON, 2014). A presença do
biofilme patogênico, considerado um dos principais fatores etiológicos das doenças orais,
aumenta a susceptibilidade do hospedeiro para o desenvolvimento de doenças como a cárie e
a periodontite (DEWHIRST et al, 2010; BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JIN et al., 2016).
2.2.1 Cárie
A cárie dental tem sido apontada como a maior responsável pela perda de dentes em
crianças e pode ter graves consequências para a saúde (WHO, 2012; JIN et al., 2016). Esta
doença afeta 60-90% das crianças em idade escolar e grande parte dos adultos no mundo já
apresentou ao menos um episódio de cárie (BEIKLER; FLEMMIG, 2011; WHO, 2012).
Dentre os microrganismos presentes na lesão, a bactéria Gram-positiva Streptococcus
mutans é a principal responsável pela formação do biofilme cariogênico supragengival
(LEMOS et al., 2013; KRZYŚCIAK et al., 2014). Estudos sugerem que S. mutans tem maior
habilidade de formar biofilme se comparado isoladamente a outros tipos de Streptococcus que
colonizam a cavidade oral (KRZYŚCIAK et al., 2014). Além disso, o S. mutans tem a
capacidade de produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos e de competir com bactérias
não-cariogênicas em pHs baixos, tornando-o o microrganismo mais cariogênico (LEMOS et
al., 2013).
5
Bactérias orais como o S. mutans promovem a desmineralização do dente devido à
produção de altos níveis de ácidos orgânicos produzidos a partir de carboidratos fermentáveis,
como a sacarose (PAES LEME et al., 2006). A sacarose é considerado o carboidrato mais
cariogênico da dieta, pois favorece a formação de um biofilme com uma matriz rica em
polissacarídeos extracelulares insolúveis do tipo glucano (CURY et al., 2000; AIRES et al.,
2008). A produção de glucanos insolúveis favorece a integridade estrutural do biofilme
(DUARTE et al., 2008), aumentando o tempo de exposição aos ácidos bacterianos,
ocasionando a desmineralização dental ou cárie (LAUDENBACH; SIMON, 2014). Assim, o
consumo de carboidratos fermentáveis apresenta relação direta com o aumento da doença
(BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JIN et al., 2016).
O protocolo utilizado no tratamento da lesão de cárie com cavitação inclui a remoção
da mesma pela escavação das superfícies afetadas, seguida de restauração (LAUDENBACH;
SIMON, 2014). Já a prevenção da doença é feita pelo controle mecânico do biofilme,
podendo ser associado o uso de antimicrobianos de uso tópico, de acordo com a indicação
clínica (RODE et al., 2012). A gravidade da cárie pode variar desde o desenvolvimento de
lesões brancas opacas ou descalcificação, até a perda da integridade da superfície do esmalte
seguida de cavitação. A Figura 1 ilustra um caso de cárie dental, mais especificamente as
lesões brancas, após tratamento ortodôntico.
Figura 1- Cárie dental após tratamento ortodôntico
Fonte: RICHTER et al., 2011.
2.2.2 Doença periodontal
A doença periodontal refere-se a diferentes quadros clínicos, denominados doenças
gengivais ou gengivite quando limitados aos tecidos periodontais de proteção (gengiva e
mucosa alveolar) e periodontite quando acometem os tecidos periodontais de suporte do
elemento dentário (osso alveolar, cemento e ligamento periodontal) (LAUDENBACH;
6
SIMON, 2014). Na gengivite, ocorre a inflamação nos tecidos moles que circundam o dente
provocando o inchaço, a vermelhidão e o sangramento destes tecidos. Com o agravamento da
gengivite, o quadro pode evoluir para a periodontite e o hospedeiro pode apresentar diferentes
graus de perda óssea, mobilidade e migração patológica do dente podendo ocasionar a perda
do elemento dental (LAUDENBACH; SIMON, 2014).
A doença periodontal é responsável pela perda de dentes em cerca de 20% dos adultos
entre 35 e 44 anos (WHO, 2012). Esta doença, predominantemente subgengival, inclui a
presença da bactéria Porphyromonas gingivalis, detectada em mais de 85% dos tecidos
afetados pela periodontite, sendo raramente encontrada em tecidos saudáveis (SLOTS;
GENCO, 1984; BOSTANCI; BELIBASAKIS, 2012; MYSAK et al., 2014). Desta forma, a
presença de P. gingivalis pode predizer a progressão da doença periodontal e a sua redução
após o tratamento é associada à resolução da doença no local afetado (BOSTANCI;
BELIBASAKIS, 2012).
Esta bactéria Gram-negativa, assacarolítica e anaeróbia é capaz de fermentar
aminoácidos como fonte de energia e pode apresentar diversos fatores de virulência, como
cisteína proteinases, lipopolissacarídeos, cápsulas e fímbrias (BOSTANCI; BELIBASAKIS,
2012). Além disso, a P. gingivalis é uma bactéria fastidiosa e requer hemina (fonte de ferro) e
menadiona (vitamina K) para seu crescimento (LAMONT; JENKINSON, 1998).
O tratamento da doença periodontal consiste na remoção mecânica profissional do
biofilme e do cálculo por raspagem/alisamento radicular, podendo ser associado a
prodecimentos cirúrgicos e a utilização de antibióticos de uso sistêmico ou tópico (BEIKLER;
FLEMMIG, 2011; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; LAUDENBACH; SIMON, 2014). A
Figura 2 - mostra um caso de periodontite avançada.
Figura 2 - Periodontite avançada com presença de biofilme, cálculo, migração dental
patológica e grave perda de inserção dental
Fonte: LAUDENBACH; SIMON, 2014.
7
2.3 CLOREXIDINA
A estratégia fundamental para o controle dos biofilmes patogênicos é a sua remoção
mecânica (WHO, 2012; ARWEILER; NETUSCHIL, 2016). Entretanto, considerando
possíveis deficiências nesta remoção pelo controle mecânico e a presença de hábitos
deletérios como dieta rica em açúcares refinados (VARONI et al., 2012), o controle químico
do biofilme tem sido uma estratégia muito discutida na literatura (CURY, 1997; HAAS et al.,
2014). Dentre os antimicrobianos mais prescritos na Odontologia encontra-se a clorexidina
(VARONI et al., 2012). Esta molécula (Figura 3) é uma bisbiguanida catiônica que pode ser
apresentada na forma de sal como o digluconato, que apresenta boa solubilidade em água
(VARONI et al, 2012). Seu amplo espectro de ação antibacteriano permite que possa ser
indicado tanto como coadjuvante na redução do biofilme cariogênico em pacientes que
utilizam aparelhos ortodônticos (PITHON et al., 2015) como em pacientes com periodontite
(SMILEY et al., 2015). Em acréscimo, é indicada para tratamentos tópicos em pequenas
cirurgias orais e sua utilização no período pós-operatório pode reduzir riscos de osteíte
alveolar (SENEL et al., 2000; YENGOPAL; MICKENAUTSCH, 2012).
Figura 3 - Estrutura química da clorexidina
Fonte: Varoni et al, 2012.
O digluconato de clorexidina (conhecida na Odontologia como clorexidina) é
comumente utilizado como enxaguatório bucal, apresentando efeitos bacteriostáticos em
baixas concentrações (0,012 – 0,06%) e efeitos bactericidas em concentrações maiores (0,12 –
0,2%) (RIBEIRO; HASHIZUME; MALTZ, 2007; VARONI et al., 2012; LEE et al., 2016),
sendo considerada padrão-ouro no controle dos biofilmes orais.
O tempo de permanência desta molécula na cavidade oral é alto em comparação a
outros antimicrobianos devido à sua capacidade de se ligar às mucinas, proteínas salivares que
revestem as superfícies dos tecidos orais (VARONI et al., 2012). Apesar disto, em um
trabalho de revisão, Ribeiro, Hashizume e Maltz (2007) relataram que clorexidina na forma de
gel apresenta resultados mais promissores se comparado à clorexidina na forma de
8
enxaguatório. Estes autores relatam redução nos níveis de S. mutans do biofilme dental por
um período de até 26 semanas após uso do gel enquanto os enxaguatórios apresentaram
redução apenas durante o tratamento, que pode variar com a utilização de uma única aplicação
ou de aplicações consecutivas por até 6 semanas, de acordo com o protocolo estabelecido.
Segundo Senel e colaboradores (2000), os géis podem prolongar o tempo de permanência da
formulação na cavidade oral, o que poderia explicar o aumento de seu efeito terapêutico.
Além disso, os géis podem ter características de liberação modificada de fármacos devido às
propriedades de seus polímeros (SENEL et al., 2000).
2.4 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS
Os sistemas de liberação modificada de fármacos são formulações que proporcionam
uma atividade a longo prazo, visto que liberam o princípio ativo em concentração terapêutica
por um período estendido (LAVOINE et al., 2014). Em acréscimo, estes sistemas de liberação
podem ser utilizados como ferramenta para aumentar as propriedades biofarmacêuticas do
fármaco diminuindo sua toxicidade, aumentando sua solubilidade, biodistribuição e
estabilidade, além de melhorar sua atividade biológica (MARTIN et al., 2015).
Para a cavidade oral, um dos sistemas de liberação mais estudado é o sistema de
liberação semissólido (géis e pomadas) (SENEL et al.; 2000; BRUSCHI; FREITAS, 2005;
VERRAEDT et al., 2010; SHARPE et al., 2014), pois promove o contato íntimo entre a
formulação e o tecido, resultando em alta concentração de fármacos no local de aplicação
(BRUSCHI; FREITAS, 2005). Em particular, um sistema de liberação semissólido que
apresenta propriedades ajustáveis e diversidade de polímeros naturais e sintéticos disponíveis
são os géis (SHARPE et al., 2014). Entretanto, as condições biológicas encontradas na
cavidade bucal podem contribuir para a rápida eliminação de tais sistemas, tornando o
desenvolvimento das formulações orais um verdadeiro desafio (SANKAR et al., 2011).
Um dos desafios é a presença de enzimas bacterianas que podem degradar
precocemente a formulação (SANKAR et al., 2011). Além disso, os microrganismos podem
produzir altos níveis de ácidos ou bases orgânicas, causando na cavidade oral uma oscilação
de pH intermitente (VAN HOUTE, 1994; TAKAHASHI et al., 1997). Há também que se
considerar a colonização das superfícies orais pelos biofilmes, que promovem proteção física
contra antimicrobianos pela formação de uma matriz extracelular, produzindo suas próprias
enzimas para adaptação fisiológica celular (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET,
2014). Outro aspecto pouco estudado é o quanto tais características biológicas interfeririam na
9
liberação do fármaco presente na formulação. Este pode ser um dos motivos pelo qual o
PerioChip®, um dos sistemas de liberação de fármacos mais estudados no tratamento da
periodontite, apresenta resultados controversos sobre sua eficácia clínica.
O PerioChip® (Figura 4) é um chip de gelatina hidrolisada contendo clorexidina na
forma de filme (TABARY et al., 2014). De acordo Jeffcoat e colaboradores (1998), Killoy
(1998) e Grover e colaboradores (2011) seu uso associado ao procedimento mecânico de
raspagem e alisamento radicular resultou em redução da bolsa periodontal, melhorando
significativamente os resultados do tratamento da periodontite adulta. Por outro lado, Grisi e
colaboradores (2002), Daneshmand e colaboradores (2002) e Medaiah e colaboradores (2014)
utilizando delineamentos experimentais semelhantes, mostraram não haver benefícios clínicos
com a sua aplicação.
Figura 4 - Inserção do Periochip® na bolsa periodontal
Fonte: MEDAIAH et al., 2014.
Outra questão apontada como limitação clínica dos sistemas de liberação modificada é
a baixa degradabilidade dos carreadores poliméricos, bem como severas irritações na mucosa
(AMEYE et al., 2005; TABARY et al., 2014). Neste contexto, a quitosana tem recebido
destaque pois é um material não-tóxico, biocompatível e biodegradável (SHARPE et al.,
2014), sendo o carreador selecionado para o sistema de liberação deste estudo.
10
3 OBJETIVOS
Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e avaliação de
seu efeito antimicrobiano em biofilmes orais patogênicos de Streptococcus mutans e
Porphyromonas gingivalis.
11
4 MATERIAIS E MÉTODO
4.1 MATERIAIS
Os materiais utilizados foram: solução de digluconato de clorexidina 20% (Fagron®,
Saint Paul, MN, USA), hidroxipropil metilcelulose (HPMC) (Methocel™K100LV, Colorcon®,
Harleysville, PA, USA). Quitosana (médio peso molecular), cloreto de sódio, fosfato de sódio
monobásico, fosfato de sódio dibásico, sulfato de magnésio e dietilamina foram adquiridos da
Sigma-Aldrich® (Sant Louis, MO, USA). Ácidos acético e fórmico foram adquiridos da
Synth® (Labsynth, Diadema, SP, BR), metanol (grau cromatográfico) da J.T. Baker®
(Phillipsburg, NJ, USA), fosfato de potássio dibásico da Vetec (Rio de Janeiro, RJ, BR),
sacarose da Merck® (Darmstadt, HE, GE) e glicose da Fluka™ (St. Gallen, SZ). Triptona,
Brain Heart Infusion (BHI), Brain Heart Infusion ágar (BHI-ágar) e base para ágar sangue
foram adquiridos da marca Oxoid® (Basingstoke, Hampshire, UK) e o extrato de levedura foi
adquirido da BD Diagnostics (Sparks, MD, USA).
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este trabalho foi dividido em duas etapas (Figura 5), sendo que a primeira envolveu a
obtenção da formulação mais adequada aos experimentos biológicos. Isto foi necessário pois,
tal como as situações clínicas, os experimentos biológicos requerem um tempo de
permanência relativamente prolongado da formulação em um meio líquido circundante.
Desta forma, houve a necessidade de garantir que o sistema de liberação mantivesse sua
integridade física durante o tempo de exposição aos caldos de cultura nos quais
cresceram os biofilmes. Em acréscimo, é imprescindível que a formulação estudada
apresente um perfil de liberação do fármaco condizente com a necessidade clínica para o
qual foi idealizado. Assim, formulações-teste com diferentes concentrações de
clorexidina foram preparadas e avaliadas visualmente em relação à sua integridade física.
As formulações-teste selecionadas à partir destes resultados iniciais foram submetidas a
um ensaio de liberação em meio estático utilizando tampão como meio de dissolução
(meio de dissolução convencional). Este ensaio em tampão possibilitou a escolha da
formulação-teste com maior liberação de ativo para os experimentos utilizando os
diferentes caldos de cultura bacterianos como meio de dissolução. Na segunda etapa do
trabalho, o efeito da formulação-teste selecionada foi avaliado em biofilmes patogênicos de S.
12
mutans ou P. gingivalis, bactérias representativas da cárie (biofilme supragengival) e doença
periodontal (biofilme subgengival), respectivamente. A viabilidade bacteriana e o pH dos
biofilmes foram determinados, assim como a quantificação da clorexidina liberada da
formulação para os caldos de cultura.
Figura 5 – Delineamento experimental do trabalho
13
4.3 OBTENÇÃO DO SISTEMA DE LIBERAÇÃO MODIFICADA
A base do sistema de liberação foi preparada com quitosana de peso molecular médio
(Sigma-Aldrich®, Sant Louis, Missouri, USA) a 4% em ácido acético 0,1 M, em temperatura
ambiente sob agitação constante. Após estabilização da dispersão, hidroxipropil metilcelulose
(HPMC) foi adicionada, seguida do digluconato de clorexidina previamente liofilizado. A
liofilização da solução de digluconato de clorexidina a 20% (p/v) foi a estratégia utilizada
para atingir a elevada concentração de fármaco exigida pela proposta da formulação. O teor
do liofilizado foi corrigido pela umidade residual. Ao final do preparo, as formulações
permaneceram em repouso por 24 horas em temperatura ambiente e o pH final das mesmas
foi igual a 7.
Após o preparo de quatro formulações-teste com quantidades variáveis de digluconato
de clorexidina (Tabela 1) na presença ou ausência do HPMC, as mesmas foram
acondicionadas em seringas e esterilizadas por raios-X (130 Gy, 160 kV, 25 mA, 0.3 mm de
filtro de Cobre) por 30 minutos (Rad Source’s RS 2000 Biological Research Irradiator,
Shanghai Medicilon, Shanghai, China).
Tabela 1 – Composição das formulações-teste preparadas com concentrações variáveis de
digluconato de clorexidina na presença ou ausência do HPMC
Formulação-
teste
Gel de quitosana
a 4%
Digluconato de
clorexidina HPMC
1 90% 10% -
2 82% 10% 8%
3 72% 20% 8%
4 52% 40% 8%
Para simular o meio líquido circundante nos quais os biofilmes permanecem, as
formulações-teste foram aplicadas nas paredes de tubos estéreis de 50 mL e, após adição de
45 mL de tampão fosfato de sódio 30 mM (pH 6,9), foram incubadas a 37° C e 5% de CO2
por 4 dias. Apenas as formulações-teste 2, 3 e 4 mantiveram-se aderidas ao tubo e, por este
motivo, foram selecionadas para o ensaio de liberação em meio estático em tampão fosfato,
descrito a seguir.
14
4.4 ENSAIO DE LIBERAÇÃO DO FÁRMACO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO)
As formulações-teste 2, 3 e 4, previamente esterilizadas, foram aplicadas nas paredes
de tubos estéreis de 50 mL e avaliadas em relação ao perfil de liberação através de um ensaio
em meio estático, contendo tampão fosfato como meio de dissolução. Este é o meio de
dissolução mais utilizado para estudo de liberação de fármacos, sendo denominado neste
estudo de meio de dissolução convencional. Assim, aos tubos contendo cada formulação-teste
foram adicionados 45 mL de tampão fosfato de sódio 30 mM (pH 6,9), sendo incubados a 37°
C em estufa com 5% de CO2 durante 4 dias. Uma formulação sem digluconato de clorexidina
foi utilizada como controle e o meio de liberação foi trocado diariamente. Nos tempos 24, 48,
72 e 96 horas após o início do experimento, alíquotas de 2 mL do meio de liberação de todos
os grupos foram coletados para quantificação de digluconato de clorexidina liberado das
formulações (n=3).
O preparo das amostras foi realizado por filtração em membrana de acetato de celulose
de 0,22 µm (Millipore®, Billerica, Massachusetts, EUA). Estas amostras foram comparadas a
curvas analíticas preparadas utilizando uma solução de digluconato de clorexidina a 20%
(p/v) (Sigma-Aldrich®, Sant Louis, MO, USA) diluída em fase móvel no intervalo de
concentração de 5 a 50 µg/mL.
4.5 QUANTIFICAÇÃO DE DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA
As quantificações foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência
(CLAE)(PROEMINENCE, Shimadzu®, Nakagyo-ku, Kyoto, Japão), com detector
espectrofotométrico de arranjo de diodos (DAD)(SPDM20A, Shimadzu®, Nakagyo-ku,
Kyoto, Japão). A coluna de fase reversa C-18 (modelo Shim-pack VP-ODS, Shimadzu®,
Nakagyo-ku, Kyoto, Japão) com 4,6 mm x 25 cm e diâmetro de partícula de 5 µm foi
utilizada e acoplada a uma pré coluna C18, a 40° C, com vazão de 0,8 mL/min, utilizando
como fase móvel metanol (65%) – água ultrapurificada pH 3,5 (35%) (corrigido com ácido
fórmico) (v/v) e 0,4% de dietilamina, modo isocrático e detecção em 254 nm. O volume
injetado de amostra foi de 20 µL. Os resultados foram obtidos através do Software
LabSolutions (Shimadzu®, Nakagyo-ku, Kyoto, Japão). Os resultados foram expressos em
concentração de clorexidina liberada da formulação de acordo com o tempo.
Após as quantificações, os resultados sugeriram que a formulação-teste 2, contendo
10% de digluconato de clorexidina, apresentou o melhor perfil de liberação do fármaco (vide
15
“Resultados”, página 21). Assim, esta formulação foi selecionada para o ensaio de liberação
em meio estático utilizando os caldos de cultura de S. mutans ou P. gingivalis como meio de
dissolução, descrito a seguir.
4.6 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)
Considerando que a liberação de clorexidina à partir da formulação pode ser
influenciada pelo meio de dissolução no qual se encontra, um ensaio de liberação em meio
estático semelhante ao descrito no item 4.4 avaliou tanto o caldo de cultura utilizado nos
experimentos de S. mutans (preparado com triptona e extrato de levedura ultrafiltrado) quanto
o caldo de cultura utilizado no experimento de P. gingivalis (preparado com meio brain heart
infusion, BHI, suplementado com hemina e menadiona). A liberação de clorexidina da
formulação utilizando tampão fosfato como meio de dissolução foi utilizada como controle.
As amostras foram preparadas adicionando-se metanol na proporção 1:2 (1000 µL) em
alíquotas previamente acondicionadas em tubos de microcentrífuga (500 µL) por 24 horas, a -
20° C, visando a otimização do processo de precipitação de proteínas. Após este período, os
tubos foram deixados em temperatura ambiente por 30 minutos, e em seguida, centrifugados
durante 15 minutos a 10.000 g (5810 R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), sendo o
sobrenadante submetido à filtração por membrana de 0,22 µm (Millipore®, Billerica,
Massachusetts, USA).
Para assegurar que o método de precipitação de proteínas não promoveu perda do
fármaco, foram utilizadas amostras dos grupos do controle do veículo. Assim, na
ausência do fármaco, foram preparadas curvas analíticas em triplicata utilizando as
matrizes sem o fármaco (superposição de matriz) e o procedimento de precipitação antes da
análise. Estas curvas analíticas foram chamadas de curvas extraídas e a quantificação de
clorexidina foi realizada de acordo com o descrito no item 4.5.
4.7 BIOFILMES
Após a seleção da formulação-teste 2, contendo 82% de quitosana, 8% de HPMC e
10% de clorexidina, os experimentos biológicos com biofilme tiveram início, sendo descritos
a seguir.
16
4.7.1 Biofilme de Streptococcus mutans
4.7.1.1 Reativação bacteriana e preparo do inóculo
Streptococcus mutans UA 159 foi gentilmente cedida pelos professores Jaime
Aparecido Cury e Livia Maria Andaló Tenuta da FOP-UNICAMP. Após descongelamento
em banho de gelo, as bactérias foram reativadas a partir da transferência de 100 µL da
suspensão bacteriana para meio de cultura preparado com triptona e extrato de levedura
ultrafiltrado contendo glicose 1% (p/v) (pH 7,0), sendo incubadas a 37° C e 5% de CO2. Após
18 horas, a suspensão foi semeada em placas de BHI-ágar e incubadas a 37° C e 5% de CO2
por 24 horas. As colônias de S. mutans foram transferidas da placa para o meio de cultura
ultrapurificado contendo 1% de glicose (p/v) e incubadas por 18 horas para a formação do
inóculo (KOO et al., 2003).
4.7.1.2 Formação do biofilme e exposição aos tratamentos
Os biofilmes de Streptococcus mutans UA 159 foram formados por 6 dias em lâminas
de vidro (26 x 76 x 1,2 mm) (Figura 6). Assim, 100 µL do inóculo bacteriano descrito no item
anterior foram transferidos para tubos de 50 mL contendo caldo de cultura ultrapurificado
(extrato de levedura e triptona) e sacarose 1%. Após o acondicionamento das lâminas de
vidro, o conjunto foi incubado a 37° C e 5% de CO2 (KOO et al., 2003). No terceiro dia de
formação do biofilme, as lâminas de vidro foram transferidas para outros tubos de 50 mL aos
quais foram aderidas as seguintes formulações (515 mg + 10): 1) Formulação contendo 92%
de quitosana e 8% de HPMC como controle do veículo (CV) ou 2) Formulação contendo 82%
de quitosana, 8% de HPMC e 10% de clorexidina (CHX). Um grupo sem exposição à
formulação foi incluído como controle negativo (CN). Após adição de caldo de cultura
contendo sacarose, o conjunto foi incubado novamente. Os caldos de cultura foram trocados
diariamente. Tanto os biofilmes quanto os caldos de cultura foram analisados 24, 48, 72 e 96
horas após a exposição às formulações.
Após cada período experimental (24, 48, 72 ou 96 horas após exposição às
formulações), os biofilmes foram lavados três vezes em solução salina para desprendimento
de células não aderidas. Em seguida, os biofilmes foram coletados e alíquotas de 15 mg foram
distribuídas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução salina. As
amostras foram analisadas em relação à viabilidade bacteriana como descrito no item 4.7.3.2.
17
Os caldos de cultura foram analisados para determinação do pH dos biofilmes (item 4.7.3.1),
sendo posteriormente armazenados para a quantificação de fármaco liberado pela formulação
(item 4.7.3.3). Dois experimentos independentes foram realizados em triplicata (n=6).
Figura 6 – Formação do biofilme de S. mutans e exposição aos tratamentos
4.7.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis
4.7.2.1 Película de saliva
A adesão de P. gingivalis é dependente da película de saliva (PAPAIOANAOU et
al., 2012). Assim, no primeiro dia de experimento, lâminas de vidro (26 x 76 x 1,2 mm),
sobre as quais cresceriam os biofilmes, foram imersas em saliva humana estéril por 2 horas
a 37° C. A saliva foi coletada de 5 voluntários adultos saudáveis e com fluxo salivar normal
que não haviam utilizado antibióticos ou quaisquer medicações durante 3 meses antes da
coleta. Os participantes mastigaram um filme (Parafilm® M; American Can Co., Neenah, US)
devidamente higienizado e a coleta da saliva foi realizada em um frasco estéril. As salivas
foram centrifugadas (12000 g durante 20 minutos a temperatura de 4° C) e filtradas em
membrana filtrante de acetato de celulose de 0,22 µm (Millipore®, Billerica, Massachusetts,
18
US) antes da sua utilização. A participação dos voluntários foi aprovada pelo Comitê de
Ética da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo –
FCFRP/USP (protocolo nº. 376) (Anexo I).
4.7.2.2 Reativação bacteriana e preparo do inóculo
As colônias de P. gingivalis W83, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Sérgio Luiz de
Souza Salvador do Departamento de Análises Clínicas, Toxicologia e Bromatologia da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP (FCFRP/USP), foram reativadas
em placas de ágar sangue suplementado com hemina (5 μg/mL), menadiona (1 μg/mL) e 5%
de sangue de carneiro desfibrinado (PAPAIOANNOU et al., 2012). As placas foram
incubadas em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera contendo 80% de N2, 10% de H2 e
10% de CO2. Após 7 dias, as bactérias foram coletadas e ressuspendidas em solução salina,
sendo ajustadas na escala 0,5 de McFarland (1,5.108 UFC/mL) por densidade ótica em
espectrofotômetro a 625 nm (UV Cary 50 Varian, Melbourne, Victoria, Austrália). A
suspensão obtida foi utilizada para a formação do biofilme.
4.7.2.3 Formação do biofilme e exposição aos tratamentos
O biofilme foi formado por 3 dias de acordo com Papaioannou e colaboradores (2012),
utilizando lâminas de vidro (26 x 76 x 1,2 mm) ao invés de brackets ortodônticos (Figura 7).
Assim, o inóculo foi transferido para tubos de 50 mL contendo BHI suplementado com
hemina (5 μg/mL) e menadiona (1 μg/mL) aos quais foram previamente aderidas as seguintes
formulações (515 mg + 10): 1) Formulação contendo 92% de quitosana e 8% de HPMC como
controle do veículo (CV) ou 2) Formulação contendo 82% de quitosana, 8% de HPMC e 10%
de clorexidina (CHX). Um grupo sem exposição à formulação foi incluído como controle.
As lâminas contendo a película de saliva foram adicionadas ao tubo e conjunto foi
incubado em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera contendo 80% de N2, 10% de H2 e
10% de CO2. Os caldos de cultura foram trocados diariamente. Tanto os biofilmes quanto os
caldos de cultura foram analisados 24, 48 e 72 horas após a exposição às formulações.
Após cada período experimental (24, 48 ou 72 horas após exposição às formulações),
os biofilmes foram lavados três vezes em solução salina, sendo coletados com swab estéril.
Após o esfregaço na lâmina de vidro, a ponta do swab foi cortada e transferida para tubos de
1,5 mL contendo 1 mL de solução salina. Assim como no experimento com S. mutans, a
19
viabilidade bacteriana (item 4.7.3.2), pH dos biofilmes (item 4.7.3.1) e quantificação de
fármaco liberado pela formulação (item 4.7.3.3) foram determinados. O experimento foi
realizado em triplicata (n=3).
Figura 7 – Formação do biofilme de P.gingivalis e exposição aos tratamentos
4.7.3 Análises
4.7.3.1 Mensuração dos pHs dos biofilmes
Os pHs dos biofilmes foram determinados nos caldos de cultura de acordo com Duarte
e colaboradores (2008) utilizando-se um pHmetro digital (PG2000, Gehaka, São Paulo).
4.7.3.2 Viabilidade bacteriana
Para a determinação da viabilidade bacteriana as amostras foram sonicadas com 1
pulso com 20% de amplitude, durante 15 segundos (sonicador FB505, Fischer Scientific,
Pittsburgh, Pensilvânia, USA) (AIRES et al., 2008). Após sonicação, uma alíquota de 100 μL
20
da suspensão obtida na coleta foi diluída em salina e diluições seriadas foram inoculadas em
duplicata pela técnica da gota (TENUTA et al., 2008).
No experimento com S. mutans a inoculação foi realizada em placas de BHI-ágar,
sendo incubadas a 37° C e 5% de CO2 por 48 horas. No experimento com P. gingivalis, a
inoculação foi realizada em placas de BHI-ágar sangue suplementado com hemina (5 μg/mL)
e menadiona (1 μg/mL), sendo incubadas em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera
contendo 80% de N2, 10% de H2 e 10% de CO2 por 7 dias. Após o tempo de incubação para
cada espécie, as contagens das UFC foram realizadas com o auxílio de uma lupa
estereoscópica (Stemi DV4, Zeiss, Göttingen, Germany). Os resultados da contagem de S.
mutans foram expressos em UFC/mg de biofilme úmido enquanto os resultados de P.
gingivalis foram expressos em UFC/área da lâmina (mm²).
4.7.3.3 Quantificação de clorexidina nos caldos de cultura dos biofilmes de S. mutans e P.
gingivalis
As amostras foram preparadas de acordo com o descrito no item 4.6 e a quantificação
do fármaco foi realizada por CLAE/DAD (item 4.5). Os resultados foram expressos em
porcentagem de clorexidina liberada da formulação em função do tempo.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados com o auxílio do software SAS System (SAS Institute Inc.
The SAS System, release 9.3. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2012). Um modelo linear
de análise de variância foi ajustado e a aderência dos resíduos à distribuição Gaussiana foi
avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk, coeficiente de assimetria, curtose e análise gráfica. O
teste de Tukey-Kramer (viabilidade de S. mutans, pH dos biofilmes, quantificação de
clorexidina no experimento de P. gingivalis) e Tukey (viabilidade de P. gingivalis,
quantificação de clorexidina no experimento de S. mutans) foram utilizados para comparar as
médias dos efeitos significativos. O nível de significância foi estabelecido em 5%.
21
5 RESULTADOS
5.1 SELETIVIDADE DO MÉTODO
Previamente aos experimentos de quantificação de clorexidina, foram realizadas
análises para a verificação da confiabilidade e seletividade da metodologia proposta. As
curvas analíticas utilizadas para a quantificação da clorexidina em tampão fosfato e nos caldos
de cultura utilizados apresentaram linearidade satisfatória para os intervalos de concentrações
avaliadas (5 a 50 µg/mL) e os coeficientes de determinação foram superiores ao recomendado
pela literatura R2 > 0,99 (ANVISA, 2003).
O tempo de retenção do analito foi de 6,4 minutos (Figura 8a). A presença de outros
componentes da formulação e dos diferentes meios utilizados não interferiu na quantificação
do ativo, apresentando tempo de retenção menor do que o do analito (Figura 8b e 8c).
5.2 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO)
As formulações-teste 2, 3 e 4 contendo respectivamente, 10, 20 e 40% de clorexidina
foram avaliadas em relação à liberação de clorexidina. Os resultados da análise (Figura 9)
mostraram que, apesar de dobrar a concentração de fármaco na formulação 3, a liberação se
manteve muito próxima daquela obtida pela formulação 2. Em acréscimo, apesar de conter a
maior quantidade inicial de fármaco, a formulação 4 apresentou liberação de clorexidina
muito menor do que as demais formulações nas primeiras 24 horas, justificando a escolha da
formulação-teste número 2 para o estudo com os biofilmes.
22
Figura 8 – Perfis cromatográficos (CLAE-DAD) obtidos pela análise de: a) solução
preparada em tampão contendo 50 µg/mL de clorexidina; b) caldo de cultura na presença
de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de S.mutans; c) caldo de
cultura na presença de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de P.
gingivalis
23
Figura 9 – Concentração de clorexidina liberada das formulações-teste 2, 3 e 4 contendo,
respectivamente, 10, 20 e 40% de ativo
Resultados obtidos por CLAE-DAD do ensaio de liberação realizado com (●) Formulação-teste 2; (■)
Formulação-teste 3 e (▲) Formulação-teste 4
5.3 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)
A avaliação da liberação de clorexidina a partir da formulação-teste 2 mostrou que a
utilização de diferentes caldos de cultura como meio de dissolução diminui a liberação do
fármaco em comparação ao tampão (Figura 10). Em acréscimo, a concentração de clorexidina
liberada no caldo de cultura utilizado para o crescimento de S. mutans foi menor se
comparada ao caldo de cultura utilizado para o crescimento de P. gingivalis no tempo 24
horas.
Figura 10 – Concentração de clorexidina liberada em cada tempo a partir da formulação-teste
2 utilizando diferentes meios de dissolução
Resultados obtidos por CLAE-DAD do ensaio de liberação realizado utilizando como meio de dissolução o (●)
Tampão fosfato de sódio; (■) Caldo de cultura para o crescimento de S. mutans ;(▲) Caldo de cultura para o
crescimento de P. gingivalis
50
100
150
200
250
300
24 48 72 96
[clo
rexid
ina]
µg
/mL
Tempo (horas)
50
100
150
200
250
300
24 48 72 96
[clo
rexid
ina]
µg
/mL
Tempo (horas)
24
5.4 BIOFILMES
5.4.1 Biofilme de Streptococcus mutans
5.4.1.1 Mensuração do pH dos biofilmes
Antes da exposição aos tratamentos, o pH dos biofilmes apresentou valores de 4,0 ±
0,1 indicando metabolização bacteriana dos carboidratos e produção de ácidos (dados não
mostrados). A Tabela 2 mostra os resultados pH dos biofilmes de S. mutans nos diferentes
tempos de exposição após a exposição aos tratamentos. Os grupos CN e CV não apresentaram
diferença entre si (p>0,05), mas apresentaram quedas de pH maiores se comparados à CHX
em todos os tempos (p<0,05). Os valores de pH entre os tempos de 24, 48 e 72 foram
crescentes em CHX (p<0,05) e não houve diferença significativa entre 72 e 96 horas (p>0,05).
Tabela 2 – Mensuração do pH dos biofilmes de S. mutans de acordo com os tratamentos
Tempo após
incubação com as
formulações (horas)
CN CV CHX
24 3,9 ± 0,0 A 4,0 ± 0,1 A 5,77 ± 0,1 B
48 3,9 ± 0,0 A 3,9 ± 0,0 A 6,72 ± 0,0 C
72 4,0 ± 0,0 A 3,9 ± 0,0 A 6,84 ± 0,1 D
96 3,9 ± 0,1 A 3,9 ± 0,1 A 6,84 ± 0,0 D
CN= controle negativo (sem tratamento); CV= controle do veículo da formulação; CHX= formulação contendo
clorexidina. Dados expressos com média ± desvio (n=6). Os valores que não partilham a mesma letra (A, B, C,
D) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer,
p<0,05.
5.4.1.2 Viabilidade bacteriana
A Figura 11 mostra os resultados de viabilidade bacteriana em biofilmes de S. mutans
de acordo com os tratamentos. Para o controle negativo (CN) houve um decréscimo na
viabilidade bacteriana nos tempos 72 e 96 horas se comparado a 24 horas (p<0,05). O grupo
controle do veículo (CV) apresentou a mesma tendência que CN nos referidos tempos
(p<0,05). A exposição do biofilme à formulação experimental contendo clorexidina (CHX)
resultou em menor viabilidade bacteriana se comparada aos controles em todos os tempos
(p<0,05), não apresentando diferença entre si (p>0,05).
25
Figura 11 – Viabilidade do biofilme de S. mutans de acordo com os tratamentos
CN= controle negativo (sem tratamento); CV= controle do veículo da formulação; CHX= formulação contendo
clorexidina. Dados expressos com média ± desvio padrão em escala logarítmica (n=6). Os valores que não
partilham a mesma letra (A, B, C, D, E) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk
seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer, p<0,05.
5.4.1.3 Quantificação de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans
Os dados de liberação da clorexidina corroboram com os resultados de viabilidade
bacteriana e de mensuração de pH do biofilme de S. mutans. A Tabela 3 mostra os valores de
porcentagem de clorexidina em relação à quantidade inicial em tampão fosfato de sódio, caldo
de cultura sem bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans.
Tabela 3 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de
fármaco na formulação (média + dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem
bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans
Tempo após
incubação
com as
formulações
(horas)
Meio de liberação
Tampão fosfato de sódio
Caldo de cultura sem
bactéria
Caldo de cultura dos
biofilmes de S. mutans
24 22,8 ± 0,9A 13,6 ± 0,6B 6,9 ± 1,2EF
48 11,9 ± 0,8BC 10,6 ± 1,4CD 3,4 ± 0,2GH
72 9,0 ± 0,2DE 7,8 ± 0,3E 1,9 ± 0,1H
96 8,9 ± 1,3DE 5,1 ± 0,5FG 1,8 ± 0,2H
Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3). Os valores que não partilham a mesma letra (A a H) são
significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey, p<0,05.
ABBCD D D
A ABC CDD
E E
1E+0
1E+2
1E+4
1E+6
1E+8
24 48 72 96
log
UFC
/mg
de
bio
film
e ú
mid
o
Tempo (horas)
CN
CV
CHX
E E
26
Nas primeiras 24 horas, a maior e a menor liberação de clorexidina foi observada na
formulação exposta ao tampão e ao caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans,
respectivamente (p<0,05). A formulação exposta ao caldo de cultura sem bactérias apresentou
maior teor de clorexidina se comparada ao caldo de cultura dos biofilmes em todos os tempos
(p<0,05).
Nas primeiras 24 horas, todas as formulações apresentaram maior teor de clorexidina
em relação aos demais tempos (p<0,05). Ao longo do tempo, a liberação de clorexidina em
tampão diminui significativamente até 72 horas (p<0,05) não havendo diferença estatística em
comparação ao tempo de 96 horas (p>0,05). Já no caldo de cultura sem bactérias a quantidade
de clorexidina diminuiu significativamente ao longo do tempo (p<0,05). No caldo de cultura
dos biofilmes o teor de clorexidina não foi significativamente diferente nos tempos de 48, 72
e 96 horas (p>0,05).
A partir dos resultados do ensaio de liberação foi realizado um cálculo para a obtenção
da concentração de clorexidina em porcentagem (p/v) quantificada nos diferentes meios de
dissolução (Tabela 4). Estes cálculos poderiam auxiliar a comparação dos dados com as
concentrações de clorexidina descritas na literatura. A concentração variou nos tempos 24 a
96 horas de 0,025 a 0,010% no tampão, de 0,016 a 0,006% no caldo de cultura sem bactérias e
de 0,008 a 0,002% no caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans.
Tabela 4 - Concentração do fármaco em porcentagem nos diferentes meios de liberação
(média ± dp)
Tempo após
incubação
com as
formulações
(horas)
Meio de liberação
Tampão fosfato de sódio
Caldo de cultura sem
bactérias
Caldo de cultura dos
biofilmes de S. mutans
24 0,025 ± 0,001 0,016 ± 0,000 0,008 ± 0,001
48 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,001 0,004 ± 0,000
72 0,010 ± 0,000 0,011 ± 0,010 0,002 ± 0,000
96 0,010 ± 0,002 0,006 ± 0,004 0,002 ± 0,000
Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3).
27
5.4.2 BIOFILME DE Porphyromonas gingivalis
5.4.2.1 Mensuração do pH dos biofilmes
O pH dos biofilmes de P. gingivalis foi de 7,1 ± 0,1, não diferindo entre os grupos ou
tempos estudados.
5.4.2.2 Viabilidade bacteriana
A Figura 12 mostra os resultados de viabilidade bacteriana em biofilmes de P.
gingivalis de acordo com os tratamentos. Para o CN houve um aumento na viabilidade
bacteriana em 72 horas se comparado aos tempos de 24 e 48 horas (p<0,05). A viabilidade das
bactérias no grupo CV também aumentou durante o experimento, mas foi menor se
comparada ao CN em todos os tempos (p<0,05), sendo igual ao grupo CHX nas primeiras 24
horas (p>0,05). O grupo CHX resultou em menor viabilidade bacteriana se comparada ao CN
em todos os tempos e ao CV nos tempos de 48 e 72 horas (p<0,05), não apresentando
diferença entre si (p>0,05).
Figura 12 – Viabilidade do biofilme de P. gingivalis de acordo com os tratamentos
CN= controle negativo (sem tratamento); CV= controle do veículo da formulação; CHX= formulação contendo
clorexidina. Dados expressos com média ± desvio padrão em escala logarítmica (n=3). Os valores que não
partilham a mesma letra (A, B, C, D, E) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk
seguido pelo teste post-hoc Tukey, p<0,05.
AB
AC
D
BD
1E+0
1E+2
1E+4
1E+6
1E+8
24 48 72
log
UFC
/mm
2
Tempo (horas)
CN
CV
CHX
E E E E
28
5.4.2.3 Quantificação de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis
A Tabela 5 mostra os valores em porcentagem de clorexidina a partir da formulação
nos diferentes meios. Os resultados descritos na tabela corroboram com os obtidos na análise
da viabilidade do biofilme de P. gingivalis.
Tabela 5 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de
fármaco na formulação (média ± dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem
bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis
Tempo após
incubação
com as
formulações
(horas)
Meio de liberação
Tampão fosfato de sódio
Caldo de cultura sem
bactérias
Caldo de cultura dos
biofilmes de P.
gingivalis
24 22,8 ± 0,9A 17,6 ± 0,3B 11,3 ± 0,3C
48 11,9 ± 0,8C 10,8 ± 0,2C 7,2 ± 0,11EF
72 9,0 ± 0,2D 6,5 ± 0,1F 4,1 ± 0,4G
Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3). Os valores que não partilham a mesma letra (A a G) são
significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer, p<0,05.
Em todos os meios de dissolução houve decréscimo na porcentagem de clorexidina
liberada ao longo dos dias, diferindo entre si em todos os tempos (p<0,05). No tempo 24
horas, a maior e a menor liberação de clorexidina foi observada na formulação exposta ao
tampão e ao caldo de cultura dos biofilmes, respectivamente (p<0,05). Em acréscimo, as
porcentagens de teor de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes foram cerca de 1,5
vezes menores em comparação ao caldo sem bactérias em todos os tempos (p<0,05) .
Assim como realizado para S. mutans, a partir dos resultados do ensaio de liberação
foi realizado um cálculo para a obtenção da concentração de clorexidina em porcentagem
(p/v) quantificada nos diferentes meios de dissolução (Tabela 6). A concentração variou nos
tempos 24 a 72 horas de 0,025 a 0,010% no tampão, de 0,020 a 0,007% no caldo de cultura
sem bactérias e de 0,013 a 0,005% no caldo de cultura com bactérias.
29
Tabela 6 – Concentração do fármaco nos diferentes meios de liberação (média ± dp)
Tempo após
incubação
com as
formulações
(horas)
Meio de liberação
Tampão fosfato de sódio
Caldo de cultura sem
bactérias
Caldo de cultura dos
biofilmes de P.
gingivalis
24 0,025 ± 0,001 0,020 ± 0,000 0,013 ± 0,001
48 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,000 0,008 ± 0,000
72 0,010 ± 0,000 0,007 ± 0,000 0,005 ± 0,000
Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3).
30
6 DISCUSSÃO
Clorexidina é um agente antimicrobiano comumente utilizado como enxaguatório
bucal, apresentando efeitos bacteriostáticos em baixas concentrações (0,012 – 0,06%) e
efeitos bactericidas em concentrações maiores (0,12 – 0,2%) (RIBEIRO; HASHIZUME;
MALTZ, 2007; VARONI et al., 2012; LEE et al., 2016). Apesar de apresentar um tempo de
permanência alto em comparação a outros antimicrobianos orais, a possibilidade de estender
este tempo utilizando uma formulação farmacêutica pode trazer vantagens no controle de
biofilmes patogênicos. Em acréscimo, a obtenção da formulação na presença de condições
biológicas, mesmo que minimamente desafiadoras se comparadas às situações clínicas, pode
trazer limitações quanto à liberação do fármaco. De fato, isto foi observado no presente
trabalho.
De uma forma geral, a liberação de clorexidina da formulação foi menor quando a
mesma foi exposta aos caldos de cultura se comparada ao meio convencional (tampão
fosfato). Entretanto, enquanto o meio convencional é composto de tampão fosfato em pH 7,
os caldos de cultura microbiológicos contém substratos essenciais para o pleno
desenvolvimento bacteriano como peptona, proteínas, carboidratos, enzimas, leveduras
autolisadas, sais, vitaminas, entre outros. A liberação de clorexidina foi menor ainda ao se
comparar estes dados com os caldos de cultura contendo as bactérias (S. mutans ou P.
gingivalis). Isto pode ser explicado devido à presença de várias moléculas provenientes do
ambiente de formação dos biofilmes. É bem estabelecido que nos biofilmes as bactérias se
comunicam por quorum sensing, processo pelo qual os microrganismos regulam a densidade
populacional por sinalização química (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET;
2014). Além disso, ocorrem trocas de substâncias (oxigênio, nutrientes) entre o biofilme e o
meio, além de haver replicação dos microrganismos e metabolização de substrato circundante
(MARTIN et al., 2015). Provavelmente, estas substâncias interferiram com a liberação de
fármaco da formulação devido ao aumento da força iônica do meio de dissolução
(BONFERONI et al., 2000; BAATI et al, 2015). Assim, a utilização de meios de dissolução
mais complexos que o meio convencional pode contribuir para os estudos de obtenção de
sistemas de liberação modificada.
Neste contexto, a utilização de um meio de liberação de fármaco mais próximo ao
meio fisiológico para onde a formulação é idealizada – no caso, a cavidade oral - poderia
predizer o possível desempenho clínico de tal formulação. Ou seja, há necessidade de
modelos que avaliem a quantificação do fármaco em um meio que possa prever o
31
comportamento in vivo da forma farmacêutica. Isto é apontado na literatura como um dos
principais motivos para o insucesso clínico de grande parte das formulações
farmacêuticas (PATEL; LIU; BROWN, 2012). Ainda que com limitações inerentes ao
modelo biológico utilizado, o presente trabalho propõe alguns desafios biológicos
constantes na cavidade oral como presença de macromoléculas, enzimas, bactérias ,
biofilme e oscilações de pH. Estas variáveis podem ser consideradas interferentes tanto
na manutenção da integridade física quanto na liberação do fármaco da formulação e
modelos biológicos mais complexos devem ser propostos no futuro de forma a
contemplar o ambiente oral em sua totalidade. Assim, a formulação e a carga total de
fármaco incorporada a ela poderia sofrer adequações antes mesmo dos ensaios clínicos.
Ainda que a quantificação de clorexidina nos caldos de cultura de S. mutans e P.
gingivalis tenha sido menor se comparada ao meio de dissolução convencional, o efeito
biológico promovido foi observado tanto para os biofilmes supra quanto para os subgengivais.
Apesar de não terem sido observadas mudanças de pH nos biofilmes de P. gingivalis,
provavelmente por limitação da metodologia adotada, os resultados mostram que o pH dos
biofilmes de S. mutans expostos à formulação foi maior se comparado aos controles em todos
os tempos estudados. A produção de ácidos pelas bactérias S. mutans é um fatores que
contribuem para o desenvolvimento e estabelecimento de biofilmes cariogênicos (KOO et al.,
2003) e o efeito da clorexidina na diminuição da acidogenicidade destes biofilmes é bem
estabelecida na literatura (LEE et al., 2016; CCAHUANA-VASQUEZ; CURY, 2010).
Entretanto, as concentrações de clorexidina que apresentam este efeito são maiores do que
aquelas encontradas no presente estudo. Enquanto Lee e colaboradores (2016) mostraram que
houve diminuição na acidogenicidade após exposições a uma solução de clorexidina a 0,04%
e Ccahuana-Vasquez e Cury (2010) observaram este efeito utilizando clorexidina a 0,012%,
este trabalhou mostrou que concentrações variando de 0,002 a 0,008% já atenuam a
acidogenicidade dos biofilmes de S. mutans. Entretanto, por se tratar de uma proposta de
sistema de liberação modificada, este estudo expôs continuamente a formulação contendo o
antimicrobiano enquanto os trabalhos citados fizeram exposições ocasionais à clorexidina-
solução, simulando uso deste antimicrobiano como enxaguatório. Em acréscimo, há que se
considerar que a quantificação do fármaco foi realizada apenas no caldo de cultura, o que não
exclui a possibilidade da clorexidina estar ligada à componentes específicos do biofilme.
Estudos futuros devem ser delineados para estudar esta variável.
A baixa concentração de clorexidina durante períodos prolongados também diminuiu a
viabilidade celular dos biofilmes de S. mutans e P. gingivalis em todos os tempos analisados.
32
Esta molécula se liga à superfície celular bacteriana carregada negativamente, rompendo a
membrana celular e causando morte bacteriana (VARONI et al., 2012). Na presença de
biofilmes de S. mutans, cerca de 7% e 2% de clorexidina foi liberada da formulação em 24 e
96 horas após o primeiro contato com o biofilme, respectivamente. Assim, para os biofilmes
de S. mutans, a formulação contendo clorexidina pode ser considerada bactericida, pois foi
capaz de inviabilizar as bactérias no biofilme e diminuir sua acidogenicidade. Para o estudo
com P. gingivalis, a formulação proposta apresentou efeito na inibição da formação dos
biofilmes, sendo a liberação de clorexidina da formulação de 11% e 4% em 24 e 72 horas,
respectivamente. Estes valores são maiores do que a concentração inibitória mínima (CIM)
determinada para esta bactéria em sua forma livre (PARK et al., 2014), o que poderia
justificar estes resultados já que em um biofilme a susceptibilidade ao antimicrobiano
aumenta na ordem de 10 a 1000 vezes (MONROE, 2007; WU et al., 2014; FLEMMING et
al., 2016). Neste contexto, os modelos de biofilme podem contribuir para o desenvolvimento
de sistemas de liberação modificada já que tanto a liberação do fármaco como seu efeito
antibacteriano pode ser monitorados ao mesmo tempo.
A quitosana, utilizada como veículo da formulação proposta, é um polissacarídeo
extraído dos crustáceos e obtido pela deacetilação parcial da quitina (RINAUDO, 2006).
Considerado um polímero de destaque na área farmacêutica, esta molécula bioadesiva é capaz
de prolongar tanto a retenção da formulação na mucosa oral como a liberação do fármaco
(SENEL et al., 2000; KHOR; LIM, 2003; RINAUDO, 2006; RODRIGUEZ-GARCIA;
GALAN-WONG; AREVALO-NIÑO, 2010; GARD et al., 2012). Estas características únicas
da quitosana, aliadas a sua não toxicidade, promove sua ampla utilização como carreador
polimérico em sistemas de liberação de fármacos (JI et al., 2010; ELVIRI et al., 2015
SHARPE et al., 2014). De fato, os resultados do presente estudo confirmam tal perfil pois o
sistema de liberação apresentado foi capaz de liberar a clorexidina lentamente da formulação,
conforme demosntrado pelos efeitos biológicos e pelos resultados de quantificação tanto em
tampão quanto nos caldos de cultura bacterianos. Além destas propriedades, os resultados
mostram que este polissacarídeo apresentou efeitos de inibição bacteriana em biofilmes de P.
gingivalis. De acordo com a literatura, a quitosana apresenta atividade antimicrobiana
(DUTTA; TRIPATHI; DUTTA, 2011) e dispersões de quitosana podem inibir células
planctônicas e halos de crescimento bacteriano de P. ginigivalis (IKINCI et al., 2002;
RODRIGUEZ-GARCIA; GALAN-WONG; AREVALO-NIÑO, 2010). Assim, a utilização de
quitosana como carreador polimérico poderia potencializar os efeitos de um sistema de
liberação modificada, além de garantir biocompatibilidade com os tecidos orais. Entretanto,
33
estudos futuros devem contemplar condições de cultivo mais complexas como presença de
mais de uma bactéria (biofilmes multiespécie) e presença de saliva em fluxo contínuo.
Apesar da existência de protocolos de tratamento clínico bem estabelecidos para cárie
e peridontite, a realização das pesquisas para o controle destas doenças biofilme-dependentes
utilizando os antimicrobianos atualmente disponíveis é relevante para a Odontologia (WU et
al., 2014; DARRENE; CECILE; 2016). Por outro lado, a utilização de modelos
microbiológicos que possam minimamente contribuir para estudar formulações farmacêuticas
passíveis de serem utilizadas na cavidade oral pode ser extremamente relevante para a área
farmacêutica. Assim, o presente estudo sugere a importância de aliar os estudos de diferentes
áreas de forma a vislumbrar o benefício clínico almejado para o tratamento e controle das
doenças orais.
34
7 CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que o sistema de liberação obtido foi eficiente na liberação do
ativo. O modelo proposto para a avaliação da formulação mostrou que componentes do meio
de dissolução como nutrientes, microrganismos e seus metabólitos podem interferir na
liberação do ativo do sistema. Apesar disso, o sistema de liberação obtido foi capaz de
diminuir a patogenicidade dos biofilmes de Streptococcus mutans e de Porphyromonas
gingivalis, mostrando que essa formulação pode apresentar relevância clínica na área da
odontologia.
35
REFERÊNCIAS
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starch/Carbopol® 974P mixtures as buccal bioadhesive carriers. International Journal of
Pharmaceutics, v. 301, p. 170–80, 2005.
3. ANVISA. Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Diário Oficial da União, 02
jun. 2003. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/documents/33880/2568070/
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ANEXO I
- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FCFRP/USP